專利名稱：海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及磁力學(xué)等多方面領(lǐng)域，尤其涉及一種核殼結(jié)構(gòu)納米免疫納米磁珠制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
眾所周知，樣品前處理是個(gè)非常重要的手段，它的成功與否對(duì)樣品的檢測(cè)至關(guān)重要。利用免疫磁性顆粒來(lái)篩選和分離在食物、臨床、土壤等環(huán)境中的微生物、細(xì)胞、化學(xué)元素等目標(biāo)奮力的方法得到越來(lái)越多的肯定。由于免疫磁珠的分離篩選方法的快速、高濃縮比、 操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際中應(yīng)用很廣泛。免疫磁珠基于抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別.磁性微珠直接或者間接偶聯(lián)在抗體上，從而與細(xì)胞相連在高強(qiáng)度、梯度磁場(chǎng)中達(dá)到細(xì)胞磁性分離的目的等許多優(yōu)點(diǎn)。
海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠是一種較新型的免疫磁珠類型，具有顯著地優(yōu)點(diǎn)。在作為免疫磁珠分離目標(biāo)抗體時(shí)由于其為中間空的特殊結(jié)構(gòu)類型。大大減小了微球的密度，使得微球可以在溶液中懸浮，增大了免疫磁珠與目標(biāo)抗體的接觸面積，便于分離。在結(jié)構(gòu)上另外一個(gè)顯著地優(yōu)點(diǎn)是多孔結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠最外層為海膽狀，很大程度上增加了微球的外比表面積，從而更大的增加了免疫磁珠與目標(biāo)抗體的接觸面積。海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠體積極小，為微米甚至納米級(jí)別的微球。具有最大的生物相溶性和最小的抗原性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)免疫磁珠功能的進(jìn)一步改進(jìn)，提供一種海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法。
本發(fā)明技術(shù)方案包括如下步驟1)制備二氧化硅納米球以正硅酸乙酯正硅酸乙酯為前驅(qū)物，氨水為催化劑，乙醇為溶劑采用StSber法制備單分散的二氧化娃納米球；2)制備SiO2OFe3O4結(jié)構(gòu)體以二氧化硅納米球作為Fe3O4殼層形成的模板，在25 500C的溫度條件下將FeCl2水溶液與二氧化硅納米球分散液混合，然后經(jīng)離心，固體物質(zhì)以水與乙醇交替洗滌后，干燥，制備SiO2O Fe3O4結(jié)構(gòu)體；3)制備SiO2OFe3O4OTiO2核殼結(jié)構(gòu)體將SiO2O Fe3O4結(jié)構(gòu)體與氧化鈦反應(yīng)，形成SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結(jié)構(gòu)體，離心分離，取固體物質(zhì)用無(wú)水乙醇和蒸餾水清洗；4)制備空心@Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體通過(guò)堿水熱處理SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結(jié)構(gòu)體，得到海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體；5)對(duì)海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體的表面進(jìn)行修飾修飾空心OFe3CMOTiO2結(jié)構(gòu)體的表面。
與對(duì)免疫磁珠功能的進(jìn)一步改進(jìn)，本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明制備方法所需的設(shè)備投資少，原料低廉且利用率高、生產(chǎn)費(fèi)用低、工藝簡(jiǎn)單、易于操作、反應(yīng)條件溫和、所的材料污染小。達(dá)到了現(xiàn)代技術(shù)對(duì)于綠色環(huán)保的要求，是一種非常具有前景的制備免疫磁珠3的可行方法。
在所述步驟3)中，先將SiO2O Fe3O4結(jié)構(gòu)體溶解于乙醇中，然后加入氨水，溫度保持在60°C，攪拌后滴加鈦酸丁酯，經(jīng)水解縮合反應(yīng)形成SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結(jié)構(gòu)體。
在所述步驟4)中，將SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結(jié)構(gòu)體分散水中，加入堿溶液后，再將溶液于110°C環(huán)境溫度下反應(yīng)，得到空心@ Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體。
所述堿溶液為NaOH 水溶液，或 KOHLiOHCa (OH) 2 NH3 · H2O。
所述堿溶液的濃度為I. O 2. O mol/L·
由于堿濃度對(duì)表面氧化鈦的形貌也起著重要的調(diào)節(jié)作用，本發(fā)明通過(guò)控制堿的濃度以增強(qiáng)海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的最外層纖維化程度，從而增大海膽狀構(gòu)納米免疫磁珠的外比表面積。
本發(fā)明還提出了海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠在作為免疫磁珠分離目標(biāo)抗體時(shí)的應(yīng)用。
