專利名稱：用于膜離子交換色譜的介質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于膜離子交換色譜的介質(zhì)，特別是用于病毒純化的生物分離領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
病毒純化是新興的生物分離領(lǐng)域。由于基因療法臨床研究必需大量的純病毒，傳統(tǒng)的純化方法，即超離心不再經(jīng)濟。需要發(fā)展更快速、廉價和可擴展的純化技術(shù)。色語已被用于病毒純化，主要以小珠的形式?；谏V的病毒純化的首次報道可追溯到約半個世紀以前(參見例^口, Haruna， I.; Yaoi， H.; Kono, R. ; Watanabe， I.， Separation ofadenovirus by chromatography on DEAE-cellulose. Virology 1961, 13，(2)， 264 )。最近當小珠色鐠的容量和使用限制日益嚴重時，膜色讒開始引起注意。
諸如基于季銨離子等的那些強陰離子交換劑在下游處理中用作俘獲在諸如生物流體，尤其是在制造的生物制劑溶液中存在的諸如內(nèi)毒素、病毒、核酸和宿主細胞蛋白(HCP)等帶負電荷的大塊雜質(zhì)的精制介質(zhì)。
傳統(tǒng)上，在小珠形式中已經(jīng)提供和使用了陰離子交換劑，例如來自GE Healthcare Bio-Sciences AB的Q Sepharose 。然而，基于小球的系統(tǒng)的通量限制要求大體積的柱子以有效地俘獲雜質(zhì)。
在基于小球的色語中，可供吸附的大部分表面面積位于小珠內(nèi)部。因此，由于質(zhì)量輸送通常受制于孔擴散，分離過程固有地緩慢。為了減小該擴散阻力并同時增大動態(tài)結(jié)合能力，可以采用小直徑的小珠。然而，使用小直徑珠子換來的代價是提高的柱壓降。因此，制備色譜分離的優(yōu)化通常牽涉到效率/動態(tài)容量(小珠有利的)和柱壓降(大珠有利的)之間的折衷。
相比而言，基于膜的色鐠系統(tǒng)(也稱之為膜吸著體)具有直接與
4對流膜孔相連接的配體，因此消除了內(nèi)部孔擴散對質(zhì)量輸送的影響。
此外，具有緊密的膜孔度分布外加有效的流量分配器的微孔膜基材的
使用能減小軸向分散并提供所有位點的均勻使用。因此，膜吸收介質(zhì)
的質(zhì)量輸送比標準基于小球的色語介質(zhì)高一個數(shù)量級，使之同時具有高效率和高通量分離。由于與基于小球的介質(zhì)填充的珠子相比，單層
膜或平整堆疊的膜的非常薄，沿色譜床發(fā)現(xiàn)減小的壓力降，因此提高流速和生產(chǎn)力。通過使用具有足夠表面積的膜，制造具有非常大的直徑高度比(d/h)的裝置結(jié)構(gòu)能實現(xiàn)必要的結(jié)合能力。由于大部分色語小珠的容量在小珠內(nèi)部，基于膜的色語系統(tǒng)相比小珠所取得的優(yōu)勢在于被吸附實體的尺寸增大(例如從蛋白分子至病毒顆粒)
恰當設(shè)計的膜吸著體具有的色譜效率優(yōu)于標準制備基于小球的
樹脂10~100倍。因此，為了在膜吸著體上實現(xiàn)相同水平的分離，可采用10倍小的床高度。相比基于小球的系統(tǒng)10 ~ 30 cm的床高度，1 ~5 mm的床長度對于膜吸著體是標準的。由于大體積膜吸著體所要求的極端柱邊長比，裝置設(shè)計是至關(guān)重要的。為了保持膜吸著體的固有性能優(yōu)勢，需要適當?shù)娜肟诤统隹诜峙淦饕杂行实乩每捎媚んw積。膜吸著體技術(shù)理想地適用于該用途。然后，目前商業(yè)化膜吸著體具有各種缺點，包括低容量，較差的雜質(zhì)分離以及難以洗脫經(jīng)純化的材料。
