專利名稱：工業(yè)循環(huán)冷卻水中硝酸細(xì)菌的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種工業(yè)循環(huán)冷卻水中硝酸細(xì)菌的測定方法，屬于生物細(xì)菌的定量檢測方法。
工業(yè)循環(huán)冷卻水系統(tǒng)本身就是一個良好的細(xì)菌生長的生態(tài)環(huán)境，為細(xì)菌的生長提供了空氣、水分、溫度和適宜的酸堿度。在密閉的循環(huán)冷卻水系統(tǒng)中，一般均使用亞硝酸類的緩蝕劑，其亞硝酸根的濃度要保持在300～400mg/L。這為硝酸菌(NItrobacter)的生長提供了充分的無機(jī)鹽養(yǎng)料。硝酸菌大量的繁殖，將形成生物污泥堆積在管道內(nèi)，從而降低設(shè)備傳熱效率，并堵塞管道。同時由于細(xì)菌的生化作用，水中的亞硝酸根迅速地轉(zhuǎn)化為硝酸根，不僅使緩蝕劑的濃度大大降低，而生成的大量硝酸為強(qiáng)酸物質(zhì)，腐蝕設(shè)備?，F(xiàn)有技術(shù)中因沒有測定方法，只能用測定水中異氧菌數(shù)來代表細(xì)菌的總數(shù)，來評定水的質(zhì)量。如中國專利ZL97112019.6公開的《快速測定循環(huán)水中含菌量的方法》，以TTC為染色劑，與由蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、蒸餾水配制成的染色培養(yǎng)基液，經(jīng)組裝試管后滅菌備用；再將定量的被測水移入備好的試管中封閉搖均后，置入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至試管內(nèi)液體變?yōu)闇\粉紅色，按所培養(yǎng)時間得出單位容積被測水中含菌數(shù)。該方法操作簡便、測定快速，但所測出的仍是水中異氧菌的總數(shù)。而硝酸細(xì)菌是一類化能自氧細(xì)菌，是與異氧菌生理代謝類型不同的細(xì)菌。因此只測定水中異氧菌數(shù)量，是無法正確判定有亞硝酸和氨類物質(zhì)存在的水系統(tǒng)中細(xì)菌的總量，從而確定水的好壞程度的。在實際生產(chǎn)中，往往造成水系統(tǒng)中的藥劑濃度反復(fù)波動，有時幾天內(nèi)亞硝酸根從正常的300～400mg/L降到檢不出，而硝酸根從十幾個mg/L上升到上千個mg/L，嚴(yán)重影響生產(chǎn)的正常進(jìn)行。
本發(fā)明的目的是提供一種能夠簡單、方便地對硝酸細(xì)菌進(jìn)行定量檢測的工業(yè)循環(huán)冷卻水中硝酸細(xì)菌的測定方法，以便科學(xué)地進(jìn)行水質(zhì)管理，合理指導(dǎo)水中殺菌劑的投加，有效地控制細(xì)菌的生長，保證生產(chǎn)正常進(jìn)行，同時也使得對殺菌劑的殺菌效率能夠作出正確評價。
本發(fā)明的目的是通過以下措施實現(xiàn)的。
一種工業(yè)循環(huán)冷卻水中硝酸細(xì)菌的測定方法，采用最大可能菌數(shù)計數(shù)法(MPN法)，其檢測步驟如下1)制備培養(yǎng)基用適量的亞硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂與蒸餾水配置成液體培養(yǎng)基，并用酸或堿調(diào)pH值至中性，定量分裝于試管中滅菌后備用；2)制備比色試劑取冰醋酸50ml與900ml水混合，加入對氨基苯磺酸5.0克，蓋塞搖均，加入鹽酸萘乙二胺0.05克溶解后，用水稀釋到1000ml制成比色試劑原液，再取3～5份比色劑原液和1份水混合均勻制成比色試劑；3)水樣采集與稀釋用無菌采樣瓶采集被測水樣，在無菌箱內(nèi)以10倍稀釋法做至少3個稀釋度，應(yīng)使最后一個稀釋度接種培養(yǎng)后沒有硝酸細(xì)菌生長；4)接種在前述裝有培養(yǎng)基的滅過菌的試管中分別加入等量的不同稀釋度的水樣，每個稀釋度做4～6個重復(fù)組，其中一組作為對照組，其余為檢測組；5)恒溫培養(yǎng)將上述檢測組試管置于28～30℃恒溫培養(yǎng)3～14天，同時將對照組試管置于4℃冰箱內(nèi)保存相同的時間；6)結(jié)果檢查計數(shù)從培養(yǎng)后的每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養(yǎng)液于比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘后，將檢測組發(fā)出的紅色與對照組目測比較，紅色較淡的比色管為陽性(+)，表示有硝酸細(xì)菌生長，與對照組紅色一致的為陰性(-)，表示沒有硝酸細(xì)菌生長，根據(jù)檢查結(jié)果，得出陽性組合指數(shù)，用MPN法查表求出每毫升水樣中硝酸細(xì)菌數(shù)。
