平衡循環(huán)，而閥將進(jìn)料流切換到第六柱（6)的入口并且第六柱（6)的 出口直接連接到串聯(lián)中的第一柱（1)，使得來自前一柱(6)的產(chǎn)品進(jìn)料溢流被捕獲在已再 生、重新平衡的第一柱（1)上。
[0138] 上文已經(jīng)描述了連續(xù)捕獲色譜方法，其中色譜方法步驟的多管柱操作使用可切換 通道的閥組"集成回路"（即，可致動(dòng)閥的陣列，可對(duì)其進(jìn)行編程以形成進(jìn)料的切換流路， 以通向具有多個(gè)步驟的多管柱單元操作中的一系列柱）調(diào)節(jié)。出于舉例說明的目的，此類 系統(tǒng)已在對(duì)進(jìn)料流中的抗體產(chǎn)品進(jìn)行蛋白A親和色譜分離的背景下進(jìn)行了描述，然而應(yīng)當(dāng) 認(rèn)識(shí)到，諸如圖10A-10E的所示閥陣列的設(shè)備可用于形成任何類型的色譜分析的多管柱、 連續(xù)方法，包括尺寸排阻色譜、離子交換色譜、使用另一種類型的非蛋白A的配體的親和色 譜、金屬離子螯合、疏水相互作用色譜等等。
[0139] 連續(xù)低DH病毒滅活
[0140] 如上所述，在設(shè)計(jì)包括一系列單元操作的生物藥品制造方法時(shí)，早期步驟將通常 為捕獲色譜步驟。在圖2A中所示的抗體生產(chǎn)方法中，蛋白A捕獲色譜步驟緊接著從生物反 應(yīng)器中初始回收抗體后進(jìn)行。在許多捕獲色譜操作中，尤其是蛋白A親和色譜法，從親和捕 獲介質(zhì)的洗脫通過降低流過色譜柱的緩沖液的pH而實(shí)現(xiàn)。蛋白A/抗體復(fù)合物在低pH下 解離，例如約pH 3.0與pH 3. 5之間。因此，蛋白A柱的洗出液為低pH溶液。抗體產(chǎn)品如 果保持在低PH下超過30分鐘（±5分鐘）將發(fā)生嚴(yán)重的降解；在另一方面，低pH孵育是 使可能存在于溶液中的病毒滅活的非常好的方法。如果抗體產(chǎn)品旨在作為藥物使用，則病 毒滅活是整個(gè)制造方法中的必需步驟，并且如果捕獲色譜步驟產(chǎn)生了含有抗體產(chǎn)品的低PH 洗出液，則將有利的是在連續(xù)方法中將洗出液直接轉(zhuǎn)移到設(shè)計(jì)用于低pH病毒滅活的單元 操作。
[0141] 參見圖11，示意性地示出了設(shè)計(jì)為連續(xù)低pH病毒滅活的單元操作。該單元操作 被設(shè)計(jì)為接收低PH進(jìn)料（如通過入口（54)進(jìn)入集成多閥門閥塊或閥組（40))并將進(jìn)料轉(zhuǎn) 移到一系列保持/孵育容器（50, 51，52)中的一個(gè)。閥組（4)配備適用于獨(dú)立地和可供選 擇地轉(zhuǎn)移到連接到閥組（40)的保持/孵育容器（50, 51，52)任一個(gè)的通道和閥陣列（由 圖[X]n表示）。圖11所示單元操作的目標(biāo)是使產(chǎn)品溶液在適用于可能存在于溶液中的病 毒滅活的PH下孵育。例如，對(duì)于抗體產(chǎn)品溶液，在低于pH 3. 5的預(yù)先選定的受控pH(例如 ±0.2pH單位）下孵育30分鐘±5分鐘，根據(jù)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)降低活病毒的水平，并且抗體產(chǎn)品 的降解或變性將是可接受的。病毒滅活步驟通常被設(shè)計(jì)為提供3或以上的對(duì)數(shù)下降值，即 至少10, 000倍的活病毒減少。
[0142] 再次參見圖11，將產(chǎn)品溶液的等分試樣通過入口（54)轉(zhuǎn)移到孵育容器（52)。容 器的尺寸可被制定為接收前一單元操作通量的所有或任何部分轉(zhuǎn)移。在利用一次性設(shè)備的 連續(xù)方法中，容器（50, 51，52)可有利地為塑料袋、瓶、燒瓶等。同樣，系統(tǒng)的其他組件諸如 通向閥組（40)的管道以及閥組本身的部件可由單次使用的材料制成。例如，閥系統(tǒng)可由覆 蓋閥致動(dòng)器和相關(guān)通道的陣列的可更換片狀膜形成，其中柔性膜的并置導(dǎo)致關(guān)閉的閥控通 道系統(tǒng)，其模式由陣列中不同的打開和關(guān)閉閥的組合決定。（參見例如為BioSMB?純化系 統(tǒng)（Tarpon Biosystems, Inc. ,Worcester, MA (US)中的特色的閥盒系統(tǒng)）。