吸收(absorption)指通過滲透將物質(zhì)吸入吸收性材料體內(nèi)。吸附(adsorption)指分子由體相運動至吸附介質(zhì)表面。吸著(sorption)是包括吸附和吸收的總稱。相類似地，本文中稱之為吸著體的吸著材料或者吸著裝置指或能吸附或能吸收或者能同時吸附或吸收的材料或裝置。
膜吸著體是高度多孔的相互連接的介質(zhì)，具有當溶液流經(jīng)其孔時移除(吸附和/或吸收)溶液中一些成分的能力。膜吸著體的性質(zhì)及其在所需用途中良好地發(fā)揮作用的能力取決于介質(zhì)的孔結(jié)構(gòu)(骨架)以及暴露于所述溶液的表面的性質(zhì)。通常，首先由在水中不溶解或者不溶脹并且具有可接受的機械性質(zhì)的聚合物形成多孔介質(zhì)。所述多孔介質(zhì)優(yōu)選為經(jīng)過本領(lǐng)域廣泛已知的相分離方法制造的多孔膜片。參見例如Zeman LJ， Zydney AL， Micro filtration and Ultrafiltration: Principlesand Applications, New York: Marcel Dekker， 1996。中空纖維和管狀膜也是可接受的骨架。通常需要分離處理步驟以改性所形成的多孔結(jié)構(gòu)的外部表面或外表面和內(nèi)部孔表面從而引入必要的吸附性質(zhì)。由于膜結(jié)構(gòu)通常由疏水聚合物形成，表面改性步驟的另一目的也是使得所述表面親水或者可水潤濕的。
本發(fā)明涉及經(jīng)設(shè)計用于純化諸如腺病毒等病毒的離子交換色鐠介質(zhì)。腺病毒是基因療法研究中選摔的一種栽體。其穩(wěn)定，非包膜并
且能容易地感染細胞。最常見的類型是標記的Ad5。其容易地在實驗室表達，但需要從細胞蛋白中徹底的純化以避免在隨后轉(zhuǎn)染研究中假陽性信號的。當然，為其最終用途，即基因療法和接種疫苗也需要純腺病毒。電泳研究顯示在大約8的pH時牢固地帶有負電荷，而細胞溶解產(chǎn)物懸浮+液中大部分物種在該pH下具有較弱的電荷。這使得陰離子交換色譜是用于Ad5純化的合適技術(shù)。
用于病毒移除和純化的陰離子交換膜先前已按照美國專利7，160，464的教導通過化學接枝技術(shù)進行制備。它教導了接枝有帶有一個或多個帶有正電荷的基團的聚合性側(cè)鏈的膜的制備。熟悉膜修飾領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地理解接枝過程對于每種膜基材是特有的，需要先進的設(shè)備和繁復的開發(fā)工作。本發(fā)明提供了明顯更簡捷的方法基于膜的直接涂覆制造帶有正電荷的膜吸著體。其他現(xiàn)有技術(shù)教導了沒有直接將帶有電荷的表面涂層連接到支持膜上的陰離子交換膜的制備。美國專利6,780,327教導了包括多孔性基材和具有聚合物骨架和懸吊正電荷基團的交聯(lián)涂層的正電荷膜的制備，其中，每個懸吊正電荷基團通過單鍵經(jīng)極性間隔基團直接與骨架相連。然而，極性間隔基團的存在帶來了更多的膜表面和吸附劑分子之間的相互作用模式，諸如偶極相互作用和氫鍵。在傳統(tǒng)生物分離條件下，后者極其難以調(diào)節(jié)。所希望的是形成主要通過電荷相互作用與溶液成分發(fā)生作用的吸著介質(zhì)，而電荷相互作用可通過離子強度很容易地進行調(diào)節(jié)和精細調(diào)整。例如，在典型的腺病毒純化應用中，高離子強度(高鹽濃度)用于將病毒從膜上洗脫。如果存在其他相互作用，經(jīng)純化的病毒的產(chǎn)率可降低。因此，本發(fā)明公開了在多孔膜表面上形成交聯(lián)涂層，其具有通過單 一 非極性聯(lián)接基(linker)與涂層聚合物的骨架相連的正電荷基團。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明已克服現(xiàn)有技術(shù)的問題，其提供了介質(zhì)和裝置，諸如包括該介質(zhì)的陰離子交換劑，其中陰離子交換涂層形成在具有非特異性蛋
