專利名稱：一種基于單鏈dna核酸適配體修飾氧化石墨烯涂層的固相微萃取頭制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)分析測(cè)試儀器領(lǐng)域，涉及到基于單鏈DNA核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法。適用于復(fù)雜生物樣品中痕量生物堿、抗生素或核苷酸類物質(zhì)的高選擇性、快速分離與富集。
背景技術(shù)：
樣品前處理方法與技術(shù)一直是現(xiàn)代化學(xué)領(lǐng)域的重要課題和發(fā)展方向之一。在一個(gè)完整的樣品分析過程中包括樣品采集、樣品前處理、分析測(cè)定、數(shù)據(jù)處理與報(bào)告結(jié)果，其中樣品前處理所需的時(shí)間約占整個(gè)分析時(shí)間的60%，并可能帶來30%以上的誤差，因而成為分析工作中的瓶頸問題，也是分析過程中最為關(guān)鍵的部分。傳統(tǒng)的樣品前處理方法有液-液萃取、蒸餾、吸附、沉淀、索氏萃取、高溫消解等，這些樣品前處理技術(shù)雖然具有可靠性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在著處理時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，勞動(dòng)強(qiáng)度大，消耗大量有機(jī)溶劑等較多缺點(diǎn)。研究高效、快速、簡(jiǎn)便、無二次污染的樣品前處理技術(shù)，已經(jīng)成為目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。固相微萃取(SPME)是一種簡(jiǎn)便的樣品前處理技術(shù)，自1989年Belardi等首次報(bào)道以來，受到了分析化學(xué)家們的廣泛關(guān)注。SPME技術(shù)是基于用涂有固定相的熔融石英纖維來吸附、富集樣品中的待測(cè)物質(zhì)。該方法巧妙地將待測(cè)物的萃取、脫附、進(jìn)樣結(jié)合在一起，無需或僅需少量有機(jī)溶劑，操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，易與氣相或液相色譜儀聯(lián)用。涂層是SPME技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵，涂層的性質(zhì)很大程度上決定了方法的靈敏度和選擇性。目前，已有幾種商品化的SPME熔融石英纖維涂層，大部分商品化涂層是通過物理作用吸附 到萃取頭表面，選擇性不高，穩(wěn)定性較差，在有機(jī)溶劑里不穩(wěn)定，且不適合于處理極性或堿性物質(zhì)，限制了其應(yīng)用的范圍。近年來，一些文獻(xiàn)報(bào)道了幾類新型SPME涂層的研制工作，如聚硅氧烷-富勒烯(Xiao C. H.，Han S. Q.，Wang Z. XingY. , J. , and Wu C. Y. 2001. J. Chromatogr. A927:121-130)、冠醚(Zeng, Z. R.，ff. L. Qiu, andZ. F. Huang. 2001. Anal. Chem. 73:2429-2436)、杯芳經(jīng)(Li, X. J. , Z. R. Zeng, S. Z. Gao, and
H.B. L1. 2004. J. Chromatogr. A1023:15-25)等，這些涂層的選擇性相對(duì)于商品化涂層有一定提高，但分析對(duì)象范圍較窄，主要用于測(cè)定揮發(fā)或半揮發(fā)性有機(jī)環(huán)境污染物，且選擇性仍不夠強(qiáng)。類似于酶-底物的相互作用識(shí)別原理的分子印跡技術(shù)的出現(xiàn)，在分析化學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)能夠以較高選擇性識(shí)別復(fù)雜樣品中的印跡分子，且化學(xué)穩(wěn)定性好，制備簡(jiǎn)單，適合作為SPME的涂層材料。但由于分子印跡技術(shù)本身的局限，尚存在以下不足之處分子印跡聚合物(MIP)中剛性識(shí)別“空穴”易被破壞或變形；MIP涂層在生物樣品分析中受到較大限制；其特異性及親合力不如生物識(shí)別體系如酶-底物、抗體-受體等相互作用；萃取溶劑大多為有機(jī)溶劑，易污染環(huán)境。為此，適合于復(fù)雜生物樣品中痕量物質(zhì)分析，同時(shí)選擇性更強(qiáng)的SPME涂層是目前涂層研究的趨勢(shì)，而具有特異性強(qiáng)、親和力高等優(yōu)點(diǎn)的生物識(shí)別體系無疑是合適的選擇。
