用于操縱液滴中的樣品的系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)專利申請
[0002] 本申請涉及本申請者的共同待決的未公開的以下專利申請：2011年7月22 日的US13/188, 584 ;2012 年 6 月 29 日的EP12 174 408. 0 ;2012 年 7 月 2 日的JP 2012-148654;以及，2012年7月23日的CN2012 10254865. 1，這些專利申請的全部內(nèi)容通 過明確地參考用于所有目的而并入到本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種液滴操縱系統(tǒng)和一種盒，盒具有聚合物膜以用于操縱在聚合物膜 上的液滴中的樣品。小液滴操縱系統(tǒng)可以包括這種盒、由基板支承的電極陣列和用于控制 個別電極選擇和用于向它們提供個別電壓脈沖用于通過電濕潤來操縱液滴的中央控制單 JL〇
[0004] 在各種領(lǐng)域，特別是科研、藥物篩選或，法醫(yī)學(xué)和醫(yī)療診斷領(lǐng)域中完善地確定了對 于生物材料諸如組織樣品或微生物，特別是核酸或蛋白質(zhì)等的分析。發(fā)展了適當(dāng)方法來用 于不同目的，每種方法需要特殊的反應(yīng)試劑和裝置的特殊集合來執(zhí)行相應(yīng)方法。然而，將現(xiàn) 有分析程序用于每種領(lǐng)域中存在的不同條件和要求仍然面臨著挑戰(zhàn)。例如在法醫(yī)學(xué)中，通 常只能提供相對少量的待分析材料。此外，這種材料量相當(dāng)?shù)?，給涉及的人員帶來額外挑 戰(zhàn)。因此，程序需要具體地適應(yīng)這些條件。另一方面，對于實驗室診斷程序而言，生物材料 通常以充分的量提供，但根據(jù)要解決的潛在問題而單獨地采取所需方法。
[0005] 對于生物材料分析的第一步而言，需要本領(lǐng)域中熟知的方法。例如從犯罪現(xiàn)場 (在法醫(yī)學(xué)中）或者從患者（用于診斷目的）收集相關(guān)材料。這些材料可以是組織樣品（諸 如口腔黏膜細(xì)胞、毛囊）或者體液（諸如血液、唾液等）。然后這種起始材料需要進(jìn)一步加 工來使得核酸或蛋白質(zhì)可用于分析。通常，溶解步驟最初用于這些目的，涉及例如施加熱、 特定酶活性和/或施加具體化學(xué)品。細(xì)胞溶解之后從額外細(xì)胞材料純化相關(guān)的核酸或蛋白 質(zhì)。在需要分析核酸的情況下，可以提議核酸擴(kuò)增步驟來增加樣品產(chǎn)率。核酸擴(kuò)增通常由 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)來實現(xiàn)。這種方法允許使用序列特異引物而擴(kuò)增具體預(yù)先限定的核 酸序列。取決于要解決的問題，擴(kuò)增的材料必須通過測序而被進(jìn)一步分析。
[0006] 隨著這些方法的可靠性和簡化的進(jìn)步，例如通過使用套件，這些方法變成了這些 不同領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)程序。以及隨著對于基于分子水平的診斷不斷增加的需求，對于相關(guān)樣 品的自動化處理，始于初始生物樣品直到最終分析，存在增加的需要。
[0007] 相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)
[0008] 自動化樣品處置系統(tǒng)是本領(lǐng)域中眾所周知的。一示例是來自本申請人（瑞士 TecanSchweizAG,Seestrasse103,CH_8708Mannedorf)的reedomEVO? 機(jī)器人工作站。 這種裝置能允許在獨立儀器中或者與分析系統(tǒng)自動連接地進(jìn)行自動液體處置。這些自動化 系統(tǒng)通常需要更大量的液體（微升至毫升）來處理。它們也是不被設(shè)計成便攜式的較大系 統(tǒng)。
