本發(fā)明涉及用于使用顯微術(shù)(諸如掃描電子顯微術(shù)(sem))的顯微可見(sub-visible)的顆粒(諸如微顆粒和/或納米顆粒)的高精度定量的方法。

背景技術(shù)：

從液體樣本精確計(jì)數(shù)顯微可見的顆粒(諸如病毒顆粒、類病毒顆粒、無機(jī)和聚合物珠、以及其它納米顆粒和微顆粒)的數(shù)量在許多處理中是重要的。例如，經(jīng)修改的病毒載體常用于基因治療應(yīng)用中。每ml的活性載體的數(shù)量(病毒樣本的感染滴度)可以使用標(biāo)準(zhǔn)的感染性測(cè)定來確定。然而，通過使用當(dāng)前可用的方法，不可能精確地確定樣本中的顆粒(包括非感染顆粒)的總數(shù)量。感染顆粒與非感染顆粒的比率提供關(guān)于最終的基因治療產(chǎn)品和上游發(fā)展過程的質(zhì)量和療效的無價(jià)信息。

當(dāng)前可用技術(shù)(諸如定量流式細(xì)胞術(shù)(qfcm))的一個(gè)主要限制是感興趣的納米顆粒不被直接檢測(cè)。相反，結(jié)合到一群納米顆粒的探針的數(shù)量被定量。由于每個(gè)納米顆粒結(jié)合的探針的數(shù)量變動(dòng)，所以傳統(tǒng)的間接技術(shù)的精度通常低，并且依賴于標(biāo)本和探針之間的親合性。感興趣的納米顆粒可以被直接檢測(cè)的技術(shù)將克服該限制。而且，如果該技術(shù)將能夠以足夠的分辨率使顆?？梢暬?，則單個(gè)的顆?？梢曰谒鼈兊拇笮『托螒B(tài)被識(shí)別，因此被直接計(jì)數(shù)。甚至集群內(nèi)的顆粒也可以被計(jì)數(shù)和估計(jì)。通過使用當(dāng)前可用的親合性方法或基于光散射的技術(shù)，這是不可能的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的新穎的高精度直接顆粒方法可以被用于從液體樣本對(duì)無機(jī)和有機(jī)顯微可見的顆粒(諸如納米顆粒)兩者計(jì)數(shù)。另一個(gè)重要的特征是，標(biāo)本的分布比以前可能的分布更均勻，并且這使對(duì)于取樣的需要減少，并且現(xiàn)在可以以單個(gè)的顆粒可以被容易地識(shí)別的分辨率進(jìn)行分析。顯微可見的顆粒在不需要信號(hào)探針的情況下被直接檢測(cè)，并且可以在正常的二維圖像中被可視化。本發(fā)明的顆粒定量sem(pqsem)方法優(yōu)選地基于低真空過濾、掃描電子顯微術(shù)(sem)或其它電子顯微術(shù)技術(shù)和圖像分析。本發(fā)明可以與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)一起或不與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)一起使用，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的示例將是國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)協(xié)會(huì)(nist)表征的聚苯乙烯珠。

本發(fā)明提供上述問題的解決方案。更特別地，該方法用于顯微可見的顆粒的定量。提供過濾膜，所述過濾膜具有穿過該過濾膜而限定的多個(gè)孔。過濾膜與真空室操作接合。利用密封劑密封孔。包含液體與顯微可見的顆粒的樣本液滴被施加到過濾膜上。液體使位于樣本液滴直接下方的孔中的密封劑溶解。液體流過其中密封劑已被溶解的孔，并且顯微可見的顆粒留在過濾膜的頂部。顆粒設(shè)置在其上的過濾膜被移動(dòng)到電子顯微鏡，并且在顯微鏡中獲取的圖像中被計(jì)數(shù)。