近幾十年，抗體技術(shù)發(fā)展迅速，基于抗體-抗原相互作用的生物識(shí)別體系在分析化學(xué)領(lǐng)域也獲得了較多應(yīng)用。但自從1990年核酸適配體出現(xiàn)以來，抗體技術(shù)受到前所未有的挑戰(zhàn)。核酸適配體(Aptamer)是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)經(jīng)體外篩選得到的一段短的單鏈寡核苷酸序列(DNA或RNA)。適配體與各種配體的結(jié)合是基于單鏈核酸結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的多樣性，它通過鏈內(nèi)某些互補(bǔ)堿基間的配對(duì)和靜電作用、氫鍵作用等自身發(fā)生適應(yīng)性折疊，形成一些穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，通過各種相互作用與配體間產(chǎn)生高特異性的結(jié)合力。例如，茶堿與咖啡因在結(jié)構(gòu)上只相差一個(gè)甲基，難以區(qū)分。Jenison等從RNA庫中分離得到茶堿適配體，與茶堿的親和力比咖啡因高10000倍以上(JenisonR.D. , Gill S. C. , PardiA. , andPoIiskyB. 1994. Science263:1425-1429) ；Rusconi 等也發(fā)現(xiàn)，盡管凝血因子Xa和YD a(F W )有一套相同的結(jié)構(gòu)域，但修飾過的RNA適配體對(duì)凝血因子W a比對(duì)凝血因子Xa顯示高出500多倍的選擇性(Rusconi C. , YehA. , Lyerly H. , LawsonJ. , and Sullenger B. 2000. Thromb. Haemostasis84:841-848)。適配體與抗體一樣能與相應(yīng)配體高效、專一地結(jié)合，同時(shí)適配體還具有抗體無法比擬的以下優(yōu)點(diǎn)目標(biāo)物范圍廣，具有高的親和力，結(jié)合特異性強(qiáng)，篩選制備方便，穩(wěn)定性高，可復(fù)性，易引入修飾基團(tuán)。至今已經(jīng)篩選出300種以上能夠與目標(biāo)分子結(jié)合的適配體，這些目標(biāo)分子包括酶、生長(zhǎng)因子、抗體、轉(zhuǎn)錄因子、核苷酸、肽、多肽、抗生素、氨基酸、有機(jī)染料以及重金屬離子，甚至完整的病毒和病原體以及細(xì)胞。適配體由于親和力高、特異性強(qiáng)以及相對(duì)于抗體/抗原傳統(tǒng)生物識(shí)別體系的眾多優(yōu)點(diǎn)，在分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。適配體在化學(xué)修飾后能夠固定在各種材料表面，如玻璃、磁性微球、金屬、硅膠、量子點(diǎn)等，應(yīng)用于各類分離技術(shù)，包括生化分析、生物傳感器、適配子信標(biāo)、毛細(xì)管電泳、親和色譜、生物質(zhì)譜、流式細(xì)胞分析、熒光偏振分析、靶向治療等。例如，McGown小組較早報(bào)道了將核酸適配體共價(jià)鍵合修飾到開管毛細(xì)管的管壁上，用來分離小分子目標(biāo)物如氨基酸、多環(huán)芳香烴、二肽等(Vo T. U. , McGown L. B. 2006.Electrophoresis25:749) ；Medley等人開發(fā)出一種利用適配體鍵合到納米金顆粒上來檢測(cè)疾病細(xì)胞的比色方法(Medley C. D. , Smith J. E. , Tang Z. 2008. Anal Chem80:1067-1072)。氧化石墨烯(grapheneoxide)是石墨烯的一種重要的派生物，也被稱為功能化的石墨烯。它的結(jié)構(gòu)與石墨烯大體相同，石墨烯是一種二維碳原子晶體，具有獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)，由一層密集的、包裹在蜂巢晶體點(diǎn)陣上的碳原子以sp2雜化連接而成的單原子層組成，具有高的比表面積，突出的導(dǎo)熱性能和力學(xué)性能，但是他自身可以用的基團(tuán)很少。