專利名稱：過濾方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序中的蛋白制劑中間制品的過濾 方法以及該方法中使用的病毒清除過濾器。
背景技術：
由于擔心在抗體藥品、重組蛋白藥品、血漿制劑、血漿分級制劑等蛋白制劑中混入 來源于原料、來源于工序的病毒，因而在制造這些蛋白制劑的過程中需要對病毒進行失活 或者清除。
作為可能會混入蛋白制劑中的病毒的失活方法，可以進行加熱處理或使用化學藥 品的處理等，但僅通過這些單獨的處理病毒的失活并不充分，另外這些方法可能會使蛋白 制劑中的有用蛋白質(zhì)本身變性。在此背景下，作為不伴隨化學變性的物理性病毒消除方法， 使用過濾膜來分離清除病毒。
作為病毒清除用的過濾膜，已知有由纖維素之類的天然材料形成的膜、或者由聚 偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PEQ之類的合成高分子材料形成的病毒清除膜(非專利文獻 1 4)。
利用裝填了這些病毒清除膜的病毒清除裝置進行的蛋白制劑中間制品的過濾，希 望能夠在短時間內(nèi)過濾更多量的蛋白質(zhì)，并且能夠以充分高的病毒清除性能清除病毒。但 實際上，例如纖維素膜在即使20mg/ml以上的蛋白質(zhì)濃度下也能夠進行過濾而不易發(fā)生膜 堵塞，但耐壓性低，實際使用壓力只能提高到IOOkPa左右，或者，合成高分子膜雖然耐壓性 高、實際使用壓力即使提高到300kPa左右也沒問題，但若蛋白質(zhì)濃度提高至20mg/ml左右 則存在引起膜的堵塞、造成無法過濾的問題。因此，一般只能進行10mg/ml以下的低濃度下 的過濾(專利文獻1)。
從這些理由來看，在使通過各種色譜法或超濾法等純化工序濃縮了的、高蛋白質(zhì) 濃度的蛋白制劑中間制品在高壓下流過病毒清除裝置的過濾條件下的過濾方法的研究并 沒有進展，另外適用于該方法的病毒清除過濾器的開發(fā)也沒有進展。
另外蛋白制劑中間制品是用于制造蛋白制劑的貴重材料，且在制造規(guī)模中確定病 毒清除工序的過濾方法、運轉(zhuǎn)條件在時間上經(jīng)濟上都伴隨著困難，因此本發(fā)明人強烈意識 到，預先在小規(guī)模中確定了病毒清除工序的過濾方法、蛋白制劑中間制品的蛋白質(zhì)濃度、病 毒清除過濾器的入口壓力、和/或過濾時間的運轉(zhuǎn)條件，并將其應用于放大后的蛋白制劑 的制造工序的重要性。
專利文獻1 日本特開2004-277323號公報
非專禾Ij文獻 1 :Manabe. S,Removal of virus through novelmembrane filtration method.，Dev. Biol. Stand.，(1996)88 :81-90.
__專禾Il文獻2 Brandwein H等· ,Membrane filtration for virus removal. ,Dev Biol(Basel).，(2000) 102 :157-63.
非專利文獻 3 :Aranha-Creado 等，Clearance of murine leukaemia virus from monoclonalantibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter., Biologicals. (1998) Jun ； 溈⑵ J67-72.
非專利文獻4 :LMoce-Llivina等,Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes infiltering viral suspensions, Journal of Virological Methods, (2003)April, Vol. 109，Issue 1，Pages 99—101.發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
鑒于上述問題，本發(fā)明的課題在于提供在使高蛋白質(zhì)濃度的蛋白制劑中間制品在 高壓力下流過病毒清除過濾器的條件下的、蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序的過濾方 法，并提供該方法中使用的病毒清除過濾器。
用于解決問題的方案
本發(fā)明人等為解決上述課題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，通過使用下述過濾方法， 能夠確定放大(scale up)至工業(yè)規(guī)模時的蛋白制劑中間制品的蛋白質(zhì)濃度、病毒清除過濾 器的入口壓力、和/或過濾時間這些運轉(zhuǎn)條件，對病毒清除工序設備的設計也有用，從而完 成了本發(fā)明。所述過濾方法使用下述病毒清除過濾器，在蛋白制劑中間制品的入口壓力為 150kPa以上且600kPa以下、平均蛋白過濾速度為1. 0kg/m2/Hr以上的條件下，向該病毒清 除過濾器中流過通過純化工序使蛋白質(zhì)濃度提高到20mg/ml以上且100mg/ml以下的蛋白 制劑中間制品，且過濾時間為1小時以上且5小時以下，從而得到病毒清除率LRV彡3的蛋 白制劑中間制品的濾液。所述病毒清除過濾器具有至少分別有一個蛋白制劑中間制品的入 口和出口的容器和用于清除病毒的病毒清除膜，容器內(nèi)空間被病毒清除膜分隔為蛋白制劑 中間制品的入口側(cè)空間和出口側(cè)空間，蛋白制劑中間制品的入口、出口中至少入口為具有 600kPa以上耐壓性的嵌合結構的噴嘴，病毒清除膜的有效膜面積為0. OOOlm2以上且0. 03m2 以下。