[0143] 為了密切地監(jiān)控溶液的pH，每個(gè)容器將配備pH傳感器（未示出）以及用于接收 酸性和/或堿性溶液以將PH調(diào)節(jié)到所需范圍內(nèi)的進(jìn)入口（未示出）?？赡苤匾氖牵?容器（50, 51，52)中的抗體產(chǎn)品溶液保持充分混合，例如使得可得到準(zhǔn)確的pH讀數(shù)并且任 何PH調(diào)節(jié)都將影響容器中收集到的整個(gè)等分試樣。在此類情況下，容器將配備混合裝置， 其在圖11中示意性地由螺旋槳式混合槳（53)表示，但是作為另外一種選擇其可以是適于 實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品溶液所需均勻程度的任何裝置。磁力攪拌棒、搖瓶、搖床等均是合適的并為本文所 設(shè)想的。
[0144] 通過閥組件（40)的可變引入通道可將來流導(dǎo)向每一個(gè)保持/孵育容器 (50, 51，52)。每個(gè)孵育容器的內(nèi)容物可單獨(dú)地導(dǎo)向該單元操作的出口（55)。在圖11的示意 圖中，通過入口（54)進(jìn)入單元操作的溶液被導(dǎo)向第三孵育容器（52)，而第一孵育容器的內(nèi) 容物被導(dǎo)向出口（55)，例如以轉(zhuǎn)移到下一單元操作。圖11中的虛線代表可用但未使用的通 道，它們用于將來自入口（54)的溶液導(dǎo)向容器（50)和（51)，以及用于將容器（51)和（52) 的內(nèi)容物導(dǎo)向出口（55)，例如以轉(zhuǎn)移到下一單元操作。除了所示的管線外，閥組件（40)可 設(shè)有閥和栗（未示出）以將溶液從一個(gè)容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)。通過一系列容器的這種轉(zhuǎn)移可 例如在需要對(duì)此單元操作的pH或其他溶液條件進(jìn)行分步調(diào)節(jié)的情況下實(shí)施。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，第一容器（52)可用于低pH下的孵育，然后第二和后續(xù)容器可用于進(jìn)一步的加 工，諸如緩沖液交換（例如以逐漸升高pH)、將產(chǎn)品暴露于離液劑或在有利的溶液條件下孵 育以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)重新組裝或重折疊。參見圖12和13,示出了通過一系列串聯(lián)的三個(gè)保持/ 孵育容器（50)轉(zhuǎn)移溶液。在圖12中，保持/孵育容器（50)之間的轉(zhuǎn)移通道示為流過閥組 件（40)，使得通過操縱集成閥系統(tǒng)來控制順序轉(zhuǎn)移。在圖13中，從一個(gè)容器（50)到下一個(gè) 的順序轉(zhuǎn)移不使用閥組件（40)控制，而是通過某些其他裝置進(jìn)行，例如通過溢流、人工轉(zhuǎn) 移或通過源容器中的傳感器觸發(fā)的轉(zhuǎn)移，例如定時(shí)器、料位傳感器或在達(dá)到特定pH時(shí)發(fā)送 轉(zhuǎn)移操作信號(hào)的PH傳感器。
[0145] 將蛋白質(zhì)產(chǎn)品暴露于低pH的可接受時(shí)間窗口通常很窄（例如30±5分鐘）。過短 的暴露時(shí)間不能提供充分的病毒滅活，而過長(zhǎng)的暴露時(shí)間則會(huì)導(dǎo)致較高程度的產(chǎn)品降解。 連續(xù)加工允許在緊密的時(shí)間容限內(nèi)操作低PH病毒滅活單元操作。優(yōu)選的方法涉及以半連 續(xù)方式使產(chǎn)品溶液的"包"或等分試樣穿過單元操作。在低PH病毒滅活步驟前的單元操作 為捕獲色譜操作（例如抗體產(chǎn)品的蛋白A親和色譜法）的情況下，產(chǎn)品作為一系列連續(xù)的 洗出液峰進(jìn)入低pH病毒滅活單元操作。通過混合可在預(yù)定的孵育期間（例如在上述實(shí)例 中的30分鐘±5分鐘）內(nèi)收集的低pH加工的多個(gè)洗脫液峰，將應(yīng)用正確的孵育時(shí)間并可 實(shí)施連續(xù)轉(zhuǎn)移到下一單元操作。