而氧化石墨烯則是在二維基面上多了有大量官能團(tuán)，如羥基、環(huán)氧官能團(tuán)、羧基等，從而可以合成大量共價(jià)鍵合的氧化石墨烯衍生物。氧化石墨烯的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和超大的比表面積、優(yōu)良的光學(xué)、熱學(xué)和機(jī)械性能使之在納米電子器件、生物傳感器、信息存儲(chǔ)等領(lǐng)域的潛在重要應(yīng)用。例如，Shan等將氧化石墨烯與賴氨酸共價(jià)結(jié)合，賴氨酸修飾后的氧化石墨烯在水中會(huì)產(chǎn)生大量的自由氨基，作為新型生物檢測(cè)器，將過氧化氫酶共價(jià)結(jié)合到賴氨酸修飾后的氧化石墨烯上可以定性檢測(cè)生物體中的H2O2 (Shan C. S.，Yang H. F.，Han D. X.，ZhangQ. X. , Ivaska A. , and Niu L. 2009. Langmuir25:12030-12033)。同時(shí)，氧化石墨烯在和適配體鍵合后進(jìn)行分離檢測(cè)方面，也有很大潛力。例如，Sheng等開發(fā)了一個(gè)簡(jiǎn)單的方法來檢測(cè)由赭曲霉和鮮綠青霉引起的赭曲霉毒素A,利用氧化石墨烯與未結(jié)合赭曲霉毒素A的適配體鍵合使之熒光粹滅，而結(jié)合赭曲霉毒素A的適配體仍有熒光,該傳感器赭曲霉毒素A結(jié)構(gòu)類似物沒有響應(yīng)(Sheng L. F.，Ren J. T.，MiaoY. Q.，Wang J. H.，WangE. K. 2011. Biosens.Bioelectron. 26:3494-3499)。相對(duì)于氧化石墨烯和核酸適配體在各自相關(guān)領(lǐng)域中的廣泛研究和應(yīng)用，將氧化石墨烯和核酸適配體結(jié)合在一起應(yīng)用于固相微萃取技術(shù)，以氧化石墨烯為載體提供大的比表面積，以核酸適配體為識(shí)別單元提高選擇性，國內(nèi)外均未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述SPME涂層材料在選擇性、穩(wěn)定性、生物樣品兼容性等方面存在的問題，本發(fā)明將氧化石墨烯超高比表面積的特點(diǎn)、核酸適配體特異選擇性強(qiáng)的特性與SPME技術(shù)耗時(shí)少、效率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起，制備得到一種基于單鏈DNA核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相涂層的新型石英纖維固相微萃取頭。該新型萃取頭可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中生物堿、抗生素或核苷酸類物質(zhì)高效、高選擇性分離與富集，清除樣品基體干擾，從而降低檢出限，提高分析的準(zhǔn)確性和精度。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種基于單鏈DNA修飾氧化石墨烯涂層的新型固相微萃取頭的制備方法，按以下步驟進(jìn)行(I)對(duì)石英纖維進(jìn)行丙酮洗、苯洗、堿洗、酸洗、高溫活化，然后用具有不飽和雙鍵的硅烷化試劑在纖維表面進(jìn)行硅烷化處理；(2)在聚合溶劑中加入功能單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，充分混合制得多孔聚合物溶液，取一定量所述多孔聚合物溶液于試管中，插入硅烷化石英纖維，通氮?dú)獬鹾?，密封試管口，水浴中熱引發(fā)共聚反應(yīng)；聚合一定時(shí)間，取出石英纖維，置于干燥箱中于一定溫度下老化一定時(shí)間；(3)在同一根石英纖維上重復(fù)步驟(2)若干次，即在石英纖維表面重復(fù)涂潰多孔聚合物涂層； (4)用具有氨基的硅烷化試劑對(duì)得到的多孔聚合物涂層石英纖維進(jìn)行硅烷化處理；(5)在PBS緩沖液、催化劑EDC溶液、NHS溶液及氧化石墨烯水溶液的混合液中，插入硅烷化多孔聚合物涂層石英纖維，室溫反應(yīng)一定時(shí)間，取出纖維，置于干燥箱中于一定溫度下老化；(6)在同一根石英纖維上依次重復(fù)步驟(4)及(5)若干次；(7)將第(6)步中最后得到的氧化石墨烯/多孔聚合物涂層石英纖維取出，插入到PBS緩沖液、EDC溶液、NHS溶液及核酸適配體溶液的混合液中，室溫反應(yīng)一定時(shí)間，取出后用PBS緩沖液清洗，氮?dú)獯蹈桑４?。