即本發(fā)明包括以下。
[1] 一種過濾方法，其是將蛋白制劑中間制品在規(guī)定的蛋白質(zhì)濃度及壓力下流過 病毒清除過濾器的過濾方法，其中，
(1)使用下述病毒清除過濾器具有至少分別有一個蛋白制劑中間制品的入口 和出口的容器和用于清除病毒的病毒清除膜，容器內(nèi)空間被病毒清除膜分隔為蛋白制劑 中間制品的入口側(cè)空間和出口側(cè)空間，蛋白制劑中間制品的入口、出口中至少入口為具有 600kPa以上耐壓性的嵌合結構的噴嘴，病毒清除膜的有效膜面積為0. OOOlm2以上且0. 03m2 以下，
(2)在蛋白制劑中間制品的入口壓力為以上且eOOltfa以下、平均蛋白過濾 速度為1. 0kg/m2/Hr以上的條件下，向該病毒清除過濾器中流過通過純化工序使蛋白質(zhì)濃 度提高到20mg/ml以上且100mg/ml以下的蛋白制劑中間制品，且過濾時間為1小時以上且 5小時以下，
(3)得到病毒清除率LRV彡3的蛋白制劑中間制品的濾液。
[2]根據(jù)[1]所述的過濾方法，向[1]所述的病毒清除過濾器中，
(4)在蛋白制劑中間制品的入口壓力為以上且eOOltfa以下、平均蛋白過濾速度為1.0kg/m7Hr以上的條件下，流過通過純化工序使蛋白質(zhì)濃度提高到20mg/ml以上 且100mg/ml以下的蛋白制劑中間制品，且過濾時間為3小時以上且5小時以下，
(5)得到病毒清除率LRV彡3的蛋白制劑中間制品的濾液。
[3]根據(jù)[1]或[2]所述的過濾方法，病毒是選自細小病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、黃病 毒科、呼腸孤病毒科、副粘病毒科、皰疹病毒科、小核糖核酸病毒科、乳多空病毒科中的任一 種病毒。
[4]根據(jù)[1]至[3]中任一項所述的過濾方法，蛋白制劑中間制品中的蛋白質(zhì)為免 疫球蛋白。
[5]根據(jù)[4]所述的過濾方法，免疫球蛋白為免疫球蛋白G。
[6]根據(jù)[1]至[5]中任一項所述的過濾方法，病毒清除膜由經(jīng)親水化的合成高分 子形成。
[7]根據(jù)[1]至[6]中任一項所述的過濾方法，病毒清除膜為中空纖維型病毒清除膜。
[8] 一種方法，其采用[1]至[7]中任一項所述的過濾方法的蛋白質(zhì)濃度和入口壓 力條件作為放大時的運轉(zhuǎn)條件。
[9]根據(jù)[8]所述的方法，其還采用[1]至[7]中任一項所述的過濾方法的過濾時 間作為放大時的運轉(zhuǎn)條件。
[10] 一種病毒清除過濾器，其是用于[1]至[7]中任一項所述的過濾方法中的病 毒清除過濾器，其具有至少分別有一個蛋白制劑中間制品的入口和出口的容器和用于清除 病毒的病毒清除膜，容器內(nèi)空間被病毒清除膜分隔為蛋白制劑中間制品的入口側(cè)空間和出 口側(cè)空間，蛋白制劑中間制品的入口、出口中至少入口為具有600kPa以上耐壓性的嵌合結 構的噴嘴，病毒清除膜的有效膜面積為0. OOOlm2以上且0. 03m2以下。
[11]根據(jù)[10]所述的病毒清除過濾器，病毒清除膜為中空纖維型病毒清除膜。
[12]根據(jù)[10]或[11]所述的病毒清除過濾器，其中，病毒清除膜是具有開孔率大 的粗大結構層和開孔率小的致密結構層、且含有熱塑性樹脂的微多孔膜，該粗大結構層至 少存在于一側(cè)的膜表面，其厚度為5. Ομπι以上，該致密結構層的厚度為膜厚度總體的50% 以上，并且該病毒清除膜是該粗大結構層和該致密結構層一體化而成的多層微多孔膜。
發(fā)明的效果
通過使用本發(fā)明的過濾方法，能夠確定在使高蛋白質(zhì)濃度的蛋白制劑中間制品在 高壓力下流過病毒清除過濾器的條件下的、蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序的運轉(zhuǎn)條 件。即預先在小規(guī)模下確定了病毒清除工序的過濾方法、蛋白制劑中間制品的蛋白質(zhì)濃度、 病毒清除過濾器的入口壓力、和/或過濾時間的運轉(zhuǎn)條件，能夠?qū)⑵鋺糜诜糯蠛蟮牡鞍?制劑的制造工序。放大只需與蛋白制劑中間制品的體積增加比率成比例地增加病毒清除過 濾器的膜面積即可。
另外作為附加的效果，還用于進一步改善蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序， 而且，還能夠用于設計能夠以更短時間制造更大量的蛋白制劑的病毒清除工序。
具體實施方式
