專利名稱：一種抗Ⅲ型前膠原氨基末端肽單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及一種抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體及其用途，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
III型前膠原氨基末端肽(簡寫為PIIINP)是III型前膠原分泌到細胞外后被蛋白酶 切下的N端肽，前膠原轉(zhuǎn)化為膠原時，被分解下來的前膠原肽可在體內(nèi)存在一定時間， 血清中的III型前膠原氨基末端肽可作為判定肝纖維化的指標。III型前膠原氨基末端肽與 肝纖維化形成的活動程度密切相關(guān)。其升高程度與炎癥、壞死和肝纖維化程度有關(guān)。與 體內(nèi)沉積的膠原無關(guān)。而是反映肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的動態(tài)過程。III型前膠原氨基末端 肽持續(xù)升高的慢性活動性肝炎，提示病情可能會惡化并向肝硬變形成發(fā)展，而III型前膠 原氨基末端肽降至正?？深A示病情緩解，因此，測定血清中III型前膠原氨基末端肽含量 在輔助診斷肝纖維化中具有重要價值。肝纖維化是指肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，由于細胞外基質(zhì)的形成和降解的 平衡失調(diào)，導致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程。臨床上對肝纖維化的診斷方 法主要有肝組織病理學診斷、影像學檢查及血清學診斷。血清學診斷是研究最廣泛的肝 纖維化診斷方法，其最常用的肝纖維化指標有透明質(zhì)酸、層粘蛋白、III型前膠原氨基末 端肽、IV型膠原等。這些血清學指標的高低與肝纖維化嚴重程度密切相關(guān)，因而可用于 診斷肝纖維化。血清化驗的優(yōu)點是取材方便、容易復查，如果能定期檢查(如每半年或 一年)則可以根據(jù)這些指標是升高或降低的總趨勢來了解肝臟纖維化的發(fā)展變化情況， 也能大致了解抗纖維化的治療的臨床效果。除了對肝纖維化進行輔助診斷，有文獻報道將血漿III型前膠原氨基末端肽 (PIIINP)作為心肌纖維化的指標，用來評估在急性心肌梗死(AMI)、高血壓時心肌纖維 化的情況。聞心培等報道的肺部疾病PIIINP值均增高，反映肺內(nèi)膠原合成代謝處于活躍 階段，大量膠原(包括I、II、III型膠原)沉積臟器而致臟器纖維化?；陔p抗體夾心法原理的固相酶聯(lián)免疫法(ELISA)是檢測抗原最常用的方法， 在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg, AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶 結(jié)合物而建立此法。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗， 分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可 以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。在一步法測定中，當標本中受檢 抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復合 物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過 剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀， 所得結(jié)果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(hook effect)，因為標準曲線到達 高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。但用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高親和力的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體及其 在雙抗體夾心固相酶聯(lián)免疫法制備的檢測試劑盒中的應用，以克服此類試劑容易產(chǎn)生的 鉤狀效應，提高對III型前膠原氨基末端肽的檢測靈敏度和準確性。本發(fā)明所提供的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于其輕鏈的 氨基酸殘基序列如SEQ ID Nal所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ IDNo.2所示。所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，是由保藏號為CCTCC NO.C201058的雜交瘤細胞株4E5F4A11分泌產(chǎn)生。所述的雜交瘤細胞株是以III型前膠原氨基末端肽為免疫源，小鼠為免疫對象， 通過免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸液，并使之與骨髓瘤細胞進行細胞融合獲得。