專利名稱：通過低pH和二價(jià)陽(yáng)離子分離生物大分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在組合物中分離生物大分子的方法。特別地，本 發(fā)明涉及在包含雜質(zhì)的組合物中分離生物大分子的方法，該方法包括(a) 降低該組合物的pH, (b)向該組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子，以及(c)從該雜質(zhì)中
分離該生物大分子。
背景技術(shù)：
生物大分子(如重組生物大分子)在多種技術(shù)中具有重要意 義。傳統(tǒng)上，已采用了許多不同的方法來純化生物大分子，舉例而言，例 如，過濾、離心、尺寸排阻層析、親和層析或上述方法的組合。純化方法 的選擇通?；谠撋锎蠓肿雍徒M合物中與該生物大分子共存的一種或 多種雜質(zhì)的區(qū)別特征。大量的生物大分子具有商業(yè)意義，對(duì)于能夠及時(shí)和 低成本純化大量生物大分子的能力存在著需求。已進(jìn)行了廣泛的研究來提 高目前的純化生物大分子的純化技術(shù)和方法的效率。適用于小規(guī)模制備的 純化技術(shù)通常不適用于工業(yè)規(guī)^莫純化。 具有商業(yè)重要性的生物大分子包括，例如，蛋白和核酸，例 如，DNA和RNA。常以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行分離的生物大分子的兩種范例是單 克隆抗體和融合蛋白。這些抗體和融合蛋白在多種診斷和治療領(lǐng)域具有價(jià) 值，并被用于治療各種疾病，例如> 遺傳和獲得性免疫缺陷疾病和感染疾病。
生產(chǎn)純化抗體的傳統(tǒng)方法包括硫酸銨沉淀，使用辛酸后離 心，離子交換層析(例如，DEAE或羥基磷灰石)，免疫親和純化(例如， 蛋白A和蛋白G ),以及透4斤。例如，參見Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow和Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)。上述方法的聯(lián)合使 用非常常見，例如，使用乙醇進(jìn)行組分分離(fractionation)后進(jìn)行離子交換 層析和/或辛酸(CA)沉淀從血漿純化抗體。例如，可參見McKinney等人， 丄Immunol. Methods 96:271-278 (1987);美國(guó)專利4,164,495、 4,177,188、 RE 31,268、 4，939,176和5，164，487。此外，發(fā)酵中的酸化已被用于提高抗 體和重組蛋白的回收率和穩(wěn)定性。例如，參見Lydersen等人，Annals New York Academy of Sciences 745:222-31 (1994)。
10005]已開發(fā)了多種其它方法來分離和/或純化抗體，其中包括了 酸沉淀的應(yīng)用。例如，參見美國(guó)專利7,038,017、 7,064,191、 6,846,410、 5,429,746、 5,151,504、 5,110,913、 4,933,435、 4,841,024和4,801,687。然
而，這些方法中有許多可導(dǎo)致在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)抗體時(shí)大的原料量和回收損 失和/或高成本。對(duì)于(特別是在進(jìn)行切向流過濾中)通過調(diào)節(jié)收獲條件來 提高細(xì)胞澄清穩(wěn)健性的效果上進(jìn)行的工作還非常有限。 從含有哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞的工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器中收獲 抗體和重組蛋白通常采用過濾或離心。然而，在采用這些技術(shù)時(shí)，核酸(例 如，DNA)、宿主細(xì)胞(HCP)和生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分通常不能與該目標(biāo)生物大 分子充分分離。最近在細(xì)胞培養(yǎng)中提高蛋白生產(chǎn)數(shù)量的需求使得生物反應(yīng) 器需要在更高的細(xì)胞密度下運(yùn)行，這從而提高了雜質(zhì)(例如DNA、 HCP 和其它培養(yǎng)基成分)的數(shù)量。污染物水平的上升對(duì)細(xì)胞收獲操作(例如， 過濾和離心步驟)以及下游純化步驟(例如，層析和透析步驟)提出了更 高的要求。更高水平的雜質(zhì)的添加增加了所需進(jìn)行的純化步驟數(shù)，從而降 低了總體的生產(chǎn)能力。
作為前述困難和低效的結(jié)果，需要提高生物大分子的分離策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及在包含雜質(zhì)的組合物中分離生物大分子的方法， 該方法包括(a)降低該組合物的pH， (b)向該組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子，以及 (c)從該雜質(zhì)中分離該生物大分子。在部分實(shí)施方式中，(a)中的降低pH和 (b)中的添加二價(jià)陽(yáng)離子發(fā)生在(c)中的分離之前。 生物大分子的分離可通過多種手段實(shí)現(xiàn)。在部分實(shí)施方式 中，通過過濾所述組合物進(jìn)4亍(c)的分離，該過濾形成滲透流(permeate stream)和滯留流(retentate stream)。在l吏用過濾的部分實(shí)施方式中，該生物 大分子基本在滲透流中，而在部分實(shí)施方式中，通過切向流過濾器進(jìn)行該 過濾。在其它實(shí)施方式中，通過離心該組合物進(jìn)行(c)中的分離，該分離形 成上清液和沉淀物。在使用過濾的部分實(shí)施方式中，該生物大分子基本在 上清液中。 在本發(fā)明的部分方面，(a)中該組合物的pH被降低至少1 pH 單位。在本發(fā)明的部分方面，(a)中該組合物的pH被調(diào)節(jié)至約3,0至約6.5、 約3.0至約5.0或約4.0至約4.7的pH范圍內(nèi)。 在本發(fā)明的部分方面，該生物大分子為蛋白。在部分實(shí)施方 式中，該蛋白為可溶性蛋白。在部分實(shí)施方式中，該蛋白為抗體。在部分 實(shí)施方式中，該組合物包含真核細(xì)胞物質(zhì)。在部分實(shí)施方式中，該雜質(zhì)包 含蛋白、脂質(zhì)、核酸、核糖核酸或其組合。
〖0012] 本發(fā)明可使用各種二價(jià)陽(yáng)離子。在部分實(shí)施方式中，該二價(jià) 陽(yáng)離子選自Ca2\ Mg2+、 Cu2+、 Co2+、 Mn2+、 Ni2+、 Be2+、 Sr2+、 Ba2+、 Ra2+、Zn2+、 Cd2+、 Ag2+、 Pd2+、 Rh"及其組合。在部分實(shí)施方式中，該二價(jià)陽(yáng)離 子選自Ca2'、 Mg2+、 Cu2+、 Co2+、 Mr +及其組合。在部分實(shí)施方式中，該 組合物包含約1 mM至約100 mM,或約2 mM至約50 mM的二價(jià)陽(yáng)離子濃度。 本發(fā)明的部分方面涉及分離生物大分子的方法，其中該二價(jià) 陽(yáng)離子的添加使該生物大分子的回收率提高3%以上。在部分實(shí)施方式中， 該生物大分子的回收率被提高10%以上。 在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，通過過濾該組合物進(jìn)行該分 離，其中該過濾形成跨膜壓；且其中該跨膜壓在該過濾過程中保持基本恒定。 在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，所述組合物的pH被降低至pH 3.0至pH 5.0;該二價(jià)陽(yáng)離子選自Ca2+, Mg2+， Cu2+， Co2+, Mn2+或其組 合；通過過濾所述組合物進(jìn)行該分離；且該生物大分子為抗體。 在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在包含雜質(zhì)的組合物中純化 生物大分子的方法，該方法包括(a)降低所述組合物的pH; (b)向所述組合 物添加二價(jià)陽(yáng)離子，以及(c)在所述組合物中分離所述生物大分子和所述雜 質(zhì)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及澄清(clarifying)包含生物大分子和雜 質(zhì)的組合物的方法，該方法包括(a)降低所述組合物的pH; (b)向所述組合 物添加二價(jià)陽(yáng)離子，以及(c)在所述組合物中分離所述生物大分子和所述雜 質(zhì)。


圖1顯示了在pH為4.5、 5.75和7.1 (未調(diào)節(jié))時(shí)單克隆抗 體(Mab)細(xì)胞培養(yǎng)的顆粒大小分布的分析。當(dāng)pH為4.5時(shí)，直徑小于2.5 jxm 的顆粒的比例明顯下降，而直徑在2.5和6.0 pm之間的顆粒群有所增加。圖2^C表了在pH4.5 (圖2c) 、 5.75 (圖2b )和7.1 (圖2a)
下，以臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞的放大圖像。實(shí)驗(yàn)圖像顯示了低pH水平下染色
的提高。
『0019] 圖3顯示了細(xì)胞培養(yǎng)中上清液濁度與pH下降的函數(shù)。 一般 而言，由于細(xì)胞和顆粒的絮凝，較低pH水平下的濁度會(huì)下降。圖4代表了收獲原料(harvest feed)的pH調(diào)節(jié)對(duì)于上清液濁
后上清液的濁度。x軸代表了對(duì)收獲物質(zhì)的各種pH調(diào)節(jié)值。特別地，可 使用25% v/v乙酸或檸檬酸將收獲原料的pH調(diào)節(jié)至特定的pH,完成細(xì)胞 物質(zhì)的絮凝和沉降，并測(cè)量澄清上清液的濁度(澄清度)以獲得該數(shù)據(jù)。 圖4中的數(shù)據(jù)來自于包含不同重組蛋白(包括抗體和融合蛋白)的各種收 荻流(harvest streams)。該圖像顯示隨著調(diào)節(jié)后的收獲物質(zhì)的pH下降，上 清液的濁度也總體下降，表明在較低pH值下具有更澄清的上清液。這是 由于在較低pli下更高度的細(xì)胞絮凝導(dǎo)致了細(xì)胞物質(zhì)更快速的沉降。這種 絮凝和更快的沉降在接近膜表面提供了更好的物質(zhì)傳遞，從而提供了更有 效的微量過濾操作性能(參見圖12和圖13)。 圖5代表了不同pH水平對(duì)于從兩種單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)物中去 除宿主細(xì)胞蛋白(圖5a)和DNA (圖5b)的作用，該細(xì)胞培養(yǎng)物生成抗 體A和B。 x軸代表該細(xì)胞培養(yǎng)物的不同pH調(diào)節(jié)值。y軸代表了樣本中 殘留的宿主細(xì)胞蛋白或DNA的百分比(％)。