確定蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序的運轉(zhuǎn)條件時，重要的項目為蛋白制劑6中間制品的平均蛋白過濾速度和病毒清除率。過濾速度通常與蛋白質(zhì)濃度呈負相關，若蛋 白質(zhì)濃度變高則過濾速度降低，因此所花費的過濾時間長，是不優(yōu)選的。為了降低蛋白質(zhì)濃 度而追加稀釋工序，在設備方面也會造成成本增加，是不優(yōu)選的。為了在蛋白質(zhì)濃度為高濃 度的狀態(tài)下進行過濾而不降低過濾速度，前提是病毒清除過濾器自身的耐壓為600kPa以 上，只要使用以下的病毒清除過濾器即可，該病毒清除過濾器具有至少分別有一個入口和 出口的容器和用于清除病毒的病毒清除膜，容器內(nèi)空間被病毒清除膜分隔為蛋白制劑中間 制品的入口側(cè)空間和出口側(cè)空間，入口的結構為設有具有600kPa以上耐壓性的嵌合結構 的噴嘴。
在此所說的設有具有600kPa以上耐壓性的嵌合結構的噴嘴，例如有魯爾鎖定 (Luer lock)式噴嘴、或一觸式(one touch)連接噴嘴(例如SMC公司制造的hch-size One-touch Mini.Inch-size One-Touch fittings、0ne_touch Mini (以上注冊商標)等)、 接頭(coupler)式噴嘴、卡套(ferrule)式噴嘴等，這些噴嘴均可以使用。除這些以外，只 要是能不漏液地送進濾液、且設有具有600kPa以上耐壓性的嵌合結構的噴嘴，當然能夠適 用于本發(fā)明。
另外，病毒清除膜的有效膜面積需要在0.0001m2以上且0.03m2以下。若大于 0. 03m2，則過濾中所需的蛋白制劑中間制品的量變?yōu)榇罅?，因此產(chǎn)生評價成本增加的問題。 另一方面，若有效膜面積減小至低于0. 0001m2，則產(chǎn)生如下問題過濾量變少，用于評價病 毒清除性能的蛋白制劑中間制品的體積過小，難以對病毒進行定量。因此，0.0001m2以上 且0. 03m2以下是合適的。優(yōu)選為0. 0003m2以上且0. 02m2以下，更優(yōu)選為0. 0005m2以上且 0. Olm2以下，最優(yōu)選為0. 0007m2以上且0. 002m2以下。
另外，病毒清除膜的有效膜面積是指病毒清除膜的表面積中蛋白制劑中間制品能 夠通過的部分的面積。病毒清除膜為中空纖維的情況下，從中空纖維的內(nèi)側(cè)向外側(cè)過濾時， 是指中空纖維內(nèi)側(cè)的表面積中蛋白制劑中間制品能夠通過的部分的面積；從中空纖維的外 側(cè)向內(nèi)側(cè)過濾時，是指中空纖維外側(cè)的表面積中蛋白制劑能夠通過的部分的面積。另外，病 毒清除膜為平板膜的情況下，是指流入蛋白制劑中間制品一側(cè)的表面的表面積中蛋白制劑 中間制品能夠通過的部分的面積。
病毒清除膜的有效膜面積的調(diào)整具有以下特征在中空纖維型過濾器中，通過增 減中空纖維的根數(shù)能夠容易地實現(xiàn)放大(scale up)和縮小(scale down)，由于放大和縮小 時不存在大的干擾因素，因此容易得到可縮放性(scalability)。即，可認為在中空纖維型 過濾器的情況下，當膜面積改變時，則僅過濾體積發(fā)生改變，而能夠維持過濾性能。由膜面 積改變而造成的影響即為由濾液增減而造成的影響。如前所述，若過少，則對病毒的定量產(chǎn) 生不利影響，若過多，則對操作的便利性和成本帶來影響。平板膜的情況下，顯著的放大雖 改變膜的形狀(由圓盤型到筒型等)，但也認為只帶來同樣的影響。蛋白制劑制造工序中的 病毒清除工序的工序設計能夠通過小規(guī)模實施，而無需實際生產(chǎn)規(guī)模，這依賴于這樣的可 縮放性的可靠性。
作為病毒清除過濾器，可以利用具有前述結構的過濾器。膜的形狀可以利用平 板膜結構或中空纖維結構的膜，優(yōu)選為中空纖維結構的膜。作為膜的材質(zhì)，可以利用具有 600kPa以上耐壓性的物質(zhì)。例如，優(yōu)選以聚偏氟乙烯(PVDF)或聚醚砜(PES)、聚砜(PS)這 樣的合成高分子作為材料的、具有親水性的膜。重要的一點是具有600kPa以上耐壓性這點ο
作為使以合成高分子作為材料的膜具有親水性的方法，已知有使具有一個乙烯基 的親水性乙烯基單體在微多孔膜的微孔表面以3%以上且50%以下的接枝(graft)率進 行接枝聚合的方法(國際公開第2004/035180號小冊子)、介由交聯(lián)劑使由多官能度丙烯 酸酯或甲基丙烯酸酯形成的高分子結合的方法(日本特開2000-1548號公報)、以及使含 有聚合引發(fā)劑和親水性單體的溶液浸漬于膜中而在微孔中進行聚合的方法(國際公開第 91/16968號小冊子)等多種方法。使之具有親水性的目的在于，提高以疏水性的合成高分 子作為材料的膜的蛋白制劑中間制品的過濾性。因此，使之具有親水性的方法不限于在此 列舉的例子。
另外，在此所說的接枝率由下述式子所定義。
接枝率(％) = 100XK接枝后的膜質(zhì)量-接枝前的膜質(zhì)量)/接枝前的膜質(zhì)量}