具體來說，所述步驟(2)中多孔聚合物溶液的制備所采用的聚合溶劑為丙酮溶液，加入的功能單體為甲基丙烯酸，加入的交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，加入的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。作為一個(gè)具體實(shí)施例，所述步驟(2)中多孔聚合物溶液的制備是在錐形瓶中加入335 μ L甲基丙烯酸功能單體、5mL三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交聯(lián)劑、50mg偶氮二異丁腈引發(fā)劑及45mL丙酮溶液，充分搖勻。當(dāng)然，上述功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑及聚合溶液也可以采用其它的體積用量，只要滿足反應(yīng)所需的量即可。
作為其中一個(gè)優(yōu)選方案，步驟5中所采用的氧化石墨烯化學(xué)鍵合條件為所述EDC溶液濃度為4. 5飛mM，NHS溶液濃度為8 12mM，氧化石墨烯水溶液的濃度為O. 35、. 6mg/mL的混合液中，PBS緩沖液EDC溶液NHS溶液氧化石墨烯水溶液體積比為2:2:1:2 ;室溫下鍵合，鍵合時(shí)間為24h。進(jìn)一步地具體來說，步驟5中所采用的氧化石墨烯化學(xué)鍵合條件為所述EDC溶液濃度為5mM，NHS溶液濃度為10mM，氧化石墨烯水溶液的濃度為O. 5mgmL的混合液中，PBS緩沖液EDC溶液NHS溶液氧化石墨烯水溶液體積比為2:2:1:2。作為其中一個(gè)優(yōu)選方案，步驟7所采用的核酸適配體化學(xué)鍵合條件為所述EDC溶液濃度為4. 5飛mM，NHS溶液濃度為8 12mM，核酸適配體溶液濃度為5. 5 6. 5 μ g/mL,PBS緩沖液EDC溶液NHS溶液核酸適配體溶液體積比為1:6:4:5，室溫下鍵合，鍵合時(shí)間為24h。進(jìn)一步地具體來說，步驟7所采用的核酸適配體化學(xué)鍵合條件為所述EDC溶液濃度為5mM，NHS溶液濃度為10mM，核酸適配體溶液濃度為6. 25 μ gmL, PBS緩沖液EDC溶液NHS溶液核酸適配體溶液體積 比為1:6:4:5。石英纖維表面重復(fù)涂潰多孔聚合物涂層2 4層，以確保涂層穩(wěn)定。同樣地，步驟6是指對(duì)同一根石英纖維上依次對(duì)步驟4及5重復(fù)4飛次，通過多次化學(xué)鍵合涂潰方法將氧化石墨烯修飾到多孔聚合物涂層表面。石英纖維表面光潔平整，表面積小，核酸適配體在裸石英纖維表面鍵合較難實(shí)現(xiàn)，存在固載率低、易脫落、不穩(wěn)定等問題，難以滿足SPME富集性能要求。本發(fā)明在硅烷化石英纖維表面制備一層多孔聚合物涂層，再通過多次化學(xué)鍵合涂潰方法將氧化石墨烯修飾到多孔聚合物涂層表面，利用氧化石墨烯涂層表面羧基基團(tuán)與核酸適配體端基上修飾的氨基基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)鍵合，將核酸適配體固載于氧化石墨烯/多孔聚合物涂層表面，克服了常規(guī)涂潰方法固載率低、易脫落、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，并且顯著提高核酸適配體固載量，增強(qiáng)SPME富集效率。


圖1各圖是核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭制備過程示意圖。其中，圖1A是石英纖維表面化學(xué)處理及硅烷化示意圖；圖1B是多孔聚合物涂層纖維制備示意圖；圖1C是多孔聚合物涂層表面鍵合氧化石墨烯示意圖；圖1D是氧化石墨烯涂層表面鍵合核酸適配體示意圖。圖2是氧化石墨烯的透射電子顯微鏡照片(5000倍)。圖3是氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的掃描電子顯微鏡照片(涂層涂潰次數(shù)為5)，其中圖3A是1000倍放大；圖3B是50000倍放大。圖4是腺苷核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭(Apt-PP-fiber)、亂序核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭(SApt-PP-fiber)、氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭(Non_Apt-PP-fiber)萃取ImgL腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷、β -胸苷、鄰甲基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液萃取量對(duì)比圖。