圖6代表了不同pH水平對(duì)于兩種不同的單克隆抗體A (圖 6a)和B (圖6b)的產(chǎn)品質(zhì)量和回收率影響。x軸代表了對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的 各種pH調(diào)節(jié)值。對(duì)于MabA圖像(圖6a)，方塊表示蛋白回收率，圓形 表示SEC單體，而三角形表示IRC主同工型。對(duì)于MabB圖像(圖6b), 菱形表示蛋白回收率，x表示SEC單體，而圓形表示IEC主同工型。 圖7代表了不同pH水平對(duì)于微量過濾性能的作用。x軸代 表了對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的各種pH調(diào)節(jié)值。x代表了宿主細(xì)胞蛋白的濃度百分 比，星型代表了DNA濃度，實(shí)心三角代表了濁度，空心三角代表了 SEC 單體，而星號(hào)代表了 IEC主同工型。 圖8代表了不同pH水平對(duì)于微量過濾后單克隆抗體A的產(chǎn) 率的作用。由于膜污染，未能在5.5以上的pH水平下進(jìn)行測(cè)量。圖9代表了不同pH水平對(duì)于離心后分離單克隆抗體B的作 用。菱形代表了抗體B的回收率，方塊代表了宿主細(xì)胞蛋白濃度，三角代 表了DNA濃度，加號(hào)(+)代表了濁度測(cè)量值，圓形(O)代表了 SEC單體， 而x代表了 IEC主同工型。 圖10顯示了微量過濾系統(tǒng)的示意圖。該系統(tǒng)操作的目的在 于在層析純化前從細(xì)胞培養(yǎng)物中去除細(xì)胞和其它碎片。采用微過濾器(公 稱孔徑0.2 - 0.65(im )以橫流形式(收獲原料和滯留流與膜表面平行流動(dòng)) 進(jìn)行澄清。該系統(tǒng)包括使原料循環(huán)通過微量過濾(MF)筒的蠕動(dòng)泵；然而， 還可使用其它的泵，例如凸葉轉(zhuǎn)子或隔膜泵。在過濾中，監(jiān)測(cè)經(jīng)過時(shí)間、 滲透流重量以及筒入口、出口和滲透流壓力。在將細(xì)胞培養(yǎng)的條件化培養(yǎng) 基濃縮5-7倍后，進(jìn)行與緩沖液(pH與收獲原料pH類似)恒定體積滲濾， 以回收多數(shù)剩余產(chǎn)物u從系統(tǒng)中以恒定的流速吸出滲透流，并收集入容器中。該操作可在2-26。C之間的溫度下進(jìn)行。該原料容器包含未調(diào)節(jié)或pH 調(diào)節(jié)的收獲原料，并進(jìn)行攪拌以防止細(xì)胞沉降。 圖11顯示了計(jì)算跨越該微過濾器的跨模壓降(TMP)的方法。 該TMP可在該收獲原料、滯留流和滲透流側(cè)測(cè)得的壓力計(jì)算得到。該壓 力測(cè)量可采用針端壓力計(jì)、數(shù)字計(jì)量器或壓力傳感器進(jìn)行。圖12代表了 pH調(diào)節(jié)對(duì)于微量過濾操作性能的作用。y軸代 表了使用0.65 pm孔徑中空顯微過濾器時(shí)以psi計(jì)的微量過濾器平均跨膜 壓差(TMP); x軸代表在膜上裝載的收獲原料體積與膜面積的比例(L/m2)。 用于該微量過濾實(shí)驗(yàn)的該收獲原料包含生成糖基化人源化單克隆抗體 (IgG)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。圖12的圖例顯示了不同pH調(diào)節(jié)的收獲流的 數(shù)據(jù)以及不同比例細(xì)胞活力。該圖顯示從中性生物反應(yīng)器條件下降至 4.7-5.3的pH的收獲原料的過濾相比保持在6.8和7.2的pH范圍的未調(diào)節(jié) 收獲原料的過濾在過濾器上產(chǎn)生了更低的總體跨模壓。該數(shù)據(jù)顯示降低收 獲流的pH可減少設(shè)定滲透通量下過濾器的積垢(顯示為高裝載下的較低 TMP),從而帶來了更強(qiáng)健的微量過濾操作。圖13代表了 pH調(diào)節(jié)對(duì)于微量過濾操作性能的作用，其與 圖12類似，但針對(duì)另一單克隆抗體。y軸代表了使用0.65pm孔徑中空顯 微過濾器時(shí)以psi計(jì)的微量過濾器平均跨膜壓差(TMP); x軸代表在膜上裝 栽的收獲原料體積與膜面積的比例(L/m2)。用于該微量過濾實(shí)驗(yàn)的該收獲 原料包含生成分化良好的人源化單克隆抗體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。圖13 的圖例顯示了不同pH調(diào)節(jié)的收獲流的數(shù)據(jù)以及不同比例細(xì)胞活力。該圖 顯示從中性生物反應(yīng)器條件下降至4.7-5.2的pH的收獲原料的過濾相比保 持在6.8和7.2的pH范圍的未調(diào)節(jié)收獲原料的過濾在過濾器上產(chǎn)生了更低 的總體跨模壓。該數(shù)據(jù)顯示降低收獲流的pH可減少設(shè)定滲透通量下過濾器的積垢(顯示為高裝載下的較低TMP)。這帶來了更強(qiáng)健的微量過濾操作。 圖14代表了 pH變化和不同二價(jià)陽(yáng)離子的存在對(duì)于條件化 收獲流中產(chǎn)物蛋白效價(jià)的影響。y軸代表了產(chǎn)物效價(jià)，歸一化至pH7.0收 獲且未添加陽(yáng)離子時(shí)的效價(jià)。x軸代表了在不同pH值(pH7、 5或4)和 二價(jià)陽(yáng)離子類型時(shí)不同生物大分子的收獲流。融合蛋白的數(shù)據(jù)顯示了在 pH 5時(shí)添加Co"可將該融合蛋白保留在溶液中或排除與絮凝細(xì)胞和細(xì)胞 碎片的可能蛋白共沉淀物?？贵w的數(shù)據(jù)顯示了在pH 5時(shí)添加Mg"或Ca2+ 可將該抗體保留在溶液中或排除與絮凝細(xì)胞和細(xì)胞碎片的可能共沉淀物。 圖16代表了向收獲原料添加不同陽(yáng)離子后調(diào)節(jié)為pH5對(duì)于 收獲的作用。y軸顯示了基于添加離子存在或未存在時(shí)的未調(diào)節(jié)收獲流的 蛋白損失百分比。圖左邊第一欄代表了在收獲pH調(diào)節(jié)為pH5.0且不添加 任何二價(jià)離子時(shí)損失14%的蛋白(由于沉淀)。其余欄代表了在不同二價(jià) 陽(yáng)離子存在時(shí)額外的蛋白損失(>14%)或蛋白生成恢復(fù)(< 14%)。該數(shù)據(jù)顯 示各種過渡金屬離子(例如N產(chǎn)，Ca2+， Mg2+, Mn"和Co")的存在可提 高蛋白回收率。 圖17代表了 CoCl2濃度對(duì)于從以25%乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0的 收獲流的蛋白效價(jià)回收率的作用。y軸代表了在不同CoCh水平下pH調(diào)節(jié)的收獲流的蛋白損失百分比。x軸代表了調(diào)節(jié)為pH5.0的收獲流中存在 的CoCl2的濃度(mM)。該數(shù)據(jù)顯示隨著0)2+離子濃度上升，蛋白產(chǎn)物的損 失百分比由于pH誘導(dǎo)的沉淀而下降。顯示了融合蛋白的平衡濃度為10 mM。 圖18代表了本發(fā)明的方法對(duì)于過濾器蛋白去除率(filter protein rejection)禾口總體澄清回4史率(overa11 clarification recovery)的4乍用。y 軸代表了由保持系數(shù)(R)定義的即時(shí)過濾器蛋白去除率。x軸代表了包含該 目標(biāo)生物大分子的組合物的澄清操作中的體積通量。圖中顯示了四個(gè)單獨(dú) MF實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)由空心和實(shí)心三角顯示的試驗(yàn)(runs)代表了調(diào)節(jié)為pH5.0 且添加了 10mMCoCb的收獲流；而由空心和實(shí)心圓圈顯示的試驗(yàn)代表了 未調(diào)節(jié)且未添加CoCl2的收獲流。該數(shù)據(jù)顯示對(duì)于所有研究的裝載比例， pH調(diào)節(jié)的含有10 mM CoCl2的收獲原料的MF保持系數(shù)更低。該數(shù)據(jù)顯 示與使用未調(diào)節(jié)收獲原料的試驗(yàn)的20%產(chǎn)率損失相比，含有Co"二價(jià)離子 的試驗(yàn)顯示了目標(biāo)蛋白的完全回收率。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及在包含雜質(zhì)的組合物中分離生物大分子的方法， 該方法包括(a)降低該組合物的pH, (b)向該組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子，以及 (c)從該雜質(zhì)中分離該生物大分子。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從具有初始高密度 生物物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中分離(通過過濾)工業(yè)規(guī)模數(shù)量的 抗體時(shí)，過濾器的跨膜壓降明顯增加，推測(cè)這可能是由于高濃度細(xì)胞物質(zhì) 在膜表面的積垢。過濾器積垢的增加進(jìn)而負(fù)面影響了回收抗體的數(shù)量，降 低了澄清產(chǎn)率，并導(dǎo)致滲透流中相對(duì)更高的雜質(zhì)水平。在部分情況下，跨 膜壓上升至超越該過濾器機(jī)械耐受力的值，從而引起完成前的操作停止， 并導(dǎo)致明顯更低的產(chǎn)物產(chǎn)率。
為了減少過濾器跨膜壓，提高滲透流中的蛋白回收率，并減 少滲透流中的雜質(zhì)數(shù)量，本發(fā)明的方法在過濾前降低了收獲流的pH,引 起大細(xì)胞和細(xì)胞碎片的絮凝以及其它雜質(zhì)(例如DNA)的沉淀。據(jù)發(fā)現(xiàn) 雜質(zhì)(細(xì)胞，細(xì)胞碎片和DNA)絮凝為較大顆粒提高了接近該過濾器表 面的組合物的物質(zhì)傳遞， >>人而減少了在預(yù)定滲透流通量和流速下跨越該過 濾器的跨膜壓。此外，通過降低收獲流pH引起的雜質(zhì)的共沉淀導(dǎo)致了這 些雜質(zhì)在過濾器上更好的滯留，從而減少了滲透流中的雜質(zhì)水平。 據(jù)發(fā)現(xiàn)降低該組合物的pH可誘導(dǎo)收獲原料中目標(biāo)抗體的沉 淀，導(dǎo)致目標(biāo)抗體被膜滯留，從而減少了滲透流中目標(biāo)抗體的數(shù)量。本發(fā) 明的方法進(jìn)一步包括在過濾前向pH調(diào)節(jié)的收獲原料添加二價(jià)陽(yáng)離子以選 擇性減少該抗體的共沉淀，增加從滲透流中回收的抗體數(shù)量，同時(shí)不影響
雜質(zhì)的數(shù)量。 本發(fā)明的方法可用于在組合物中分離生物大分子和雜質(zhì)。示 范性的生物大分子(例如，抗體，重組蛋白，融合蛋白等)在低pH和二 價(jià)陽(yáng)離子的存在下具有類似的溶解度屬性。 術(shù)語(yǔ)"分離"指在組合物中將生物大分子與至少 一種其它不 需要的成分或雜質(zhì)分離。術(shù)語(yǔ)"分離"包括"純化"和"澄清"。對(duì)于生物大分 子不要求特定的分離水平，然而在部分實(shí)施方式中，至少50%, 70%, 80%, 90%或95% (w/w)的雜質(zhì)與該生物大分子相分離。例如，在部分實(shí)施方式中，生物大分子的分離包括將該生物大分子與組合物中原始存在的80%的