所述方法進(jìn)一步包括將包含過濾膜的過濾器組件預(yù)先安裝到sem支撐體上的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括將安裝帶放置在sem支撐體上的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括在使樣本液滴沉積在過濾膜上之前提供具有限定在其中的細(xì)長(zhǎng)通道的sem支撐體、使用包含樣本液滴的注入器以及使注入器在細(xì)長(zhǎng)通道的頂部對(duì)齊的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括將sem支撐體連接到與真空源連接的真空室和經(jīng)由細(xì)長(zhǎng)通道使過濾膜經(jīng)受抽吸力的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括在樣本液滴不觸及過濾膜的任何外邊緣的情況下使樣本液滴沉積到過濾膜上的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：液體僅使設(shè)置在樣本液滴直接下方的孔中的密封劑溶解，而液滴側(cè)的相鄰的孔保持被密封劑密封，因?yàn)橐后w尚未與設(shè)置在這些孔中的密封劑接觸。

所述方法進(jìn)一步包括顯微可見的顆粒在過濾膜上形成限定的且可測(cè)量的足跡和從該足跡的外周邊到該足跡的中心獲取一系列的顆粒的圖像的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括對(duì)以顆粒清晰可見的分辨率獲取的電子顯微術(shù)圖像中的顆粒數(shù)數(shù)—手動(dòng)地或使用圖像分析方法自動(dòng)地?cái)?shù)數(shù)的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括估計(jì)覆蓋整個(gè)足跡的顯微術(shù)圖像(覆蓋整個(gè)足跡的一個(gè)低倍率圖像或聯(lián)結(jié)在一起的足跡的幾個(gè)較高倍率子圖像)中的過濾膜上的足跡的總面積的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括從整個(gè)足跡的面積和從高得足以清晰地看見單一顆粒的分辨率的圖像導(dǎo)出的每面積單位的顆粒的數(shù)量來計(jì)算樣本中的顆粒的總數(shù)量的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括可能地補(bǔ)償其信息從以高得足以清晰地看見單個(gè)顆粒的倍率從足跡的周邊通過中心獲取一系列圖像導(dǎo)出的足跡中的顆粒的非均勻徑向顆粒分布的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括使用來自足跡的總顆粒估計(jì)、液體樣本的施加的體積和稀釋度來計(jì)算溶液中的顆粒的濃度的步驟。

所述方法進(jìn)一步包括使用液體的稀釋劑來使位于樣本液滴直接下方的孔中的密封劑溶解的步驟。標(biāo)本應(yīng)當(dāng)為液體形式，并且稀釋劑應(yīng)當(dāng)與稀釋劑相容并具有有效地溶解正被使用的密封劑的性質(zhì)。

所述方法進(jìn)一步包括使用甘氨酸作為密封劑的步驟。可以使用的其它密封劑包括但不限于基于海藻糖/蔗糖的密封劑。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的真空設(shè)備的示意性正面?zhèn)纫晥D；