[0009] 一種用來溶解和/或純化生物樣品的便攜式裝置從WO2007/061943已知。使用 布置于兩側(cè)上的電極在盒腔室內(nèi)執(zhí)行核酸的處理，因此通過電解、電穿孔、電滲透、電動力 或電阻加熱來處理生物材料。盒還包括篩選基質(zhì)或隔膜。通過使用充分的緩沖劑和其它試 劑，與施加電極組合，能在腔室內(nèi)執(zhí)行各種反應(yīng)，并且所希望的產(chǎn)品例如可以被導(dǎo)向至收集 隔膜。如果分析核酸的序列，并行分析的序列數(shù)量限于探針數(shù)量。通常，能被處理的探針數(shù) 量限于相關(guān)儀器能并行檢測的四個不同波長。盒本身可以放置于整合的系統(tǒng)內(nèi)，整合的系 統(tǒng)包括所需的控制元件和能源。盡管這種盒提供至少部分地電子控制樣品處理的系統(tǒng)，仍 然需要研宄者或技術(shù)實驗室工作人員的干預(yù)。
[0010] 應(yīng)對生物樣品的自動化處理的其它方案源自微流體領(lǐng)域。這個技術(shù)領(lǐng)域大體上涉 及少量液體（通常呈微米級或納米級形式）的控制和操縱。在通道系統(tǒng)中的液體移動是本 身已知的，例如受到固定裝置中的微泵或者旋轉(zhuǎn)實驗室器具中的離心力控制。在數(shù)字微流 體系統(tǒng)中，限定的電壓被施加到電極陣列的電極，使得個別液滴被定址（電濕潤）。對于電 濕潤方法的一般概述，請參看Washizu,IEEETransactionsonIndustryApplications, 第 34 卷，No. 4, 1998,和Pollack等人，Labchip, 2002,第 2 卷，96-101。簡言之，電濕潤 指使用微電極陣列（優(yōu)選地被疏水性層覆蓋）來移動液滴的方法。通過向電極陣列的電極 施加限定的電壓，引起在定址電極上存在的液滴的表面張力變化。這導(dǎo)致在定址電極上小 滴接觸角的顯著變化，因此小滴移動。對于這種電濕潤程序，已知布置這些電極的兩種主要 方式：使用具有電極陣列的單個表面來引起液滴移動或者添加第二表面，第二表面與類似 電極陣列相對并且設(shè)置至少一個接地電極。電濕潤技術(shù)的主要優(yōu)點在于僅需要少量液體， 例如，單個小滴。因此能在顯著更短的時間執(zhí)行液體處理。而且，液體移動的控制完全可在 電子控制之下，導(dǎo)致樣品的自動化處理。
[0011] 使用具有電極陣列的單個表面（電極的單平面布置）進(jìn)行電濕潤的液滴操縱裝置 從美國專利No. 5, 486, 337已知。所有電極放置于載體基板的表面上，下放到基板內(nèi)，或者 被不可濕潤的表面覆蓋。電壓源連接到電極。通過向隨后的電極施加電壓來使小滴移動， 因此根據(jù)向電極的電壓施加順序來引導(dǎo)液滴在電極上方的移動。
[0012] 使用帶有至少一個接地電極的相對表面的電極陣列對液滴移動進(jìn)行微米級控制 的電濕潤裝置從US6, 565, 727 (電極的雙平面布置）已知。這種裝置的每個表面可以包括 多個電極。電極陣列的驅(qū)動電極優(yōu)選地由位于每個單個電極邊緣處的突出部布置成彼此相 互交錯關(guān)系。兩個相對陣列形成間隙。導(dǎo)向至間隙的電極陣列的表面優(yōu)選地被電絕緣疏水 層覆蓋。液滴定位于間隙中并且通過向定位于該間隙的相對位點上的多個電極連續(xù)地施加 多個電場而在單極填料流體內(nèi)移動。
[0013] 在處理生物樣品的情形下操縱液滴的這種電濕潤裝置的使用從美國專利申請 No. 2007/0217956Al已知。在這里建議例如通過熱循環(huán)在印刷電路板上擴(kuò)增核酸。通過在 參考電極與一個或多個驅(qū)動電極之間施加電勢而在電極陣列上運輸小滴。樣品放置于印刷 電路板上的儲集器內(nèi)，并且小滴在印刷電路板上分配。