6白結(jié)合的親水性基材上。正電荷通過非極性聯(lián)接基(linker)與涂層骨架 相連，基膜材料優(yōu)選為超高分子量的聚乙烯。所述介質(zhì)以結(jié)合-洗脫模 式發(fā)揮作用，洗脫受到高離子強度的促進。介質(zhì)提供了優(yōu)異的應用性 能、可堿性清潔性和容易的裝置制造。
在某些實施方式中，本發(fā)明涉及多孔性吸著(sorptive)介質(zhì)，包括 具有第一外側(cè)和第二外側(cè)的基材(substrate)，兩側(cè)均為多孔性的，且之 間具有多孔性的厚度，所述基材為親水性的，并且具有吸著材料，所 述吸著材料基本覆蓋所述基材的固體基質(zhì)(solid matrix)和所述第一和 第二外表面，所述吸著材料包括通過非極性聯(lián)接基連接的季銨離子官 能性的交聯(lián)聚合物。在某些實施方式中，交聯(lián)聚合物用電荷改性劑進 行改性，所述電荷改性劑包括含有通過非極性聯(lián)接基與能和所述交聯(lián) 聚合物進行反應的部分相連的季銨離子基團的有機化合物。所述有機 化合物可具有式Y(jié)-Z-N(CH3)3+X-，其中，Y是反應性離去基團，Z是 非極性脂肪族或芳香族聯(lián)接基，X是水溶性酸帶有負電荷的離子。
在某些實施方式中，本發(fā)明涉及純化病毒的方法，包括將含有病 毒的溶液流經(jīng)膜以吸附病毒，所述膜包括第一外側(cè)和第二外側(cè)的基 材，兩側(cè)均為多孔性的，且之間具有多孔性的厚度，所述基材為親水 性的，并且具有基本覆蓋所述基材固體基質(zhì)和所述第一和第二外表面 的吸著材料，所述吸著材料包括通過非極性聯(lián)接基連接的季銨離子官 能性的交聯(lián)聚合物；用緩沖液沖洗所述膜；將所述病毒從所述膜上洗 脫。


圖1是顯示根據(jù)某些實施方式的膜的表面特性的示意圖； 圖2是腺病毒-GPF感染滴定圖3是對于不同的病毒純化膜所吸附和洗脫的腺病毒量的圖(以 上樣溶液中起始濃度的百分比計)；
圖4是起始細胞溶解產(chǎn)物，流經(jīng)溶液(F)，清洗溶液(W)和洗脫液 (E)的SDS-PAGE;以及
圖5是作為利用BPTMAB的PEI改性程度的函數(shù)的洗脫Ad5的 圖，其中通過重量增加量評估的作為用BPTMAB進行PEI改性的程 度的函數(shù)的洗脫Ad5的百分比。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及多孔性色鐠或吸著介質(zhì)和包含此介質(zhì)的陰離子交換劑，所述介質(zhì)具有形成在多孔性自支撐基材上的多孔性聚合性涂層。 所述介質(zhì)特別適用于諸如細胞溶解產(chǎn)物等溶液中病毒的穩(wěn)定移除。
所述多孔性基材具有與基材的幾何或物理結(jié)構(gòu)相聯(lián)系的兩個表 面。片材將具有頂面和底面，或者第一和第二表面。這些是普通標稱 的"側(cè)"。在使用中，流體將從一側(cè)(表面)流過基材并通過另一側(cè) (表面)。
兩表面之間的厚度是多孔性的。該多空部分具有與孔相聯(lián)系的表 面區(qū)域。為了避免術(shù)語"表面"、"多個表面，，或"表面區(qū)域"或相 似用法之間的混淆，本發(fā)明人將幾何表面稱之為外部表面或外表面或 側(cè)。與孔相聯(lián)系的表面區(qū)域稱之為內(nèi)部或孔表面區(qū)域。
多孔性材料包括孔和固體基質(zhì)或骨架，所述孔為空置的空間，這 構(gòu)成了所述材料的物理實施方式。例如，在聚合物多孔性膜中，相分 離的聚合物提供了所述基質(zhì)。本文中，本發(fā)明人討論了涂覆或覆蓋介 質(zhì)表面。本發(fā)明人通過這所表達的意思是所述內(nèi)部表面和外部表面均 被涂覆但不完全阻塞孔，即保留大部分用于對流流動的結(jié)構(gòu)。具體而 言，對于內(nèi)部表面區(qū)域，涂覆或覆蓋是指基質(zhì)被涂覆或覆蓋，大部分 孔保持敞開。
