專利名稱：從一種印度蚯蚓體腔液中得到的引起精子不能游動的蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新穎的、從屬于節(jié)肢動物門的蚯蚓Pheretima posthuma中分離到的、引起精子不能游動的蛋白，該蛋白可以作為抗致育因子。本發(fā)明還提供了從蚯蚓成熟樣本的體腔分離活性因子的方法，可以由普通方式從屬于節(jié)肢動物門的蚯蚓Pheretima posthuma獲得成熟樣本，該因子可以作為抗致育因子。
控制人口爆炸是與發(fā)展中國家(如印度、中國)的進步密切相關的重要項目。市場上有一些避孕工具和試劑，這無疑有助于控制生育和控制人口，但大多數避孕工具和試劑或存在成功避孕問題，或存在毒副作用問題，因為避孕藥丸含有類固醇。因此，我們確實需要非常成功的裝置或產品，既可保證成功避孕，又不會引起毒副作用。
因此，各個國家都在嘗試得到這樣的產品，但迄今為止，還沒有一個國家獲得成功。在日本有這樣一個有趣的故事，東京大學的一位前名譽教授和一個調查小組開展了一項研究項目，研究從Eisenia foetida的體腔液中得到避孕物質。取自日本蚯蚓Eisenia foetida體腔液中的一種添加因子立即引起了包括人類在內的許多脊椎動物的精子游動停止。研究小組非常激動，繼續(xù)純化這種因子。他們發(fā)現該因子為一種蛋白質，并且是41kDa的單體蛋白質。此后，當他們又克隆出這種蛋白質的基因時，他們突然發(fā)現這種蛋白質具有很高的毒性(Sekizawa et al.，1996，Biomed.Res.，17(3)，197-203；Sekizawa et al.，1997，Gene，191，97-102；Yamaji et al.，1998，J.Biol.Chem.，273(9)，5300-5306；Kobayashi et al.，2000，J.Expl.Zool.，286，538-549)。將這些蛋白質注入老鼠的血液中，它們立即就死亡。在紅細胞的制備過程中添加這種蛋白質后，瞬間即導致細胞溶解。這次事故雖然未能使達到他們的目的，但是他們卻發(fā)現了這種蛋白質的另一面即它具有抑制神經鞘磷脂的功效，神經鞘磷脂是存在于大多數脊椎動物細胞膜中的油脂。正是這種抑制力導致了細胞的溶解。不過，他們發(fā)現有一種像這些蛋白質一樣重要的高效神經鞘磷脂抑制蛋白質，但目前還無法獲取。這種蛋白質取名為“Lysenin”，因其所具有的神經鞘磷脂抑制功能而擁有極高的市場價值。該研究小組還發(fā)表了許多有關“Lysenin”的論文。
顯然，他們未能實現自己的主要目標，即將其用作抗致育因子從而獲得較高的商業(yè)利潤。
本發(fā)明的主要目的是從一種蚯蚓的體腔液中鑒別出一種因子，該因子能引起精子立即停止運動，并能用作抗致育因子。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種與當前市售的其它表現出嚴重副作用的避孕劑相比較，完全無毒的混合物。
發(fā)明人的工作始于印度蚯蚓Pheretima posthuma，抽提體腔液，并檢測它們對精子活動性的作用，發(fā)現它能夠與lysenin一樣有效，同樣立刻使精子停止運動。但二者存在著明顯的差異。印度蚯蚓體內的抽提物并不會造成小鼠、老鼠及兔子死亡。針對該種毒性進行的詳細、認真的試驗表明其對肝臟及其他組織并無有害影響。此外，在RBC準備中添加它們后并沒有像觀察“l(fā)ysenin”時出現細胞菌溶解現象。因此，該抽提物能夠造成精子永久性地停止活動，而不至于產生任何副作用。在控制生育時使用這種優(yōu)勢可以帶來巨大的商業(yè)利潤。
這種因子同樣也是蛋白質。申請人通過分子排斥色譜法(SG-100)將其加以凈化。由此可以得出它是從一種印度蚯蚓體內提取的產品，并且應該得到保護。
附圖的簡要說明

圖1體腔液經過SG100凝膠過濾柱的洗脫圖，得到PI、PII、PIII三個峰。檢測收集自每個峰的蛋白對精子活動性的作用。