圖2是過濾器組件的示意性截面?zhèn)纫晥D；

圖3a是粘附到聚醚砜過濾器的聚苯乙烯珠的未經(jīng)處理的高倍率sem圖像；

圖3b是粘附到聚醚砜過濾器的聚苯乙烯珠的檢測(cè)和計(jì)數(shù)的高倍率sem圖像；

圖3c是上面的圖3b的sem圖像的近攝圖；

圖4a是高倍率的使用sem(一次電子)的液滴足跡圖像的邊緣的示意圖；

圖4b是低倍率的使用sem(一次電子)的液滴足跡圖像的邊緣的示意圖；

圖5a是本發(fā)明的其中孔敞開的膜的截面示意性側(cè)視圖；

圖5b是圖5a中所示的、但是其中孔被密封的膜的截面示意性側(cè)視圖；

圖5c是圖5b中所示的本發(fā)明的膜的截面示意性側(cè)視圖，該膜具有沉積在其上的樣本液滴；

圖5d是本發(fā)明的圖5c中所示的膜的截面示意性側(cè)視圖，該膜具有被吸收到該膜中的液滴；以及

圖6是圖5d的放大圖。

具體實(shí)施方式

參照?qǐng)D1-6來描述本發(fā)明的方法。圖1是真空組件100的示意性前視圖，真空組件100具有真空設(shè)備102，真空設(shè)備102經(jīng)由在真空設(shè)備102和真空室104之間延伸的管106連接到真空室104。優(yōu)選地，管106具有合適的閥，諸如魯爾(luer)閥108。真空壓力計(jì)110與真空室104操作接合以測(cè)量其中的真空壓力。過濾器組件112通過過濾器組件底座114安裝在真空室104的頂部。過濾膜116被設(shè)置在過濾器組件112上。注入器118位于過濾膜116上方。

圖2是過濾器組件112的示意性截面圖。本發(fā)明的整個(gè)分析過程可以通過將過濾膜116預(yù)先安裝到sem支撐體(氧化鋁樁體)上、而不是當(dāng)過濾膜16包含待分析和計(jì)數(shù)的樣本/標(biāo)本時(shí)手動(dòng)地這樣做來簡(jiǎn)化。該安裝可以通過在sem樁體120中簡(jiǎn)單地鉆孔來進(jìn)行。這樣的設(shè)備的使用使在先前的設(shè)置期間丟失標(biāo)本或損壞過濾膜116的風(fēng)險(xiǎn)最小化，在先前的設(shè)置中，包含標(biāo)本的過濾膜116在安裝到sem樁體120上期間被手動(dòng)地操縱。下面討論過濾膜116的準(zhǔn)備的細(xì)節(jié)。這樣的pqsem分析消耗品設(shè)備的制造相對(duì)便宜。

更特別地，過濾器組件112優(yōu)選地具有經(jīng)修改的sem氧化鋁樁體120，雙面碳安裝帶122被放置到經(jīng)修改的sem氧化鋁樁體120上。密封的多孔過濾膜116被放置在碳安裝帶122的頂部。下面特別地參照?qǐng)D5-6來詳細(xì)描述密封過濾膜116的過程。包含待分析的標(biāo)本或樣本124的注入器118被設(shè)置或定位在過濾膜116上方，并且被用于使樣本液滴126沉積到過濾膜116上。因?yàn)闃扼w120被密封地連接到過濾器組件底座114、過濾器組件底座114又被安裝在真空室104上，所以在樁體120內(nèi)部存在真空使得該真空從過濾器組件112下方對(duì)過濾膜116施加抽吸力。這被使得成為可能，因?yàn)橄薅ㄔ跇扼w120內(nèi)部的細(xì)長(zhǎng)腔體或通道128與過濾膜116和真空室104流體連通。如下所述，重要的是注入器118被正確地定位在過濾膜116上方，使得當(dāng)樣本液滴126沉積到過濾膜116上時(shí)，樣本液滴126與過濾膜116的邊緣不接觸并且被放置在擴(kuò)大的腔體部分129正上方，該擴(kuò)大的腔體部分129被限定在通道128和安裝帶122的底側(cè)之間。優(yōu)選地，液滴126被放置在與延伸通過通道128的縱軸(l)對(duì)齊的腔體部分129的中心處或附近。

圖3a-3c是粘附到聚醚砜過濾器的聚苯乙烯珠的高倍率sem圖像。圖3a是未處理的圖像130，圖3b是檢測(cè)和計(jì)數(shù)的圖像132。圖3c是圖3b的視圖和圖3a的部分131的近攝圖133。在這些示例圖像中，在131.47μm²的視場(chǎng)中檢測(cè)到77個(gè)顆粒。這對(duì)應(yīng)于每μm²大約0.59個(gè)顆粒。視圖133示出了被編號(hào)的顆粒1、2、3、4、5、6、7、28、29、30。