圖5是腺苷核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭萃取不同濃度腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液萃取量曲線。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例如以腺苷為例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。如圖1所示，基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭的制備方法如下(I)將5. Ocm長(zhǎng)石英纖維置于丙酮中浸泡O. 5h，取出，用乙醇清洗三次；隨即放入苯中浸泡O. 5h，取出，用乙醇清洗三次，再用蒸餾水清洗三次；置于1. Omol/L NaOH堿洗液中室溫浸泡lh，取出，用蒸餾水清洗三次；堿洗后石英纖維隨即置于1. Omol/L HCl洗液中浸泡lh，取出，用蒸餾水清洗干凈。經(jīng)堿洗、酸洗后石英纖維置于烘箱內(nèi)150°C活化lh。從烘箱中取出石英纖維，立即置于10% (v/v)3-甲基丙烯酰基-丙基-三甲氧基硅烷硅丙酮溶液中，硅烷化反應(yīng)lh，取出后以乙醇沖洗三次，氮?dú)獯蹈伞?2)在錐形瓶中加入335 μ L甲基丙烯酸功能單體、5mL三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交聯(lián)劑、50mg偶氮二異丁腈引發(fā)劑及45mL丙酮溶液，充分搖勻。取一小試管，加入1.5mL上述聚合溶液，放入一根經(jīng)硅烷化處理的石英纖維，通氮?dú)庖猿ピ嚬軆?nèi)空氣，立即用膠塞封口，置于恒溫水浴鍋中60°C加熱聚合。1. 5h后,聚合溶液固化,打開膠塞,勻速拔出石英纖維，轉(zhuǎn)移入潔凈的空試管中，通氮?dú)獬?，用膠塞封口后置于烘箱60°C下加熱固化12h。(3)上一步中得到的多孔聚合物涂層纖維，按照上述第(2)步相同方法在其表面進(jìn)行第二次、第三次涂潰，制得反復(fù)凃潰3次的多孔聚合物涂層石英纖維，將其置于恒溫干燥箱中150°C下加熱老化處理2h。(4)采用Hummers氧化法制備氧化石墨烯。在干燥的500mL三口燒瓶中加入100mL98%的濃硫酸,用冰塊冷卻至(TC, 100r/min轉(zhuǎn)速下攪拌,加入2. 5g天然鱗片石墨及1.25g NaNO3，再緩慢加入8g KMNO4，冰水浴2h。將燒瓶置于35°C左右的恒溫水浴中，IOOr/min轉(zhuǎn)速下攪拌，待反應(yīng)液溫度升至35°C后繼續(xù)攪拌30min，隨后用分液漏斗連續(xù)滴加去離子水130mL，控制反應(yīng)液溫度在100°C以內(nèi)，反應(yīng)lh。冷卻至室溫，向燒瓶中加入50mL5%H202，靜置12h。用5%HC1調(diào)節(jié)溶液pH為7. 0，在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心，棄去上清液，取下層沉淀物置于表面皿中，60°C下真空干燥，得到氧化石墨。稱取氧化石墨0.0500g溶解于IOOmL去離子水中，在600w功率條件下超聲3h，靜置12h，取上層清液，在4000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心lOmin，取上層清液于，65°C下真空干燥，得到氧化石墨烯。(5)在10OmL燒杯中加入25mg氧化石墨烯及50mL去離子水,600w功率條件下超聲2h,得到氧化石墨烯溶液(0. 5mg/mL)。(6)將多孔聚合物涂層石英纖維置于10% (v/v) Y-氨丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中，硅烷化反應(yīng)3h，取出后以乙醇清洗三次，氮?dú)獯蹈伞?7)在 50mL 小燒杯中加入 0. 85g NaCl.O. 22g Na2HPO4 和 0.1lg NaH2PO4,用 20mL去離子水溶解后，用0. 2mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH到7. 5，倒入IOOmL容量瓶中，加水至刻度，配成IOmM的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)。
