專利名稱：一種親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種親水、可多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片的制備方法、主體材料及其在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微流控芯片是把生物、化學、醫(yī)學分析等過程中的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等操作單元集成到郵票或信用卡大小的芯片上，并完成一系列功能的微型化裝置。它具有體積小、功能多、通量高、樣品及試劑消耗少等優(yōu)點，被稱為“改變世界”的七大技術(shù)之一。目前國內(nèi)外主要有三種不同體系的微流控芯片一、玻璃微流控芯片；二、聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片；三、熱塑性微流控芯片。不同的微流控芯片需要不同的制備方法。一、玻璃微流控芯片
玻璃(包括普通玻璃和石英玻璃)具有優(yōu)良的親水性、光學性、電滲性和耐腐蝕性，但玻璃的硬度和易脆性限制了玻璃的微加工。目前國內(nèi)、外主要采用刻蝕法制備玻璃微流控芯片(參見Harrison D. J. , Fan Ζ. H. , Anal. Chem. , 1992，64，1926-1932 ；Lahann J., Langer R., Anal. Chem., 2003，75，2117-2122)?？涛g是利用溶液(氫氟酸)、反應(yīng)離子(F 系氣體離子化)與預(yù)刻蝕材料(玻璃)之間的化學反應(yīng)來去除未被掩蔽膜材料掩蔽的部分而達到刻蝕目的?？涛g包括濕法刻蝕和干法刻蝕。濕法刻蝕具有如下優(yōu)點應(yīng)用范圍廣、選擇性好、重復(fù)性好、操作簡單、成本低。但是濕法刻蝕具有以下問題1、對圖形的控制性較差， 不能用于小的特征尺寸(微米級);2、會產(chǎn)生大量的化學廢液。而微流控芯片的分離、檢測通道都是微米級的，如何保證微米級玻璃微通道的完整性與精確性，成了濕法刻蝕必須解決的難題。干法刻蝕具有應(yīng)用范圍廣、分辨率高(可達0. 01 μ m)、重復(fù)性好、無化學廢液、易于自動操作等優(yōu)點。但干法刻蝕所需的設(shè)備昂貴、刻蝕速度慢、速率低。同時，高能離子對襯底的轟擊會造成襯底晶格損傷。而玻璃微流控芯片要在郵票或信用卡大小的玻璃上加工出微米級的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，密集的晶格損傷會導(dǎo)致整塊芯片的破損，因此干法刻蝕限制了玻璃微流控芯片的規(guī)模化生產(chǎn)。二、聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片
PDMS具有彈性，良好的光學性，化學惰性，無毒，容易加工等優(yōu)點，是另一種常用的微流控芯片制備材料(參見Duffy D. C. , Whitesides G. Μ. , Anal. Chem. , 1998，70， 4974-4984 Johnson Τ. J. , Locascio L. Ε.，Anal. Chem. , 2001，73，3656-3661)。 PDMS具有獨特的彈性，因此軟刻蝕法成為PDMS微流控芯片最常用的制備方法。軟刻蝕法利用彈性材料通過微接觸印刷、復(fù)制模塑等方法在表面帶圖案的硬模板上實現(xiàn)圖案的轉(zhuǎn)移和復(fù)制，為制作平面或曲面上的微米、納米圖案提供了簡便、有效、低成本的途徑。但PDMS 的強疏水性(參見Linder V.，Sigrist Μ. , Anal. Chem. , 2001，73，4181-4189)，不利于微流控芯片對生物樣品的分離?；瘜W改性(參見脅Y., Huang Y., Ma H. J.，J.Am. Chem. Soc. , 2007，129，72洸_7227)和氧等離子法(參見Mukhopadhyay R.，Anal. Chem. , 2006，78，5969-5972)可以修飾PDMS的表面，改善其疏水性。氧等離子法修飾效果明顯，但有效期短，修飾7天后基本回復(fù)PDMS原有的強疏水性?；瘜W改性所需時間長、步驟多、改性效率低，重復(fù)性差。此外，PDMS材料中可利用的活性基團少，難以化學鍵合以集成其他操作單元。而且，PDMS在有機溶劑中會溶脹，限制了 PDMS微流控芯片在有機溶劑中的使用(參見LeeJ. N. , Whitesides G. Μ. , Anal. Chem. , 2003，75，6544-6554)。三、無定型熱塑性微流控芯片
