專利名稱：小麥醇溶蛋白的蛋白分子微膠囊制備方法
小麥醇溶蛋白的蛋白分子微膠囊技術(shù)，屬生物技術(shù)領域。
現(xiàn)有技術(shù)進入80年代后，隨著分子改造，分子修飾研究的發(fā)展促進了以肽為原料的蛋白分子微膠囊研究興起，從而拓寬了對人工膜的視野。在生物膜的分子間往往有不同蛋白質(zhì)插入，無論插入部位深或淺都為實現(xiàn)其功能相統(tǒng)一。從分子水平分析生物膜結(jié)構(gòu)的特點不外乎是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間出現(xiàn)的特殊分子排布所致。蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與功能也千差萬別。蛋白分子微膠囊就其成膜條件而言也必需具有親水和疏水的分子排布特點。
到目前為止文獻中有關(guān)蛋白分子微膠囊的研究是通過分子改造的手段，對具有雙功能骨架(multifunctionalbackbone)分子進行化學修飾，使其一端具有親水特性，另一端具有疏水特性。關(guān)于頭部修飾的手段有多種，如攜帶陽離子或非離子狀態(tài)，以氟碳化合物或碳氫化合物的形式出現(xiàn)。頭部與多功能骨架的連接往往通過水溶性羰二亞胺及超聲波處理。頭部的起點多為半胱氨酸或高半胱氨酸。R基團與氨基酸的連接除酯鍵外，還有季胺鹽形式和烷氧基形式等等。目前僅處在理論研究階段，尚未見實用。
美國食品和藥物管理局1991年曾經(jīng)用乳化劑取代方式對淀粉進行改性，用辛烯琥珀酸2%的取代使淀粉具有一定的疏水性質(zhì)，這種改性淀粉有良好的微膠囊化效果，但抗氧化性差，很快又被禁用。因此，選擇合適的天然蛋白質(zhì)為原料用于食品和口服藥物的微膠囊化研究在當前具有重要的理論意義和應用價值。
人工膜的研究有助于探討生物膜的奧秘。在脂質(zhì)體的研究領域中，由于成泡的原料不同，目前可將其分成磷脂為原料的脂質(zhì)體;用肽為原料的蛋白分子微膠囊以及以多糖為原料的微膠囊。以磷脂為原料的脂質(zhì)體的研究已有30多年的歷史。從選材上多為天然化合物，如大豆磷脂、腦磷脂、卵磷脂及神經(jīng)磷脂等。在制備脂質(zhì)體時無論用單一組分還是幾種組分的不同比例混合都不需要對分子進行修飾，只要滿足成膜成泡條件便可順利完成。脂質(zhì)體成膜的基本條件是在于各種磷脂都具有天然的親水頭部和疏水的尾部，在成膜過程中滿足合適的條件使分子呈有序排列，如雙層膜之間是兩個膜的疏水區(qū)而雙層膜的兩側(cè)分別為親水區(qū)。脂質(zhì)體已用于藥物載體，其缺點是載藥范圍及對膜多功能的修飾上有較大的局限性。
本發(fā)明的目的在于篩選出一種純天然的，可用于人、畜、禽藥物包被的無毒無害的原料，也可用于制備各種營養(yǎng)物質(zhì)(油溶性、水溶性及醇溶性)包被外衣，甚至于用在化妝品和外用敷藥等方面，這都需要無毒無害，純天然的包被物質(zhì)。
小麥醇溶蛋白及其類似物能滿足以上需要。經(jīng)世界專利數(shù)據(jù)庫(WPI)及CA檢索，說明該蛋白的提取及用于蛋白分子微膠囊的制備尚無先例，故表明本發(fā)明具有新穎性、創(chuàng)造性和實用性。
本發(fā)明的特點是用無毒無害經(jīng)純化的天然蛋白質(zhì)制成分子微膠囊，可囊括水溶性、脂溶性和醇溶性的物質(zhì)，其分子量從0.4Kd至150Kd。具有良好的穩(wěn)定性及良好的通透性，蛋白分子微膠囊的腔內(nèi)徑電鏡下顯示為0.66μm-1.89μm，膜的厚度為0.025μm。