制備培養(yǎng)基是按亞硝酸鈉0.5克、碳酸鈉1.0克、磷酸二氫鈉0.25克、磷酸氫二鉀0.75、硫酸鎂0.03與蒸餾水1000毫升的比例配置成液體培養(yǎng)基，并用鹽酸[1∶1]調(diào)pH值至7.0±0.2。
恒溫培養(yǎng)中的檢測組水樣在培養(yǎng)至少3天后進(jìn)行預(yù)檢測，從一組每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養(yǎng)液于比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘后，將檢測組發(fā)出的紅色與對照組目測比較，當(dāng)目測結(jié)果具有為陽性(+)的檢測組試管時，即可進(jìn)行結(jié)果檢查記數(shù)。
本發(fā)明利用硝酸細(xì)菌生化反應(yīng)測定水中的硝酸細(xì)菌。硝酸細(xì)菌的生化反應(yīng)為為證實以上反應(yīng)，進(jìn)行了如下實驗。在含有NaNO2濃度為500mg/L培養(yǎng)液中，加入有硝酸菌的水樣，在30℃培養(yǎng)后測定培養(yǎng)液中亞硝酸根和硝酸根的濃度變化，表1為實驗結(jié)果(以下所述對硝酸根和亞硝酸根的測定均采用離子色譜法)。表1
從以上實驗的結(jié)果可以看出，由于硝酸菌的生理活動，使培養(yǎng)液中的亞硝酸根離子的濃度很快降低，而硝酸根離子的濃度迅速升高。因此，從理論上分析，判斷水樣中是否有硝酸細(xì)菌，可以采用兩種方法一是測定培養(yǎng)液中硝酸根離子濃度的增加，二是測定培養(yǎng)液中亞硝酸根離子濃度的降低。測定硝酸根離子的增加，可利用其與二苯胺試劑的顏色反映。但被測定的水樣中，通常本身就含有硝酸根，甚至有大量的硝酸根，使其水樣未進(jìn)行培養(yǎng)就會呈陽性反應(yīng)；另外，該反應(yīng)又受業(yè)硝酸根離子的嚴(yán)重干擾，兩種因素使得用測定硝酸根濃度增加的方法，對水樣中有無硝酸菌無法進(jìn)行正確的判定。用培養(yǎng)液中亞硝酸根離子的減少來判定水樣中是否有硝酸細(xì)菌生長，從理論分析和上述試驗都可以看出是可行的。
本發(fā)明采用的顯色劑中含有對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺，利用亞硝酸根與對氨基苯磺酸的重氮化反應(yīng)，生成的對重氮苯磺酸再與鹽酸萘乙二胺反應(yīng)，生成紅色的偶氮化合物。該反應(yīng)靈敏，不受硝酸根離子和其他離子干擾，為亞硝酸根的特征反應(yīng)，亞硝酸根含量的多少以紅色深淺來指示非常明顯，適用于細(xì)菌檢驗。該反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)式如下
本發(fā)明將對照組培養(yǎng)液置于冰箱內(nèi)4℃保存，在保存期內(nèi)亞硝酸根的濃度基本保持不變。為證明這一結(jié)論，比較在4℃和30℃下培養(yǎng)含硝酸菌水樣，對亞硝酸根的轉(zhuǎn)化實驗。表2所示為實驗結(jié)果。表2
從以上實驗結(jié)果可以看出，以放置在4℃的一組水樣培養(yǎng)液為對照組是可行的。
硝酸菌的培養(yǎng)時間，經(jīng)多次實驗證明，如果水系統(tǒng)中硝酸菌含量高(可從測定未培養(yǎng)前接種培養(yǎng)液中硝酸根離子濃度高來確定)，則只需培養(yǎng)3天，接種培養(yǎng)液中亞硝酸根濃度就從100mg/L以上降到未檢出。一般情況在培養(yǎng)8、9天后亞硝酸根濃度就有明顯的減少，甚至下降到檢不出。因此以一般對細(xì)菌檢測周期14天進(jìn)行培養(yǎng)，硝酸菌對亞硝酸根的轉(zhuǎn)換已經(jīng)完成。對未含有硝酸菌的水樣在30℃進(jìn)行培養(yǎng)，測試培養(yǎng)液中硝酸根及亞硝酸根的濃度，在14天后仍無明顯的變化。在培養(yǎng)43天后亞硝酸根濃度有一些變化。表3所示為未含有硝酸菌水樣的實驗結(jié)果，培養(yǎng)液中加入500mg/L濃度的亞硝酸鈉。表3