在25mL 小燒杯中加入 5mLPBS 緩沖液、5mLEDC 溶液(IOmM)、2· 5mLNHS 溶液(5mM)、5mL氧化石墨烯水溶液(O. 5mg/mL)，插入硅烷化后的多孔聚合物涂層石英纖維，室溫下鍵合反應(yīng)3h。取出纖維，置于恒溫干燥箱中60°C下老化處理5min。(8 )重復(fù)上述6-7步操作，在同一根多孔聚合物涂層石英纖維表面反復(fù)涂潰5次氧化石墨烯涂層，得到氧化石墨烯/多孔聚合物涂層石英纖維。用PBS緩沖液清洗氧化石墨烯/多孔聚合物涂層石英纖維，用小刀將離纖維頂端Icm以上的氧化石墨烯/多孔聚合物涂層刮去，剩下的氧化石墨烯/多孔聚合物涂層長(zhǎng)度統(tǒng)一為1. Ocm0(9)在玻璃內(nèi)插管中依次加入40 μ L6. 25 μ g/mL腺苷核酸適配體標(biāo)準(zhǔn)溶液(PBS緩沖液溶解)、8 μ LPBS緩沖液、48 μ L EDC溶液(IOmM)、24 μ L NHS溶液(5mM)，將氧化石墨烯/多孔聚合物涂層石英纖維插入玻璃內(nèi)插管中，室溫下鍵合反應(yīng)24h。取出纖維，用PBS緩沖液清洗3次，得到核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭。本實(shí)施例制備核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物SPME涂層萃取頭具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)采用化學(xué)鍵 合方法，通過多孔聚合物及氧化石墨烯涂層多次涂潰方式制備核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物SPME涂層萃取頭，如圖3所示，涂層均勻、致密，平均厚度為3. 8 μ m，RSD為2. 8 % (n=10)，氧化石墨烯在涂層表面覆蓋率為100%，該方法重現(xiàn)性高、穩(wěn)定性好。(2)如圖4所示，本發(fā)明制備的核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭對(duì)腺苷分子具有很高的選擇性萃取能力，相對(duì)于鳥苷、尿苷、胞苷、β -胸苷等結(jié)構(gòu)類似物的選擇性因子分別為6. 2、10.1、10. 5與11. 1，萃取量為未鍵合核酸適配體的氧化石墨烯/多孔聚合物涂層SPME萃取頭的14. 9倍，可用于復(fù)雜生物樣品中痕量腺苷分子的高選擇性分離與富集。該萃取頭腺苷萃取容量約為4. 6ng，如圖5所示。
權(quán)利要求
1.一種基于單鏈DNA修飾氧化石墨烯涂層的新型固相微萃取頭的制備方法，按以下步驟進(jìn)行 (1)對(duì)石英纖維進(jìn)行丙酮洗、苯洗、堿洗、酸洗、高溫活化，然后用具有不飽和雙鍵的硅烷化試劑在纖維表面進(jìn)行硅烷化處理； (2)在聚合溶劑中加入功能單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，充分混合制得多孔聚合物溶液，取一定量所述多孔聚合物溶液于試管中，插入硅烷化石英纖維，通氮?dú)獬鹾?，密封試管口，水浴中熱引發(fā)共聚反應(yīng)；聚合一定時(shí)間，取出石英纖維，置于干燥箱中于一定溫度下老化一定時(shí)間； (3)在同一根石英纖維上重復(fù)步驟(2)若干次，即在石英纖維表面重復(fù)涂潰多孔聚合物涂層； (4)用具有氨基的硅烷化試劑對(duì)得到的多孔聚合物涂層石英纖維進(jìn)行硅烷化處理； (5)在PBS緩沖液、催化劑EDC溶液、NHS溶液及氧化石墨烯水溶液的混合液中，插入硅烷化多孔聚合物涂層石英纖維，室溫反應(yīng)一定時(shí)間，取出纖維，置于干燥箱中于一定溫度下老化； (6 )在同一根石英纖維上依次重復(fù)步驟(4 )及(5 )若干次； (7)將第(6)步中最后得到的氧化石墨烯/多孔聚合物涂層石英纖維取出，插入到PBS緩沖液、EDC溶液、NHS溶液及核酸適配體溶液的混合液中，室溫反應(yīng)一定時(shí)間，取出后用PBS緩沖液清洗，氮?dú)獯蹈?，保存?br> 2.如權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中多孔聚合物溶液的制備所采用的聚合溶劑為丙酮溶液，加入的功能單體為甲基丙烯酸，加入的交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，加入的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。