HCP相分離。 術(shù)語(yǔ)"澄清"指從組合物中去除大顆粒。例如，在應(yīng)用于細(xì)胞 培養(yǎng)物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基時(shí)，術(shù)語(yǔ)"澄清"指，例如，從細(xì)胞培養(yǎng)物中去除原核 和真核(例如，哺乳動(dòng)物)細(xì)胞、脂質(zhì)和/或核酸(例如，染色體和質(zhì)粒 DNA)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括(a)降低該組合物的pH， 允許雜質(zhì)在該組合物中絮凝，(b)向該組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子，和(c)將生物 大分子與組合物中的雜質(zhì)相分離。對(duì)于雜質(zhì)不要求特定的絮凝水平，然而 在部分實(shí)施方式中，至少50%, 70%, 80%, 90%或95% (w/w)的雜質(zhì)被 絮凝。例如，在部分實(shí)施方式中，生物大分子的澄清包括絮凝組合物中存 在的80%的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。絮凝可通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行檢測(cè)，包括 分光光度法，例如濁度計(jì)。 術(shù)語(yǔ)"純化，，指不考慮雜質(zhì)的大小，將本發(fā)明的生物大分子與 組合物中的各種大小的雜質(zhì)或其它污染物相分離。因此，術(shù)語(yǔ)分離將包括 "澄清，，，但它還包括進(jìn)一步分離比澄清過程中去除的大小更小的雜質(zhì)，例 如，蛋白、脂質(zhì)、核酸以及其它形式的細(xì)胞碎片、病毒碎片、污染細(xì)菌碎 片、培養(yǎng)基成分，等等。對(duì)于生物大分子不要求特定的純化水平，然而在 部分實(shí)施方式中，至少50%, 70%, 80%, 90%或95% (w/w)的雜質(zhì)從該 生物大分子純化分離。例如，在部分實(shí)施方式中，生物大分子的純化包括 將該生物大分子與組合物中原始存在的80%的HCP相分離。
此處所用的術(shù)語(yǔ)"生物大分子"指可從有機(jī)體或其它生物培 養(yǎng)物(例如，真核(例如，哺乳動(dòng)物)細(xì)胞培養(yǎng)物或原核(例如，細(xì)菌) 細(xì)胞培養(yǎng)物)中分離的分子量超過lkDa的分子。在部分實(shí)施方式中，該 術(shù)語(yǔ)表示聚合物，例如，核酸(例如DNA， RNA)、多肽(例如，蛋白)、 碳水化合物和糖等生物聚合物。在部分實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)"生物大分子"指蛋白。在部分實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)"生物大分子，，指重組蛋白或融合蛋白。 在部分實(shí)施方式中，該蛋白為可溶性蛋白。在部分實(shí)施方式中，該生物大 分子為抗體，例如，單克隆抗體。 此處所用的術(shù)語(yǔ)"蛋白"意在包括單數(shù)和復(fù)數(shù)的"蛋白"。因 此，此處所用的術(shù)語(yǔ)"蛋白"包括，但不限于"肽"、"多肽"、"氨基酸鏈"或 任何其它用來指代氨基酸鏈的術(shù)語(yǔ)，且術(shù)語(yǔ)"蛋白"可用來取代任何上述術(shù) 語(yǔ)或與之互換。該術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步包括進(jìn)過翻"^后修飾(例如，糖基化、乙酰 化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生化、蛋白水解裂解或 通過非天然存在的氨基酸進(jìn)行修飾)的蛋白。蛋白還包括形成多聚體(例 如，二聚體、三聚體等)的多肽。術(shù)語(yǔ)蛋白還包括融合蛋白，例如，通過 將蛋白(或蛋白片段)連接至抗體(或抗體片段)基因融合方法生成的蛋 白。本發(fā)明的融合蛋白的范例包括包含連接人IgGl和人IgE的Fc區(qū)與淋 巴毒素beta受體免疫球蛋白Gl的二硫鍵連接的雙功能蛋白。
抗體可參照本發(fā)明的方法進(jìn)行純化。術(shù)語(yǔ)"抗體"指多克隆、 單克隆、多特異性、人源、人源化或嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab')2 片段，通過Fab表達(dá)庫(kù)生成的片段，抗個(gè)體基因型(抗-ld)抗體(包括， 例如，針對(duì)本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)，以及任意上述抗體的表位結(jié)合片 段。在部分實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)"抗體"指單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)"抗體"還指免 疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特異性結(jié) 合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法進(jìn)行純化的免疫球蛋 白分子可以是免疫球蛋白分子的任意類型(例如，IgG， IgE, IgM， IgD, IgA和IgY),類別(例如，IgGl, IgG2， IgG3和IgG4)和小類。本發(fā) 明的抗體包括嵌合、單鏈和人源化抗體。本發(fā)明的抗體的范例包括商業(yè)化 的抗體，例如natalizmab (人源化抗-a4整聯(lián)蛋白單克隆抗體)，人源化抗 -Alpha V Beta 6單克隆抗體，人源化抗-VLAl IgGl kappa單克隆抗體， huB3F6 (人源化IgGl/kappa單克隆抗體)。
通過本發(fā)明的方法純化的抗體可來自包括鳥類和哺乳動(dòng)物 的任何動(dòng)物來源。優(yōu)選地，該通過本發(fā)明的方法純化的抗體來自于人、鼠 (例如，小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬和雞。此 處所用的"人源"抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，并包括 從人免疫球蛋白庫(kù)或經(jīng)轉(zhuǎn)基因生成一種或多種人免疫球蛋白且不表達(dá)內(nèi) 源性免疫球蛋白的動(dòng)物中分離得到的抗體。令人，參見Kucherlapati等人 的美國(guó)專利5,939,598。在部分實(shí)施方式中，該抗體包括，但不限于，IgGl, 1gG2， lgG3和IgG4抗體，包括商業(yè)化抗體，例如natalizmab(TYSBARM), Elan Pahrmaceuticals, San Diego ， CA)。
可通過本發(fā)明的方法進(jìn)行純化的抗體包括，例如，天然抗體， 完整單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體)，抗體片段(例如，結(jié)合和/或識(shí)別一種或多種抗 原的抗體片段)，人源化抗體，人源抗體(Jakobovits等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993);， Jakohovites等人，Nature 362:255-258(1993); Bruggermann等人.，Year in Immunol. 7:33 (1993);美國(guó)專利5,591,669和 5,545,807)，從抗體噬菌體庫(kù)分離的抗體和抗體片段(McCafferty等人.， Nature 348:552-554 (1990); Clackson等人，Nature 352:624-628 (1991); Marks等人,J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Marks等人,Bio/Technology 10:779-783 (1992); Waterhouse等人，Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993))。通過本發(fā)明的方法純化的抗體可在N-或C-末端重組融合至外源 多肽或化學(xué)結(jié)合(包括共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合)至多肽或其它組合物。例如， 通過本發(fā)明方法純化的抗體可重組融合或結(jié)合至可用于檢測(cè)測(cè)定標(biāo)記的 分子或外源多肽，藥物，或毒素等效應(yīng)分子。例如，參見PCT公布WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624;美國(guó)專利5，314，995和EP 396,387。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物大分子或組合物是藥學(xué)可 接受的。"藥學(xué)可接受的"指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適于與人類和動(dòng)物的組織接觸，沒有過度的毒性或其他并發(fā)癥，相應(yīng)具有合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比例 的生物大分子或組合物。 在部分實(shí)施方式中，該生物大分子為可溶性蛋白。術(shù)語(yǔ)"可 溶性"指蛋白基本定位于細(xì)胞宿主中的親水或水性環(huán)境(例如，細(xì)胞質(zhì)、 外周質(zhì)或胞外基質(zhì))的傾向性。因此，在細(xì)胞組分分離中，可溶性蛋白通 常會(huì)基本隨宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、外周質(zhì)或胞外成分進(jìn)行分離。在部分實(shí)施 方式中，可溶性蛋白在清潔劑缺失時(shí)是水溶性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理 解多肽的細(xì)胞定位或蛋白的細(xì)胞組分分離均不是絕對(duì)的。因此，短語(yǔ)"基 本定位于"指50%， 70%, 75%, 80%, 85%, 90%， 95%或99%的蛋白在 指定的細(xì)胞位置，例如，細(xì)胞質(zhì)、外周質(zhì)或胞外基質(zhì)。 本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)"組合物"指本發(fā)明的一種或多種生物大分 子和可選的至少一種雜質(zhì)的混合物，其中該雜質(zhì)和該生物大分子不相同。 在部分實(shí)施方式中，該組合物包含生物大分子，細(xì)胞宿主有機(jī)體(例如， 哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，足以使該宿主有機(jī)體繁殖并允許該目標(biāo)生物大分子的表 達(dá)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇和使用已為本領(lǐng)域所知。在部分實(shí)施 方式中，該生長(zhǎng)培養(yǎng)基為細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)可根據(jù)被繁殖的細(xì)胞 培養(yǎng)物的類型而不同。在部分實(shí)施方式中，該細(xì)胞培養(yǎng)基為市售的培養(yǎng)基。 