一些無定型熱塑性材料(聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，聚氯乙烯PVC，聚碳酸酯PC，聚氨酯 PU等)具有透明性好、機械強度較低、柔韌性好等特點，成為微流控芯片制備材料的另一種選擇(參見Brown L. , Oleschuk R. D. , Lab Chip, 2006，6，66-73 ；Bai Y. L. , Yang S. Τ.，Langmuir, 2006，22，9458-9467 ；Flachsbart B. R.，Shannon Μ. Α.，Lab Chip, 2006, 6，667-674)。無定形熱塑性材料的特征溫度是玻璃化溫度(Tg)，當溫度低于Tg時， 高聚物表現(xiàn)為具有“玻璃”特征性能，此時的高聚物具備使用功能；當溫度高于Tg時，高聚物則具有較高彈性和一定可塑性特點。因此利用無定形熱塑性材料的玻璃化溫度，升溫至 Tg溫度以上，軟刻蝕法制備無定型熱塑性微流控芯片。該方法簡便、有效、成本低，易于規(guī)?；a(chǎn)。但是，該方法也存在一些明顯的缺點。首先，該方法需要昂貴的設(shè)備，生產(chǎn)量小時成本太高。其次，經(jīng)該方法生產(chǎn)的芯片熱塑定型后高分子材料中基本沒有可利用的活性基團，難以化學鍵合以集成其他操作單元。再者，無定形熱塑性材料在紫外區(qū)(300nm以下) 具有強烈的吸收，因此這類微流控芯片無法使用紫外檢測器檢測。由此可見，每種微流控芯片都有其獨特的優(yōu)勢，但又都存在著一些明顯的局限性。 玻璃微流控芯片具有性能穩(wěn)定、重復(fù)性好、可集成多功能單元等優(yōu)點。但高昂的生產(chǎn)設(shè)備， 高比例的報廢率，增加了制備成本，限制了玻璃微流控芯片的發(fā)展。PDMS微流控芯片和無定型熱塑性微流控芯片具有易于制備、可規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點。但PDMS材料疏水性太強，而熱塑型芯片需要昂貴的設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有方法的局限性，提出了一種親水、多功能集成、易于光學檢測的雜合型微流控芯片。主體材料包括1)交聯(lián)劑為雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯、雙酚A環(huán)氧乙烯基酯或聚氨酯丙烯酸酯，2)單體為含不同活性基團的丙烯酸類化合物，包括但不限于丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸等。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片，它是在透明的基片上涂覆一層厚 50 - 500微米的由含不同活性基團的丙烯酸類化合物的單體和交聯(lián)劑及UV引發(fā)劑組成的混合物，并在含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板覆蓋下紫外光照固化后，顯影除去未固化的交聯(lián)劑、引發(fā)劑和單體，封合蓋片得到的親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片，所述的交聯(lián)劑可以是雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯、雙酚A環(huán)氧乙烯基酯或聚氨酯丙烯酸酯。上述的微流控芯片，所述的基片可以是玻璃片、石英片、聚甲基丙烯酸甲酯片 (PMMA)或聚二甲基硅氧烷片(PDMS)。上述的微流控芯片，所述的丙烯酸類化合物的單體可以是丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸。上述的微流控芯片，根據(jù)需要可進一步集成各種功能單元。一種制備上述親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片的方法，它包括如下步驟
步驟一預(yù)聚物制備，將交聯(lián)劑、單體和UV聚合引發(fā)劑按比例混合均勻，交聯(lián)劑單體 引發(fā)劑的質(zhì)量比范圍為20 20 :1-200 200 1 ；
步驟二 暴光固化在透明的基片上均勻涂布厚度50-500微米的由步驟一制備的預(yù)聚物，預(yù)烘培后，覆蓋含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板，紫外光照固化；
步驟三顯影移去掩膜板，烘培固化，用顯影液除去未固化的交聯(lián)劑、引發(fā)劑和單體， 得到預(yù)先設(shè)計好的微通道結(jié)構(gòu)；