優(yōu)點及效果成膜蛋白經(jīng)修飾后制成蛋白分子微膠囊可包裹水溶性化合物如染料伊文斯蘭(Evan′sblue)，不經(jīng)修飾能包裹疏水化合物(美蘭)。若在蛋白分子微膠囊中加入堿性品紅染料，混勻后可見到紅色透明的蛋白分子微膠囊出現(xiàn)，說明蛋白分子微膠囊具有良好的通透性。其通透性不限于上述染料或香料。
蛋白分子微膠囊包裹的熒光抗體用胃蛋白酶處理，經(jīng)37℃24小時保溫后，蛋白分子微膠囊的膜被胃蛋白酶消化呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
蛋白分子微膠囊在pH5-8的介質(zhì)中24小時或更長時間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有任何變化，說明蛋白分子微膠囊在該pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。
蛋白分子微膠囊在室溫下(15℃-25℃)幾天，4℃下幾個月，-20℃下數(shù)月存放不改變其形態(tài)特性。
純化后的這種蛋白質(zhì)，經(jīng)氨基酸自動分析儀(Beckman121BM)測定其氨基酸組成中含有五種脂肪烴側(cè)鏈的氨基酸，即丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和脯氨酸以及一種芳香族氨基酸-苯丙氨酸。這六種具有不同疏水性質(zhì)的氨基酸占該蛋白分子的26.4%，該蛋白質(zhì)的N-未端為苯丙氨酸。該蛋白質(zhì)的N-未端測定是在甲酸水(第一相)和苯-冰醋酸(第二相)系統(tǒng)中完成。點樣后經(jīng)雙向?qū)游?，在苯丙氨酸位置出現(xiàn)了明顯的熒光亮點，經(jīng)DNS-phe標準樣品與樣品混合點樣，證實二個樣品落于一處。另外，在第一相層析后出現(xiàn)三個點，一點為原點，一點為ε-Lys，中心最亮的一點為DNS-OH，俗稱鬼點。第二相DNS-OH與另一點分開，中心點即為該蛋白質(zhì)的N-未端-苯丙氨酸。
蛋白分子微膠囊，脂質(zhì)體和多糖的微膠囊都是良好的藥物載體。由于成膜的原料不同，其分子結(jié)構(gòu)也不同，顯然與其生物學功能之間關(guān)系不容忽視。選擇合適的天然蛋白質(zhì)作為分子微膠囊的原料，用于食品和口服藥物及化妝品的分子微膠囊化的研究，作為導向人工膜蛋白，受體人工膜蛋白，人工全合成膜蛋白分子的基因工程的研究。用該蛋白質(zhì)為抗原所制備的抗體對小麥質(zhì)量的鑒定及小麥新品種的選育，完善對麥粉的全面認識，更具有深遠的理論意義和應用價值。
包裹藥物的分子微膠囊用于口服定位釋放，適用于對胃有刺激和有較大毒性不能直接服用的藥物?？诜牡鞍追肿游⒛z囊是磷脂脂質(zhì)體定位釋放所不能及的。包裹香料的蛋白分子微膠囊用于化妝品同樣可以解決延緩釋放的問題。
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容及方案1.原料麥粉經(jīng)分離，純化后得到的醇溶蛋白見附圖1，其使用濃度為0.5-5.0mg/ml。麥粉除小麥面粉外還包括大麥、燕麥、高粱、玉米等種子面粉。
2.被包被液與麥醇溶蛋白溶液的比例蛋白質(zhì)溶液∶水∶伊文斯蘭(Evan′sblue)以(3-4)∶(0-4)∶(1-3)的體積比混合，加入適量蔗糖脂肪酸酯，在室溫下(15-25℃)200-1000rpm攪拌10-20分鐘，制成蛋白分子微膠囊。
蛋白質(zhì)∶氨基黑∶食用油以2∶1∶1體積比例混合后，加入與食用油相同體積的蘇丹Ⅲ，制成蘭邊紅芯包油的蛋白分子微膠囊。