在部分實(shí)施方式中，該組合物包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含，例如， 無機(jī)鹽，碳水化合物(例如，葡萄糖、半乳糖、麥芽糖或果糖等糖)，氨 基酸，維生素(例如，B族維生素(如B12)、維生素A、維生素E，核 黃素，硫胺素和生物素)，脂肪酸和脂質(zhì)(例如，膽固醇和類固醇)、蛋 白和肽(例如，白蛋白、鐵傳遞蛋白、纖連蛋白和胎球蛋白)，血清(例 如，包含白蛋白、生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)抑制劑的組合物，例如，胎牛血清、新 生小牛血清和馬血清)，痕量元素(例如，鋅、銅、硒和三羧酸中間體) 及其組合。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的范例包括，但不限于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如，MEM， DMEM, GMEM)，復(fù)合培養(yǎng)基(RPMI 1640, IscovesDMEM, LeibovitzL- 15, LeibovitzL- 15， TC 100)和無血清培養(yǎng)基(例如，CHO， HamFlO 及衍生物，HamF12, DMEM/F12)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的常見緩沖液包括PBS， Hanks BSS, Earles鹽，DPBS， HBSS， EBSS。培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng) 基已為本領(lǐng)域公知，并可從，例如Sigma- Aldrich Corporation (St. Louis, MO), HyClone (Logan, UT), Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA)， Cambrex Corporation (E. Rutherford, NJ)， JRH Biosciences (Lenexa, KS), Irvine Scientific (Santa Ana, CA)和其他公司獲得。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的其它成分包括 抗壞血酸、檸檬酸鹽、半胱氨酸/胱氨酸、谷氨酰胺、葉酸、谷胱甘肽、亞 油酸、亞麻酸、疏辛酸、油酸、棕櫚酸、吡。多醛/吡。多醇、核黃素、硒、硫 胺素、鐵傳遞蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明的范圍內(nèi)可對(duì)生 長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行改良。 在部分實(shí)施方式中，該組合物進(jìn)一步包含收獲原料。術(shù)語(yǔ)"收 荻原料"指收獲前一刻細(xì)胞所存在的培養(yǎng)基，或收獲后收獲細(xì)胞被立即放 入的、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基。收獲原料可包含上述列舉的任意組合物，例如 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，或其它適于重懸浮該收獲細(xì)胞或細(xì)胞組分的培養(yǎng)基。例如， 在部分實(shí)施方式中，該收獲培養(yǎng)基可包含水、緩沖液、滲透劑、抗降解劑 等。 術(shù)語(yǔ)"雜質(zhì)，，指不同于本發(fā)明的生物大分子的一種或多種組 合物成分。在部分實(shí)施方式中，該雜質(zhì)可包括完整的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如， 中國(guó)倉(cāng)鼠卯巢細(xì)胞(CHO纟田月包)或鼠骨髓瘤細(xì)胞(NSO細(xì)胞))或部分 細(xì)胞，例如，細(xì)胞碎片。在部分實(shí)施方式中，該雜質(zhì)包含了蛋白(例如， 可溶性或不溶性蛋白、或蛋白片段，例如HCP)、脂質(zhì)(例如，細(xì)胞壁物 質(zhì))、核酸(例如，染色體或染色體外DNA )、核糖核酸(t-RNA或mRNA ) 或其組合，或任意其它不同于目標(biāo)生物大分子的細(xì)胞碎片。在部分實(shí)施方
雜質(zhì)可以是表達(dá)目標(biāo)蛋白的原核或真核細(xì)胞(例如，細(xì)胞壁、細(xì)胞蛋白、DNA或RNA等)的細(xì)胞成分。在部分實(shí)施方式中，該雜質(zhì)不是來自于宿 主有機(jī)體，例如，雜質(zhì)可來自于細(xì)胞培養(yǎng)基或生長(zhǎng)培養(yǎng)基、緩沖液或培養(yǎng) 基添加劑。此處所用的雜質(zhì)包括單個(gè)不需要的成分，或者多個(gè)不需要的成 分的組合。 本發(fā)明的生物大分子可從包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基和各種真核細(xì)胞 (例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到。本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞，包括可用于本發(fā)明的方法的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是能夠在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的 任意哺乳動(dòng)物細(xì)胞。示范性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括，例如，CHO細(xì)胞(包括 CHO陽(yáng)Kl, CHODUKX-Bll， CHODG44)， VERO， BHK, HeLa, CV1(包 括Cos; Cos-7)， MDCK， 293， 3T3， C127，骨髓癌細(xì)胞系(特別是鼠源)， PC12， HEK-293細(xì)月包(包括HEK畫293T和HEK-293E), PER C6， Sp2/0， NSO以及W138細(xì)胞。也可使用由任意前述細(xì)胞獲得的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 本發(fā)明的生物大分子可從包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基和各種原核細(xì)胞， 例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌和各種假單胞屬的物 種，例如，銅綠假單胞菌，酵母細(xì)胞，例如酵母屬、畢赤酵母屬、漢森(氏) 酵母屬、克魯維酵母菌屬、裂殖酵母屬、許旺酵母屬以及亞羅酵母屬，昆 蟲細(xì)月包，例如，粉紋夜蛾、Z^ ,'^ tem、 5^c^to/^era、果錄和5/9，或者植 物細(xì)胞，例如Arabidopsis的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 可根據(jù)目標(biāo)生物大分子選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系。 在本發(fā)明中，該組合物的pH被調(diào)節(jié)至低于收獲原料的pH。 本發(fā)明的組合物(例如，包含收獲原料的組合物)在未調(diào)節(jié)時(shí)通常具有約 6.0至約8.0，約6.5至約7.5或約6.8至約7.2的pH。在部分實(shí)施方式中， 任意低于收獲原料pH的pH可被用于本發(fā)明的分離。在部分實(shí)施方式中， 該組合物的pH被降低至約1.0至約6.0、約2.0至約5.5、約3.0至約6.5、 約3.0至約5.0、約4.0至約5.0、約4.0至約4.7、約4.3至約5.0或約4.7至約5.0的pH范圍。在部分實(shí)施方式中，該組合物的pH被降低至約4.0 至約4.7的范圍。在部分實(shí)施方式中，該pH可被降低至約3.5的pH。對(duì) 于部分生物大分子，低于3.5的pH導(dǎo)致目標(biāo)生物大分子的變形或不穩(wěn)定， 因此不被采用。不希望受限于任何理論，在部分實(shí)施方式中，該收獲原料 pH的降低使得一種或多種該組合物的成分(主要是細(xì)胞和細(xì)胞碎片)的 絮凝。在部分實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞DNA被絮凝，使得目標(biāo)生物大分子 的分離更為容易和/或更為有效。在部分實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞蛋白被絮凝， 使得目標(biāo)生物大分子的分離更為容易和/或更為有效。在部分實(shí)施方式中， 其中過濾被用于分離該生物大分子，聚集的大顆粒減少了過濾器孔的積 垢，從而帶來了更大的過濾效率，更低的跨膜壓，以及更高的通過量。在 部分實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過降低pH分離生物大分子的方法。 本發(fā)明的組合物的pH可通過多種手段調(diào)節(jié)。在部分實(shí)施方 式中，可通過向該組合物添加酸降低該pH。適當(dāng)?shù)乃岚ǎ幌抻冢?強(qiáng)酸，例如高氯酸(HC104),氫碘酸(ffl.),氫溴酸(HBr)，氫氯酸(HC1)，硝 酸(麗03),硫酸(雙質(zhì)子)(H2S04)，或者弱酸，如醋酸(CH3COOH)(例 如，冰醋酸)，檸檬酸(C6H.807)，曱酸(HCOOH)，氰酸(HCN)，硫酸氫離 子(HSCV)或任意上述酸的組合。在部分實(shí)施方式中，該組合物的pH可通 過使用緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如可用磷酸鹽緩沖液(例如，磷酸鈉和磷酸鉀)， 重碳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液，醋酸鹽緩沖液，氨基 丁三醇緩沖液，HEPES緩沖液，及其組合。 不希望受限于任何理論，在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，酸 pH的降低幫助聚集大的雜質(zhì)顆粒，從而減少"積垢"，即，過濾器的孔的 堵塞和填充。增多的過濾器積垢可負(fù)面影響滲透流中目標(biāo)生物大分子的回 收率，導(dǎo)致較低的澄清產(chǎn)率和滲透流中相對(duì)更高的雜質(zhì)水平。在部分情況 下，該過濾器的積垢增加了跨膜壓。該過濾器的積垢可使跨膜壓值上升至 超越該過濾器的機(jī)械耐受力，從而引起該過濾器操作在完成前終止，并導(dǎo)致明顯更低的產(chǎn)物回收率。因此，在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過降 低組合物的pH在該組合物中分離更大數(shù)量或體積的生物大分子的方法。
在部分實(shí)施方式中，該pH的下降可增加所回收的生物大分子的純度和質(zhì)