[0014] 然而，上文所提到的裝置都不允許完全自動地處理核酸，以較小體積規(guī)模從收集 的材料開始直到最終分析。所提出的裝置的額外缺點是由于電極陣列的這種布置的性質(zhì)， 通常生產(chǎn)起來較為昂貴，因此在使用中是不是一次性的。然而，對于不同的生物樣品和應(yīng)用 持續(xù)地再使用相同裝置帶來交叉污染相關(guān)樣品的風(fēng)險，這將導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。因此，這些裝 置不適合于高處理量的化驗。
[0015] 帶有聚合物膜以操縱聚合物膜上的液滴中的樣品的容器從W02010/069977A1已 知：生物樣品處理系統(tǒng)包括用于較大體積處理的容器和平坦聚合物膜，平坦聚合物膜具有 下表面和疏水性上表面。平坦聚合物膜由突起保持離容器的底側(cè)一定距離。當(dāng)容器定位于 膜上時，這個距離限定至少一個間隙。液滴操縱儀器包括用于引起液滴移動的至少一個電 極陣列。支承至少一個電極陣列的基板也公開為用于液滴操縱儀器的控制單元。容器和膜 可逆地附著到液滴操縱儀器上。該系統(tǒng)因此允許至少一個液滴從至少一個井狀結(jié)構(gòu)通過容 器的通道移位到平坦聚合物膜的疏水性上表面上并且到至少一個電極陣列上方。液滴操縱 儀器通過電濕潤而實現(xiàn)了對于平坦聚合物膜的疏水性上表面上的所述液滴的引導(dǎo)移動的 控制和在那里處理生物樣品。
[0016] 發(fā)明目的和概要
[0017] 本發(fā)明的目的在于提供一種帶有電極陣列的替代液滴操縱系統(tǒng)，工作膜可以定位 于電極陣列上，液滴操縱系統(tǒng)被配置成操縱液滴中的樣品并且對放置于電極陣列上的工作 膜上的這些樣品進(jìn)行光學(xué)檢查。
[0018] 根據(jù)第一方面實現(xiàn)了這個目的，其中，提議包括基板和電極陣列的液滴操縱系統(tǒng)， 工作膜可以定位于電極陣列頂部上以操縱工作膜上的液滴中的樣品。本發(fā)明的液滴操縱系 統(tǒng)包括基板，基板帶有至少一個電極陣列和中央控制單元，中央控制單元用于控制（一個 或多個）電極陣列的個別電極的選擇和通過向電極提供個別電壓脈沖以通過電濕潤來操 縱液滴。本發(fā)明的液滴操縱系統(tǒng)的特征在于其被配置成在電極頂部上接納工作膜以在工作 膜放置于所述（一個或多個）電極上時利用（一個或多個）電極陣列來操縱液滴中的樣品， 并且液滴操縱系統(tǒng)的（一個或多個）電極陣列的至少一個選定個別電極被配置成由光學(xué)檢 測系統(tǒng)的光穿透以對位于工作膜上的液滴中的樣品進(jìn)行光學(xué)檢查或分析。
[0019] 替代地，工作膜可以由盒包括，盒將放置于電極陣列上，或者工作膜可以單獨地設(shè) 置于電極陣列頂部上。
[0020] 根據(jù)第二方面實現(xiàn)了這個目的，其中提出了一種液滴操縱系統(tǒng)，其包括基板和電 極陣列，帶有工作膜的盒可以定位于電極陣列頂部上以在盒的工作膜放置于電極陣列上時 利用電極陣列來操縱液滴中的樣品。盒的特征在于其包括：
[0021] a)主體，其包括上表面、下表面以及多個井狀結(jié)構(gòu)，井狀結(jié)構(gòu)被配置成在其中保持 試劑或樣品；
[0022] b)可柔性變形的頂部結(jié)構(gòu)，其不可滲透液體并且被配置成密封井狀結(jié)構(gòu)的頂側(cè)；
[0023] c)可刺穿的底部結(jié)構(gòu)，其不可滲透液體并且被配置成密封井狀結(jié)構(gòu)的底側(cè)；
[0024] d)工作膜，其位于主體的下表面下方，工作膜不可滲透液體并且包括疏水性上表 面；
[0025] e)周圍間隔件，其位于主體的下表面下方并且將工作膜連接到主體，；
[0026] f)在主體的下表面與工作膜的疏水性上表面之間的間隙，間隙由周圍間隔件限 定；以及
[0027] g)多個刺穿元件，其位于可刺穿的底部結(jié)構(gòu)下方并且被配置成刺穿該可刺穿的底 部結(jié)構(gòu)以從井狀結(jié)構(gòu)向間隙內(nèi)釋放試劑或樣品。
[0028] 在每種情況下從附屬權(quán)利要求得到額外和創(chuàng)新性特點。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的盒的優(yōu)點包括：