3.如權(quán)利要求2所述的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中多孔聚合物溶液的制備是在錐形瓶中加入335 μ L甲基丙烯酸功能單體、5mL三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交聯(lián)劑、50mg偶氮二異丁腈引發(fā)劑及45mL丙酮溶液，充分搖勻。
4.如權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法，其特征在于步驟5中所采用的氧化石墨烯化學(xué)鍵合條件為所述EDC溶液濃度為4. 5飛mM，NHS溶液濃度為8 12mM，氧化石墨烯水溶液的濃度為O. 35、. 6mg/mL的混合液中，PBS緩沖液EDC溶液NHS溶液氧化石墨烯水溶液體積比為2:2:1:2 ;室溫下鍵合，鍵合時(shí)間為24h。
5.如權(quán)利要求4所述的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法，其特征在于步驟5中所采用的氧化石墨烯化學(xué)鍵合條件為所述EDC溶液濃度為5mM，NHS溶液濃度為IOmM,氧化石墨烯水溶液的濃度為O. 5mg/mL的混合液中，PBS緩沖液EDC溶液NHS溶液氧化石墨烯水溶液體積比為2: 2:1:2。
6.如權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法，其特征在于步驟7所采用的核酸適配體化學(xué)鍵合條件為所述EDC溶液濃度為4. 5飛mM，NHS溶液濃度為8 12mM，核酸適配體溶液濃度為5. 5 6. 5 μ gmL, PBS緩沖液EDC溶液NHS溶液核酸適配體溶液體積比為1:6:4:5，室溫下鍵合，鍵合時(shí)間為24h。
7.如權(quán)利要求6所述的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法，其特征在于步驟7所采用的核酸適配體化學(xué)鍵合條件為所述EDC溶液濃度為5mM，NHS溶液濃度為IOmM,核酸適配體溶液濃度為6. 25 μ gmL, PBS緩沖液EDC溶液NHS溶液核酸適配體溶液體積比為1:6:4:5。
8.如權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法，其特征在于石英纖維表面重復(fù)涂潰多孔聚合物涂層2 4層。
9.如權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭的制備方法，其特征在于步驟6是指對(duì)同一根石英纖維上依次對(duì)步驟4及5重復(fù)4 6次。
10.采用權(quán)利要求1、任一方法所制備的基于核酸適配體/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂層的萃取頭。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于單鏈DNA修飾氧化石墨烯涂層的新型固相微萃取頭的制備方法，按以下步驟進(jìn)行(1)對(duì)石英纖維進(jìn)行硅烷化處理；(2)在石英纖維表面涂漬多孔聚合物溶液；(3)重復(fù)涂漬多孔聚合物涂層；(4)硅烷化處理；(5)在PBS緩沖液、催化劑EDC溶液、NHS溶液及氧化石墨烯水溶液的混合液中，插入硅烷化多孔聚合物涂層石英纖維；(6)在同一石英纖維上重復(fù)步驟(4)及(5)若干次；(7)將氧化石墨烯/多孔聚合物涂層石英纖維取出，插入到PBS緩沖液、EDC溶液、NHS溶液及核酸適配體溶液的混合液。本發(fā)明克服了常規(guī)涂漬方法固載率低、易脫落、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，并且顯著提高核酸適配體固載量，增強(qiáng)SPME富集效率。
文檔編號(hào)B01J20/282GK103055830SQ20121057584
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者胡小剛, 范亞男, 蔡泉林, 伍莉莉, 柳曉飛 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)