量 在部分實(shí)施方式中，該組合物的pH的下降導(dǎo)致目標(biāo)生物大 分子和雜質(zhì)的共沉淀，從而減少了胞外基質(zhì)中生物大分子的回收率。本發(fā) 明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在部分實(shí)施方式中，向pH調(diào)節(jié)的組合物中添加二價(jià)陽(yáng) 離子適于提高目標(biāo)生物大分子的回收率。術(shù)語(yǔ)"提高的回收率"指本發(fā)明的 方法與不添加二價(jià)陽(yáng)離子的相同純化方法的比較。例如，如果方法A是本 發(fā)明的方法(除了未向收獲原料添加二價(jià)陽(yáng)離子)，并獲得100 mg的目 標(biāo)生物大分子，而方法B與方法A —致(除了方法B向收獲原料添加二 價(jià)陽(yáng)離子外)，并獲得了 U0mg的生物大分子，則可認(rèn)為方法B"提高的 回收率"為10%。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法將生物大分子的回收 率才是高了3%, 4%, 5%, 6%， 7%, 8%, 9%， 10%, 15%, 20%或25%以 上。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法將回收率提高至10%, 15%, 20%, 25%， 30%或50%。 在本發(fā)明中，向該組合物添加了二價(jià)陽(yáng)離子。本領(lǐng)域已知存 在多種二價(jià)陽(yáng)離子，并包括，例如4丐陽(yáng)離子(Ca2—、鎂陽(yáng)離子(Mg,，銅陽(yáng) 離子(Cu2、鈷陽(yáng)離子(Co2、錳陽(yáng)離子(Mn2、鎳陽(yáng)離子(N產(chǎn))，鈹陽(yáng)離子 (Be2+),鍶陽(yáng)離子(Sn24)，鋇陽(yáng)離子(Ba24)，鐳陽(yáng)離子(Ra2+),鋅陽(yáng)離子(Zn2—), 鎘陽(yáng)離子(Cd2—),銀陽(yáng)離子(Ag2、鈀陽(yáng)離子(Pd2+)，銠陽(yáng)離子(Rh")及其 組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到該陽(yáng)離子可以鹽的形式存在，例如，鈣鹽 (如CaCl2 )可在置于水溶液中時(shí)生成鉀陽(yáng)離子。因此，此處所用的短語(yǔ)"添 加二價(jià)陽(yáng)離子"將不僅包括添加帶電狀態(tài)的陽(yáng)離子，也包括添加可在導(dǎo)入
本發(fā)明的組合物后生成二價(jià)陽(yáng)離子的鹽或其它化合物。在部分實(shí)施方式 中，該二價(jià)陽(yáng)離子為Q)2+或Ni2+,或它們的鹽(例如，CoCl2, NiCl2,， CaCl2，MnCl2， MgCl2和CuCl2)，或一種或多種這些離子或鹽的組合。可以預(yù)計(jì)
特定的二價(jià)陽(yáng)離子會(huì)更適于不同的生物大分子。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 輕易和快速地測(cè)試多種二價(jià)陽(yáng)離子以確定何者可實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)生物大分子
的最大回收率。 本發(fā)明中可在該組合物中使用各種濃度的二價(jià)陽(yáng)離子。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在收獲原料中通?？缮倭看嬖诓煌瑪?shù)量的二價(jià)陽(yáng)離 子(內(nèi)源性二價(jià)陽(yáng)離子)，且不同數(shù)量的二價(jià)陽(yáng)離子可根據(jù)本發(fā)明被添加 至收獲原料(外源性二價(jià)陽(yáng)離子)。在部分實(shí)施方式中，該二價(jià)陽(yáng)離子的 濃度同時(shí)包含外源性和內(nèi)源性陽(yáng)離子。然而，處于實(shí)際目的，由于內(nèi)源性 二價(jià)陽(yáng)離子的數(shù)量與外源性二價(jià)陽(yáng)離子相比較'j、 ， 二價(jià)陽(yáng)離子濃度計(jì)算時(shí) 可僅考慮外源性二價(jià)陽(yáng)離子。在部分實(shí)施方式中，該組合物中的二價(jià)陽(yáng)離 子在組合物中以約0.01 mM至約1M的濃度存在。在部分實(shí)施方式中，該 二價(jià)陽(yáng)離子在組合物中以約0.1 mM至約500 mM,或約0.5 mM至約200 mM,約1.0 mM至約100 mM，約2 mM至約50 mM,約5 mM至約15 mM, 或約2 mM至約20 mM的濃度存在。在部分實(shí)施方式中，該二價(jià)陽(yáng)離子 在組合物中以約10 mM的濃度存在。不希望受限于任何方法論，可通過 類似于實(shí)施例14中的方法確定二價(jià)陽(yáng)離子的適當(dāng)濃度，其中不同濃度的 二價(jià)陽(yáng)離子被添加至pH調(diào)節(jié)的包含生物大分子的組合物，然后測(cè)定回收 最大量生物大分子時(shí)的最低濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，對(duì)于不同的 生物大分子可能要求不同濃度的陽(yáng)離子。 可采用不同的手段從一種或多種雜質(zhì)分離本發(fā)明的生物大 分子。從雜質(zhì)分離生物大分子的手段的范例包括，不限于，沉淀、免疫沉 淀、層析、過濾、離心及其組合。在部分實(shí)施方式中，通過過濾器實(shí)現(xiàn)該 生物大分子從該雜質(zhì)的分離。術(shù)語(yǔ)"過濾"指使組合物通過一個(gè)或多個(gè)具有 特定孔徑的半透膜(或介質(zhì))以去除組合物中的懸浮顆粒的方法。在涉及 過濾時(shí)，術(shù)語(yǔ)"滲透流"指在過濾中通過該過濾器孔的組合物的組分。在涉及過濾時(shí)，術(shù)語(yǔ)"滯留流"指在過濾中保留在過濾器上或未通過該過濾器孔 的組合物的組分。在部分實(shí)施方式中，在過濾后，本發(fā)明的生物大分子基 本存在于滲透流中(即，它通過了過濾器孔并被收集)，而雜質(zhì)(例如，
細(xì)胞碎片、DNA和/或HCP)基本存在于滯留流中。在部分實(shí)施方式中， 在過濾后本發(fā)明的生物大分子基本存在于滯留流中，而雜質(zhì)基本存在于滲 透流中。在部分實(shí)施方式中，可通過"小試規(guī)模"過濾預(yù)測(cè)用于工業(yè)規(guī)模過 濾的適當(dāng)條件。用于純化特定生物大分子的適當(dāng)?shù)倪^濾器類型、化學(xué)品和模 塊結(jié)構(gòu)已為本領(lǐng)域所知，并可基于各種因素進(jìn)行選擇，例如，待過濾的組 合物成分的數(shù)量和大小，待過濾的組合物的體積，以及待過濾的組合物的 細(xì)胞密度和活性。在部分實(shí)施方式中，可使用如膜過濾器、板式過濾器、 筒式過濾器、袋式過濾器、加壓葉片過濾器、轉(zhuǎn)鼓過濾器或真空過濾器等 過濾器。在部分實(shí)施方式中，可使用厚度過濾器或錯(cuò)流過濾器?？稍诒景l(fā) 明中使用的橫流過濾器模塊包括中空纖維、管狀、平板狀(板框式)、螺 旋纏繞式或渦流式(例如，旋轉(zhuǎn))過濾器結(jié)構(gòu)。在部分實(shí)施方式中，可使 用切向流過濾器。在部分實(shí)施方式中，在切向流(橫流)模式中采用了中 空纖維、管狀和平片膜模塊?？晒┦褂玫氖惺圻^濾器由多家生產(chǎn)商生產(chǎn)， 例^口, Mllipore Corporation (Billerica, MA), Pal 1 Corporation (East Hills, NY), GE Healthcare Sciences (Piscataway, NJ), 以及Sartorius Corporation (Goettingen,德國(guó))。 本發(fā)明的過濾器中的孔徑可根據(jù)被分離的生物大分子的類 型以及組合物中存在的雜質(zhì)的類型而變化。在部分實(shí)施方式中，該過濾器 孔徑可以是0.1 至1.0 jxm、 0.2pm至0.8jxm或0.2pm至0.65jxm。 組合物(例如收獲流)在過濾過程中運(yùn)動(dòng)通過過濾器由于膜 阻力而形成了跨膜壓。由于膜表面被細(xì)胞物質(zhì)積聚(或極化)，對(duì)于恒定流速下的跨膜流動(dòng)的阻力增加，從而導(dǎo)致驅(qū)動(dòng)力或跨膜壓增加。如果減少 接近膜表面的細(xì)胞物質(zhì)數(shù)量，或如果減少膜的極化，則跨膜壓傾向于保持 基本恒定。計(jì)算跨膜潛力的方法已為本領(lǐng)域所知，并包括使用壓力傳感器 或計(jì)量器。在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，可通過平均原料和滯留流出口壓
和滲透流壓的差異計(jì)算跨膜壓。圖8顯示了跨膜壓計(jì)算的圖解。 —^t而言，在未進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的組合物(例如，收獲原料) 過濾過程中，隨著更多的組合物被裝載到過濾器上，過濾器的跨膜壓明顯 增加。例如，在部分實(shí)施方式中，由于過濾器的孔被逐漸堵塞，從過濾過 程開始(第一批組合物被放置在過濾器上)到過濾過程結(jié)束(通常得到 7-10x的細(xì)胞物質(zhì)濃度和3-5x的滲濾液濃度)，跨膜壓上升5psi、 7psi、 10psi、 15 psi或20psi或更高。例如，如圖12 (原料組合物A)和圖13 (原料組合物A )所示，未進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的收獲原料溶液的過濾過程中跨 膜壓從剛開始將收獲原料裝載至過濾器時(shí)的小于約lpsi上升至在過濾器 上裝載60升/n^的收獲原料時(shí)的大于約10psi (跨膜壓上升1000%)。因 此，術(shù)語(yǔ)"基本恒定，，在涉及跨膜壓時(shí)指在過濾過程中的增加不超過4 psi、 3 psi或2 psi。基本恒定的跨膜壓可通過圖12中的收獲原料組合物B至G 和圖13中的原料組合物B至F得到示范。這些組合物的每一種起始于小 于約1 psi的跨膜壓，且在過濾過程中，過濾這些組合物的過濾器上的跨 膜壓不超過2psi。因此，可認(rèn)為在過濾圖12中組合物B至G以及過濾圖 13中原料組合物B至F的過濾器上的跨膜壓保持恒定。在部分實(shí)施方式 中，本發(fā)明涉及在純化組合物中的生物大分子的方法，該方法包括(a)降低 該組合物的pH; (b)向該組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子；然后(c)通過膜過濾該組 合物，該過濾導(dǎo)致跨膜壓，其中該跨膜壓在過濾過程中保持基本恒定。 在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法減少了蛋白過濾器去除 率。術(shù)語(yǔ)"蛋白過濾器去除率"可通過等式11 = (1-[Cp/CR])進(jìn)行說明，其中 R代表蛋白過濾器去除率系數(shù)，Cp是目標(biāo)生物大分子的即時(shí)滲透濃度，CR是目標(biāo)生物大分子的即時(shí)滯留濃度。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分離 組合物中的生物大分子的方法，其包括降低該組合物的pH,向該組合物 添加二價(jià)陽(yáng)離子，并過濾該生物大分子，其中在給定的體積通量下該蛋白 過濾器去除率系數(shù)的值相對(duì)于未調(diào)節(jié)PH和/或未添加二價(jià)陽(yáng)離子的組合物 的生物大分子的相應(yīng)值更低。例如參見圖18。
在分離生物大分子時(shí)，在部分實(shí)施方式中(例如，在商業(yè)生