膜的結構優(yōu)選為沿著蛋白制劑中間制品流動的方向，上游側(cè)存在孔徑大且空孔 率高的粗大結構層，下游側(cè)存在孔徑小而適于清除病毒的致密結構層，粗大結構層和致密 結構層的連接為孔徑連續(xù)地變化的梯度結構。
另外，更加優(yōu)選的膜的結構優(yōu)選為多層微多孔膜，其是具有開孔率大的粗大結構 層和開孔率小的致密結構層、且含有熱塑性樹脂的微多孔膜，該粗大結構層至少存在于一 側(cè)的膜表面，其厚度為5. 0 μ m以上，該致密結構層的厚度為膜厚度總體的50%以上，并且 該粗大結構層和該致密結構層處于一體化的狀態(tài)。
另外，前述粗大結構層優(yōu)選為部分開孔率由膜表面向致密結構層連續(xù)減少的傾斜 結構，并且僅存在于膜表面的一側(cè)。該膜可以按照例如日本特開平11-319522號公報、或日 本特開平9-169867號公報、國際公開第2004/035180號小冊子中公開的方法進行制造。
作為評價中使用的病毒，能夠從可能混入到蛋白制劑中的相關病毒或特異性模型 病毒、非特異性模型病毒中任意地選擇。在此所說的相關病毒、特異性模型病毒、非特異性 模型病毒的定義與日美歐藥品注冊國際協(xié)調(diào)會議(ICH)準則中所記載的定義相同。即，相 關病毒是指與已知在蛋白制劑的制造工序中使用的細胞基材、其他的試劑類或各種物質(zhì) 中共存的或可能存在的病毒的種類相同或同種的病毒。特異性模型病毒是指與已知存在 的、或懷疑存在的病毒密切相關的病毒。即被定義為相同屬或科的病毒，其與檢測出的病毒 或懷疑存在的病毒具有相似的物理和化學性質(zhì)。非特異性模型病毒被定義為用于病毒清除 工序特性解析試驗中的病毒，所述試驗是為了分析制造工序在病毒的清除或失活方面通常 具有何種程度的能力、即為了分析工序可靠地發(fā)揮病毒清除能力方面的特性(robustness) 而進行的。
例如，制劑為單克隆抗體等由來自于小鼠的基材而制造的情況下，作為相關病毒 或特異性模型病毒，可以使用小鼠白血病病毒等逆轉(zhuǎn)錄病毒、小鼠微小病毒(minute virus of mice, MVM)等細小病毒、牛腹瀉病毒等黃病毒。作為非特異性模型病毒，可以將豬細小 病毒等細小病毒作為最小尺寸的病毒模型而使用。
另外，制劑為血漿分級制劑等由來自于人血漿的基材而制造的情況下，作為相關 病毒，可以使用人細小病毒B19(細小病毒科)或HIV病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒科)等；作為B19 特異性模型病毒可使用豬細小病毒(細小病毒科)；作為丙型肝炎病毒特異性模型病毒可 使用牛腹瀉病毒(黃病毒科)等。同樣地只要從單純皰疹病毒、假性狂犬病病毒等皰疹病毒科、或副流感病毒等副粘病毒科、呼腸孤病毒3型等呼腸孤病毒科、脊髓灰質(zhì)炎病毒等小 核糖核酸病毒科、SV40病毒等乳多空病毒科等中選擇使用即可。關于使用病毒的選擇，應 該根據(jù)ICH等公知要求事項來確定。
將一定量的這些用于評價的病毒添加到蛋白制劑中間制品中，測定利用病毒清除 過濾器過濾前后的病毒量，從而測定病毒清除性能評價。此時添加的病毒量可以由必要的 病毒清除率逆運算而求出。但是，共存于病毒溶液中的混雜物(雜質(zhì))可能引起過濾器網(wǎng)眼 堵塞，可能會對過濾試驗產(chǎn)生弊病，因而希望根據(jù)該病毒溶液的純度調(diào)整添加的病毒量。病 毒溶液被純化的情況下，相對于蛋白制劑中間制品的體積可以添加10%體積以下的病毒溶 液，優(yōu)選為至5%體積以下，更優(yōu)選為體積以下，但未被純化而含有很多混雜物的情況 下，希望添加體積以下、優(yōu)選為0.5%體積以下、更優(yōu)選為0. 體積以下的很少的量。 但是，希望添加能夠檢測到LRV ^ 3的必要最低限的量以上體積的病毒溶液。
另外，在此所言的病毒清除率LRV，是以對數(shù)值表示用病毒清除過濾器過濾后的溶 液的病毒量相對于過濾前的溶液的病毒量的降低率而得到的值。例如，可由下述式子計算。
LRV = Iog10A-Iog10B
其中，A =用病毒清除過濾器過濾前的溶液的病毒濃度
B =用病毒清除過濾器過濾后的溶液的病毒濃度
另外，根據(jù)病毒的制備方法，有時含有大量的混雜物，給過濾速度帶來較大的損 害。這種情況下，只要純化病毒、分離混雜物后再使用即可。病毒的純化法、如使用超速離 心分離的方法等是公知的。
設定滿足病毒清除過濾器的病毒清除率LRV為3以上的條件。比病毒清除過濾 器的孔徑更大的尺寸的病毒的清除率通常為LRV ^ 3，另一方面比病毒清除過濾器的孔徑 更小的尺寸的病毒的清除率通常為LRV < 3 (泉浩業(yè)等，有關血漿分級制劑的安全性的研 究II.單克隆抗體純化干燥濃縮人血液凝固第VIII因子制劑(々α ζ工4卜Μ(注冊商 標))及肌肉注射用人免疫球蛋白制劑(抗HBs人免疫球蛋白“日赤”(注冊商標)、人免疫 球蛋白“日赤(注冊商標)”)的制造工序中的病毒除去膜的效果，Japanese Journal of Transfusion Me dicine, (1999), Vol. 45. No. 3, Pages 357-361·)。此時，當然不是清除率 一定為LRV = 0，有時能得到3以下的一定程度的清除率，但認為這并不是病毒清除過濾器 的尺寸分離本來應有的清除率，而是由于病毒分子的部分聚集或吸附而產(chǎn)生的。因此，意在 清除尺寸為過濾器的孔徑以上的病毒時，應該滿足LRV彡3以上的清除率。