蛋白質(zhì)溶液∶水∶熒光抗體以3∶(0-4)∶(0.5-2)的體積比混合，加適量蔗糖脂肪酸酯，在室溫下(15-25℃)200-1000rpm攪拌10-20分鐘，可制成熒光抗體摻入的蛋白分子微膠囊。
3.被包被物的分子量范圍所制備的蛋白質(zhì)分子微膠囊可包裹分子量0.4kD-150kD化合物，其中包括水溶性化合物(如染料Evan′sblue等)，脂溶性化合物和醇溶性化合物。
4.蛋白分子微膠囊成膜條件上述被包被液與小麥醇溶蛋白溶液的體積比，加適量蔗糖脂肪酸酯，在室溫下(15-25℃)下，200-1000rpm攪拌10-20分鐘，可制成有良好穩(wěn)定性和良好通透性的蛋白分子微膠囊，該蛋白分子微膠囊的腔直徑為0.66-1.89μm，膜厚度為0.025μm。
5.按本發(fā)明制備的蛋白分子微膠囊，可用于包裹各種藥物、維生素、營養(yǎng)素及其他化合物，可用于人、禽、畜藥物載體，化妝品及食品中特殊成份的載體。該蛋白分子微膠囊可在常規(guī)條件下與抗體分子結(jié)合制成導向蛋白，例如兔抗鼠、羊抗兔、兔抗豚鼠抗體，見附圖3。
6.檢測手段蛋白質(zhì)的含量用Folin-酚法測定或用紫外吸收法測定，蛋白分子微膠囊的檢測用光學顯微鏡(200x，400x)，熒光顯微鏡及JEM-100CX透射電子顯微鏡觀測。
實施例實例1小麥醇溶蛋白的提取及純化小麥粉經(jīng)過200目過篩，并以1∶4的重量比加入40-90%的乙醇進行浸泡提取，4-5小時后200目尼龍綢過濾，該濾液即為醇溶蛋白的粗制品。取占膠床體積1-3%的上述濾液，通過膠床體積為38.0毫升的Sephadex LH20柱，其直徑與高度的比為1.5厘米∶22.5厘米，在洗脫速度為0.2毫升/分鐘條件下，經(jīng)過40-90%的乙醇洗脫的第一個峰即為下述各實施例所采用的原料來源，見附圖1。
實例2小麥醇溶蛋白分子微膠囊的制備用實例1經(jīng)純化的小麥醇溶蛋白以0.5-5.0mg/ml的濃度，以蛋白質(zhì)溶液∶水∶伊文斯蘭(Evan′sblue)以(3-4)∶(0-4)∶(1-3)的體積比例混合后，并加入占總體0.1%的蔗糖脂肪酸酯，在室溫下(15-25℃)進行200-1000rpm10-20分鐘的混合攪拌，成為微膠囊懸液。再于-20℃冷凍干燥制成微膠囊干粉，此粉經(jīng)加水至原體積復溶后仍保持原膠囊微型結(jié)構(gòu)的膜完整性。此稱為冷凍干燥及吸水復原特性或DRV特性。
實例3小麥醇溶蛋白分子微膠囊包裹抗體的制備方法經(jīng)純化的小麥醇溶蛋白以0.5-5.0mg/ml的濃度，以蛋白質(zhì)溶液∶水∶熒光抗體(如GAR-FITC羊抗兔熒光抗體或GAH-FITC羊抗人熒光抗體或兔抗豚鼠熒光抗體，)為3∶(0-4)∶(0.5-2)的體積比，加入占總體0.1%的蔗糖脂肪酸酯，在室溫(15-25℃)下進行200-1000rpm10-20分鐘混合攪拌，制成定位釋放微膠囊懸液，此懸液在熒光顯微鏡下可觀察到黃綠色熒光球，見附圖3。再加入過量的胃蛋白酶0.01g/200μl及200μl酸性緩沖液，以模擬胃內(nèi)環(huán)境于37℃下作用24小時，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光彌散及囊膜破壞成網(wǎng)狀。
實例4小麥醇溶蛋白分子微膠囊囊泡的檢測方法按實例1制成的蛋白分子微膠囊懸液，用0.25%戊二醛固定后，在45℃-50℃下加入等體積的0.1-0.16%瓊脂，待冷后進行冰凍切片，JEM-100CX透射電鏡觀察，蛋白分子微膠囊的腔直徑為0.66-1.89μm，膜的厚度為0.025μm。