圖2PIII(凝膠色譜的活性峰)經過HPLC DEAE柱的洗脫圖。得到一個不連續(xù)的小峰(DI)、和三個連續(xù)的峰(DII、DIII、DIV)，檢測收集自每個峰的蛋白對精子活動性的作用。
圖3離子交換層析步驟這的活性部分的SDS-PAGE電泳，12％的分離膠和3.5％的濃縮膠。約3μg的蛋白溶于20μl樣品緩沖液中，樣品緩沖液含有0.01MTris，10％SDS，5％β巰基乙醇和0.1％溴酚藍(pH6.8)。100℃加熱5分鐘，加入凝膠，在50伏電壓下電泳。7μl預先染色的標準參照物(GIBCO-BRL)用于確定分子量。得到20千道爾頓(kDa)的單體蛋白(圖3)。
表格的簡要描述表1每個蛋白峰加入精子懸液檢測其引起停止運動的數據。每個蛋白峰取15μg，加入精子懸液，分別在30秒、2分鐘、5分鐘和10分鐘檢測它們引起精子停止運動的效果。只有PIII引起100％的停止運動，PI和PII沒有效果。
表2每個蛋白峰加入精子懸液檢測其引起停止運動的數據。每個蛋白峰取5μg，加入精子懸液，分別在30秒、2分鐘、5分鐘和10分鐘檢測它們引起精子停止運動的效果。第一個bound峰的蛋白引起精子百分之百地停止運動，表明這一部分存在活性因子。
相應地，本發(fā)明提供了一種新穎的、從蚯蚓Pheretima posthuma中分離的精子不能游動蛋白，該蛋白具有如下性質a.陰離子蛋白，b.分子量20kDa，c.無毒且無溶血活性，而且d.在2分鐘之內引起精子不能游動。
在本發(fā)明的一個實施例中，當該蛋白以10-15毫克/千克體重的劑量注射入于大鼠和小鼠一個月時，沒有任何不良作用。
在本發(fā)明的另一個實施例中，該蛋白能夠在哺乳動物(包括人)的內部和外部施用。
在本發(fā)明的另一個實施例中，該精子不能游動物也可以用作抗致育因子，它含有從屬于環(huán)節(jié)動物門的蚯蚓Pheretima posthuma得到的體腔液抽提物。
在本發(fā)明的另一個實施例中，這種新穎的精子不能游動試劑還包含傳統(tǒng)的藥學上可接受的添加劑。
在本發(fā)明的另一個實施例中，這種新穎的精子不能游動試劑有溶液、凝膠、粉末、膠囊、藥片和乳膏狀形式。
在本發(fā)明的另一個實施例中，這種新穎的精子不能游動試劑是無毒的，而且當注射入哺乳動物時，不表現出任何溶血活性。
在本發(fā)明的另一個實施例中，這種新穎的精子不能游動試劑在兩分鐘之內引起精子百分之百地停止運動。
在本發(fā)明的另一個實施例中，這種新穎的精子不能游動試劑是非固醇類的，并且能夠外用。
本發(fā)明更多的實施例與分離CF(體腔液)中的活性因子有關，用一般的方式從蚯蚓Pheretima posthuma的成熟標本得到體腔液，其中所述方法包括如下步驟a.提供從蚯蚓Pheretima posthuma的成熟標本得到的體腔液(CF)，將CF超聲處理后離心，b.得到上清作為CF的粗抽提物，c.將CF的粗抽提物進行凝集過濾層析，d.在280nm處測定蛋白部分，e.得到三個蛋白峰并分析每個峰的活性f.收集活性峰III，凍干，透析，用DEAE柱進行HPLC以進一步純化，g.洗脫bound和unbound的蛋白，h.研究每個蛋白峰在280nm的吸收，i.匯集，凍干，透析每個峰，檢測它們對精子游動性的活性，并且j.鑒定出具有引起精子不能游動的第一個受束縛的峰，進行SDS-PAGE電泳以檢測其純度及分子量。
在本發(fā)明的另一個實施例中，以10-15毫克/千克體重的劑量，將所述CF注入大鼠和小鼠體內，進行不能游動測驗。即使在注射后一個月后，動物仍然沒有死亡。
本發(fā)明的另一個實施例與一種方法有關。其中，將10μl粗抽提物加入制備的250μl RBC中，在溫育30分鐘后，紅細胞仍然保持完整的。該結果表明該蛋白沒有溶血活性。
本發(fā)明的另一個實施例提供了一種從雄性大鼠和小鼠制備精子懸浮液、用于生物分析的方法，所述方法包括下列步驟a.收集有生育能力的雄性大鼠和小鼠的精子，用BWW培養(yǎng)基稀釋，培養(yǎng)基用油覆蓋，在CO2恒溫箱37℃平衡，空氣中CO25％，b.再次培育精子懸浮液，使精子能夠游動，c.收集有高運動活力的精子懸浮液，其具有至少70％的向前游動活力。