所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，屬于IgG亞型。所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的腹水效價為1 106。本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體可以與III型前膠原氨基末端肽高 度特異性結(jié)合，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的的方法，制備成III型前膠原氨基末端肽 的各種檢測試劑盒。尤其是，應用本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體和雙抗 體夾心固相酶聯(lián)免疫法制備的III型前膠原氨基末端肽的檢測試劑盒，不僅可以定量檢測 人血清中III型前膠原氨基末端肽的含量，使檢測靈敏度能達到0.974ng/ml，檢測準確性 在0.9至1.1之間，劑量-反應曲線的線性在0.998以上，批內(nèi)不精密度小于10%，批間 不精密度小于15%，而且與對比檢測試劑配對T檢驗P值>0.05，與對比檢測試劑相關(guān) 性 r(Pearson Correlation) > 0.90、P (Sig. (2-tailed)) < 0.01，具有較高的診斷一致性，可 用于臨床上對肝纖維化的輔助診斷。


圖1為5’ RACE產(chǎn)物電泳圖，其中1號為輕鏈結(jié)果，2號為重鏈結(jié)果，M為 DNA Marker。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要 求書所限定的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件、實驗室手冊中 所述的條件或按照制造廠商所建議的條件。實施例1 抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的制備一、動物免疫取雌性6 8周齡的BALB/c小鼠，首次免疫用濃度為5mg/ml的III型前膠原氨基末端肽純品，經(jīng)腹腔和四肢腋下注射，總量lml。每隔2周以同樣的方法加強免疫 1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，從經(jīng)三次免疫后小鼠眼球采血，離心分離血 清，用ELISA法選出效價高的小鼠準備融合。二、雜交瘤細胞系的制備 完成免疫過程的小鼠準備取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，在融合前一 天制備飼養(yǎng)細胞。融合時無菌下取小鼠脾細胞，與SP2/0細胞以10 1混合，以50% PEG介導融合，離心后重懸于HAT選擇性培養(yǎng)基中，接種于含有飼養(yǎng)細胞的96孔微孔板 中，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，融合后第3d、第5d、第7d用HAT培養(yǎng)液半量換液， 兩周后換用HT培養(yǎng)液。觀察雜交瘤細胞的生長情況，等克隆長至孔底面積的1/3 1/2，取培養(yǎng)上清 液，用ELISA法進行抗體檢測，篩選陽性克隆。以有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞 進行克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細胞抗體陽性率為100%，選出高分泌特異性細胞株(即 ELISA效價在1 IO6以上的陽性克隆)，此時可將陽性克隆細胞進一步擴大培養(yǎng)。將雜 交瘤細胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個月以上和反復凍存、復蘇，定期收集上清，用篩選抗體的 方法測定上清中的抗體，直至細胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。三、單克隆抗體的制備和純化選用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟，1 2周后收集生長狀態(tài) 良好的單克隆雜交瘤細胞株4E5F4A1該細胞株已在設置于中國武漢大學內(nèi)的中國典 型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期為2010年7月1日，保藏號為CCTCC NO.C201058，每只腹腔注射lml。接種2周左右的小鼠腹部可見明顯膨大，以頸椎脫 臼法處死后打開腹腔，取出腹水。離心后吸取上清，用硫酸銨沉淀后，再用DEAE離子 交換柱純化，用PH5.6，20mM的醋酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液。再用親和層析純化法 (蛋白A-Sepharose4B柱)繼續(xù)純化，上樣條件樣品和蛋白A_Sepharose4B柱用PH8.2， 1.0M的Tris緩沖液平衡后再上樣。洗脫條件用PH3.0，50mM的甘氨酸緩沖液洗脫， 收集洗脫液，制得特異的單克隆抗體。