圖4a-4b示出了使用sem(一次電子)成像的液滴足跡的邊緣。圖4a示出了高倍率的圖像134，圖4b示出了低倍率的足跡圖像136。圖4a中所示的高倍率圖像134的位置在圖4b中用白色箭頭標(biāo)記，使得圖像134示出整個(gè)足跡圖像136的一部分。在足跡外部顆粒的數(shù)量可忽略的情況下，液滴的邊緣被很好地限定。在低倍率處，液滴的整個(gè)足跡136被可視化，并且足跡的面積可被精確地測(cè)量。在該示例中，足跡的面積(atotal)被測(cè)量為8.436mm²。

圖5a-5d是過濾膜116的截面?zhèn)纫晥D，并且描述密封過濾膜116并然后使密封劑溶解的過程。在圖5a中，過濾膜116具有敞開的孔138，該敞開的孔138被限定在過濾膜116的細(xì)長(zhǎng)網(wǎng)格構(gòu)件139之間，延伸通過過濾膜116。在圖5b中，孔138被密封劑140填充。在圖5c中，作為包含待分析的顆粒142的液體144的樣本124的樣本液滴126沉積到過濾膜116上。優(yōu)選地，通過使用上述注入器118使液滴126沉積到過濾膜116上。當(dāng)液滴126與密封劑140接觸時(shí)，液體144使設(shè)置在液滴126正下方的密封劑140溶解，使得液體144被吸收并且通過僅設(shè)置在液滴126下方的孔138。因?yàn)榇?jì)數(shù)的顆粒142具有大于膜的孔138的大小，所以當(dāng)液滴126下方的孔138中的密封劑140被溶解并且液體144經(jīng)受來自過濾膜116下方的真空室104的細(xì)長(zhǎng)室128的抽吸時(shí)，顆粒142在液體和任何較小的污染物144被吸收或流到這些孔中的同時(shí)被沉積在過濾膜116的頂部。

圖6是圖5d的過濾膜116的放大圖。顯微可見的顆粒142停留在過濾膜116上，并且顆粒142大于孔138a-138j，所以它們不通過孔，即使孔敞開并且經(jīng)受來自真空室104(在圖1中示出)的抽吸。孔138a-d和138i-j仍然被密封劑140填充，因?yàn)橛捎谒鼈兩形磁c樣本液滴126的液體144接觸(參見圖5c)，所以它們尚未被液體144溶解。更特別地，液體144中的稀釋劑(諸如合適的緩沖劑)使密封劑140溶解。如以上所指出的，稀釋劑應(yīng)當(dāng)與標(biāo)本相容，即，具有標(biāo)本形態(tài)和聚集狀態(tài)的最小影響。稀釋劑還應(yīng)當(dāng)具有使密封劑溶解的性質(zhì)。這是要確保真空僅在足跡處被維持，并且通過“打開”感興趣區(qū)域外部的孔使得設(shè)置不使真空損失。當(dāng)液體144使設(shè)置在孔138e-138h中的密封劑140溶解時(shí)，液體144填充孔138e-138h以替換密封劑140。這使得對(duì)顆粒142計(jì)數(shù)更容易，因?yàn)轭w粒142躺在過濾段116的頂部，并且在整個(gè)過濾膜116上很好地分布。

示例

下面是根據(jù)本發(fā)明的準(zhǔn)備過濾膜116的方法的說明性示例。

1.通過將樣本連續(xù)地稀釋在依賴于每個(gè)特定樣本的緩沖劑狀況的適當(dāng)?shù)南♂寗?通常為水、磷酸鹽緩沖的、hepes緩沖的、tris緩沖的或組氨酸緩沖的鹽水)中來準(zhǔn)備包含顯微可見的顆粒142(諸如微顆粒和/或納米顆粒)的樣本以用于計(jì)數(shù)。