先將海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠加入被檢測(cè)樣品中，使被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)和免疫磁珠上已固定的抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)；然后通過(guò)磁場(chǎng)下吸附免疫磁珠和已經(jīng)被免疫磁珠捕獲的被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)；最后收集免疫磁珠和已經(jīng)被免疫磁珠捕獲的被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)，用于生物檢測(cè)或鋪盤。
本發(fā)明海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠具有良好的磁性。在分離步驟中免疫磁分離效率聞，15分鐘分尚率可達(dá)到99 100%。
海膽狀空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)磁分離優(yōu)點(diǎn)1、分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；2、操作簡(jiǎn)單、不需要復(fù)雜手段或昂貴的設(shè)備；3、不影響被分離細(xì)胞或其他生物的生物學(xué)性狀和性能。


圖I為本發(fā)明中采用溶膠-凝膠法與模板法等相結(jié)合的方法制備多孔海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備示意圖。
圖2為SiO2球模板的SEM圖片。
圖3 為為 SiO2OFe3O4 的 SEM 圖片。
圖4 為 SiO2O Fe3O4 OTiO2 的 SEM 圖片。
圖5為海膽狀空心Fe3O4OTiO2的SEM圖片。
具體實(shí)施方式
一、如圖I所示，制備海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠I、利用改進(jìn)的StSber法制備單分散氧化娃納米球采用St0ber法，以10 ml TEOS (正硅酸乙酯正硅酸乙酯)為前驅(qū)物，30 ml氨水為催化劑，200 ml乙醇為溶劑，制備單分散的二氧化硅納米球，干燥后待用。
取得的二氧化硅納米球的SEM圖片如圖2所示。
2、制備 SiO2O Fe3O4 結(jié)構(gòu)體配制O. 6g/100ml的FeCl2水溶液，待用。
以二氧化硅納米球作為Fe3O4殼層形成的模板，在25 50°C的溫度條件下，將 FeCl2水溶液加入到二氧化硅納米球分散液中，F(xiàn)eCl2水溶液和二氧化硅納米球的混合質(zhì)量比為I : 1，經(jīng)2小時(shí)后，將混合物離心，取固體物質(zhì)以水與乙醇交替洗滌，再經(jīng)50°C干燥， 即取得SiO2O Fe3O4結(jié)構(gòu)體，待用。
取得的SiO2OFe3O4的SEM圖片如圖3所示。
3、制備 SiO2O Fe3O4OTiO2 核殼結(jié)構(gòu)體取O. 5 g SiO2O Fe3O4結(jié)構(gòu)體，超聲溶解在200ml乙醇中，加1.2ml氨水。溫度保持在 600C，攪拌lOmin，逐滴加入2ml鈦酸丁酯，發(fā)生水解縮合反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)即可，生成的二氧化鈦包覆在SiO2O Fe3O4表面，獲得SiO2O Fe3O4OTiO2核殼結(jié)構(gòu)體，離心分離，取固體物質(zhì)，用無(wú)水乙醇和蒸餾水清洗，待用。
取得的S_ Fe3O4 OTiO2的SEM圖片如圖4所示。
4、制備空心O Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體將O. Ig制備得到的SiO2O Fe3O4OTiO2，超聲分散在15ml水中，再加入濃度為I 2mol/ L的NaOH水溶液，或者KOHLiOHCa(OH)2 NH3 · H2O溶液15ml，然后，將溶液轉(zhuǎn)移至50ml反應(yīng)釜中，110°C反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，得到空心@ Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體。
取得海膽狀的空心Fe3O4OTiO2的SEM圖片如圖5所示。
5、對(duì)海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體的表面進(jìn)行抗體修飾。
取O. Ig海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體，對(duì)具有磁性的海膽狀的空心Fe3O4OTiO2 結(jié)構(gòu)體依次進(jìn)行氨基化修飾、醛基化修飾。
海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體的氨基化修飾將O. 4mL氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)滴加到海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體的乙醇懸浮液中，并在室溫下攪拌7h。然后，利用外加磁場(chǎng)，將APTES修飾的磁性顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出，并用乙醇溶液對(duì)其清洗 5次，取得氨基化復(fù)合顆粒。
在修飾完APTES之后，對(duì)海膽狀的空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)體的醛基化修飾將氨基化復(fù)合顆粒加入到50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的戊二醛的磷酸緩沖溶液(PBS)中，并在37°C下攪拌 3h后，用PBS溶液對(duì)其清洗3次，取得磁珠。
醛基化磁珠與多克隆抗體偶聯(lián)取400μ L磁珠，加5ml多克隆抗體(用 Na2CO3-NaHCO3 I 500稀釋)，37°C振蕩(確保顆粒不沉淀)反應(yīng)2h。用Na2CO3-NaHCO3清洗3 次。
利用生物素共軛修飾的辦法可以把抗體穩(wěn)定地修飾到抗生蛋白鏈菌素上。為了避免交叉反應(yīng)，試驗(yàn)過(guò)程中利用親和純化的多克隆抗體。改變不同的保護(hù)基團(tuán)，如牛血漿蛋白可以降低蛋白質(zhì)或其他生物分子的非特異性吸附。另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)SPR，QCM, SEM, AFM等方法對(duì)抗體固定進(jìn)行跟蹤表征以確保抗體的良好連接。