作為本發(fā)明的過濾方法中使用的蛋白制劑中間制品，能夠適用抗體藥物中間制 品、重組蛋白藥物中間制品、血漿制劑中間制品、血漿分級制劑中間制品等，但特別優(yōu)選免 疫球蛋白制劑中間制品。進一步優(yōu)選為免疫球蛋白G制劑中間制品，最優(yōu)選為免疫球蛋白 G的單克隆抗體制劑中間制品。
首先不對這些蛋白制劑中間制品進行病毒添加，用病毒清除過濾器裝置進行過 濾，由此評價蛋白制劑中間制品的平均蛋白過濾速度。在蛋白質(zhì)濃度為20mg/ml以上且 100mg/ml以下的高濃度、且蛋白制劑中間制品的入口壓力為150kPa以上且600kPa以下的 高壓條件下，進行1小時以上且5小時以下過濾，由此評價平均蛋白過濾速度(kg/m2/Hr)。 確認平均蛋白過濾速度為1.0kg/m7Hr以上的蛋白質(zhì)濃度以及壓力條件后，在該蛋白質(zhì)濃 度和壓力范圍內(nèi)，向蛋白制劑中間制品中添加規(guī)定量的病毒，用病毒清除過濾器進行過濾，由此評價病毒清除工序的病毒清除性能。
蛋白制劑的制造工序中1批的制造量有總重量擴大化的傾向。蛋白制劑的1批的 總量(總重量)方面，有例如隨著抗體藥物制劑生產(chǎn)率提高的不斷進行，1批顯示50kg以 上的高生產(chǎn)能力的例子。在這樣的高生產(chǎn)能力的蛋白制劑中，從蛋白制劑中間制品的穩(wěn)定 性、制造工序的效率的方面來看，希望病毒清除工序這一個工序在1天內(nèi)完成。因此，病毒 清除過濾器的平均蛋白過濾速度應該在1. 0kg/m2/Hr以上。若為1. 0kg/m2/Hr以上，能夠以 1根4m2過濾器在12. 5小時以內(nèi)完成50kg的蛋白制劑中間制品的過濾，以2根4m2過濾器 在6. 25小時以內(nèi)完成50kg的蛋白制劑中間制品的過濾。
確認平均蛋白過濾速度為1.0kg/m2/Hr以上的蛋白質(zhì)濃度以及壓力條件后，在 該蛋白質(zhì)濃度和壓力范圍內(nèi)，向蛋白制劑中間制品中添加規(guī)定量的病毒，用病毒清除過濾 器進行過濾，由此評價病毒清除工序的病毒清除性能。即，選擇滿足病毒清除率LRV ^ 3 的蛋白制劑中間制品的蛋白質(zhì)濃度條件及入口壓力條件。在蛋白質(zhì)濃度為20mg/ml以上 且100mg/ml以下的高濃度、且蛋白制劑中間制品的入口壓力為150kPa以上且600kPa以 下的高壓下過濾時，同樣可以得到1.0kg/m2/Hr以上的平均蛋白過濾速度，并且確認具有 LRV ^ 3的病毒清除率，推測放大后的情況下的設備、操作條件等。另外，也可以省略不添加 病毒溶液而實施的平均蛋白過濾速度的測定，而用添加了病毒的體系同時進行測定。
另外，在蛋白質(zhì)濃度為高濃度下進行過濾時有以下優(yōu)點能夠防止過濾裝置和容 器和配管等由于放大而造成的成本增加。但另一方面，若濃度變得過高，則穩(wěn)定性方面產(chǎn) 生問題。因此，蛋白質(zhì)濃度在20mg/ml以上且100mg/ml以下實施，優(yōu)選為25mg/ml以上且 100mg/ml以下，更優(yōu)選為30mg/ml以上且100mg/ml以下，最優(yōu)選為30mg/ml以上且50mg/ ml以下。
過濾時的入口壓力為高壓時，有在短時間內(nèi)能夠迅速地進行過濾的優(yōu)點，但若 壓力過高，則壓力對裝置造成的損害或泄漏的風險增加，因此在入口壓力150kPa以上且 600kPa以下實施。優(yōu)選為196kPa以上且500kPa以下，更優(yōu)選為245kPa以上且400kPa以 下，進一步優(yōu)選為^4kPa以上且400kPa以下，最優(yōu)選為294 300kPa。優(yōu)選按照同時滿足 蛋白質(zhì)濃度以及入口壓力在上述范圍內(nèi)、平均蛋白過濾速度為1.0kg/m7Hr以上、并且LRV 為LRV > 3的方式，分散地取多點進行評價。
另外，使蛋白制劑中間制品流過病毒清除過濾器的過濾時間在1小時以上且5小 時以下，放大后時的蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序的時間設定方面，在即使增大病 毒清除過濾器的膜面積也想在短時間內(nèi)完成的情況下，可以將時間設定為短時間，在即使 稍微花費一些時間也要減小病毒清除膜的有效膜面積的情況下，可以將時間設定為長時 間。另外為了確定過濾開始后3小時后也滿足LRV ^ 3的條件，優(yōu)選使蛋白制劑中間制品 流過病毒清除過濾器，且過濾時間為3小時以上且5小時以下。
實施例
通過以下實施例，對本發(fā)明進行更加詳細的說明。
[實施例1]