產(chǎn)過程中)可存在大體積的組合物(例如，收獲原料)。大體積向純化工 藝提出了諸多挑戰(zhàn)。例如，在使用大體積時(shí)，通過過濾器的流速上的微小 變化對(duì)于分離的生物大分子的回收率的作用將被放大。同樣地，在使用大 體積時(shí)，提高收獲原料中細(xì)胞密度對(duì)于產(chǎn)物回收率的作用也會(huì)被放大。因 此，大體積組合物的使用造成了獨(dú)特的問題，該種問題被放大，并相對(duì)與 較小體積的使用具有更大的影響。因此，在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及 分離大體積組合物中存在的生物大分子的方法。術(shù)語(yǔ)"大體積"指與生物大 分子的商業(yè)和/或工業(yè)生產(chǎn)相關(guān)的體積。在部分實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)"大體積"
指10至2000升、20至1000升或50至500升。 在部分實(shí)施方式中，需要從高細(xì)胞密度組合物(例如，收獲 原料)中收獲生物大分子，或者這樣做是有益的。高細(xì)胞密度組合物相對(duì) 于普通細(xì)胞密度組合物造成了獨(dú)特的問題。例如，高細(xì)胞密度組合物中可 具有更高數(shù)量的雜質(zhì)，從而提高了需要在純化過程中去除的雜質(zhì)的數(shù)量。 因此，更高細(xì)胞密度的組合物可在過濾器上更快積垢，從而阻止組合物的 過濾。在部分實(shí)施方式中，高細(xì)胞密度組合物需要使用更多的過濾器或使 用具有更大表面面積的過濾器。這兩種要求均導(dǎo)致了與過濾和/或產(chǎn)物損失 相關(guān)的更大成本。在本發(fā)明中，該組合物的pH被降低，從而去除了部分 雜質(zhì)，并允許純化更高細(xì)胞密度的組合物。因此，本發(fā)明的部分實(shí)施方式 涉及存在于高細(xì)胞密度組合物中的生物大分子的分離方法。術(shù)語(yǔ)"高細(xì)胞 密度，，通常指每毫升收獲原料約1 x 1()5至3.5x 107，約1.0xl()6至約l.Ox107,或約5.0x 106至約9.0x 106的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞密度。當(dāng)然，本領(lǐng) 域技術(shù)人員將能理解，不同的細(xì)胞通常以不同的細(xì)胞密度生長(zhǎng)。因此，在 部分實(shí)施方式中，"高細(xì)胞密度，，細(xì)胞培養(yǎng)物指所包含細(xì)胞的細(xì)胞密度高于 該細(xì)胞系常見密度的細(xì)胞培養(yǎng)物。 在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法涉及提高過濾過 程強(qiáng)健度的方法，該方法包括(a)降低該組合物的pH; (b)向該組合物添加
二價(jià)陽(yáng)離子；以及(c)膜過濾該組合物。術(shù)語(yǔ)"提高強(qiáng)健度"指對(duì)給定過濾器 使用更大范圍的流速，同時(shí)不提高跨膜壓、雜質(zhì)濃度或產(chǎn)物損失的能力。 術(shù)語(yǔ)"提高強(qiáng)健度"還指用給定的過濾器過濾更大體積或更高細(xì)胞密度的 收獲原料，同時(shí)不提高跨膜壓、雜質(zhì)濃度或產(chǎn)物損失的能力。
在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，該方法被轉(zhuǎn)化為在過濾前澄清 包含生物大分子的組合物(例如，收獲原料)的方法，該方法包括(a)降低 該組合物的pH; (b)向該組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子；以及(c)從該組合物中分 離雜質(zhì)和生物大分子。在部分實(shí)施方式中，澄清組合物與降低濁度相關(guān)， 濁度可通過濁度計(jì)檢測(cè)，例如Hach 2100AN濁度計(jì)(Hach Co.， Loveland, CO)。 在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括通過使該組合物接收 離心力(即，離心)從雜質(zhì)中分離生物大分子，其中離心形成上清液和沉 淀物。在部分實(shí)施方式中，該離心形成基本沒有雜質(zhì)(細(xì)胞或細(xì)胞碎片) 的上清液和濃縮的細(xì)胞/細(xì)胞碎片沉淀物。術(shù)語(yǔ)"沉淀物"在涉及離心時(shí)指在 離心時(shí)沉淀(或團(tuán)化)形成細(xì)胞/細(xì)胞碎片團(tuán)的組合物組分。術(shù)語(yǔ)"上清液" 指在離心過程中未沉淀(或團(tuán)化)的組合物組分，例如，保留在組合物中 的水相且基本無細(xì)胞的組合物組分。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物大 分子在離心后基本存在于上清液中(即，它基本懸浮在組合物的液體組分 中)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物大分子在離心后基本存在于沉淀物中(例如，它被沉淀出溶液，或存在于離心得到的團(tuán)中)。在部分實(shí)施 方式中，采用密度梯度從該雜質(zhì)中分離該生物大分子。因此，在部分實(shí)施 方式中，生物大分子和雜質(zhì)在離心后均保留在懸浮液中，盡管其具有不同 密度，并因此存在于離心裝置的不同位置。 可使用不同的離心裝置。在部分實(shí)施方式中，該離心可通過 盤堆(disc stack)離心實(shí)現(xiàn)。在部分實(shí)施方式中，"小試規(guī)模"過濾可用于預(yù) 測(cè)工業(yè)規(guī)模過濾的適當(dāng)條件。可改變離心變量以實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)生物大分子的 最佳分離。例如，在部分實(shí)施方式中，可采用各種轉(zhuǎn)速或流速以提高回收 的生物大分子質(zhì)量和/或回收的生物大分子的數(shù)量。 本發(fā)明的方法的步驟可以不同順序排列。例如，在本發(fā)明的 部分實(shí)施方式中，降低pH和添加二價(jià)陽(yáng)離子可在從雜質(zhì)分離該生物大分 子之前進(jìn)行。在部分實(shí)施方式中，首先調(diào)節(jié)該收荻培養(yǎng)基的pH，添加二 價(jià)陽(yáng)離子，然后從雜質(zhì)中分離該生物大分子。在其它實(shí)施方式中，首先添 加該二價(jià)陽(yáng)離子，調(diào)節(jié)該組合物的pH,然后分離該生物大分子。在部分 實(shí)施方式中，在(a)降低該pH、 (b)添加二價(jià)陽(yáng)離子或(c)從該雜質(zhì)分離該生 物大分子之間可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)純化步驟。替代性地，本發(fā)明方法的步驟 (a)、 (b)或(c)可連續(xù)實(shí)施，例如，在步驟(a)、 (b)和(c)之間沒有附加的純化 步驟。然而，當(dāng)步驟(a)、 (b)和(c)連續(xù)實(shí)施時(shí)，可在步驟(a)、 (b)和(c)之前 或之后進(jìn)行附加純化步驟。 本發(fā)明的部分實(shí)施方式涉及在包含生物大分子和雜質(zhì)的組 合物中分離生物大分子的過程中提高澄清的操作強(qiáng)健度的方法，該方法包 括(a)降低該pH, (b)使雜質(zhì)絮凝，(c)向該組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子，以 及(d)從該組合物的雜質(zhì)分離該生物大分子。術(shù)語(yǔ)"操作強(qiáng)健度"指用給定 分離裝置(例如，過濾器大小)處理更多種細(xì)胞負(fù)載進(jìn)行分離操作(例如， 過濾工藝)的能力。在部分實(shí)施方式中，pH的降低逆轉(zhuǎn)了雜質(zhì)(例如，細(xì)胞碎片等)在過濾器膜的積垢，從而允許以更高的通過量在更高的體積
負(fù)載下進(jìn)行操作。
實(shí)施例 本發(fā)明將通過特定的實(shí)施例進(jìn)行更具體的描述。以下實(shí)施例 僅為闡述目的提供，并非意在以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可 輕易理解，可根據(jù)本發(fā)明改變或更改多種非關(guān)鍵參數(shù)以獲得替代性的實(shí)施方式。
實(shí)施例1 通過比較不同pH水平下培養(yǎng)細(xì)胞的顆粒大小分布考察pH 對(duì)于細(xì)胞絮凝的作用。從兩個(gè)生物反應(yīng)器收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，然后分成三個(gè) 不同的組， 一個(gè)對(duì)照組和兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組通過25%乙酸調(diào)節(jié)至約4.5 或5.75的pH值。對(duì)照組保持約pH 7.1不變。然后通過Beckman Coulter, Multisizer III (Fullerton， CA)分析各組的樣本，測(cè)定平均直徑。結(jié)果顯示 于圖1。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在小于5.75的pH下，直徑小于2.5 pm的顆 粒具有明顯減少，2.5至6.0 (xm的顆粒群有所增加。
實(shí)施例2 通過在不同的pH水平下用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞染色并用CEDEX 細(xì)胞分析儀(Flonamics, Madison WI)對(duì)其進(jìn)行分析以考察pH變化對(duì)細(xì)胞 絮凝的作用。如實(shí)施例1所示，從兩個(gè)生物反應(yīng)器收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，然后 分成三個(gè)不同的組， 一個(gè)對(duì)照組和兩個(gè)實(shí)馬全組。實(shí)驗(yàn)組通過25%乙酸調(diào)節(jié)至約4.5和5.75的pH值。對(duì)照組保持約pH7.1不變。然后進(jìn)行TB染色， 并使用放大的圖像進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于圖2。
TB染料通過穿透并對(duì)胞內(nèi)蛋白染色實(shí)現(xiàn)對(duì)死細(xì)胞的染色。 在pH4.50下的細(xì)胞的數(shù)據(jù)顯示了相對(duì)于pH 7.00和5.75時(shí)單位面積下更 多的染色微粒。這提示TB不僅對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色，也對(duì)類似大小的其他 蛋白聚集物進(jìn)行了染色。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了較低pH下發(fā)生了蛋白沉 淀和絮凝的假設(shè)。
實(shí)施例3 測(cè)定了 pH變化對(duì)上清液濁度的作用。將細(xì)胞培養(yǎng)物分為不 同的等分，然后調(diào)節(jié)至4.25、 4.5、 4.75、 5.0、 5.25、 5.5、 6.0的pH，或不 調(diào)節(jié)(pH 7.1)。進(jìn)行沉降速度實(shí)驗(yàn)，測(cè)量所得上清液的濁度。該結(jié)果顯示
于圖3。 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上清液濁度隨pH水平的上升而上升。這提 示在較低的pH范圍下，細(xì)胞在沉降速度實(shí)驗(yàn)中被絮凝和去除。