2.可以將固定劑(通常為戊二醛或甲醛)和/或穩(wěn)定劑(通常為蔗糖或甘油)引入到被稀釋的、還包括顯微可見的顆粒142的樣本溶液124中，以穩(wěn)定和保持顆粒的結(jié)構(gòu)，并且在一些樣本中防止顆粒142不期望的聚集。固定劑/穩(wěn)定劑和稀釋劑對(duì)應(yīng)于液體144，并且與顆粒142一起形成樣本/標(biāo)本124和樣本液滴126。固定劑/穩(wěn)定劑被用于防止顆粒142在操縱期間被毀壞或損壞以及防止顆粒142不期望地彼此粘附(其使得更難以在以后對(duì)顆粒142計(jì)數(shù))。

3.過濾器組件112由多孔過濾膜116(通常由聚醚砜或聚碳酸酯制成)和由塑料或等同物制成的可打開的過濾盒(cassette)組成，多孔過濾膜116具有孔138，該孔138具有限定的孔大小(通常為0至15nm)，可打開的過濾盒用于使顆粒142與液體分離。合適的過濾器組件112在圖2中被最佳地示出。一般來說，過濾器是作為一次性使用的過濾器大批購買的，因此需要被安裝在某物上。一些供應(yīng)商還銷售過濾器保持器，并且這些設(shè)備最初被制成連接到注射器并且推送液體通過，因此不使用真空來抽吸液體通過。因此有必要將過濾器安裝到過濾器組件以確保真空完整性。在一些實(shí)驗(yàn)之后，令人驚訝地意識(shí)到過濾器可以被直接安裝在sem支撐體上，這節(jié)省了時(shí)間并且避免了手動(dòng)操縱包含過濾器的標(biāo)本的關(guān)鍵步驟?？上胂蟮氖牵@樣的組件可以便宜地制造，并且作為sem消耗品銷售。

4.過濾器組件112被安裝到塑料真空室104的頂部上，該塑料真空室104又經(jīng)由管106連接到真空設(shè)備102。

5.真空室104中的真空由3路魯爾閥108控制，并且通過使用真空壓力計(jì)110監(jiān)視。使用由電子監(jiān)視系統(tǒng)控制的電磁閥的自動(dòng)化系統(tǒng)也可以被實(shí)現(xiàn)。

6.如圖5b和5c中最佳地示出的，過濾膜116中的孔138優(yōu)選地在樣本液滴126點(diǎn)樣之前被用密封劑140(諸如甘氨酸(或等同物))密封。令人驚訝地且出乎意料地發(fā)現(xiàn)，通過在過濾膜116中使用密封劑140，液滴126內(nèi)部的顆粒142更均勻地分布(在移除液滴126的液體144之前)，并且不需要使用高真空力來降低液滴在過濾膜上非均勻地散開的風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)當(dāng)注意，顆粒的分布在外周邊處不必與中心處相同。可以通過從足跡136的外周邊或外邊緣137朝著顆粒樣本的足跡的中心139掃描設(shè)置在過濾膜上的顆粒樣本的足跡134/136(參見圖4a-4b)來確定顆粒分布圖樣。如果顆粒樣本的被掃描部分示出某個(gè)顆粒分布圖樣，則可以可靠地假設(shè)相同的顆粒分布圖樣應(yīng)用于整個(gè)圓形顆粒樣本足跡136的周圍，部分是因?yàn)轭w粒在密封劑140被液滴126中的液體溶解之前被給予時(shí)間穩(wěn)定下來。因?yàn)橐旱?26首先沉積到密封的過濾膜116上，所以液滴126的足跡136的外邊緣137變得相對(duì)明顯或清楚，為了確定在哪里開始朝著沉積在溶解的過濾膜116上的圓形顆粒樣本或足跡136的中心139掃描和計(jì)數(shù)，這是重要的。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，顆粒在過濾膜上的相對(duì)均勻的分布的優(yōu)點(diǎn)勝過在開始顆粒的計(jì)數(shù)之前必須移除密封劑以允許液滴中的液體流過過濾膜的缺點(diǎn)。液滴在過濾膜上的足跡的任何非均勻的或不明顯的周邊使得確定其足跡以及知道哪個(gè)區(qū)域?qū)⒈环治鲆员銓?duì)液滴中的所有顆粒數(shù)數(shù)更加困難。通過在所有孔138都被密封劑140密封的情況下將樣本液滴126施加到過濾膜116上，當(dāng)液滴126在過濾膜116的密封的頂表面上散開時(shí)，顆粒142均勻地分布在液滴126內(nèi)部。首先必須使密封劑140溶解的要求使液體144通過孔138流過放慢。通過不使用密封劑140，液滴126的液體144將立即開始流過孔138，并且因?yàn)橐旱?26在中心處最厚且在其周邊處較薄，所以更多顆粒142趨于位于液滴的中間。這通常導(dǎo)致顆粒非均勻地分布到過濾膜上并且顆粒樣本的足跡的外邊緣不清晰。應(yīng)當(dāng)注意，因?yàn)橐恍?biāo)本可能具有朝著空氣-水界面集中的趨勢(shì)，所以更多顆粒并不總是位于液滴的中間。一般難以準(zhǔn)確地預(yù)見不同的樣本如何表現(xiàn)和分布。