作為病毒清除過濾器，使用下述的病毒清除過濾器，該過濾器具有有效膜面積 0. OOlm2的多層微多孔中空纖維膜，過濾器入口設有具有60 以上耐壓性的魯爾鎖定式 噴嘴，容器內(nèi)空間被中空纖維膜分隔為入口側(cè)空間和出口側(cè)空間，所述多層微多孔中空纖維膜是根據(jù)國際公開第2004/035180號小冊子實施例1中所示的方法、即對由具有600kPa 以上耐壓性的聚偏氟乙烯形成的微多孔中空纖維膜以親水性乙烯基單體(丙烯酸羥丙酯) 進行接枝率10%的接枝聚合而形成的親水化微多孔中空纖維膜，開孔率大的粗大結構層存 在于中空纖維膜的內(nèi)表面，其厚度為7.0 μ m，與其一體化的開孔率小的致密結構層的厚度 為膜厚度總體的80%。作為蛋白制劑中間制品的模型，使用濃度30mg/ml的人免疫球蛋白 G溶液(以0. IM食鹽水作為溶劑)，向該溶液中，添加0.5體積％豬細小病毒(PPV)液，用 具有35nm的孔徑的中空纖維過濾器(旭化成醫(yī)療株式會社制，PLAN0VA (注冊商標)35N)進 行預過濾。預過濾后的免疫球蛋白濃度為30mg/ml，PPV的濃度為6. 1 (TCID50/ml)。
使用上述過濾裝置，在294kPa的壓力下對含有該PPV的30mg/ml的人免疫球蛋白 G溶液實施5小時死端(Dead-end)式過濾。此時，平均蛋白過濾速度在過濾開始3小時后、 4小時后、5小時后分別為1. 9,1. 9,1. 8kg/m2/Hr?？梢栽谌我粫r間點，以1. 0 (kg/m2/Hr)以 上的高速過濾的濾液評價病毒清除率。過濾開始后至1小時為止的濾液、3小時為止的濾 液、5小時為止的濾液的病毒清除率均為LRV ^ 5. 6。
病毒清除工序的運轉(zhuǎn)條件可確定為如下條件蛋白制劑中間制品的蛋白質(zhì)濃度 30mg/ml、病毒清除過濾器入口壓力294kPa、過濾時間5小時以內(nèi)。
[實施例2 4]
作為病毒清除過濾器，使用下述的病毒清除過濾器，該過濾器具有有效膜面積0.OOlm2的多層微多孔中空纖維膜，過濾器入口設有具有60 以上耐壓性的魯爾鎖定式 噴嘴，容器內(nèi)空間被中空纖維膜分隔為入口側(cè)空間和出口側(cè)空間，所述多層微多孔中空纖 維膜是根據(jù)國際公開第2004/035180號小冊子實施例1中所示的方法、即對由具有600kPa 以上耐壓性的聚偏氟乙烯形成的微多孔中空纖維膜以親水性乙烯基單體(丙烯酸羥丙酯) 進行接枝率10%的接枝聚合而形成的親水化微多孔中空纖維膜，開孔率大的粗大結構層存 在于中空纖維膜內(nèi)表面，其厚度為7. Ομπι，與其一體化的開孔率小的致密結構層的厚度為 膜厚度總體的80%。作為蛋白制劑中間制品的模型，使用濃度30mg/ml的人免疫球蛋白G 溶液(以0. IM食鹽水作為溶劑)，向該溶液中分別添加0. 5體積％的下述3種病毒液從而 制作3種溶液。將這些溶液用具有35nm孔徑的中空纖維過濾器(旭化成醫(yī)療株式會社制， PLAN0VA (注冊商標)35N)進行預過濾。
病毒溶液1)小鼠白血病病毒(A-MuLV)(實施例2，病毒濃度5. 0)
病毒溶液2)呼腸孤病毒3型(Reo-3)(實施例3，病毒濃度5. 6)
病毒溶液3)小鼠微小病毒(MVM)(實施例4，病毒濃度5. 7)
使用上述病毒清除過濾器，在病毒清除過濾器入口壓力^4kPa的壓力下對這3種 30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(含病毒溶液)實施5小時死端(Dead-end)式過濾。
其結果，(實施例2)添加A-MuLV的情況下，過濾開始后至1小時、2小時、3小時、4 小時、5小時為止的過濾速度分別為2. 2,2. 0,1. 9,1. 7,1. 6kg/m2/Hr?？梢栽谌我粫r間點，以1.0 (kg/m2/Hr)以上的高速過濾的濾液評價病毒清除率。過濾開始后至1小時為止的濾液、3 小時為止的濾液、5小時為止的濾液的病毒清除率均為LRV ^ 4. 5。病毒清除工序的運轉(zhuǎn)條 件可確定為蛋白制劑中間制品的蛋白質(zhì)濃度30mg/ml、病毒清除過濾器入口壓力294kPa、 過濾時間5小時以內(nèi)。
(實施例3)添加Reo-3的情況下，過濾開始后至1小時、2小時、3小時、4小時、5小時為止的過濾速度分別為2. 5,2. 3,2. 1,2. 0,1. 8kg/m2/Hr。可以在任一時間點，以1. 0(kg/ m2/Hr)以上的高速過濾的濾液評價病毒清除率。過濾開始后至1小時為止的濾液、3小時 為止的濾液、5小時為止的濾液的病毒清除率均為LRV > 5. 1。病毒清除工序的運轉(zhuǎn)條件可 確定為蛋白制劑中間制品的蛋白質(zhì)濃度30mg/ml、病毒清除過濾器入口壓力294kPa、過濾 時間5小時以內(nèi)。
(實施例4)添加MVM的情況下，過濾開始后至1小時、2小時、3小時、4小時、5小 時為止的過濾速度分別為2. 4,2. 3,2. 1,2. 0,2. 0kg/m2/Hr?？梢栽谌我粫r間點，以1.0 (kg/ m2/Hr)以上的高速過濾的濾液評價病毒清除率。過濾開始后至1小時為止的濾液、3小時 為止的濾液、5小時為止的濾液的病毒清除率均為LRV ^ 5. 2。病毒清除工序的運轉(zhuǎn)條件可 確定為蛋白制劑中間制品的蛋白質(zhì)濃度30mg/ml、病毒清除過濾器入口壓力294kPa、過濾 時間5小時以內(nèi)。