實(shí)施例4 通過重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)或鼠(NSO)細(xì)胞發(fā)酵生成IgGl 和IgG4類單克隆抗體。將一小瓶的原始細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞融解，并通過接種制 備大小的各種搖瓶和生物反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)增。使用無動(dòng)物成分制備該接種制 備和生產(chǎn)生物反應(yīng)器培養(yǎng)基。在所用生物反應(yīng)器狀態(tài)下控制溫度、pH和
溶氧水平。
實(shí)施例5
實(shí)施例4的收獲原^F或者(a)不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，或者(b)調(diào)節(jié)至 pH4.7。然后將調(diào)節(jié)(或未調(diào)節(jié))的收獲原料以切向流過濾模式在恒定的 再循環(huán)和滲透流速下通過微過濾器。通過對(duì)pH調(diào)節(jié)的收獲原料和非pH 調(diào)節(jié)的收獲原料計(jì)算過濾過程中的跨膜壓(見圖11 )。圖12和圖13分別 提供了 IgGl類抗體和IgG4類抗體的跨膜壓測(cè)量結(jié)果。該圖證明了將收獲 原料的pH降低為4.7至5.3范圍內(nèi)可在將其應(yīng)用于過濾器時(shí)獲得較低和相 對(duì)恒定的跨膜壓，而未進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的收獲原料在應(yīng)用于過濾器時(shí)帶來了 急劇上升的跨膜壓。 盡管不希望受限于特定的理論，該證據(jù)提示降低pH導(dǎo)致細(xì) 胞物質(zhì)絮凝的增加，從而形成了更不可能進(jìn)入微過濾器的孔的更大顆粒。 該澄清以橫流模式進(jìn)行，其中該收獲原料流入包含微孔膜的微量過濾模 塊，滯留細(xì)胞和細(xì)胞碎片被滯留并再循環(huán)進(jìn)入原料容器，同時(shí)無細(xì)胞滲透 液通過該過濾器膜并被收集(參見圖10的示意圖)。從系統(tǒng)中以恒定的 流速吸出滲透液，并收集入容器中。通過微量過濾從含有具有初始高密度 的生物物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中分離目標(biāo)蛋白時(shí)，由高濃度細(xì)胞 物質(zhì)在膜過濾器表面積垢可導(dǎo)致跨越該微過濾器的跨膜壓降的上升。為了 減少跨膜壓降以提高微量過濾操作的強(qiáng)健度并提高滲透液中的蛋白回收 率，在微量過濾前將收獲原料的p.H降低至4.0-5.0。 pH的降低導(dǎo)致大細(xì)胞 和細(xì)胞碎片隨著雜質(zhì)(例如DNA)沉淀而絮凝。據(jù)發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)(細(xì)胞、細(xì) 胞碎片和DNA)絮凝為較大顆粒提高了接近該過濾器表面的組合物的物 質(zhì)傳遞，從而減少了在預(yù)定滲透流通量和流速下跨越該過濾器的跨膜壓降 驅(qū)動(dòng)力(參見圖3和4)。
實(shí)施例6 考察了降低pH水平對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白和DNA去除的作用。 圖5證明了降低pH水平可同時(shí)提高宿主細(xì)胞蛋白和DNA從溶液中的去除。將細(xì)胞培養(yǎng)物分成不同等分，然后調(diào)節(jié)各等分樣本的pH。然后將樣
本離心，并測(cè)定宿主細(xì)胞蛋白和DNA的數(shù)量。該數(shù)據(jù)顯示在小于5.0的 pH下宿主細(xì)胞蛋白可減少50%以上，而在小于5.0的pH下DNA可減少 90%以上。這些雜質(zhì)有可能從溶液中沉淀，并被離心去除。
實(shí)》包例7 考察了 pH降低對(duì)于兩種單克隆抗體的質(zhì)量和回收率的作 用。圖6顯示兩種單克隆抗體的蛋白回收率在pH6.0以下時(shí)分別降低50/。 至10%,而抗體A在4.5以下時(shí)迅速下降。蛋白回收率的劇烈下降伴隨著 聚集物和酸性變體水平的上升，此處通過單體和主異形體水平的下降得以 說明，顯示在低pH下的分子不穩(wěn)定性?？贵wB在所觀察的pH范圍內(nèi)未 顯示明顯的降解。
實(shí)施例8 考察了 pH降低對(duì)于中空纖維微量過濾(MF)效率的作用。圖 7顯示了微量過濾收獲產(chǎn)物質(zhì)量和雜質(zhì)與圖5的結(jié)果一致，在小于5.0的 pH下宿主細(xì)胞蛋白和DNA分別減少了 50%和卯％。由于涉及樣i量過濾 單元搡作的過濾過程，澄清濁度水平低于圖3的初始實(shí)驗(yàn)。此外，該結(jié)果 顯示在更低pH水平下細(xì)胞培養(yǎng)物濁度大于2倍的下降。 小試鈔L才莫MF產(chǎn)率結(jié)果顯示于圖8。結(jié)果顯示了在初始條件 實(shí)驗(yàn)過程中所見的低于pH4.5時(shí)的產(chǎn)率損失。此外，由于MF過程中的膜 積垢，在pH5.5或更高時(shí)觀察到相當(dāng)大的損失。將細(xì)胞培養(yǎng)物降低至較低 pH水平所產(chǎn)生的絮凝作用可減少阻塞。
實(shí)施例9
考察了降低pH對(duì)于收獲單克隆抗體的作用。抗體B離心結(jié) 果同樣與圖3和圖5的澄清結(jié)果一致。小試規(guī)模離心試驗(yàn)的總體產(chǎn)率低于 初始澄清實(shí)驗(yàn)，這是由于調(diào)節(jié)和離心單元操作導(dǎo)致的額外產(chǎn)物損失。此外， 由于小試和中試規(guī)模離心時(shí)的剪切差異，濁度水平高于澄清實(shí)驗(yàn)。然而， 在澄清實(shí)驗(yàn)中這些過程產(chǎn)量具有相同的趨勢(shì)。離心數(shù)據(jù)點(diǎn)中變化性的增加 是由于離心操作條件的變化。
實(shí)施例10 測(cè)定了降低pH水平對(duì)于實(shí)施例4中的收獲原料濁度的作 用 將含有MgCb、 CaCl2或NaCl的收獲原料的pH(l)不調(diào)節(jié)(pH 6.9-7.2)， (2)調(diào)節(jié)至pH6.0, (3)調(diào)節(jié)至pH5.0, (4)調(diào)節(jié)至pH5.0, (5)調(diào)節(jié)至pH4.5， 或(6)調(diào)節(jié)至pH4.0?？墒褂?5%v/v乙酸將收獲原料等分的pH調(diào)節(jié)至特 定的pH,使細(xì)胞物質(zhì)的絮凝和沉降約2至24小時(shí)，并通過濁度計(jì)測(cè)量澄 清上清液的濁度(澄清度)以獲得該數(shù)據(jù)。上清液濁度隨著收獲物質(zhì)pH 被調(diào)節(jié)降低而總體減少，顯示了在低pH值下有更澄清的上清液(見圖4)。 該種濁度的下降是低pH水平下發(fā)生的高度細(xì)胞絮凝、進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì) 更迅速沉降的結(jié)果，絮凝和沉降的增加提供了更為有效的微量過濾操作性 能(參見圖12或圖13)。
實(shí)施例11 pH調(diào)節(jié)對(duì)于從收獲原料中回收DNA污染物的作用可通過 如下方式測(cè)定如實(shí)施例4所述收集收獲原料，然后(a)不調(diào)節(jié)該收獲原料 的pH,或者(b)將該收獲原料的pH降低至4.7。然后使調(diào)節(jié)或未調(diào)節(jié)的收 獲原料沉降24小時(shí)。從澄清上清液采取樣本并進(jìn)行DNA測(cè)試。在無細(xì)胞 收獲原料中殘留的DNA數(shù)量可通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QPCR)測(cè)定。圖15顯示了被調(diào)節(jié)至pH 4.7的收獲原料相對(duì)未調(diào)節(jié)pH的收獲原料DNA污 染物下降了約1.5至3 1og。
實(shí)施例12 通過如實(shí)施例4所述采集收獲原料以測(cè)定pH調(diào)節(jié)對(duì)于單克 隆抗體(IgG4)和融合蛋白回收率的作用。然后將收獲原料pH調(diào)節(jié)至7.0、 5.0或4.0，并且沉降2-24小時(shí)。從澄清上清液采取樣本并進(jìn)^亍蛋白效1"介 測(cè)試。然后通過蛋白G效價(jià)測(cè)定檢測(cè)無細(xì)胞收獲原料中存在的抗體或融合 蛋白的數(shù)量。圖14顯示了 pH變化對(duì)于調(diào)節(jié)的收獲流中產(chǎn)物蛋白效價(jià)的作 用。顯示了 IgG4類抗體和融合蛋白的數(shù)據(jù)。兩類蛋白的數(shù)據(jù)顯示當(dāng)pH從 7.0下降至4.0時(shí)蛋白明顯減少。由pH誘導(dǎo)的沉淀導(dǎo)致的蛋白損失的數(shù)量 在3%至52%范圍內(nèi)。該組合物的蛋白濃度的測(cè)定方法基于在蛋白G偶聯(lián) HPLC樹脂上親和捕獲抗體或融合蛋白。
實(shí)施例13 通過向該收獲原料添加10 mM的各種二價(jià)陽(yáng)離子，然后將 收獲原料pH降低至5.0,以考察向pH調(diào)節(jié)的收獲原料添加二價(jià)陽(yáng)離子對(duì) 于蛋白的作用。將所得的收獲原料沉降2-24小時(shí)。從澄清上清液采取樣 本并進(jìn)行蛋白效價(jià)測(cè)試。將效價(jià)與對(duì)照試驗(yàn)(調(diào)節(jié)至pH 5.0的收獲原料， 未添加二價(jià)陽(yáng)離子)進(jìn)行比較。通過蛋白G效價(jià)測(cè)定檢測(cè)無細(xì)胞收獲原料 中存在的抗體或融合蛋白的數(shù)量。圖16顯示了二價(jià)陽(yáng)離子的添加相比未 添加任何附加離子的對(duì)照試驗(yàn)一般可減少可溶性抗體的損失。y軸代表了 歸一化的效價(jià)，其表示為(以陽(yáng)離子處理的過濾后的收獲原料中的效價(jià)) 除以(未經(jīng)陽(yáng)離子處理的過濾后的收獲原料中的效價(jià))。
實(shí)》包例14
考察了向pH調(diào)節(jié)的收獲原料添加的二價(jià)陽(yáng)離子的不同濃度 的影響。特別地，向pH調(diào)節(jié)的收荻原料添加CoCl2(或Co,至終濃度為1 niM 、 2 mM、 5 mM、 10 mM或20 mM。從pH調(diào)節(jié)的收獲原料中回收的 產(chǎn)物數(shù)量可采用蛋白G進(jìn)行測(cè)定，以確定不同濃度的CoCl2對(duì)于產(chǎn)物回收 率的作用。圖17顯示了約10 mM的CoCl2足以在pH調(diào)節(jié)后最小化產(chǎn)物 損失(或最大化產(chǎn)物回收率)。
實(shí)施例15 將本發(fā)明的方法對(duì)于蛋白過濾器去除率的作用作為在整個(gè) 濃縮和滲濾階段通過微孔膜處理的累積體積的函數(shù)進(jìn)行考察。蛋白過濾器 去除率系數(shù)可通過如下方式確定測(cè)量不同時(shí)間間隔的滯留和滲透效價(jià)，
并以方程r=(i-[cycR])計(jì)算蛋白過濾器去除率系數(shù)。圖中顯示了四個(gè)單獨(dú)