[0146] 以舉例的方式，在連續(xù)病毒滅活系統(tǒng)中，其中產(chǎn)品進(jìn)料是從蛋白A色譜柱洗脫的 單克隆抗體，病毒滅活單元操作可有利地如下進(jìn)行：
[0147] 1.來自蛋白A的洗出液將具有pH 3. 5-pH 4. 5范圍內(nèi)的pH。在收集待加工的混 合液（例如，在等于低PH孵育期間的時(shí)間內(nèi)來自蛋白A柱的洗脫峰）后，將在保持/孵育 容器中將pH通過酸滴定調(diào)節(jié)到低pH病毒滅活條件（例如pH 3. 3);
[0148] 2.酸滴定將通過在溫和混合和連續(xù)pH監(jiān)測(cè)下添加稀酸（如IMHC1)直到達(dá)到低 pH病毒滅活的pH設(shè)定點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)；
[0149] 3.-旦達(dá)到合適的pH，將容器中的產(chǎn)品溶液內(nèi)容物保持所需的滅活時(shí)間（如30 分鐘）；
[0150] 4.在所需的孵育時(shí)間后，將采用另一 pH調(diào)節(jié)步驟（優(yōu)選地在轉(zhuǎn)移到另一（下游） 保持容器后）將滅活溶液的PH調(diào)高到適合轉(zhuǎn)移到后續(xù)單元操作的pH(例如pH 5. 0)，該后 續(xù)單元操作諸如為上樣到陽離子交換色譜柱（參見例如圖2A的項(xiàng)目13);
[0151] 5.在將產(chǎn)品溶液轉(zhuǎn)移到下一單元操作后，可清潔并沖洗保持容器以上樣另一蛋白 A洗出混合液，或者可將容器丟棄并將新的容器連接到系統(tǒng)以接收后續(xù)蛋白A洗出混合液 并讓它們通過低pH滅活步驟。
[0152] 為了避免從一個(gè)容器到另一個(gè)容器物理轉(zhuǎn)移產(chǎn)品溶液，在以上序列中描述的包含 混合蛋白A洗出液的容器的"移動(dòng)"可通過合適的控制器和閥盒實(shí)現(xiàn)。這與使用圖IOA-圖 IOE所示系統(tǒng)中的閥盒實(shí)現(xiàn)的色譜柱的模擬"移動(dòng)"非常相似。
[0153] 在可供選擇的實(shí)施方案中，蛋白A洗出液可流過連續(xù)混合的保持袋（容器）的級(jí) 聯(lián)序列，其中第一個(gè)將實(shí)現(xiàn)蛋白A洗出液的pH調(diào)節(jié)，而其中最后一個(gè)將實(shí)現(xiàn)下一單元操作 前的滅活溶液的PH再次調(diào)節(jié)。袋子的大小被制定為確保實(shí)現(xiàn)低pH病毒滅活的合適停留時(shí) 間。
[0154] 連續(xù)加工設(shè)計(jì)
[0155] 可以認(rèn)識(shí)到，為了有效地聯(lián)系整個(gè)制造方法的單元操作使得它們可以連續(xù)的方式 運(yùn)行，在操作的每個(gè)階段進(jìn)行性能的定量分析是必要的。必須開發(fā)和執(zhí)行產(chǎn)品產(chǎn)率和純度 的分析方法。此類方法可包括評(píng)估整個(gè)方法中的產(chǎn)品純度的SDS-PAGE(還原和非還原）方 法，評(píng)估通過純化方法對(duì)宿主細(xì)胞蛋白清除率的宿主細(xì)胞蛋白ELISA，以及確定產(chǎn)品濃度和 產(chǎn)率的HPLC或紫外吸光度方法。
[0156] 多管柱逆流連續(xù)色譜方法諸如SMB方法的設(shè)計(jì)需要與批方法相同的基本方法信 息。這包括進(jìn)料溶液中的產(chǎn)品濃度（滴度）、平衡結(jié)合容量（靜態(tài)結(jié)合榮浪）和整個(gè)方法順 序。依賴于色譜介質(zhì)、產(chǎn)品和溶液條件的質(zhì)量轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)相關(guān)信息對(duì)于系統(tǒng)定制也是需要 的。一般來講，這可得自穿透曲線分析。為此，設(shè)計(jì)完善的批方法是設(shè)計(jì)連續(xù)多管柱或多階 段純化方法非常好的起點(diǎn)。