四、單克隆抗體的腹水效價及鑒定取小鼠腹水抗體，用篩選抗體的方法測定效價為1 106，亞型鑒定為IgG型。實施例2 單克隆抗體的特異性鑒定材料透明質(zhì)酸、層粘蛋白、I型膠原、III型膠原、IV型膠原。方法采用ELISA法檢測，以III型前膠原氨基末端肽為陽性對照。結(jié)果顯示透明質(zhì)酸、層粘蛋白、I型膠原、III型膠原、IV型膠原均為陰性。說明本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體對III型前膠原氨基末端肽 具有高度特異性。雖然鄧修惠等通過常規(guī)單抗雜交瘤細胞技術(shù)也獲得了抗III型前膠原氨 基末端肽單克隆抗體，但所述抗體與I型膠原、III型膠原有交叉反應，特異性不高。實施例3 單克隆抗體的可變區(qū)序列的克隆與測序采用5，RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends，快速擴增 cDNA 末端)技術(shù)，
從分泌抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的雜交瘤細胞株4E5F4A11中克隆功能性抗 體的可變區(qū)序列。其步驟可簡述為由一個反義的基因特異性引物(GSPl)來合成cDNA 第一鏈，cDNA第一鏈純化后，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidytransferase, TdT)在cDNA的3’末端加上一個合成的同聚核苷酸錨定序列。利用第 二個巢式基因特異性引物(GSP2)和一個與同聚核苷酸尾巴可以退火的錨定引物來擴增 cDNA。具體實驗過程如下材料-由雜交瘤細胞株4E5F4A11分泌產(chǎn)生的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體-大腸桿菌ToplO菌株-pGEM-T Easy 克隆載體引物設計 根據(jù)免疫球蛋白基因的特點，設計兩套分別對應Ig和Kappa恒定區(qū)的基因特異 性引物GSP1、GSP2,引物序列如下pRace-H-GSPl GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTGpRace-H-GSP2 GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCCpRace-K-GSPl ACTTGACATTGATGTCTTTGpRace-K-GSP2 CACGACTGAGGCACCTCCAGATG克隆過程A、第一鏈合成以總RNA為模板，以GSPl為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈。 具體步驟如下1)在一個0.5ml的微量離心管中加入以下組分GSPl2.5ml總 RNA1 5 μ g補充經(jīng)DEPC處理的水至總體積為15.5 μ 1，混勻。2)70°C變性lOmin，冰浴Imin，短暫離心后依次加入以下組分IO^PCRbuffer 2.5 μ 125mM MgCl2 2.5 μ 1IOmM dNTP mix 1.0 μ 10.IM DTT 2.5 μ 1。3)混勻，短暫離心后置42°C lmin。4)在反應體系中加入1 μ 1 SuperScriptTMII RT (Invitrogen公司)，輕輕混勻后置 42°C 反應 50min。5)反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后置70°C、15min以終止反應。6)離心10 20秒后置于37°C。7)加入1 μ 1 RNase mix,輕輕混勻后置于37°C反應30min。8)將反應管取出置冰上備用。B、DNA 純化使用QIAGEN公司QIAquick PCR純化試劑盒。1)加5倍體積于反轉(zhuǎn)錄體系的PB緩沖液于反轉(zhuǎn)錄反應管中，混勻。2)將QIAquick離心柱置于2ml收集管中，把樣品加入離心柱，13000rpm離心60秒。3)棄去液體，將離心柱放回原來的收集管中，加入0.75ml PE緩沖液于QIAquick離心柱，13000rpm離心60秒。4)棄去液體，將QIAquick離心柱放回原來的收集管，13000rpm離心60秒。5)將QIAquick離心柱置于一干凈的1.5ml離心管，在QIAquick膜中央加入30 μ 1 EB緩沖液，靜置Imin后，13000rpm離心60秒。C、cDNA 加尾1)在一個0.5ml的微量離心管中一次加入以下組分DEPC 處理的水 6.5 μ 15*tailing buffer 5.0 μ 12mM dCTP2.5 μ 1純化的cDNA 10.0 μ 1，混勻。2)將反應管置94°C維持3min后，冰浴lmin，短暫離心后置冰上。3)加入 1 μ 1 TdT,混勻后置 37°C反應 lOmin。4)將反應管置于65°C中作用30min終止反應，離心后置于冰上備用。D、PCR在一個0.2ml的PCR薄壁管中加入以下組分滅菌水31.5 μ 110*PCR Buffer 5.0 μ 125mM MgCl2 3.0 μ 1
