專利名稱：一種硝酸還原酶活性測定新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物體內(nèi)酶活性測定新方法，尤其是植物體內(nèi)一種硝酸還原酶活 性測定新方法。
背景技術(shù)：
硝酸還原酶是植物體內(nèi)硝態(tài)氮代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶，且硝酸還原酶是一種誘導(dǎo) 酶，即在硝態(tài)氮(no3_)存在條件下能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生酶活性。植物從土壤中吸收的硝態(tài)氮首先 需要經(jīng)過硝酸還原酶的催化而形成亞硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮再經(jīng)過亞硝酸還原酶作用下轉(zhuǎn)化為 NH4+,然后NH4+在谷胺酰胺合成酶作用下形成氨基酸，進(jìn)而完成蛋白質(zhì)的合成。在植物生長 發(fā)育過程中，如果硝態(tài)氮代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶硝酸還原酶活性受到外界環(huán)境的影響則植物 體內(nèi)氨基酸和蛋白質(zhì)的合成就會受到阻礙，從而造成對植物生長發(fā)育的嚴(yán)重不利影響。因 此，對植物體內(nèi)硝酸還原酶活性的測定，能正確反應(yīng)出植物對氮素營養(yǎng)的吸收與代謝能力， 是正確評價(jià)外界環(huán)境對植物氮代謝影響的一種有效方法。目前已有的關(guān)于硝酸還原酶活性 的測定方法可以歸納為兩種一、活體法這種方法是在反應(yīng)液中加入硝態(tài)氮(N03_)，通過測定硝態(tài)氮(N03_)被植物體內(nèi)硝 酸還原酶還原成亞硝態(tài)氮的量來反應(yīng)酶活性的高低。但由于硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，其 活性會受到反應(yīng)液中加入硝態(tài)氮(no3_)的誘導(dǎo)而提高，因此這種“活體法”測定硝酸還原酶 的活性不能真實(shí)反應(yīng)植物體內(nèi)硝酸還原酶活性，只是作為一種相對比較而加以應(yīng)用。二、離體法這是一種目前正在應(yīng)用的測定植物體內(nèi)硝酸還原酶活性真實(shí)值的方法?！半x體法” 測定植物體內(nèi)硝酸還原酶活性真實(shí)值方法具體步驟是1、反應(yīng)液配制(1)利用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀配制0. lmol/L pH7. 5的磷酸緩沖液；(2)配制 0. lmol/L KNO3 磷酸緩沖液；(3)配制NADH2溶液稱取2. Omg NADH2溶于Iml 0. lmol/L的磷酸緩沖液中；(4)配制提取緩沖液25mmol/L的磷酸緩沖液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/L EDTA-Na2混合液。2、測定方法流程取實(shí)驗(yàn)材料洗凈剪碎，放在研缽中置低溫冰箱冷凍30min。取出 在冰浴中加少量石英砂和提取緩沖液。研磨為勻漿，低溫離心5min(4000r/min)。上清液即 為粗酶提取液。上述操作盡量在冰浴中進(jìn)行；3、比色取粗酶提取液，加入KNO3磷酸緩沖液和NADH2溶液。在30°C下保溫30min。 保溫后立即加ImL對-氨基苯磺酸溶液終止反應(yīng)，加ImL α -萘胺溶液，顯色20min，在臺式 離心機(jī)上離心lOmin，取上清液在分光光度計(jì)上測波長540nm處的光密度值。離體法具有的缺點(diǎn)是(1)需要配制的反應(yīng)液多(共4種)，所需化學(xué)藥品多，價(jià)格 貴；(2)測定方法流程復(fù)雜、人為造成誤差增大。首先需要低溫冰凍研缽研磨和低溫離心，費(fèi)工、費(fèi)時(shí)。從研缽中轉(zhuǎn)移至離心管離心時(shí)會造成研磨液的損失造成誤差；(3)比色時(shí)仍需 要進(jìn)一步低溫離心，使測定時(shí)間加長，造成人為誤差加大；(4)方法復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)快速、多 組測定植物體內(nèi)硝酸還原酶的真實(shí)活性。本項(xiàng)發(fā)明所涉及的這種植物體內(nèi)硝酸還原酶活性的測定方法是在多年試驗(yàn)基礎(chǔ) 上獲得的一種簡便、精確并可快速、多組測定植物體內(nèi)硝酸還原酶活性真實(shí)值的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
植物體內(nèi)硝酸還原酶活性的高低能夠真實(shí)地反應(yīng)植物對硝態(tài)氮吸收與代謝的能 力，是評價(jià)環(huán)境條件對植物氮代謝影響的一種有效方法。因此，建立一種能夠簡便、快速測 定植物體內(nèi)硝酸還原酶真實(shí)活性的方法在植物氮代謝研究領(lǐng)域具有重要作用。本項(xiàng)發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是在保持已有的“離體法”測定硝酸 還原酶活性比色時(shí)加入的顯色劑對-氨基苯磺酸溶液和α-萘胺溶液不變前提下，進(jìn)行如 下操作1、提取液配制用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和(V/V)的1-丙醇配制成IOOmM, pH7. 5的提取液。2、測定方法流程取植物樣品0. 3克左右剪碎裝入反應(yīng)試管，加入提取液6毫升， 抽真空1-2分鐘，從反應(yīng)試管中取出ImL反應(yīng)液放入潔凈試管中。將裝有樣品的反應(yīng)試管 吹氮?dú)?0秒后用錫紙封住試管口，將該試管放入30-35°C水浴中保溫1小時(shí)后，取反應(yīng)液 ImL放入潔凈試管。然后向反應(yīng)試管中加入ImL提取液，再放入30_35°C水浴中保溫1小時(shí) 后，取反應(yīng)液ImL放入潔凈試管。再向反應(yīng)試管中加入ImL提取液，放入30_35°C水浴中保 溫1小時(shí)，取反應(yīng)液ImL放入潔凈試管。