d.精子懸浮液離心5-10分鐘，稀釋球狀精子，得到40-50μl具有所需濃度(2.0×105-2.5×105個精子)的溶液。
在本發(fā)明的另一個實施例中，抗生育復合物是從屬于節(jié)肢動物門的蚯蚓Pheretima posthuma中分離到的，該復合物能夠在哺乳動物外部和內部使用。
I.活性原理的生物分析(a)精子的收集及精子懸浮液的準備用于試驗的精液取自于繁殖力較強的雄性鼠的尾部，并用BWW培養(yǎng)基稀釋((94mM NaCl，4.7mM KCl，1.7mM CaCl2，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，7H2O，25mM NaHCO3，0.5mM Na-pyruvate，19mM Na-lactate，5mM glucose，0.4％BSA，0.1％antibiotic solution，pH 7.2))，用油覆蓋，在二氧化碳恒溫箱內37℃培養(yǎng)，空氣中的二氧化碳濃度5％，以使培養(yǎng)基達到平衡。再次培育精子懸浮液，以使精子漂浮起來。半個小時以后，收集漂浮在懸浮液上部的精子。精子的濃度在Maclar’s chamber中可以測定出來。精子的性質及運動能力也同樣能夠得到檢驗。認為具有至少70％向前游動力、高游動性的精子懸浮液適于做試驗。從精子懸浮液上部采集的漂浮的精子；1000rpm離心五分鐘，稀釋球狀精子達到要求的濃度。將50ul精子懸浮液(2.5×105精子)置于35mm有蓋培養(yǎng)皿并用礦物油(Sigma)覆蓋，該礦物油已經在二氧化碳孵化器中，空氣中含5％的二氧化碳，預先平衡過夜。
(b)各種蛋白質分餾物對精子游動性的影響所有用于測試精子不游動性的部分都用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。將50ul測試材料加入精子懸浮液滴中，對照加入相同體積的PBS，用以代替被測試的溶液。加入測試材料后，以30秒、2分鐘、5分鐘、10分鐘的間隔在顯微鏡下觀察精子的活躍性。在這一階段，培養(yǎng)皿被保存在二氧化碳恒溫箱中。最后的觀察結束后，記錄所有測試滴劑的pH值，以確認被測懸浮液的PH值是否有任何變化。
II.游動性原理的提取及凈化用消過毒的針挑取成熟的蚯蚓標本。大約100只這樣的蚯蚓被放入容器，并用超聲處理45分鐘。用這種方法得到提取15ml體腔液(CF)。10,000rpm離心分離20分鐘，懸浮液于-20℃貯存，并作為體腔液的粗提取物以備進一步凈化。
(a)分子排斥層析體腔液用Sephadex G100柱進行凝膠過濾色譜層析，柱子預先用0.05M PBS(pH 7.2)平衡過。0.5ml的體腔液從柱子上加入。用同樣的緩沖液，以20ml/h的低速率洗脫，收集到2.0ml的洗脫組分。在280nm處檢測洗脫組分的光吸收。得到3個蛋白峰(見圖一)，分析每個峰的活性(見表一)。匯集有活性峰(PIII)的洗脫組分、凍干、透析(4℃，0.005M磷酸鹽緩沖液中24小時，其間更換緩沖液兩次)，用HPLC DEAE柱子進行離子交換層析。
(B)離子交換層析分子交換層析步驟中的活性成分進一步用HPLC DEAE(7.5×750nm)柱純化，該柱用緩沖液A(0.005磷酸鹽緩沖液)平衡。用同樣的緩沖液以0.8ml/mim的速率洗脫柱子洗脫unbound蛋白，bound蛋白用緩沖液B(緩沖液A加2.0 NaCl)280nm測定蛋白的吸收。觀察到一個unbound小峰和三個bound(圖2)，分別收集每個峰，凍干，透析每個峰(0.005M磷酸鹽緩沖液透析24小時，其間換液2次)檢測他們對精子活動性的影響(表2)。第一個峰表現出精子不游動活性，用其進行SDS-PAGE(c)SDS-PAGE離子交換層析步驟中的活性部分進行SDS-PAGE電泳，12％的分離膠和3.5％的濃縮膠。約3μg的蛋白溶于20μl樣品緩沖液中，樣品緩沖液含有0.01M Tris，10％SDS，5％β巰基乙醇和0.1％溴酚藍(pH6.8)。100℃加熱5分鐘，加入凝膠，在50伏電壓下電泳。7μl預先染色的標準參照物(GIBCO-BRL)用于確定分子量。得到20千道爾頓(kDa)的單體蛋白(圖3)。