[比較例1]
作為病毒清除過濾器，使用下述過濾裝置(旭化成醫(yī)療株式會社制，Plan0va(注 冊商標)20N)，其使用以具有IOOkPa耐壓性的纖維素作為材質(zhì)、且不含熱塑性樹脂的中空 纖維膜，中空纖維膜的入口和出口設有不具有600kPa以上耐壓性的寶塔型的噴嘴，容器 內(nèi)空間被有效膜面積0.001m2的中空纖維膜分隔為入口側(cè)空間和出口側(cè)空間。作為蛋白 制劑中間制品的模型，使用濃度30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(以0. IM食鹽水作為溶 劑)，向該溶液中添加0.5體積％豬細小病毒(PPV)液，用具有35nm孔徑的中空纖維過濾器 (Planova(注冊商標)35N)進行預過濾。預過濾后的免疫球蛋白濃度為30mg/ml，PPV的濃 度為5.9。
使用上述病毒清除過濾器，在給纖維素膜施加的上限壓力為98kPa的壓力下對該 30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(含有PPV)實施5小時死端(Dead-end)式過濾。
其結果，過濾開始后至1小時為止的濾液、5小時為止的濾液的病毒清除率均為 LRV彡5. 4。過濾速度在過濾開始1小時后、5小時后分別為0. 8,0. 7kg/m2/Hr,不滿足1. Okg/ m2/Hr。結果無法確定蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序的運轉(zhuǎn)條件。
[比較例2]
作為病毒清除過濾器，使用下述過濾裝置，其使用以具有600kPa以上耐壓性的親 水化聚偏氟乙烯作為材質(zhì)、且根據(jù)日本特公平7-71624號公報的例I中記載的方法制造的 平板膜，該平板膜表面具有致密的皮層，且相對于膜的厚度其致密結構層的厚度為20%以 下，平板膜的入口具有魯爾鎖定式噴嘴，容器內(nèi)空間被有效膜面積0. 0003m2的過濾器分隔 為入口側(cè)空間和出口側(cè)空間。作為蛋白制劑中間制品的模型，使用濃度30mg/ml的人免疫 球蛋白G溶液(以0. IM食鹽水作為溶劑)，向該溶液中，添加0. 5體積％豬細小病毒(PP V) 液，用具有35nm孔徑的中空纖維過濾器(Planova (注冊商標)35N)進行預過濾。預過濾后 的免疫球蛋白濃度為30mg/ml，PPV的濃度為5. 2。
使用上述病毒清除過濾器，在294kPa的壓力下對該30mg/ml的人免疫球蛋白G溶 液(含有PPV)實施5小時死端(Dead-end)式過濾。其結果，過濾開始后1小時為止的濾 液，由于過濾速度慢因而過濾體積過少，無法進行病毒濃度的測定。過濾開始后3小時為止 的濾液的病毒清除率為LRV ^ 4. 0。此時，過濾量在過濾開始3小時后為0. 09kg/m2，平均 每小時的過濾速度為0. 03kg/m2/Hr，不滿足1. 0kg/m2/Hr。
結果無法確定蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序的運轉(zhuǎn)條件。
[比較例3]
作為病毒清除過濾器，使用下述的病毒清除過濾器，該過濾器具有有效膜面積 0. OOlm2的微多孔中空纖維膜，過濾器入口設有具有eOOltfa以上耐壓性的魯爾鎖定式噴嘴， 容器內(nèi)空間被中空纖維膜分隔為入口側(cè)空間和出口側(cè)空間，所述微多孔中空纖維膜是根據(jù) 國際公開第2004/035180號小冊子實施例1中所示的方法、即對由具有600kPa以上耐壓性 的聚偏氟乙烯形成的微多孔中空纖維膜以親水性乙烯基單體(丙烯酸羥丙酯)進行接枝 率10%的接枝聚合而形成的、僅由粗大結構層組成的微多孔中空纖維膜。作為蛋白制劑中 間制品的模型，使用濃度30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(以0. IM食鹽水作為溶劑)，向 該溶液中，添加0.5體積％豬細小病毒(PPV)液。PPV的濃度為6.0。使用上述病毒清除過 濾器，在^4kPa的壓力下對該30mg/ml的人免疫球蛋白G溶液(含有PPV)實施5小時死 端(Dead-end)式過濾。平均蛋白過濾速度在過濾開始1小時后、3小時后、5小時后分別為 2. 3,2. 2,2. 0kg/m2/Hr。過濾開始后1小時為止的濾液、3小時前的濾液、5小時為止的濾液 的病毒清除率均為LRV = 0. 5，不滿足LRV ^ 3。結果無法確定蛋白制劑制造工序中的病毒 清除工序的運轉(zhuǎn)條件。
產(chǎn)業(yè)上的可利用件
本發(fā)明的過濾方法，能夠以非常小的規(guī)模收集對抗體藥物、重組蛋白藥物、血漿制 劑、血漿分級制劑等蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序的放大后的實際運轉(zhuǎn)條件的設 定、設備設計等有用的信息，因此對蛋白制劑制造產(chǎn)業(yè)非常有用。