吸收指通過滲透將物質(zhì)吸入吸收性材料體內(nèi)。吸附指分子由體相 運動至吸附介質(zhì)表面。吸著是包括吸附和吸收的總稱。相類似地，本 文中稱之為吸著體的吸著材料或者吸著裝置指或能吸附或能吸收或 者能同時吸附或吸收的材料或裝置
本發(fā)明的膜色語介質(zhì)包括形成在多孔性基材上的離子交換涂層。 所述多孔性基材用作所述涂層的支撐骨架。所述基材應當適于處理和 制造為牢靠完整的裝置。所述孔結(jié)構(gòu)應當提供均勻的流體分布，高通 量和高表面積。所述基材優(yōu)選為由膜形成的片材。優(yōu)選的基材由合成 或天然聚合材料制成。熱塑性材料是可用于該用途的一類有用的聚合 物。熱塑性材料包括但不僅限于聚烯烴諸如包括超高分子量聚乙烯在
內(nèi)的聚乙烯，聚丙烯，鎧裝(sheathed)聚乙烯/聚丙烯纖維，PVDF,聚 砜，聚醚砜，聚芳基砜，聚苯基砜，聚氯乙烯，聚酯諸如聚對苯二甲 酸乙二酯，聚對苯二甲酸丁二酯等，聚酰胺，丙烯酸酯類諸如聚甲基 丙烯酸曱酯，苯乙烯聚合物以及上述的混合物。其他合成材料包括纖 維素，環(huán)氧化物，聚氨酯等。所述基材也應當具有低非特異性蛋白結(jié)合。
合適的基材包括微孔濾膜，即那些孔徑約0.1 ~約10 pm的那些 膜?；牟牧峡梢允怯H水性的或者疏水性的。親水性基材材料的例子 包括但不僅限于多糖和聚酰胺，以及表面處理親水性多孔膜，諸如 Durapore (MiUipore Corporation, Billerica MA)。疏水性材料的例子包 括但不僅限于聚烯烴，聚偏氟乙烯，聚四氟乙烯，聚砜，聚碳酸酯， 聚酯，聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任 何方法由基材材料形成多孔性結(jié)構(gòu)，諸如溶液相轉(zhuǎn)換，溫度誘導相夯 離，空氣鑄造，徑跡蝕刻，拉伸，燒結(jié)，激光鉆孔等。因為本發(fā)明的 通用性質(zhì)，事實上任何可供使用的形成多孔結(jié)構(gòu)的方法適合于形成膜 吸著體的支撐骨架。已發(fā)現(xiàn)由于其機械性質(zhì)，化學、苛性和伽馬穩(wěn)定 性的組合，由超高分子量聚乙烯制成的基材材料特別適用。當使用疏 水性基材時，它們應當被賦予親水性，諸如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的改性過程。適合的改性過程公開在美國專利4，618，533和4,944,879 之中。所述基材的低蛋白結(jié)合表面親水性化(例如，<50 ug/cn^蛋白 結(jié)合)是優(yōu)選的。
涂層聚合物形成吸附性水凝膠并具有負責吸引和保持住雜質(zhì)的 化學基團(結(jié)合基團)。作為另外一種選擇，涂層聚合物具有能容易 地被改性從而引入結(jié)合基團的化學基團。所述涂層可由生物分子通過 使得蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)能俘獲到涂層深處，提高吸附能力。優(yōu)逸的涂 層聚合物是支化的或非支化的聚乙烯亞胺。
所述涂層通常構(gòu)成涂覆基材總體積的至少約3%，優(yōu)選為所迷基 材總體積的約5%~約10%。在某些實施方式中，涂層以基本均勻的 厚度覆蓋基材。千燥涂層的適宜厚度范圍為約10nm~約50nm。