IOmM dNTP mix 1.0 μ 1GSP2 (lOpmol/ μ 1) 2.0 μ 1ΑΑΡ (IOpmol/ μ 1) 2.0 μ 1dC-tailed cDNA 5.0 μ 1Tag 酶0.5 μ 1合計50.0 μ 1混勻后置PCR儀中進行反應。E、PCR產(chǎn)物電泳純化PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示其中1號為輕鏈結(jié) 果，在450bp處有一特異性條帶；2號為重鏈結(jié)果，在470bp處有一特異性條帶。F、使用Promega公司的pGEM-T Easy試劑盒，將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-TEasy 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO (Invitrogen公司)具體過程為1)輕鏈和重鏈PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分別回收450bp和470bp的條 帶，最終定容于20 μ 1體積的滅菌水中；2)在一個0.5ml的微量離心管中，加入以下組分2*連接緩沖液5 μ 1pGEM-T Easy50ng(l μ 1)PCR 產(chǎn)物25ng (3 μ 1)Τ4 連接酶1 μ 1 混勻后室溫連接2小時或者4°C連接16小時以上。3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37 °C培養(yǎng)12小時左右。G、測定所克隆的PCR產(chǎn)物的堿基序列各選取至少5個質(zhì)粒測定其所含的PCR產(chǎn)物的堿基序列。H、根據(jù)堿基序列與氨基酸編碼序列的相應關(guān)系，分析PCR產(chǎn)物的閱讀框架， 確定相應可變區(qū)的氨基酸序列，其輕鏈和重鏈的序列分別如SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 所示。根據(jù)免疫球蛋白基因的特點驗證其為抗體序列。實施例4 本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的應用采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的基于雙抗體夾心法原理的固相酶聯(lián)免疫技術(shù)，制作III型前膠原氨基末端肽檢測試劑盒，在體外定量檢測人血清中的III型前膠原氨基末端 肽的含量，用于臨床上輔助診斷肝纖維化疾病。一、檢測原理采用基于雙抗體夾心法原理的固相酶聯(lián)免疫方法(ELISA)。微孔內(nèi)包被抗III型 前膠原氨基末端肽的單克隆抗體，將標準品或待測標本加入微孔中進行溫育，在溫育過 程中，標本中的III型前膠原氨基末端肽與單克隆抗體結(jié)合形成復合物。洗滌除掉未結(jié)合 的物質(zhì)，再加入辣根過氧化物酶標記的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體進行溫育， 則酶標記單克隆抗體與微孔內(nèi)的復合物形成抗體-抗原-抗體復合物。洗滌除去未結(jié)合 的物質(zhì)，加底物顯色。顏色的強弱反映了結(jié)合的酶標抗體的量。它與標本中的III型前 膠原氨基末端肽的濃度成正比。終止反應后，用酶標儀在450nm讀吸光度，其值與標本 中的III型前膠原氨基末端肽濃度成正比。根據(jù)所測定的標準品的吸光度繪制標準曲線， 待測標本中的III型前膠原氨基末端肽濃度值即可從標準曲線上獲得。二、檢測方法A、試劑配制1)配制洗滌液將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水按1 20比例稀釋，得到洗 滌液備用。2)準備標準品用標準品稀釋液將標準品原液(200ng/ml)倍比稀釋，得到濃度 為 100ng/ml，50ng/ml, 25ng/ml, 12.5ng/ml, 6.2ng/ml 的標準品。B、操作步驟1)根據(jù)實驗用量，取出相應數(shù)量的板條，其余板條放回密封袋中，于2 8°C下 密封保存。2)在相應的微孔中分別加入已倍比稀釋的III型前膠原氨基末端肽標準品或被測 血清標本100 μ 1 ；另取1孔加入100 μ 1標準品稀釋液(則該孔III型前膠原氨基末端肽濃 度為Ong/ml)。37°C溫箱中溫育反應90分鐘。3)棄去微孔中液體，用洗滌液洗滌4 5次，洗滌完畢后，將微孔板在吸水紙上 拍干。4)每孔加入酶標抗體100 μ 1，37°C溫箱中反應45分鐘。5)棄去微孔中液體，用洗滌液洗滌4 5次，洗滌完畢后，將微孔板在吸水紙上 拍干。6)每孔加底物液A，底物液B各1滴，避光37。C反應10分鐘。7)每孔加終止液一滴終止反應，在終止反應后15分鐘內(nèi)于酶標儀450nm處測定各孔0.D值。C、標準曲線的繪制以450nm處的O.D. 值為縱座標，III型前膠原氨基末端肽的濃度為橫座標，根據(jù) 標準品的濃度及相應的實際O.D.值制得標準曲線。D、結(jié)果計算根據(jù)被測血清標本在450nm處的實際O.D.值，在標準曲線上求得其相對應的III 型前膠原氨基末端肽濃度(ng/ml)。三、結(jié)果判定正常參考值范圍3 12ng/ml。選取123例正常個體作為參考人群進行檢測，采用百分位數(shù)法確定參考值范 圍。以可信度95%為正常值范圍，計算單測上限P95。四、臨床應用結(jié)果為評價III型前膠原氨基末端肽檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)在臨床上應用于定量 測定人血清中III型前膠原氨基末端肽的含量的適用性與準確性，在上海瑞金醫(yī)院，青海 省第四醫(yī)院檢驗科兩個地點對此試劑盒進行了臨床研究。從臨床中選出281例樣本作為 研究對象，入選對象以慢性肝炎，肝硬化，脂肪肝病人為主，也包括部分無癥狀的就診 患者。采用與德國Behringwercke AG公司的III型前膠原氨基末端肽定量檢測試劑盒(放 射免疫法)作為參比的方法。比較檢測結(jié)果，并進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果見表1所示。表1本發(fā)明的檢測試劑盒的臨床應用結(jié)果