權利要求
1.一種過濾方法，其是將蛋白制劑中間制品在規(guī)定的蛋白質(zhì)濃度及壓力下流過病毒清 除過濾器的過濾方法，其中(1)使用下述病毒清除過濾器具有至少分別有一個蛋白制劑中間制品的入口和出口 的容器和用于清除病毒的病毒清除膜，容器內(nèi)空間被病毒清除膜分隔為蛋白制劑中間制品 的入口側(cè)空間和出口側(cè)空間，蛋白制劑中間制品的入口、出口中至少入口為具有600kPa以 上耐壓性的嵌合結構的噴嘴，病毒清除膜的有效膜面積為0. OOOlm2以上且0. 03m2以下，(2)在蛋白制劑中間制品的入口壓力為150kPa以上且600kPa以下、平均蛋白過濾速 度為1. 0kg/m2/Hr以上的條件下，向該病毒清除過濾器中流過通過純化工序使蛋白質(zhì)濃度 提高到20mg/ml以上且100mg/ml以下的蛋白制劑中間制品，且過濾時間為1小時以上且5 小時以下，(3)得到病毒清除率LRV^ 3的蛋白制劑中間制品的濾液。
2.根據(jù)權利要求1所述的過濾方法，向權利要求1所述的病毒清除過濾器中，(4)在蛋白制劑中間制品的入口壓力為150kPa以上且600kPa以下、平均蛋白過濾速 度為1.0kg/m7Hr以上的條件下，流過通過純化工序使蛋白質(zhì)濃度提高到20mg/ml以上且 100mg/ml以下的蛋白制劑中間制品，且過濾時間為3小時以上且5小時以下，(5)得到病毒清除率LRV^ 3的蛋白制劑中間制品的濾液。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的過濾方法，病毒是選自細小病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、黃病 毒科、呼腸孤病毒科、副粘病毒科、皰疹病毒科、小核糖核酸病毒科、乳多空病毒科中的任一 種病毒。
4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的過濾方法，蛋白制劑中間制品中的蛋白質(zhì)為免 疫球蛋白。
5.根據(jù)權利要求4所述的過濾方法，免疫球蛋白為免疫球蛋白G。
6.根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的過濾方法，病毒清除膜由經(jīng)親水化的合成高分 子形成。
7.根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的過濾方法，病毒清除膜為中空纖維型病毒清除膜。
8.一種方法，其采用權利要求1至7中任一項所述的過濾方法的蛋白質(zhì)濃度和入口壓 力條件作為放大時的運轉(zhuǎn)條件。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其還采用權利要求1至7中任一項所述的過濾方法的 過濾時間作為放大時的運轉(zhuǎn)條件。
10.一種病毒清除過濾器，其是用于權利要求1至7中任一項所述的過濾方法中的病毒 清除過濾器，其具有至少分別有一個蛋白制劑中間制品的入口和出口的容器和用于清除病 毒的病毒清除膜，容器內(nèi)空間被病毒清除膜分隔為蛋白制劑中間制品的入口側(cè)空間和出口 側(cè)空間，蛋白制劑中間制品的入口、出口中至少入口為具有600kPa以上耐壓性的嵌合結構 的噴嘴，病毒清除膜的有效膜面積為0. OOOlm2以上且0. 03m2以下。
11.根據(jù)權利要求10所述的病毒清除過濾器，病毒清除膜為中空纖維型病毒清除膜。
12.根據(jù)權利要求10或11所述的病毒清除過濾器，其中，病毒清除膜是具有開孔率大 的粗大結構層和開孔率小的致密結構層、且含有熱塑性樹脂的微多孔膜，該粗大結構層至 少存在于一側(cè)的膜表面，其厚度為5. Ομπι以上，該致密結構層的厚度為膜厚度總體的50%以上，并且該病毒清除膜是該粗大結構層和該致密結構層一體化而成的多層微多孔膜。
全文摘要
本發(fā)明提供在使高蛋白質(zhì)濃度的蛋白制劑中間制品在高壓力下流過病毒清除過濾器的條件下的、蛋白制劑制造工序中的病毒清除工序的過濾方法。一種過濾方法，其使用至少入口為具有600kPa以上耐壓性的嵌合結構的噴嘴且病毒清除膜的有效膜面積為0.0001m2以上且0.03m2以下的病毒清除過濾器，在蛋白制劑中間制品的入口壓力為150kPa以上且600kPa以下、平均蛋白過濾速度為1.0kg/m2/Hr以上的條件下，向該病毒清除過濾器中流過通過純化工序使蛋白質(zhì)濃度提高到20mg/ml以上且100mg/ml以下的蛋白制劑中間制品，且過濾時間為1小時以上且5小時以下，從而得到病毒清除率LRV≥3的蛋白制劑中間制品的濾液。
文檔編號B01D69/08GK102036740SQ20098011866
公開日2011年4月27日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權日2008年5月22日
發(fā)明者柳田恒一郎 申請人:旭化成醫(yī)療株式會社