[0030] ?液滴操縱系統(tǒng)可以用來在對被操縱或保持在工作膜上的適當(dāng)位置的液滴中的樣 品執(zhí)行分析時進(jìn)行頂部和/或底部讀取，即使在液滴位于兩個表面之間的間隙中時。
[0031] ?利用液滴操縱系統(tǒng)的電極陣列的至少一個選定個別電極，可以由光學(xué)檢測系統(tǒng) 的光來輻照位于電極上的工作膜上的液滴中的樣品，電極在光學(xué)上是透明的或者是帶有通 孔的光學(xué)通路電極。
[0032] 光學(xué)透明電極或光學(xué)通路電極可以位于電極陣列的任何位點，例如，在電極路徑 內(nèi)或者在液滴操縱系統(tǒng)的網(wǎng)格狀電極陣列內(nèi)。
[0033] ?盒被設(shè)計成物理地匹配許多不同的化驗并且因此是多種不同化驗通用的。
[0034] ?一次性盒被設(shè)計成僅單次使用并且被設(shè)置為預(yù)先加載數(shù)目和量足以用于計劃的 化驗的制備處理液體和/或試劑。
[0035] ?盒被設(shè)計成安全地吸收樣本諸如口腔拭子頭、組織或吸墨紙片，液體樣品諸如血 液等。
[0036] 電極陣列與盒完全分離并且可以很多次再使用。
[0037] ?電極陣列優(yōu)選地根據(jù)待執(zhí)行的試驗而具有變化的設(shè)計。
[0038] ?電極陣列并未由樣本材料、樣品或試劑觸及并且因此一直是清潔的。
[0039] ?利用根據(jù)本發(fā)明的盒和系統(tǒng)，單個樣品可以分成多個液滴。這允許：
[0040] ?單個小滴的個別操縱：
[0041] ?在這些小滴中每一個中執(zhí)行單獨反應(yīng)；
[0042] ?不同地并且個別地處理每個小滴；例如，可以執(zhí)行核酸擴(kuò)增并且可以分析每個小 滴中的核酸中的不同單核苷酸多態(tài)性（SNP);
[0043] ?樣品小滴中的某些可以處理以核酸分析并且來自同一樣品的其它小滴可以被提 供用于免疫測定或參考樣品。
【附圖說明】
[0044] 現(xiàn)將借助于附圖，更詳細(xì)地解釋根據(jù)本發(fā)明用于操縱液滴中的樣品的盒和系統(tǒng)， 附圖示出了本發(fā)明的優(yōu)選示例性實施例并且并不計劃用于縮小本發(fā)明的范圍。在附圖中示 出了：
[0045]圖1是根據(jù)第一實施例的框架結(jié)構(gòu)盒的豎直截面圖，具有被底部部分閉合的中央 開口，具有多個井狀結(jié)構(gòu)和由單獨周圍間隔件接觸的工作膜；盒幾乎與系統(tǒng)的電極陣列接 觸以進(jìn)行液滴操縱；
[0046] 圖2是根據(jù)第二實施例的板狀結(jié)構(gòu)盒的豎直截面圖，具有多個井狀結(jié)構(gòu)和由整合 周圍邊沿接觸的工作膜；盒幾乎與液滴操縱系統(tǒng)的電極陣列接觸；
[0047] 圖3是根據(jù)第三實施例的框架結(jié)構(gòu)盒的豎直截面圖，具有跨主體的中央開口，具 有多個井狀結(jié)構(gòu)和由單獨周圍間隔件接觸的工作膜；盒幾乎與液滴操縱系統(tǒng)的電極陣列接 觸；
[0048] 圖4是根據(jù)圖3的實施例的框架結(jié)構(gòu)盒的豎直截面圖；盒與液滴操縱系統(tǒng)的電極 陣列接觸；一個井狀結(jié)構(gòu)的周圍底部結(jié)構(gòu)打開并且其內(nèi)含物中的某些被壓入到工作膜與覆 蓋層之間的間隙內(nèi)；
[0049] 圖5是根據(jù)第四實施例的框架結(jié)構(gòu)盒的豎直截面圖，具有跨主體的中央開口，具 有多個井狀結(jié)構(gòu)和由單獨周圍間隔件接觸的工作膜；盒與液滴操縱系統(tǒng)的電極陣列接觸； 一個井狀結(jié)構(gòu)的可刺穿底部結(jié)構(gòu)是打開的并且其內(nèi)含物中的某些被壓入到工作膜與覆蓋 層之間的間隙內(nèi)，覆蓋層在此處被配置成剛性覆蓋物；
[0050] 圖6是根據(jù)第三實施例或第四實施例的框架狀盒的三維頂視圖，其中吸入裝置處 于被