向上述獲得的4支裝有ImL反應(yīng)液的試管中分別 加入去離子水4mL準(zhǔn)備用于顯色反應(yīng)。3、比色分別向上述4只試管中加入ImL 1 % (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液，顯色反應(yīng)30分鐘。用提取液ImL加入4mL去離子水后分別 加入ImL 1% (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液做空白，在 分光光度計(jì)上測定波長540nm處的光密度值，取同一時(shí)間的最佳光密度值計(jì)算硝酸還原酶 活性。單位為=μΜ NCVg-1FW IT1。本發(fā)明的有益效果是(1)提取液配制簡單(僅1種)，所需化學(xué)藥品少，成本低； (2)測定過程無需研磨、離心，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無硝態(tài)氮(N03_)的引入，不會誘導(dǎo)硝酸還 原酶活性的提高，因而誤差小，真正實(shí)現(xiàn)了對植物體內(nèi)硝酸還原酶真實(shí)值的測定；(3)方法 簡便，可以實(shí)現(xiàn)快速、多組測定植物體內(nèi)硝酸還原酶的真實(shí)活性。
具體實(shí)施例方式1、提取液配制用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和(V/V)的1-丙醇配制成IOOmM, pH7.5的提取液。2、測定方法流程取植物樣品0. 3克左右剪碎裝入反應(yīng)試管，加入提取液6毫升， 抽真空1-2分鐘，從反應(yīng)試管中取出ImL反應(yīng)液放入潔凈試管中。將裝有樣品的反應(yīng)試管 吹氮?dú)?0秒后用錫紙封住試管口，將該試管放入30-35°C水浴中保溫1小時(shí)后，取反應(yīng)液 ImL放入潔凈試管。然后向反應(yīng)試管中加入ImL提取液，再放入30_35°C水浴中保溫1小時(shí)后，取反應(yīng)液ImL放入潔凈試管。再向反應(yīng)試管中加入ImL提取液，放入30_35°C水浴中保 溫1小時(shí)，取反應(yīng)液ImL放入潔凈試管。向上述獲得的4支裝有ImL反應(yīng)液的試管中分別 加入去離子水4mL準(zhǔn)備用于顯色反應(yīng)。3、比色分別向上述4只試管中加入ImL 1 % (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液，顯色反應(yīng)30分鐘，用提取液ImL加入4mL去離子水后分別加 入ImL 1% (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液做空白，在分 光光度計(jì)上測定波長540nm處的光密度值，取同一時(shí)間的最佳光密度值計(jì)算硝酸還原酶活 性。單位為:μΜ NCVg-1FW IT1。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線用亞硝酸鉀分別配制 0，0. 05，0. 1，0. 3，0. 4，0. 5，1. 0，5. 0，10. 0， 15. 0,20. 0,25. 0,30. 0,40. 0,60. 0,80. 0，100. 0，120. 0，160. 0,200. 0μ M 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別 取lmL，加入4mL去離子水后再分別加入ImL 1% (W/V)的對-氨基苯磺酸溶液和ImL 0.2% (W/V)的α-萘胺溶液，顯色反應(yīng)30分鐘后在分光光度計(jì)上測定波長54 0nm處的光密度值， 做出亞硝酸鉀濃度和光密度值的直線圖。
權(quán)利要求
提取液配制用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和1％(V/V)的1-丙醇配制成100mM，pH 7.5的提取液。
1.提取液配制用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和(V/V)的1-丙醇配制成100mM，pH 7. 5的提取液。
2.測定方法流程取植物樣品0.3克左右剪碎裝入反應(yīng)試管，加入提取液6毫升，抽真 空1-2分鐘，從反應(yīng)試管中取出lmL反應(yīng)液放入潔凈試管中。將裝有樣品的反應(yīng)試管吹氮 氣30秒后用錫紙封住試管口，將該試管放入30-35°C水浴中保溫1小時(shí)后，取反應(yīng)液lmL放 入潔凈試管。然后向反應(yīng)試管中加入lmL提取液，再放入30-35°C水浴中保溫1小時(shí)后，取 反應(yīng)液lmL放入潔凈試管。再向反應(yīng)試管中加入lmL提取液，放入30_35°C水浴中保溫1小 時(shí)，取反應(yīng)液lmL放入潔凈試管。向上述獲得的4支裝有l(wèi)mL反應(yīng)液的試管中分別加入去 離子水4mL準(zhǔn)備用于顯色反應(yīng)。
全文摘要
一種硝酸還原酶活性測定新方法，方法改進(jìn)為用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和1％的1-丙醇配制100mM，pH7.5的提取液。樣品0.3克左右剪碎裝入反應(yīng)試管，加入提取液6mL，抽真空后，取1mL反應(yīng)液放入試管中；反應(yīng)試管吹氮?dú)?0秒后用錫紙密封，將該試管放入30-35℃水浴中保溫1小時(shí)，取反應(yīng)液1mL放入試管；再向反應(yīng)試管中加入1mL提取液，重復(fù)水浴保溫反應(yīng)3次后，分別向裝有1mL反應(yīng)液的試管中加入去離子水4mL，再分別加入1mL1％的對-氨基苯磺酸和1mL0.2％的α-萘胺，顯色30分鐘，測定540nm處的光密度值。用亞硝酸鉀做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活性。單位為μMNO2-g-1FWh-1。
文檔編號C12Q1/26GK101831484SQ20101014038
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者丁偉, 戴航宇, 程茁 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)