由于樣本液滴126的整個(gè)足跡136被用于計(jì)算顆粒142的顆粒濃度，所以液滴126不應(yīng)當(dāng)觸及過濾膜116的過濾器保持器的內(nèi)邊緣。因此，重要的是僅過濾膜116的限定部分被樣本液滴126覆蓋。這是要確保液滴126中的所有顆粒142都被計(jì)數(shù)或數(shù)數(shù)。此外，樣本液滴126的位置應(yīng)當(dāng)與樁體120內(nèi)部限定的腔體129和通道128對(duì)齊。在不用密封劑140對(duì)過濾膜116進(jìn)行預(yù)處理的情況下，周圍的過濾孔(即，圖6中的孔138a-138d和138i-138j)保持敞開，并且空氣圍繞液滴126流動(dòng)并且流過過濾膜116，使得樣本液滴126不吸收并且變得足夠快地被過濾以得到顆粒142的良好的樣本分布。換句話說，密封劑140的使用具有當(dāng)液體開始使設(shè)置在液滴126下方的密封劑140溶解時(shí)產(chǎn)生液滴126的足跡136的更明顯的外周邊137。在不使用密封劑140的情況下，沒有足夠的時(shí)間讓顆粒142均勻地分布在液滴126內(nèi)部，因?yàn)橐后w144立即開始流過孔138而沒有給予顆粒142時(shí)間穩(wěn)定下來和均勻地分布在液滴126內(nèi)部。因此密封劑140的一個(gè)非常重要的特征是產(chǎn)生真空條件使得形成限定的標(biāo)本足跡。更特別地，在沒有根據(jù)本發(fā)明的密封劑140的處理的情況下，液滴126不期望地通過擴(kuò)散和蒸發(fā)變干。由于干燥效應(yīng)，這導(dǎo)致高度非均勻的顆粒分布。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，不期望的蒸發(fā)可能引起滲透效應(yīng)，由于剩余的液滴中的鹽濃度增加，這些滲透效應(yīng)潛在地引起顆粒破裂和晶體形成。另外，這使由破壞的顆粒和被鹽析出物隱藏的顆粒引起的顆粒檢測(cè)和計(jì)數(shù)模糊不清。在本發(fā)明中，當(dāng)將樣本液滴126施加到密封的過濾膜116上時(shí)，樣本液滴126中的液體144使密封劑140緩慢地溶解以使設(shè)置在液體126下面的孔138e-138h敞開。因此，液體144被真空迅速地抽拉通過過濾膜116的孔138e-138h，這導(dǎo)致顆粒142在過濾膜116的頂表面上的良好的樣本分布。

7.在將樣本液滴126施加到過濾膜116上之前，真空設(shè)備102被啟動(dòng)，并且真空室104中的壓力被降低以在過濾膜116上產(chǎn)生抽吸。真空室104中的真空確保液滴126的液體144被均勻地吸收在過濾膜116上。密封劑和真空的使用的組合導(dǎo)致顆粒142在過濾膜116上的整個(gè)足跡136上的均勻分布。