實例5包油分子微膠囊制備方法及檢測手段經(jīng)純化的小麥醇溶蛋白以0.5-5.0mg/ml的濃度，按蛋白質(zhì)∶氨基黑∶食用油以2∶1∶1體積比例，加或不加蔗糖脂肪酸酯在室溫(15-25℃)下進行200-1000rpm10-20分鐘混合攪拌，加入蘇丹Ⅲ染料，再混勻，在光學顯微鏡下可觀察到蘭邊紅芯小泡，即包油的蛋白分子微膠囊，見附圖2。
實例6
實例6小麥醇溶蛋白分子微膠囊穩(wěn)定性的觀察按實例1樣品所用蛋白質(zhì)濃度，以蛋白質(zhì)∶美蘭∶水按12∶2∶1的體積比例，在室溫(15-25℃)下以200-1000rpm攪拌10-20分鐘，制成蛋白分子微膠囊，光學顯微鏡下可見蘭色蛋白分子微膠囊。將樣品于4-6℃及-15--20℃下存放數(shù)月，再用顯微鏡400×下觀察，未見微膠囊形態(tài)任何變化。
實例7小麥醇溶蛋白分子微膠囊通透性的檢測按實例1所用蛋白質(zhì)濃度，以蛋白質(zhì)∶水以(1-5)∶(5-15)體積比例制成的蛋白分子微膠囊，再加入適量美蘭溶液，混勻后在光學顯微鏡下見到蘭色蛋白分子微膠囊。美蘭在1-2分鐘內(nèi)進入微膠囊內(nèi)。證明蛋白分子微膠囊有良好的通透性。
實例8用大麥、高粱、玉米和燕麥粉替代小麥粉作醇溶蛋白的原料除按實例1用小麥面粉經(jīng)過200目篩網(wǎng)外還可用大麥、高粱、玉米和燕麥粉過200目篩網(wǎng)，并以1∶4的重量比加入40-90%的乙醇溶液進行浸泡提取，4-5小時后經(jīng)200目尼龍綢過濾，該濾液即為醇溶蛋白粗品，純化后獲得的醇溶蛋白亦可用于蛋白分子微膠囊的制備。


圖1 小麥醇溶蛋白的Sephadex LH20凝膠過濾純化洗脫2小麥醇溶蛋白分子微膠囊包裹食用油光學顯微鏡照片3.3×10圖3小麥醇溶蛋白分子微膠囊包裹兔抗豚鼠熒光抗體光學顯微鏡照片10×40
權(quán)利要求
1.純化后的小麥醇溶蛋白的蛋白分子微膠囊制備方法，其特征是包括小麥醇溶蛋白的純化方法、微膠囊懸液和微膠囊干粉的制備方法，1)小麥醇溶蛋白的純化方法小麥粉經(jīng)過200目過篩，并以1∶4的重量比加入40-90%的乙醇進行浸泡提取，經(jīng)4-6小時后200目尼龍綢過濾，該濾液用于醇溶蛋白的純化；取占膠床體積1-3%的上述濾液，通過膠床體積為38.0毫升的SephadexLH20柱層析純化，其柱直徑與高度的比為1.5厘米22.5厘米，洗脫速度為0.2毫升/分鐘，在此條件下，經(jīng)過40-90%的乙醇洗脫得到的第一個峰值即為純化的小麥醇溶蛋白，該蛋白組成中疏水氨基酸為26.4%-32.9%，其中含有五種脂肪酸側(cè)鏈氨基酸即丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和脯氨酸，另有一種芳香族氨基酸為苯丙氨酸，該蛋白的N-未端氨基酸為苯丙氨酸；2)用上述經(jīng)純化的小麥醇溶蛋白以0.5-5.0mg/ml的濃度與水，伊文斯蘭(Evan′sblue)混合，蛋白質(zhì)溶液，水，伊文斯蘭(Evan′sblue)三者的體積比為(3-4)∶(0-4)∶(1-3)混合后加入蔗糖脂肪酸酯為總體積的0.1%，在室溫(15-25℃)下進行200-1000rpm，10-20分鐘的混合攪拌，制備成為微膠囊懸液；再于-20℃下冷凍干燥，制成微膠囊干粉，此粉經(jīng)加水至原體積復溶后仍保持原膠囊微型結(jié)構(gòu)的膜完整性，此稱為冷凍干燥及吸水復原特性或稱DRV特性(Dehydration-Rehydration-Vesicles)；