[0157] 對(duì)于低pH滅活步驟，需要用于確定和確認(rèn)病毒滅活的可接受時(shí)間范圍的分析方 法。對(duì)于超濾/滲濾（UF/DF)步驟（參見圖2A的項(xiàng)目14)，可通過小試規(guī)模的切向流過濾 (TFF)系統(tǒng)獲得關(guān)于在變化的流速和產(chǎn)品濃度下隨跨膜壓而變化的流量的有用數(shù)據(jù)。對(duì)于 納濾和最終〇. 2微米過濾步驟（參見圖2A的項(xiàng)目16和17)，可獲得關(guān)于隨流量而變化的壓 降以及各個(gè)膜裝置的負(fù)荷容量的可用數(shù)據(jù)。
[0158] 使用方法的每個(gè)單元操作獲得的此類批方法數(shù)據(jù)，可以設(shè)計(jì)連續(xù)加工操作。第一 設(shè)計(jì)選擇為加工時(shí)間。與其中加工時(shí)間是方法設(shè)計(jì)的結(jié)果的批方法相反，連續(xù)方法允許預(yù) 先選擇加工時(shí)間。加工時(shí)間越長(zhǎng)，通過單元操作系列的流速可以越低并且整個(gè)系統(tǒng)可以更 緊湊（在所用設(shè)備的規(guī)模方面）。在另一方面，過長(zhǎng)的加工時(shí)間可導(dǎo)致達(dá)到不可接受水平的 某些階段的產(chǎn)品降解。進(jìn)料流速是需要加工的體積和加工時(shí)間的結(jié)果。需要加工的體積稱 為"批"或"批量"。
[0159] 進(jìn)入CPT方法的最低進(jìn)料流速Q(mào)ni由最長(zhǎng)加工時(shí)間t用以下公式計(jì)算：
[0161] 其中Ap是所需的產(chǎn)品的量；Cp是進(jìn)料中的產(chǎn)品濃度；而Y是總體方法產(chǎn)率。假定 細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體產(chǎn)品的初始滴度為lg/L并且純化方法的總體方法產(chǎn)率為60 %，則 實(shí)現(xiàn)3天100g生產(chǎn)率的最低進(jìn)料流速為39mL/分鐘。為了確保系統(tǒng)可運(yùn)行以充裕地實(shí)現(xiàn) 生產(chǎn)率目標(biāo)，目標(biāo)CPT方法進(jìn)料流速將設(shè)置在比最低流速高至少10 %的值或約45mL/分鐘。
[0162] -旦確定進(jìn)料流速，CPT方法設(shè)計(jì)可以第一單元操作例如捕獲步驟（諸如蛋白A親 和色譜步驟）的設(shè)計(jì)開始。對(duì)于連續(xù)SMB色譜步驟，設(shè)計(jì)算法以確定色譜介質(zhì)的最低（模 擬）轉(zhuǎn)運(yùn)速率開始。其為在沒有質(zhì)量轉(zhuǎn)移阻力的情況下將允許結(jié)合所有產(chǎn)物的介質(zhì)在將存 在理想平推流而不存在任何其他非理想?yún)?shù)的情況下的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。為了適應(yīng)質(zhì)量轉(zhuǎn)移阻力 以及處理其他非理想的因素或限制，實(shí)際的色譜介質(zhì)模擬轉(zhuǎn)運(yùn)速率將選擇為高于最低轉(zhuǎn)運(yùn) 速率。通常，從業(yè)人員選擇5-40%范圍內(nèi)的安全裕度。在上樣區(qū)中色譜介質(zhì)的體積然后取 決于通過上樣區(qū)中的柱子的流速和所需的停留時(shí)間，其主要依賴于質(zhì)量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，諸如擴(kuò) 散。知道所需的停留時(shí)間和進(jìn)料流速，就可以計(jì)算上樣區(qū)中的所需樹脂體積。