項目上海瑞金醫(yī)院試驗結(jié)果青海省第四醫(yī)院試驗結(jié)果
分析靈敏度1.254ng/ml0.974ng/ml
準確性0.9至1.1之間0.9至1.1之間
劑量一反應曲線的線性__0998__0999_
批內(nèi)不精密度__小于10%__小于10%
批間不精密度小于15%小于15%
與對比檢測試劑
0.059>0.05
配對T檢驗P值
與對比檢測試劑r (PearsonCorrelation) =0.954>0.90
相關(guān)性P(Sig. (2-tailed))=0.000<0.01
1-1-1 V由表1結(jié)果可說明應用本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體和基于雙抗體夾心法原理的 固相酶聯(lián)免疫技術(shù)制備的III型前膠原氨基末端肽檢測試劑盒，對III型前膠原氨基末端肽 檢測具有較好的靈敏度，較高的準確性、批內(nèi)不精密度和批間不精密度，且劑量-反應 曲線的線性也能較好的擬合。另外，統(tǒng)計分析結(jié)果也表明該方法與現(xiàn)有產(chǎn)品具有較好的診斷一致性， 可適用于在臨床上對肝纖維化進行輔助診斷。
權(quán)利要求
1.一種抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于其輕鏈的氨基酸殘基序 列如SEQ ID No.l所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于所述 的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體是由保藏號為CCTCC NO.C201058的雜交瘤細 胞株4E5F4A11分泌產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于所述 的雜交瘤細胞株是以III型前膠原氨基末端肽為免疫源，小鼠為免疫對象，通過免疫注射 小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸液，并使之與骨髓瘤細胞進行細胞融合獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于所述 的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體屬于IgG亞型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，其特征在于所述 的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的腹水效價為1 106。
6.一種權(quán)利要求1所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的應用，其特征在 于用于III型前膠原氨基末端肽檢測試劑盒的制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的應用，其特征在 于用于雙抗體夾心固相酶聯(lián)免疫法制備的III型前膠原氨基末端肽檢測試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體的應用，其特征在 于用于臨床上對肝纖維化疾病的輔助診斷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體，所述抗體的輕鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No.1所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ IDNo.2所示。所述的抗體是由保藏號為CCTCC NO.C201058的雜交瘤細胞株4E5F4A11分泌產(chǎn)生。本發(fā)明的抗III型前膠原氨基末端肽單克隆抗體可應用于III型前膠原氨基末端肽的各種檢測試劑盒的制備中。使用本發(fā)明的單克隆抗體和雙抗體夾心固相酶聯(lián)免疫法制備的III型前膠原氨基末端肽檢測試劑盒，不僅可以定量檢測人血清中III型前膠原氨基末端肽的含量，而且具有高靈敏度、準確性和較高的診斷一致性，可用于臨床上對肝纖維化的輔助診斷。
文檔編號G01N33/577GK102020715SQ20101051799
公開日2011年4月20日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者周季余, 黃桂民, 黃波 申請人:上海貝西生物科技有限公司