交聯(lián)劑與所述聚合物反應使得后者不溶于水并因此支撐起所述 支撐骨架的表面。合適的交聯(lián)劑包括具有低蛋白結(jié)合性質(zhì)的那些交聯(lián) 劑，諸如聚乙二醇二縮水甘油醚(PEG-DGE)。在涂層溶液中使用的交 聯(lián)劑量是基于聚合物和交聯(lián)劑上反應性基團的摩爾比。優(yōu)選的比例為 約20 ~約2000,更優(yōu)選為約40 ~約400，最優(yōu)選為約80 ~約200。 較多的交聯(lián)劑將妨礙水凝膠溶脹的能力并將因此降低吸著能力，而較 少的交聯(lián)劑將導致不完全的交聯(lián)，即剩下 一 些完全可溶的聚合物分 子。途的涂層引入季銨離子官能性。適合的電荷改性劑是具有通過非極性 聯(lián)接基與能夠和所述固定涂層反應的另一部分相連的季銨離子基團
的有機化合物。這些化合物具有通式Y(jié)-Z-N(Alk)3+X',其中，Y是反 應性離去基團，Z是非極性脂肪族或芳香族聯(lián)接基，X是任何水溶性 酸的陰離子。離去基團Y的目的是促進配體和膜涂層之間的反應然后 離去形成聯(lián)接基和涂層之間的直接鍵。"好，，的離去基團通常是在相 對溫和條件下有利于高反應產(chǎn)率的一種基團。離去基團Y的例子包括 諸如Bf、 Cr、 r、 F'等卣素，和磺?；苌?TsO-、 CF3S(V、 C4F9S03-等)。離去基團化學已得到很好地研究；參見例如M.B. Smith和J. March, Comprehensive Organic Chemistry, 5th ed.， Wiley Interscience， 2001。 通 常需要催化劑以實現(xiàn)偶聯(lián)反應并促進離去基團的離去。根據(jù)反應的性 質(zhì)，酸或堿可用作催化劑。當起始涂層由聚合性胺構(gòu)成時，通常需要 堿性催化劑以增強胺氮的親核性。該堿性催化劑可以是任何強無機堿 (鋰、鈉、鉀、4丐、鋇的氫氧化物)或有機堿(四烷基氫氣化銨)。非極 性聯(lián)接基可以是任何飽和的或非飽和的脂肪族烴類，例如(CH丄，其 中n為2 10,支化脂肪族烴類諸如-(CH2)n-C(CH3)2-，芳香族基團諸 如亞苯基、曱代亞苯基、二甲代亞苯基，或者脂肪族烴類和芳香族烴 類的組合。季銨基團-N(Alk)3+優(yōu)選為三甲基銨基，但也能包括其他烷 基或芳基諸如乙基、苯基、苯甲基、羥乙基等。陰離子X是任何水溶 性有機或無機酸的陰離子。適合的陰離子X的例子包括但不僅限于 氯、溴、碘、乙酸根、丙酸根、磷酸氫根、硫酸氫根、檸檬酸根、碳 酸氫根、甲基磺酸根，氨基磺酸根等。適合的電荷改性化合物的例子 包括2-氯乙基三甲基氯化銨(氯化氯膽堿)，2-溴乙基三曱基氯化銨， 3-氯丙基三甲基氯化銨(CPTMAC)和3-溴丙基三曱基溴化銨 (BPTMAB)。優(yōu)選的電荷改性劑是3-溴丙基三甲基溴化銨(BPTMAB)。 改性的程度，即交聯(lián)涂層上與所述電荷改性化合物反應的反應性 基團的百分數(shù)，需要足夠高以確保溶質(zhì)主要通過電荷相互作用與膜表 面相互作用。例如，PEI具有氫鍵供體基團(仲胺)，如果不能轉(zhuǎn)變 為季銨基團或者被季銨基團覆蓋則將降低洗脫病毒的產(chǎn)率。優(yōu)選的改 性度為至少10%,更優(yōu)選為至少20%，并最優(yōu)選為至少30%。由于 PEI重復單元和BPTMAB的相對尺寸(空間限制)，事實上不可能實
10現(xiàn)遠高于50%的改性度。
形成涂覆基材的優(yōu)選過程包括1)制備涂層聚合物和交聯(lián)劑的溶 液，并調(diào)節(jié)pH使得聚合物易與交聯(lián)劑反應；2)將多孔結(jié)構(gòu)浸沒在來 自l)的溶液中；3)從溶液中移出所述多孔結(jié)構(gòu)并去掉過量的液體； 4)干燥所述多孔材料以進行交聯(lián)5)將所述多孔結(jié)構(gòu)浸沒在含有電 荷改性化合物的溶液中 一定時間；6)從電荷改性化合物溶液中移出所 述多孔結(jié)構(gòu)，用水沖洗并干燥。