[0163] 完成第一單元操作的設(shè)計(jì)后，可將此步驟的出口產(chǎn)品流速設(shè)置為等于方法中第二 單元操作的入口流速，使得每個(gè)連接步驟的水流容量相匹配。與第一單元操作相似的設(shè)計(jì) 算法可應(yīng)用于方法中的每個(gè)單元操作。每個(gè)單元操作的批數(shù)據(jù)可用于開發(fā)該單元操作的連 續(xù)操作設(shè)計(jì)，其允許聯(lián)系到之前和后續(xù)單元操作。當(dāng)完成整個(gè)純化方法中所有單元操作的 這一過程時(shí)，初始CPT方法設(shè)計(jì)即完成。通過該初始設(shè)計(jì)，可以定型、制定和訂購(gòu)制造方法 所有步驟的合適設(shè)備和一次性用品，以適應(yīng)初始CPT設(shè)計(jì)的參數(shù)和要求。
[0164] -旦已確立初始設(shè)計(jì)，接著可通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)每個(gè)方法步驟進(jìn)行優(yōu)化，以使任何 所需的屬性最大化，諸如體積生產(chǎn)率或緩沖液利用。為了建立無縫簡(jiǎn)潔的連續(xù)方法，每個(gè)單 元操作的大小和通量將由流速（水流容量）而不是待加工的總體積或質(zhì)量進(jìn)行控制。對(duì)于 每個(gè)步驟，優(yōu)化將涉及研究控制單元操作大小和水流容量的原理和現(xiàn)象。例如，使用連續(xù)多 管柱SMB的色譜步驟的優(yōu)化將涉及研究分離因子S和轉(zhuǎn)運(yùn)單元數(shù)NTU對(duì)方法步驟性能的影 響。
[0165] 分離因子S是由與產(chǎn)品進(jìn)料速率相關(guān)的床轉(zhuǎn)運(yùn)速率所致轉(zhuǎn)運(yùn)能力的度量，并定義 如下：
[0166]
[0167] 其中和? 分別為液相和固定相的流速（就床而言，? 為模擬轉(zhuǎn)運(yùn)速 率），Qstastl。為介質(zhì)的結(jié)合容量，并且C 為進(jìn)料中的濃度。
[0168] 轉(zhuǎn)移單元數(shù)NTU用作逆流色譜系統(tǒng)的質(zhì)量轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)的度量，并定義如下：
[0169] NTU = koLXaXV/?feed
[0170] 其中為系統(tǒng)的總體質(zhì)量轉(zhuǎn)移系數(shù)，V為柱體積，并且a為比表面積，其等于顆粒 表面積除以柱體積。NTU是系統(tǒng)中的停留時(shí)間和特征性質(zhì)量轉(zhuǎn)移時(shí)間的比率。
[0171] 通過評(píng)價(jià)不同NTU和S值下的性能的實(shí)驗(yàn)研究，可以確定每個(gè)步驟的最佳加工條 件，以便實(shí)現(xiàn)所需的生產(chǎn)率同時(shí)滿足分離或性能目標(biāo)（例如，蛋白A色譜步驟的宿主細(xì)胞蛋 白質(zhì)移除）。除了該優(yōu)化外，將有利的是研究單元操作的穩(wěn)定性和對(duì)干擾的靈敏性，以便確 立集成方法穩(wěn)健性的一些初步參數(shù)。例如，最佳的加工條件可能太接近將會(huì)導(dǎo)致不可接受 的性能的條件，在此情況下，對(duì)條件進(jìn)行調(diào)節(jié)以提供最佳和可接受地穩(wěn)定的性能。
[0172] 最后，在此階段，應(yīng)特別注意每一個(gè)單元操作的壓降。由于其可變?yōu)閱卧僮骷?jí)聯(lián) 中的限制因素，因此波動(dòng)容器的安裝將是均衡級(jí)聯(lián)中關(guān)鍵點(diǎn)的系統(tǒng)壓力并因此需要調(diào)節(jié)壓 降以維持所需下游流速的重要裝置。
[0173] 通往入口進(jìn)料速率的每個(gè)步驟的穩(wěn)健性將具有重要的意義，以確保能夠適應(yīng)實(shí)際 操作中將經(jīng)歷的運(yùn)行條件的范圍。包括在此目標(biāo)內(nèi)的是開發(fā)整個(gè)連續(xù)管線的關(guān)閉和啟動(dòng)程 序，包括本文所述的緊急收集容器的使用程序。
[0174] 在制造方法的連續(xù)操作期間，必須在方法中的每個(gè)點(diǎn)采樣，