步驟四封合蓋片采用熱壓或等離子處理將蓋片(玻璃、石英、PDMS、PMMA和PVP等) 與帶有微通道結(jié)構(gòu)的基片封合。上述的制備方法，步驟一所述的單體是丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸。上述的制備方法，步驟一所述的交聯(lián)劑是雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯、雙酚A環(huán)氧乙烯基酯或聚氨酯丙烯酸酯。上述的制備微流控芯片的方法，在得到步驟四制得的微流控芯片后，可以進一步根據(jù)需要集成各種不同的功能單元。例如在芯片上集成硼親和富集單元以富集順式二羥基生物分子。在通道特定區(qū)域內(nèi)注入環(huán)氧基團與三(2，3環(huán)氧基丙基)異氰酸酯、間氨基苯硼酸、己二胺和聚乙二醇200的混合溶液，將芯片放置在電熱板上80°C反應(yīng)2小時，用甲醇抽洗分離通道以除去殘余的未反應(yīng)物，即得到含硼親和富集單元的芯片。本發(fā)明的親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片具有如下優(yōu)點
1、良好的親水性。由以上物質(zhì)共聚得到的高分子層的純水接觸角均小于70° (圖1)， 這有利于降低所制得的微流控芯片對生物分子的非特異吸附。2、光學性能優(yōu)良?？梢姽馔高^率不低于85%，深紫外區(qū)(小于300nm)強烈吸收紫外，透過率不高于0.5% (圖2)。可見光透過率高，有利于熒光檢測；深紫外區(qū)的強吸收，微流控芯片可以直接用于紫外吸收檢測，不需要額外制備光學檢測狹縫，簡化了芯片制作流程。3、含有活性基團，包括環(huán)氧基，羥基，羧基等(圖3)，根據(jù)需要可利用這些活性基團進行化學反應(yīng)以集成各種功能單元。4、良好的可復(fù)制性。本發(fā)明所提出的交聯(lián)劑和單體可采用紫外光引發(fā)共聚形成高分子材料，未暴光的地方可以用顯影液將未聚合的預(yù)聚物除去，從而，通過暴光和顯影，可以對設(shè)計好的圖案進行復(fù)制。該方法的復(fù)制精度可達到Imm (圖4)。盡管本發(fā)明使用的主體材料芳香族含丙烯酸酯聚合物與Humpal等的專利(W0 20081063686 A2)所使用的材料是同一類聚合物，但在制備方法、表面性能和應(yīng)用領(lǐng)域方面存在著顯著的不同。首先，在制備方法上，本發(fā)明使用透明一擋光掩膜板，透UV光的地方聚合，擋光的地方?jīng)]有聚合，顯影液可直接將未聚合的預(yù)聚物洗去，一步得到精確至微米級的微通道結(jié)構(gòu)。而專利WO 20081063686 A2中是先將預(yù)聚物全部UV聚合，再用激光燒蝕出微米級結(jié)構(gòu)。其次，在表面性能上，本發(fā)明使用活性單體與芳香族含丙烯酸酯共聚，可以在表面上得到環(huán)氧、羥基、羧基等活性基團，而PCT (W0 20081063686 A2)中并未涉及微結(jié)構(gòu)表面活性基團的利用。第三，本發(fā)明制備的是一種新型微流控芯片，應(yīng)用領(lǐng)域集中在生物學領(lǐng)域。而PCT (W0 20081063686 A2)中，利用芳香族含丙烯酸酯聚合物的可見光透明性，在襯底上制備聚合物微結(jié)構(gòu)層，并將該方法用于制備棱鏡、適配鏡等光學器件。


圖1.雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯與A)丙烯酸縮水甘油酯、B)丙烯酸和C)甲基丙烯酸甲酯的共聚物表面的純水接觸角。圖2.芳香族含丙烯酸酯共聚材料的紫外一可見光譜。圖3.芳香族含丙烯酸酯與A)丙烯酸縮水甘油酯、B)丙烯酸和C)甲基丙烯酸甲酯共聚物的XPS光電子能譜。圖4.芳香族含丙烯酸酯共聚材料的可復(fù)制性A)掩膜板B)復(fù)制得到的微結(jié)構(gòu)。圖5.微流控芯片的制備流程圖。圖6.單通道微流控芯片的照片。圖7. —種等電點標記物的等電聚焦譜圖。圖8.集成了微富集單元的微流控芯片A)芯片照片，B)整體材料的SEM圖。圖9.集成了免疫親和微富集單元的微流控芯片的照片(微通道中淺藍色通道為免疫親和富集單元，最下方的無色透明通道為分離和檢測單元)。
具體實施例方式實施例1
石英/雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯/PDMS微流控芯片的制備 將1克雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯(EBECRYL 600購于Cytec公司)溶于1克甲基丙烯酸甲酯， 加入0. 05克UV引發(fā)劑(Irgacure 184，購于Ciki公司)，渦旋，超聲30分鐘。將預(yù)聚物均勻旋涂在石英基片上，厚度為50微米，60°C預(yù)烘培10分鐘，貼上含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板，UV固化10秒，除去掩膜板，80°C烘培30分鐘，在丙二醇醋酸酯中顯影1分鐘。制備適合的PDMS蓋片，等離子處理30秒后，與基底封合，得到的所設(shè)計的微流控芯片。實施例2