以上試驗結(jié)果表明，水樣在30℃培養(yǎng)14天，如果未含有硝酸菌，則培養(yǎng)液中硝酸根濃度無明顯變化；如果水樣中含有硝酸菌，則硝酸菌的生理活動以完全能夠?qū)⑴囵B(yǎng)液中的亞硝酸根濃度明顯降低，從而可用MPN計數(shù)法定量檢測出硝酸菌的濃度。
根據(jù)水樣中硝酸菌濃度的不同，硝酸菌的生理活動對亞硝酸根的轉(zhuǎn)換完成的時間從3天到14天不等，采用預(yù)檢測步驟能夠有效地減少檢測所需要的時間。
培養(yǎng)液中亞硝酸根的濃度在500～1000mg/L的范圍內(nèi)，對硝酸菌的生理活動影響不大，因此在這個濃度內(nèi)配制都可以。表4為硝酸菌濃度為500mg/L和1000mg/L兩種培養(yǎng)基的對比試驗結(jié)果。表4<
考慮到用相對低的濃度培養(yǎng)更利于細(xì)菌生長，并在比色測定時色差更為明顯，故采用500mg/L的亞硝酸鈉培養(yǎng)液效果更加。
本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的優(yōu)點在于能夠簡單、方便地對工業(yè)循環(huán)冷卻水中的硝酸細(xì)菌進(jìn)行定量檢測，而不是用測定水中的異氧菌來替代，使得能夠科學(xué)地對水質(zhì)進(jìn)行管理，合理指導(dǎo)水中殺菌劑的投加，有效地控制細(xì)菌的生長，保證生產(chǎn)正常進(jìn)行，同時也使得對殺菌劑的殺菌效率能夠作出正確評價。由于該方法簡單、易行、容易學(xué)習(xí)、原料容易取得，因此可以很方便地用于冶金、化工、及各大化肥廠等工業(yè)循環(huán)冷卻水系統(tǒng)中，對硝酸細(xì)菌的測定、防治。
下面對本發(fā)明的實施例進(jìn)行詳述。
一種工業(yè)循環(huán)冷卻水中硝酸細(xì)菌的測定方法，采用最大可能菌數(shù)計數(shù)法(MPN法)，其檢測步驟如下1)制備培養(yǎng)基用亞硝酸鈉0.5克、碳酸鈉1.0克、磷酸二氫鈉0.25克、磷酸氫二鉀0.75、硫酸鎂0.03與蒸餾水1000毫升的比例配置成液體培養(yǎng)基，并用鹽酸[1∶1]調(diào)pH值至7.0±0.2，分裝于15×150毫米的試管中，每管準(zhǔn)確裝入培養(yǎng)基5ml，管口塞上棉塞，于121±1℃高壓滅菌至少15分鐘后備用；2)制備比色試劑取冰醋酸50ml與900ml水混合，加入對氨基苯磺酸5.0克，蓋塞搖均，加入鹽酸萘乙二胺0.05克溶解后，用水稀釋到1000ml制成比色試劑原液，再取4份比色劑原液和1份水混合均勻制成比色試劑；3)水樣采集與稀釋采用在140℃高溫下干熱滅菌至少2小時的無菌采樣瓶采集被測水樣，在無菌箱內(nèi)以10倍稀釋法做5個稀釋度，使最后一個稀釋度接種培養(yǎng)后沒有硝酸細(xì)菌生長；4)接種在前述裝有培養(yǎng)基的滅過菌的試管中分別加入1毫升不同稀釋度的水樣，每個稀釋度做5個重復(fù)組，其中一組作為對照組，其余為檢測組；5)恒溫培養(yǎng)將上述檢測組試管置于28～30℃恒溫培養(yǎng)，同時將對照組試管置于4℃冰箱內(nèi)保存相同的時間；6)預(yù)檢測恒溫培養(yǎng)中的檢測組水樣在培養(yǎng)至少3天后進(jìn)行預(yù)檢測，從一組每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養(yǎng)液于比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘后，將檢測組發(fā)出的紅色與對照組目測比較，當(dāng)目測結(jié)果具有為陽性(+)的檢測組試管時，即可進(jìn)行下一步的結(jié)果檢查記數(shù)。
7)結(jié)果檢查計數(shù)從培養(yǎng)后的每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取0.05毫升的培養(yǎng)液于10毫升比色管中，再于比色管中加入5毫升比色試劑，15分鐘后，將檢測組發(fā)出的紅色與對照組目測比較，紅色較淡的比色管為陽性(+)，表示有硝酸細(xì)菌生長，與對照組紅色一致的為陰性(-)，表示沒有硝酸細(xì)菌生長。根據(jù)檢查結(jié)果，采用GB/T14643.6-93《工業(yè)循環(huán)冷卻水中鐵細(xì)菌的測定-MPN法》，得出陽性組合指數(shù)，查表求出每毫升水樣中硝酸細(xì)菌數(shù)。