現(xiàn)在轉(zhuǎn)至圖1,描繪了根據(jù)某些實施方式的膜結(jié)構(gòu)。在所示的實 施方式中，微孔超高分子量聚乙烯膜首先在其表面上采用自由基引發(fā) 劑和UV活化通過共聚合二甲基丙晞酰胺和亞曱基-二-丙烯酰胺進行 改性。按此方式進行改性的這些膜具有約0.65 pm的孔徑并且可由 Entegris, Inc.商業(yè)提供，稱之為MPLC。這些膜的特征在于其表面的低 蛋白結(jié)合；與該膜結(jié)合的IgG為40~ 50 ug/cm2，高于DURAPORE 膜2 3倍，但6~7倍低于Immobilon P和其他類似的商業(yè)提供的疏 水性、高結(jié)合性膜。
改性膜用含有聚乙烯亞胺(PEI)和交聯(lián)劑，聚乙二醇二縮甘油 醚(PEG-DGE)的溶液涂覆。涂層在室溫下干燥并固化24小時，用水清 洗，并進一步用通過氫氧化鈉保持在pH13的3-溴丙基三甲基溴化銨 (BPTAB)的50%水溶液進行改性。
所得膜在表面上具有高密度的正電荷，這由負電荷染料例如 Ponceau S的高吸附所指示。所述膜在苛性介質(zhì)中穩(wěn)定并能制造為大 量裝置。它能容易地起皺褶、熱密封或外鑄模。
以下實施例包括在本文中用于描迷的目的而非旨在限制本發(fā)明。
實施例1.將6x6"的孔徑為0.65 pm的親水性化聚乙烯膜片材用 含有7重量o/。的聚乙烯亞胺(Sigma-Aldrich)， 0.35%的聚乙二醇二縮水 甘油醚(Sigma-Aldrich)和0.03 M氬氧化鈉的水溶液涂覆。去掉過量 的溶液并使所述膜千燥過夜。隨后用水清洗并浸沒在100 mL的3-溴 丙基三曱基溴化銨(BPTMAB)和0.1 M氫氧化鈉的50重量％溶液中。 所述膜放置在該溶液中48小時，周期性加入NaOH以保持pH為13. 然后從溶液中取出所迷膜，用水清洗并干燥。
實施例2.在實施例中制備的膜用于腺病毒純化。首先通過冷凍 和解凍的多次循環(huán)從受感染的細胞中提取出腺病毒。通過離心去掉細
ii胞碎片在上清液中留下存活的病毒顆粒。用核酸酶處理上清液。進一
步通過將其流經(jīng)過微孔0.2 pm濾膜凈化上清液。所述溶液用平衡緩沖 液，pH8.0， NaCl濃度100mM稀釋。相同緩沖液用于純化膜的調(diào)理。 病毒溶液緩慢地通過吸附病毒顆粒的膜，使得大部分細胞碎片流過濾 膜。然后用清洗緩沖液，pH 8.0, NaCl濃度200 ~ 250 mM清洗所述 膜，從而移除任何微弱結(jié)合的碎片。最后，用洗脫援沖液，pH 8.0, NaC11000 mM,將病毒從所述膜上洗脫下來。
通過自行(in house)開發(fā)的綠色熒光蛋白(GFP)檢驗評估病毒濃 度。圖2顯示了綠色焚光區(qū)域(在顯微鏡下觀察)如何與病毒顆粒濃 度相關(guān)。大多數(shù)據(jù)是利用3-天GFP檢驗獲得的。病毒保持和洗脫數(shù)椐 在圖3中。
本發(fā)明的吸著介質(zhì)的一個特征是制成的腺病毒的高產(chǎn)率和純度。 圖3中的空心棒對應于從細胞溶解產(chǎn)物中俘獲的腺病毒，而實心棒指 示從膜上回收的病毒的百分比。該數(shù)據(jù)所表明的高病毒回收(>70%) 使得該介質(zhì)非常適用于腺病毒用途。
用凝膠電泳分析病毒顆粒的純度，這顯示在圖4中。可以看到本 發(fā)明的膜，PEI-BPTMAB，提供了洗脫病毒懸浮液的高純度，這優(yōu)于 由較弱的BSA帶所指示的商業(yè)膜A。
實施例4.采用反應混合物中各種濃度的BPTMAB根據(jù)實施例1制備 膜，這形成不同程度的改性。圖5顯示利用BPTMAB的PEI改性程 度對洗脫病毒的百分比有直接影響。
1權(quán)利要求