石英/雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯/PDMS微流控芯片的制備 將1克雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯(EBECRYL 600購于Cytec公司)溶于1克甲基丙烯酸甲酯， 加入0. 005克UV引發(fā)劑(Irgacure 184，購于Ciba公司)，渦旋，超聲30分鐘。將預(yù)聚物均勻旋涂在石英基片上，厚度為250微米，60°C預(yù)烘培10分鐘，貼上含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板，UV固化50秒，除去掩膜板，80°C烘培30分鐘，在丙二醇醋酸酯中顯影1分鐘。制備適合的PDMS蓋片，等離子處理30秒后，與基底封合，得到所設(shè)計的微流控芯片。實施例3
石英/雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯/PDMS微流控芯片的制備 將0. 5克雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯(EBECRYL 600購于Cytec公司)溶于0. 5克甲基丙烯酸甲酯，加入0.01克UV引發(fā)劑(Irgacure 184，購于Cih公司)，渦旋，超聲30分鐘。將預(yù)聚物均勻旋涂在石英基片上，厚度為500微米，60°C預(yù)烘培10分鐘，貼上含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板，UV固化10秒，除去掩膜板，80°C烘培30分鐘，在丙二醇醋酸酯中顯影1 分鐘。制備適合的PDMS蓋片，等離子處理30秒后，與基底封合，得到所設(shè)計的的微流控芯片，芯片照片見圖6。實施例4
石英/雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯/PDMS微流控芯片在等電聚焦分離-全通道紫外吸收檢測中的應(yīng)用
將實施例3中制備得到的微流控芯片應(yīng)用于等電聚焦分離-全通道紫外吸收檢測。由于微結(jié)構(gòu)層在300nm以下對紫外光具有強烈的吸收，分離通道兩側(cè)的高分子材料起到光學檢測狹縫的作用，該芯片可以直接用于紫外吸收檢測。和通常的金屬狹縫相比， 檢測通道無盲區(qū)，自動光學對準，無需手動粘貼檢測狹縫，制作更簡單。樣品為濃度為1% (w/v)的等電點為5. 1的等電點標記物，其含有1% (w/v)的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液和洲(v/V)的PH梯度為pH 3-10的載體兩性電解質(zhì)。為了抑制電滲流，利用真空裝置在微流控芯片的分離通道內(nèi)連續(xù)抽取1% (w/v)的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液30分鐘。隨后在通道內(nèi)注入樣品溶液。在芯片左、右兩端的儲液池內(nèi)同時分別加入 100微升0. 1摩爾/升的磷酸溶液和100微升0. 1摩爾/升的氫氧化鈉溶液。在芯片左、右兩端的儲液池內(nèi)分別插入陽極和陰極電極，施加1500V電壓進行等電聚焦分離，聚焦完成時的電泳圖見圖7。實施例5
含硼親和富集單元的石英/聚氨酯丙烯酸酯-丙烯酸縮水甘油酯/PDMS雜合型微流控芯片的制備
將0. 6克聚氨酯丙烯酸酯(EBECRYL 6602購于Cytec公司)溶于0. 2克丙烯酸縮水甘油酯，加入0.01克UV引發(fā)劑(Irgacure 369購于Ciki公司)，渦旋，超聲30分鐘。將預(yù)聚物均勻旋涂在石英襯底上，60°C預(yù)烘培10分鐘，貼上含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板，UV固化30秒，除去掩膜板80°C烘培30分鐘，在丙二醇醋酸酯中顯影1分鐘。制備帶有適合所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的孔結(jié)構(gòu)的PDMS蓋片，等離子處理30秒，與基底封合(照片見圖8A)。將0. 32克的三(2，3環(huán)氧基丙基)異氰酸酯和0. 01克的間氨基苯硼酸超聲溶解在 3克的聚乙二醇200和200微升的陽離子光引發(fā)劑中。在微流控芯片的通道內(nèi)注入上述混合溶液，加蓋掩膜，紫外光引發(fā)聚合30分鐘，用甲醇抽洗富集單元以除去未聚合的有機物， 即得到含有硼親和整體富集單元的微流控芯片。(圖8B為硼親和整體富集單元的SEM圖)。實施例6
含免疫親和富集單元的玻璃/雙酚A環(huán)氧乙烯基酯-丙烯酸/PDMS雜合型微流控芯片的制備