本發(fā)明方法中，制備培養(yǎng)基中所給出的液體培養(yǎng)基的各成分的含量和制備比色劑中比色劑原液的各成分含量，實際是比例關(guān)系，而不限于其所給出的具體量。另外比色劑原液可隨時制備，貯于棕色瓶內(nèi)密閉置于冰箱中，可保存一個月。
權(quán)利要求
1.一種工業(yè)循環(huán)冷卻水中硝酸細(xì)菌的測定方法，采用最大可能菌數(shù)計數(shù)法(MPN法)，其特征在于1)制備培養(yǎng)基用適量的亞硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂與蒸餾水配置成液體培養(yǎng)基，并用酸或堿調(diào)pH值至中性，定量分裝于試管中滅菌后備用；2)制備比色試劑取冰醋酸50ml與900ml水混合，加入對氨基苯磺酸5.0克，蓋塞搖均，加入鹽酸萘乙二胺0.05克溶解后，用水稀釋到1000ml制成比色試劑原液，再取3～5份比色劑原液和1份水混合均勻制成比色試劑；3)水樣采集與稀釋用無菌采樣瓶采集被測水樣，在無菌箱內(nèi)以10倍稀釋法做至少3個稀釋度，應(yīng)使最后一個稀釋度接種培養(yǎng)后沒有硝酸細(xì)菌生長；4)接種在前述裝有培養(yǎng)基的滅過菌的試管中分別加入等量的不同稀釋度的水樣，每個稀釋度做4～6個重復(fù)組，其中一組作為對照組，其余為檢測組；5)恒溫培養(yǎng)將上述檢測組試管置于28～30℃恒溫培養(yǎng)3～14天，同時將對照組試管置于4℃冰箱內(nèi)保存相同的時間；6)結(jié)果檢查計數(shù)從培養(yǎng)后的每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養(yǎng)液于比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘后，將檢測組發(fā)出的紅色與對照組目測比較，紅色較淡的比色管為陽性(+)，表示有硝酸細(xì)菌生長，與對照組紅色一致的為陰性(-)，表示沒有硝酸細(xì)菌生長，根據(jù)檢查結(jié)果，得出陽性組合指數(shù)，用MPN法查表求出每毫升水樣中硝酸細(xì)菌數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的制備培養(yǎng)基是按亞硝酸鈉0.5克、碳酸鈉1.0克、磷酸二氫鈉0.25克、磷酸氫二鉀0.75、硫酸鎂0.03與蒸餾水1000毫升的比例配置成液體培養(yǎng)基，并用鹽酸[1∶1]調(diào)pH值至7.0±0.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的恒溫培養(yǎng)中的檢測組水樣在培養(yǎng)至少3天后進(jìn)行預(yù)檢測，從一組每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養(yǎng)液于比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘后，將檢測組發(fā)出的紅色與對照組目測比較，當(dāng)目測結(jié)果具有為陽性(+)的檢測組試管時，即可進(jìn)行結(jié)果檢查記數(shù)。
全文摘要
一種利用硝酸細(xì)菌生化反應(yīng)對工業(yè)循環(huán)冷卻水中硝酸細(xì)菌進(jìn)行測定的方法,用適量的亞硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂與蒸餾水配置成液體培養(yǎng)基;取冰醋酸50ml與900ml水混合,加入對氨基苯磺酸5.0克搖均,加入鹽酸萘乙二胺0.05克溶解,用水稀釋到1000ml制成比色試劑液;采用多管發(fā)酵技術(shù),在28℃～30℃恒溫培養(yǎng)3～14天;再用比色法測定試管培養(yǎng)基中被測試樣是否為陽性反應(yīng);最后采用MPN法,對被測試樣中的硝酸細(xì)菌進(jìn)行定量。
文檔編號C12Q1/06GK1250103SQ9911921
公開日2000年4月12日 申請日期1999年8月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月26日
發(fā)明者劉韻秋 申請人:上海寶鋼集團(tuán)公司