二、海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠在作為分離目標(biāo)抗體示例將待檢測(cè)樣品和海膽狀核殼結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠加入到樣品管中。樣品管在勻速旋轉(zhuǎn)、 變速旋轉(zhuǎn)、靜止富集或正反向旋轉(zhuǎn)狀態(tài)的不同組合下，樣品管中的被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)和免疫磁珠上已固定的抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)；在固定磁場(chǎng)下，把免疫磁珠和已經(jīng)被免疫磁捕獲的被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)吸附在樣品管內(nèi)壁；收集免疫磁珠和已經(jīng)被免疫磁捕獲的被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)，用于生物檢測(cè)或鋪盤。
海膽狀空心Fe3O4OTiO2結(jié)構(gòu)磁分離優(yōu)點(diǎn)1、分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；2、操作簡(jiǎn)單、不需要復(fù)雜手段或昂貴的設(shè)備；3、不影響被分離細(xì)胞或其他生物的生物學(xué)性狀和性能。
權(quán)利要求
1.一種海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于包括如下步驟 1)制備二氧化硅納米球以正硅酸乙酯正硅酸乙酯為前驅(qū)物，氨水為催化劑，乙醇為溶齊U，采用StSber法制備單分散的二氧化娃納米球； 2)制備Si02@Fe304結(jié)構(gòu)體以二氧化硅納米球作為Fe304殼層形成的模板，在25 50°C的溫度條件下將FeC12水溶液與二氧化硅納米球分散液混合，然后經(jīng)離心，固體物質(zhì)以水與乙醇交替洗滌后，干燥； 3)制備Si02@Fe304iTi02核殼結(jié)構(gòu)體將Si02@ Fe304結(jié)構(gòu)體與氧化鈦反應(yīng)，形成Si02i Fe304iTi02核殼結(jié)構(gòu)體，離心分離，取固體物質(zhì)用無(wú)水乙醇和蒸餾水清洗； 4)制備空心@Fe304@Ti02結(jié)構(gòu)體通過(guò)堿水熱處理Si02@ Fe304@Ti02核殼結(jié)構(gòu)體，得到海膽狀的空心Fe304@Ti02結(jié)構(gòu)體； 5)對(duì)海膽狀的空心Fe304@Ti02的表面進(jìn)行修飾修飾空心OFe304iTi02結(jié)構(gòu)體的表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于在所述步驟3)中，先將Si02@ Fe304結(jié)構(gòu)體溶解于乙醇中，然后加入氨水，溫度保持在60°C，攪拌后滴加鈦酸丁酯，經(jīng)水解縮合反應(yīng)形成Si02@ Fe304iTi02核殼結(jié)構(gòu)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于在所述步驟4)中，將Si02@ Fe304@Ti02核殼結(jié)構(gòu)體分散水中，加入堿溶液后，再將溶液于110°C環(huán)境溫度下反應(yīng)，得到空心@ Fe304iTi02結(jié)構(gòu)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于在所述步驟4)中所述堿溶液為NaOH水溶液，或KOHLiOHCa (OH) 2 ΝΗ3·Η20。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法，其特征在于在所述步驟4)中，堿溶液的濃度為I. O 2. O mol/1。
6.如權(quán)利要求I所述海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠在作為免疫磁珠分離目標(biāo)抗體時(shí)的應(yīng)用，其特征在于先將海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠加入被檢測(cè)樣品中，使被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)和免疫磁珠上已固定的抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)；然后通過(guò)磁場(chǎng)下吸附免疫磁珠和已經(jīng)被免疫磁珠捕獲的被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)；最后收集免疫磁珠和已經(jīng)被免疫磁珠捕獲的被檢測(cè)樣品中的目標(biāo)，用于生物檢測(cè)或鋪盤。
全文摘要
海膽狀結(jié)構(gòu)納米免疫磁珠的制備方法及其應(yīng)用，屬于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及磁力學(xué)等多方面領(lǐng)域，本發(fā)明通過(guò)順序制備二氧化硅納米球、SiO2@Fe3O4結(jié)構(gòu)體、SiO2@Fe3O4@TiO2核殼結(jié)構(gòu)體、空心@Fe3O4@TiO2結(jié)構(gòu)體，最后對(duì)海膽狀的空心Fe3O4@TiO2結(jié)構(gòu)體的表面進(jìn)行修飾。本發(fā)明制備方法所需的設(shè)備投資少，原料低廉且利用率高、生產(chǎn)費(fèi)用低、工藝簡(jiǎn)單、易于操作、反應(yīng)條件溫和、所的材料污染小。達(dá)到了現(xiàn)代技術(shù)對(duì)于綠色環(huán)保的要求，是一種非常具有前景的制備免疫磁珠的可行方法。
文檔編號(hào)B82Y40/00GK102921357SQ201210432468
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者董文鈞, 沈金明, 沈旸 申請(qǐng)人:江蘇康寶電器有限公司