將0. 5克雙酚A乙烯基樹脂(EBECRYL 150購于Cytec公司)溶于0. 5克丙烯酸，加入 0. 005克UV引發(fā)劑(DAR0⑶R 1173購于Ciki公司)，渦旋，超聲30分鐘。將預(yù)聚物均勻旋涂在玻璃基底上，40°C預(yù)烘培10分鐘，貼上含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板，UV固化 10秒，除去掩膜板60°C烘培30分鐘，在丙二醇醋酸酯中顯影1分鐘。制備帶適合所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的孔結(jié)構(gòu)的PDMS蓋片，等離子處理30秒，封合芯片。丙烯酸與雙酚A乙烯基共聚得到的材料上含有羧基。將含有protein A的溶液注入到芯片的免疫親和富集區(qū)域， 反應(yīng)2小時后沖洗除去剩余的protein Α。往富集單元區(qū)域中注入抗體溶液，37°C下溫育1小時后洗除去剩余的抗體，得到集成有免疫親和富集單元的雜合型微流控芯片，照片見圖 9。
權(quán)利要求
1.一種親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片，其特征是它是在透明的基片上涂覆一層厚50 - 500微米的由含不同活性基團的丙烯酸類化合物的單體和交聯(lián)劑及UV 引發(fā)劑組成的混合物，并在含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板覆蓋下紫外光照固化后， 顯影除去未固化的交聯(lián)劑、引發(fā)劑和單體，封合蓋片得到的親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片，所述的交聯(lián)劑是雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯、雙酚A環(huán)氧乙烯基酯或聚氨酯丙烯酸酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是所述的基片是玻璃片、石英片、聚甲基丙烯酸甲酯片或聚二甲基硅氧烷片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是所述的丙烯酸類化合物的單體是丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是根據(jù)需要可進一步集成各種功能單元。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片的方法， 其特征是它包括如下步驟步驟一預(yù)聚物制備將交聯(lián)劑、單體和UV聚合引發(fā)劑按比例混合均勻，交聯(lián)劑單體引發(fā)劑的質(zhì)量比范圍為20 20 :1-200 200 1 ；步驟二 暴光固化在透明的基片上均勻涂布厚度為50 - 500微米、由步驟一制備的預(yù)聚物，預(yù)烘培后，覆蓋含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板，紫外光照固化；步驟三顯影移去掩膜板，烘培固化，用顯影液除去未固化的交聯(lián)劑、引發(fā)劑和單體， 得到預(yù)先設(shè)計好的微通道結(jié)構(gòu)；步驟四封合蓋片采用熱壓或等離子處理將蓋片與帶有微通道結(jié)構(gòu)的基片封合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是所述的單體是丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是所述的交聯(lián)劑是雙酚A環(huán)氧丙烯酸酯、 雙酚A環(huán)氧乙烯基酯或聚氨酯丙烯酸酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備微流控芯片的方法，其特征是在得到步驟四制得的微流控芯片后，進一步根據(jù)需要集成各種不同的功能單元。
全文摘要
一種可規(guī)?；a(chǎn)的親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片，它是在透明的基片上涂覆一層厚50－500微米的、由含不同活性基團的丙烯酸類化合物的單體和交聯(lián)劑及UV引發(fā)劑組成的混合物，并在含有所需設(shè)計的微結(jié)構(gòu)圖案的掩膜板覆蓋下紫外光照固化后，顯影除去未固化的交聯(lián)劑、引發(fā)劑和單體，封合蓋片得到的親水、多功能集成、易于光學檢測的微流控芯片，它非特異吸附小，具有良好的生物兼容性，可應(yīng)用于生物分子的反應(yīng)、分離和檢測等應(yīng)用。該類型微流控芯片易于光學檢測，特別是紫外光吸收檢測，中間高分子層充當光學狹縫的作用，不需要額外的光學狹縫。該類型微流控芯片由于含有活性基團，易于集成多功能操作單元。本發(fā)明公開了其制法。
文檔編號B01L3/00GK102166537SQ20111003256
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者劉震, 李澧 申請人:南京大學