MF實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)由空心和實(shí)心三角顯示的試驗(yàn)(runs)代表了調(diào)節(jié)為pH5.0 且添加了 10mMCoCl2的收獲流；而由空心和實(shí)心圓圈顯示的試-驗(yàn)代表了 未調(diào)節(jié)且未添加CoCl2的收獲流。該數(shù)據(jù)顯示對(duì)于所有研究的裝載比例， pH調(diào)節(jié)的含有10 mM CoCl2的收獲原料的MF保持系數(shù)更低。例如，在 典型的大規(guī)模裝載率60-70L/m"下，計(jì)算得到的去除率系數(shù)為約30%,而 未進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的試驗(yàn)接近完全去除(90-100。/。)。圖6還顯示了從各個(gè)微量 過濾試驗(yàn)中得到的蛋白回收率。含有Co"二價(jià)離子的試驗(yàn)顯示了目標(biāo)蛋白 的完全回收，而使用未調(diào)節(jié)的收獲原料的試驗(yàn)具有20°/。的產(chǎn)率損失。 將本發(fā)明的方法對(duì)于蛋白過濾器去除率的作用作為在整個(gè) 濃縮和滲濾階段通過微孔膜處理的累積體積的函數(shù)進(jìn)行考察。蛋白過濾器 去除率系數(shù)可通過如下方式確定測(cè)量不同時(shí)間間隔的滯留和滲透效價(jià)， 并以方程R二(l-[CVCy)計(jì)算蛋白過濾器去除率系數(shù)。圖18所述的數(shù)據(jù)來 自于四個(gè)不同的微量過濾實(shí)驗(yàn)在C和D中，10mM的CoCl2在pH調(diào)節(jié) 過程中被添加至收獲流；在A和B中，未添加CoCl2。所有的收獲原料被調(diào)節(jié)至pH5.0。圖18顯示了在所有研究的裝載比例中，以10mM的CoCl2 調(diào)節(jié)的收獲原料具有較低的微量過濾保持系數(shù)。例如，在典型的大規(guī)模裝 載率60-70L/m2下，對(duì)于試驗(yàn)C和D計(jì)算得到的微量過濾去除率系數(shù)為約 30%,而試驗(yàn)A和B接近完全去除(90-100%)。圖18還顯示了從各個(gè)微量 過濾試驗(yàn)中得到的總體蛋白回收率。包含0)2+二價(jià)離子(C和D)的試驗(yàn) 顯示了接近完全的目標(biāo)蛋白回收率，而未添加Co"的試驗(yàn)(A和B)導(dǎo)致 了 20%的產(chǎn)率損失。 本發(fā)明中的特定實(shí)施例意在對(duì)本發(fā)明的某 一 方面進(jìn)行單獨(dú) 闡述，并非本發(fā)明進(jìn)行限制，且任意功能性相同的組合物或方法亦在本發(fā) 明范圍之內(nèi)。事實(shí)上，除本文所顯示的和所述的之外，對(duì)本發(fā)明所進(jìn)行的 各種調(diào)整，通過前述描述和附圖，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。 該種調(diào)整意在落入所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。 本說明書中所涉及的所有出版物和專利申請(qǐng)均引用作為參 考，其引用程度如同每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)均為特定的單獨(dú)的引 用作為參考。
權(quán)利要求
1. 在包含雜質(zhì)的組合物中分離生物大分子的方法，該方法包括(a)降低所述組合物的pH；(b)向所述組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子；以及(c)從所述雜質(zhì)分離所述該生物大分子。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過過濾所述組合物進(jìn)行(c)的分離， 該過濾形成滲透流和滯留流。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述過濾通過切向流過濾器進(jìn)行。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所迷生物大分子基本在所述滲透流中。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過離心所迷組合物進(jìn)行(c)的分離， 該離心形成上清液和沉淀物。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述生物大分子基本在所述上清液中。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中(a)中所述組合物的pH降低至少1 pH單位。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中(a)中所述組合物的pH降低至約3.0 至約6.5的pH范圍內(nèi)。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中(a)中所述組合物的pH降低至約3.0 至約5.0的pH范圍內(nèi)。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中(a)中所述組合物的pH降低至約4.0 至約pH4.7的pH范圍內(nèi)。
11. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述生物大分子為蛋白。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述蛋白為可溶性蛋白。
13. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的蛋白是抗體。
14. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述組合物包含真核細(xì)胞物質(zhì)。
15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述雜質(zhì)選自蛋白、脂質(zhì)、核酸、核糖核酸及其組合。
16. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述二價(jià)陽(yáng)離子選自Ca2+、 Mg2+、 Cu2'、 Co"、 Mn2"、 N產(chǎn)、Be2f、 Sr2+、 Ba2'、 Ra2〖、Zn2+、 Cd2,、 Ag2'、 Pd2+、 Rh^及其組合。
17. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述二價(jià)陽(yáng)離子選自Ca2+、 Mg2+、 Cu2+、 Co2+、 Mn2+及其組合。
18. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中向所述組合物添加所述二價(jià)陽(yáng)離子 形成約1 mM至約100 mM的二價(jià)陽(yáng)離子濃度。
19. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中向所述組合物添加所述二價(jià)陽(yáng)離子形成約2 mM至約50 mM的二價(jià)陽(yáng)離子濃度。
20. 如權(quán)利要求l-19任意一項(xiàng)所述的方法，其中添加所述二價(jià)陽(yáng)離子將 所述生物大分子的回收率提高3%以上。
21. 如權(quán)利要求l-19任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物大分子的回收 率被提高10%以上。
22. 如權(quán)利要求卜4和7-21任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過過濾所述組 合物進(jìn)行(c)中的分離，其中該過濾導(dǎo)致跨膜壓；且其中所述跨膜壓 在該過濾過程中基本保持恒定。
23. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中(a) 所述組合物的pH被降低至pH 3.0至pH 5.0;(b) 該二價(jià)陽(yáng)離子選自Ca2t—、 Mg2+、 Cu2+、 Co2+、 Mn2+及其組合；(c) 通過過濾所述組合物進(jìn)行該分離；以及(d) 該生物大分子為4元體。
24. 在包含雜質(zhì)的組合物中純化生物大分子的方法，該方法包括(a) 降低所述組合物的pH;(b) 向所述組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子；以及(c) 從所述雜質(zhì)分離所該生物大分子。
25. 澄清包含生物大分子和雜質(zhì)的組合物的方法，該方法包括(a) 降低所述組合物的pH;(b) 向所述組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子；以及(c) 從所述雜質(zhì)分離所述該生物大分子。
26. 如權(quán)利要求24-25任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過過濾所述組合物 進(jìn)行所述(c)的分離，該過濾形成滲透流和滯留流。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中該生物大分子基本在所述滲透流中。
28. 如權(quán)利要求24-25任意一項(xiàng)所述的方法，其中(a)中所述組合物的pH 降低至約3.0至約6.5的pH范圍內(nèi)。
29. 如權(quán)利要求24-25任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物大分子為蛋白。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中所迷的蛋白是抗體。
31. 如權(quán)利要求24-25任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述雜質(zhì)選自蛋白、 脂質(zhì)、核酸、核糖核酸或其組合。
32. 如權(quán)利要求24-25任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述二價(jià)陽(yáng)離子選自 Ca2+、 Mg2+、 Cu2+、 Co2+、 M,或其組合。
33.如權(quán)利要求24-25任意一項(xiàng)所述的方法，其中向所述組合物添加二 價(jià)陽(yáng)離子形成約1 mM至約lOOmM的二價(jià)陽(yáng)離子濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及在組合物中分離生物大分子的方法。特別地，本發(fā)明涉及在包含雜質(zhì)的組合物中分離生物大分子的方法，該方法包括(a)降低該組合物的pH，(b)向該組合物添加二價(jià)陽(yáng)離子，以及(c)從該雜質(zhì)中分離該生物大分子。
文檔編號(hào)B01D37/00GK101534920SQ200780041005
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2007年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月1日
發(fā)明者喬森納·羅梅羅, 菲利普·喬治·德維爾莫蘭, 詹妮弗·尹·凱斯, 詹姆士·克羅斯托夫斯基 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司