8.樣本液滴126的合適的體積(通常為5μl)被施加在多孔的且密封的過濾膜116上。如以上所指出的，重要的是顆粒142的直徑大于過濾膜116的孔138的直徑并且液滴126不觸及過濾器底座的邊緣?？梢酝ㄟ^使用注入系統(tǒng)來施加比5μl高的體積，在該注入系統(tǒng)中，多滴或者較大體積被施加在過濾膜116上的同一個(gè)位置上。一般來說，較大體積的使用使取樣誤差最小化，并且允許對(duì)不太集中的樣本進(jìn)行分析。

9.樣本液滴126在由真空室104提供的真空壓力下在過濾膜116上被吸收達(dá)通常60秒。準(zhǔn)確的壓力值可能必須部分地根據(jù)孔大小、樣本類型、體積、純度和粘度被調(diào)整。

10.在吸收之后，可以從安裝到sem氧化鋁樁體120上(通常通過使用粘合劑和導(dǎo)電碳帶122)的過濾器組件112拆卸過濾膜116。

11.然后可以例如在合適的室壓力(通常為1×10-⁵mbar)下使用碳蒸發(fā)器用碳薄膜(通常為20nm厚)濺射涂布其上放置有結(jié)合的顆粒142的過濾膜116。濺射涂布提高過濾膜116的傳導(dǎo)性；增加過濾膜116的信噪比并且減小電子束損壞和帶電效應(yīng)。為了使用sem對(duì)過濾材料成像，該技術(shù)通常是有必要使用的。使用碳涂布可能是非傳統(tǒng)的，但是與較大晶粒大小的金屬濺射相比它提供較高分辨率的sem成像。

12.過濾膜116可以被轉(zhuǎn)移到sem，并且來自散射的一次電子(使用in-lens檢測(cè)器)或二次電子(諸如通過使用se2檢測(cè)器)的信號(hào)既被以低倍率記錄以覆蓋整個(gè)足跡，又被以高倍率(通常為10000至30000)記錄以用于計(jì)數(shù)。如果使用具有不同的二次電子簽名的參考標(biāo)準(zhǔn)(盡管沒有必要確定顆粒濃度)，則可以通過組合來自不同檢測(cè)器(諸如in-lens檢測(cè)器和se2檢測(cè)器)的強(qiáng)度信息來使感興趣的顆粒與參考顆粒區(qū)分開。

13.低倍率圖像136(參見圖4b)被用于限定液滴的足跡的大小和總體標(biāo)本分布，而高倍率圖像被用于確定顆粒計(jì)數(shù)。

14.高倍率圖像(諸如圖像134)是在整個(gè)樣本足跡上從邊緣137開始、通過中心139、再到液滴的相對(duì)邊緣獲取的，以便使液體的整個(gè)足跡上的顆粒分布的差異的任何影響最小化。

15.從低倍率圖像(諸如圖像136)，通過追蹤足跡的邊緣來計(jì)算樣本足跡的面積(atotal)。對(duì)被包圍的像素?cái)?shù)數(shù)，并且將數(shù)得的數(shù)量乘以像素大小。

16.從高倍率圖像，檢測(cè)顆粒142并且對(duì)顆粒142數(shù)數(shù)。該過程可以通過手動(dòng)標(biāo)記或通過使用合適的軟件(諸如vironova專有的軟件analyzer或任何其它適當(dāng)?shù)膱D像分析軟件)的自動(dòng)標(biāo)記來執(zhí)行。每面積單位的顆粒的平均數(shù)量(n/afov)從圖像數(shù)據(jù)集計(jì)算。