1. 一種多孔性吸著介質(zhì)，其包括具有第一外側(cè)和第二外側(cè)的基材，兩側(cè)均為多孔性的，且之間具有多孔性的厚度，所述基材為親水性的，并且具有基本覆蓋所述基材固體基質(zhì)和所述第一和第二外表面的吸著材料，所述吸著材料包括具有通過非極性聯(lián)接基連接的季銨離子官能性的交聯(lián)聚合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的多孔性吸著介質(zhì)，其中，所述基材包括微孔膜。
3. 如權(quán)利要求2的多孔性吸著介質(zhì)，其中，所述膜包括聚烯烴。
4. 如權(quán)利要求3所述的多孔性吸著介質(zhì)，其中，所述聚烯烴是聚乙烯。
5. 如權(quán)利要求1所述的多孔性吸著介質(zhì)，其中，所述基材是超高分子量聚乙烯膜。
6. 如權(quán)利要求1所述的多孔性涂敷介質(zhì)，其中，所述交聯(lián)聚合物包括聚乙烯亞胺。
7. 如權(quán)利要求1所述的多孔性涂敷介質(zhì)，其中，所述交聯(lián)聚合物用電荷改性劑進行改性，所述電荷改性劑包括具有通過所述非極性聯(lián)接基與能和所述交聯(lián)聚合物進行反應的部分相連的季銨離子基團的有機化合物。
8. 如權(quán)利要求7所迷的多孔性涂敷介質(zhì)，其中，所述有機化合物可具有式Y(jié)-Z-N(CH3)3+X-，其中，Y是反應性離去基團，Z是非極性脂肪族或芳香族聯(lián)接基，X是水溶性酸帶有負電荷的離子。
9. 如權(quán)利要求8所述的多孔性涂敷介質(zhì)，其中，Y是選自由Br'、Cr、 r、 TsCr和CF3S(V構(gòu)成的組的成員，Z是(CH2)。，其中n為2-10。
10. 如權(quán)利要求6所述的多孔性涂敷介質(zhì)，其中，通過3-溴丙基三甲基溴化銨將所述季銨鹽官能性引入到所述聚乙烯亞胺中。
11. 一種純化病毒的方法，所述方法包括將含有所述病毒的溶液通過膜以吸附所述病毒，所述膜包括具有第一外側(cè)和第二外側(cè)的基材，兩側(cè)均為多孔性的，且之間具有多孔性的厚度，所迷基材為親水性的，并且具有基本覆蓋所迷基材固體基質(zhì)和所述第一和第二外表面的吸著材料，所述吸著材料包括通過非極性聯(lián)接基連接的季銨離子官能性的交聯(lián)聚合物；用緩沖液沖洗所述膜；將所述病毒從所述膜上洗脫。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所迷交聯(lián)聚合物用電荷改性劑進行改性，所述電荷改性劑包括具有通過所述非極性聯(lián)接基與能物。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述有機化合物可具有式Y(jié)-Z-N(CH3)3+X-，其中，Y是反應性離去基團，Z是非極性脂肪族或芳香族聯(lián)接基，X是單價水溶性酸帶有負電荷的離子。
14. 一種陰離子交換劑，所述陰離子交換劑包括多孔性吸著介質(zhì)，所述多孔性吸著介質(zhì)包括具有第一外側(cè)和第二外側(cè)的基材，所述兩側(cè)均為多孔性的，且之間具有多孔性的厚度，所述基材為親水性的，并且具有基本覆蓋所述基材固體基質(zhì)和所述第一和第二外表面的吸著材料，所述吸著材料包括具有通過非極性聯(lián)接基連接的季銨離子官能性的交聯(lián)聚合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于色譜用途的介質(zhì)，其中，所述介質(zhì)是具有涂覆有諸如聚乙烯亞胺等聚合物的表面的膜。所述固定聚合物涂層用電荷改性劑進行改性從而使介質(zhì)具有季銨離子官能性。所述介質(zhì)非常適合于病毒的色譜純化。
文檔編號B01J20/285GK101474552SQ20081017627
公開日2009年7月8日 申請日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日
發(fā)明者M·科茲洛夫 申請人:米利波爾有限公司