2.根據(jù)權(quán)利要求1·1)所述方法，其特征是除用小麥粉及其降解片斷與合成類似物制備醇溶蛋白分子微膠囊以外，也可以用大麥、高粱、玉米、燕麥粉及其他禾谷類農(nóng)作物種子面粉制備醇溶蛋白分子微膠囊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1·2)所述方法，其特征是以蛋白質(zhì)溶液∶水∶熒光抗體(如羊抗兔熒光抗體GAR-FITC或羊抗人熒光抗體GAH-FITC))混合三者的體積為3∶(0-4)∶(0.5-2)制成定位釋放微膠囊懸液，此懸液在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光球，再加入過量的胃蛋白酶0.01g/200μl及200μl酸性緩沖液以模擬胃內(nèi)環(huán)境，于37℃下作用24小時，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光彌散及囊膜破壞成網(wǎng)狀，此證明微膠囊在胃酶作用下能夠釋放包裹的熒光抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1·2)所述方法，其特征是制備的微膠囊懸液，用0.25%戊二醛固定后，加入等體積的0.1-0.16%瓊脂(Agar)，待冷后進行冰凍切片，然后在透射電鏡下觀察，蛋白分子微膠囊的腔直徑為0.66-1.89μm，膜的厚度為0.025μm，此證明蛋白分子微膠囊是空腔而非分子團。
5.根據(jù)權(quán)利要求1·2)所述方法，其特征是以蛋白質(zhì)溶液，氨基黑，食用油相混合，三者的體積比為(1-2)∶1∶1，加入占總體積的0.1%蔗糖脂肪酸酯，在室溫(15-25℃)下進行200-1000rpm10-20分鐘攪拌后加入蘇丹Ⅲ染料，混勻，在光學顯微鏡下可觀察到蘭邊紅芯小泡，即包油的蛋白分子微膠囊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1·2)所述方法，其特征是以蛋白溶液，美蘭，水相混合，三者體積比為12∶2∶1，在室溫(15-25℃)下以200-1000rpm攪拌10-20分鐘，制成蛋白分子微膠囊懸液，光學顯微鏡下可見蘭色蛋白分子微膠囊，將此蛋白分子微膠囊樣品在4-6℃及-15--20℃下存放4-5個月后，在顯微鏡400x下觀察，未見微膠囊形態(tài)有任何變化，此證明蛋白微膠囊的穩(wěn)定性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1·2)所述方法，其特征是以蛋白溶液，水相混合，二者體積比為以(1-5)∶(5-15)制成的蛋白分子微膠囊懸液，再加入適量美蘭溶液，混勻后1-2分鐘之內(nèi)在光學顯微鏡下見到蘭色蛋白分子微膠囊，美蘭在短時間內(nèi)進入了微膠囊，此證明蛋白分子微膠囊有良好的通透性。
全文摘要
本發(fā)明用凝膠過濾等手段純化了一個天然蛋白質(zhì)—小麥醇溶蛋白，該蛋白質(zhì)在一定濃度的溶劑系統(tǒng)中經(jīng)過攪拌處理可成膜成泡稱為蛋白分子微膠囊。蛋白分子微膠囊在透射電子顯微鏡下觀察直徑為0.70—2.0μm，腔直徑為0.66—1.89μm，膜的厚度為0.025μm，能包裹分子量為0.4kd—150kd的化合物。蛋白分子微膠囊具有良好的穩(wěn)定性和通透性，經(jīng)低溫冷凍干燥后可壓成鱗片狀，加水后又可復原仍保持蛋白分子微膠囊的脫水、吸水、泡的穩(wěn)定性(Dehydration-Rehydration-Vesicles即DRV)。
文檔編號B01J13/06GK1091679SQ9410055
公開日1994年9月7日 申請日期1994年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月26日
發(fā)明者王素云, 楊中漢 申請人:北京大學