17.顆粒樣本中的每ml的顆粒的數(shù)量?jī)?yōu)選通過使用以下公式計(jì)算：

其中，c是顆粒的濃度，df是稀釋因子，v是樣本的施加的體積。還可以使用考慮當(dāng)樣本被朝著其中心掃描時(shí)顆粒分布可能不同于顆粒樣本的周邊的公式。

總的來說，本發(fā)明的顆粒定量掃描電子顯微術(shù)(pqsem)技術(shù)是高精度直接顆粒檢測(cè)和計(jì)數(shù)技術(shù)。本發(fā)明的重要特征是，直接檢測(cè)不依賴于探針和標(biāo)本之間的親合性，而許多現(xiàn)有的傳統(tǒng)技術(shù)依賴于探針和標(biāo)本之間的親合性。所有參數(shù)(諸如液滴的稀釋因子、施加的體積、足跡)可以被控制，并且每面積單位的顆粒的數(shù)量可以在使來自于近似和假設(shè)的誤差最小化的同時(shí)被直接測(cè)量。而且，pqsem的分辨能力允許檢測(cè)集群內(nèi)的單個(gè)的顯微可見的顆粒，并且不同大小或其它形態(tài)特征的兩群顆?？梢詮耐粋€(gè)樣本計(jì)數(shù)。來自通過本發(fā)明的pqsem技術(shù)產(chǎn)生的高對(duì)比度圖像的顆粒和足跡可以通過使用自動(dòng)圖像分析被容易地檢測(cè)。這提供了用于迅速地收集大的數(shù)據(jù)集并且生成魯棒的統(tǒng)計(jì)結(jié)果的手段。

雖然已根據(jù)優(yōu)選的組成和實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是要理解，在不脫離隨附的權(quán)利要求的精神和范圍的情況下，可以對(duì)其進(jìn)行某些替換和更改。

權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.一種用于顯微可見的顆粒的定量的方法，包括：

提供過濾膜(116)，所述過濾膜(116)具有穿過該過濾膜(116)而限定的多個(gè)孔(138)，所述過濾膜(116)與真空室(104)操作接合；

利用密封劑(140)密封所述孔；

在包含液體(144)和顯微可見的顆粒(142)的樣本液滴(126)不觸及所述過濾膜(116)的任何外邊緣的情況下將所述樣本液滴(126)施加到所述過濾膜(116)上；

所述液體(144)使設(shè)置在所述樣本液滴(126)下方的孔(138e-138h)中的密封劑(140)溶解；

所述液體(144)流過其中密封劑(140)已被溶解的孔，并且所述顯微可見的顆粒(142)留在所述過濾膜(116)的頂部；以及

所述顯微可見的顆粒(142)在電子顯微術(shù)中被計(jì)數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括將包含所述過濾膜(116)的過濾器組件(112)預(yù)先安裝到sem支撐體(120)上的步驟。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括將安裝帶(122)放置在所述sem支撐體(120)上的步驟。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括在使所述樣本液滴(126)沉積在所述過濾膜(116)上之前提供具有限定在其中的細(xì)長(zhǎng)通道(128)的sem支撐體(120)、使用包含所述樣本液滴(126)的注入器(118)以及使所述注入器(118)在細(xì)長(zhǎng)通道(128)的頂部對(duì)齊的步驟。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括將所述sem支撐體(120)連接到與真空源(102)連接的真空室(104)和經(jīng)由細(xì)長(zhǎng)通道(128)使所述過濾膜(116)經(jīng)受抽吸力的步驟。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括所述液體(144)僅使設(shè)置在樣本液滴(126)正下方的孔(138e-138h)中的密封劑(140)溶解、而相鄰的孔(138a-138d，138i-138j)保持被密封劑(140)密封的步驟。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括所述顯微可見的顆粒(142)在所述過濾膜(116)上形成足跡(136)和從所述足跡(136)的外周邊(137)朝著所述足跡(136)的中心(139)對(duì)顯微顆粒(142)進(jìn)行掃描的步驟。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括使用所述液體(144)的稀釋劑來使位于所述樣本液滴(126)直接下方的孔中的密封劑(140)溶解的步驟。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括使用甘氨酸作為密封劑(140)的步驟。