III.毒性測驗(a)死亡率測驗為了檢測體腔液是否具有毒性效果，按照15毫克/千克體重的劑量，將粗提取物注射入(i.v和i.p)大鼠和小鼠(每種5只)。對照動物注射等體積0.9％的鹽水。即使是注射后一個月，沒有任何動物死亡。
(b)溶血測驗將血液收集到肝素化的試管后，立即制備大鼠的紅細胞(RBCs)。用等滲透鹽液將血液稀釋三倍，1000rpm離心5分鐘。用鹽液清洗球化的紅細胞五次，稀釋至約2×105細胞/毫升。將10μl粗提取物(0.19mg)加入制備的50μl紅細胞中，在顯微鏡下觀察。即使是在培育30分鐘后紅細胞仍然保持完整，表明該蛋白沒有任何溶血活性。
完成所有的體外和體內實驗后，申請人無疑有資格要求保護對Pheretimaposthuma體腔液中因子的分離，該因子具有強烈的引起精子不能游動的作用，同時完全無毒。這個20kDa的蛋白是一個強的、引起精子不能游動的因子。當培養(yǎng)皿上的精子數恒定時，該蛋白對大鼠、小鼠和人具有相似的濃度作用。因此，該蛋白具有作為抗致育因子的巨大潛能，它無副作用，而大多數目前市場上可得到的、含有類固醇的避孕劑均有副作用。它將成為市場上第一個非甾族的、外用的試劑(置于陰道)。
初步的實驗清楚地表明它有希望作為外用試劑。
表1.SG 100不同洗脫峰的精子不能游動作用
每次測試取50μl(2.5×105個精子)，加入15μg每個峰的蛋白。結果得自五次觀察的數據。表2.HPLC DEAE離子交換層析不同峰的精子不能游動作用
每次測試取50μl(2.5×105個精子)，加入5μg每個峰的蛋白。結果得自五次觀察的數據。
權利要求
1.一種新的從蚯蚓Pheretima posthuma中分離到的精子不能游動蛋白，該蛋白具有如下性質a.陰離子蛋白，b.分子量20kDa，c.無毒且無溶血活性，而且d.在2分鐘之內引起精子不能游動。
2.權利要求1的蛋白，其中當以10-15mg/Kg的劑量施用于大鼠和小鼠一個月時，沒有任何不良效果。
3.權利要求1的蛋白，該蛋白能夠內用或外用于包括人的哺乳動物。
4.一個新的精子不能游動因子，該因子也可以用作抗致育因子，它包含從屬于節(jié)肢動物門的蚯蚓Pheretima posthuma中分離到的體腔液抽提物。
5.權利要求4的新的精子不能游動因子，還保護傳統(tǒng)的藥學上可接受的添加劑。
6.權利要求5的新的精子不能游動因子，它具有凝膠，粉末，膠囊，溶液，藥片和乳膏的形式。
7.權利要求4的新的精子不能游動因子，它無毒，當注射入哺乳動物后不表現出溶血活性。
8.權利要求4或5的新的精子不能游動因子，在兩分鐘之內，它顯示出100％精子不能游動的作用。
9.權利要求4的新的精子不能游動因子，它是非固醇類的并且可以外用。
10.一種用一般方法從蚯蚓Pheretima posthuma的成熟標本的從體腔液分離活性因子的方法，其中所述方法包括如下步驟a.提供從蚯蚓Pheretima posthuma的成熟標本得到的體腔液(CF)，將CF超聲處理后離心，b.得到上清作為CF的粗抽提物，c.將CF的粗抽提物進行凝集過濾層析，d.在280nm處測定蛋白，e.得到三個蛋白峰并分析每個峰的活性f.收集活性峰III，凍干，透析，用DEAE柱進行HPLC以進一步純化，g.洗脫不受束縛和受束縛的蛋白，h.研究每個蛋白峰在280nm的吸收，i.匯集，凍干，透析每個峰，檢測它們對精子游動性的活性，并且j.鑒定出具有引起精子不能游動的第一個受束縛的峰，進行DS-PAGE電泳以檢測其純度及分子量。
11.權利要求10的方法，其中以10-15mg/Kg的劑量，通過將所述體腔液注射入大鼠和小鼠進行毒性檢測，注射一個月后沒有表現出致死效應。
12.權利要求10的方法，其中用大鼠的紅細胞進行溶血實驗，將10μl粗提取物加入制備的250μl紅細胞中，培育30分鐘后紅細胞仍然保持完整，表明該蛋白沒有任何溶血活性。
13.一種從雄性大鼠和小鼠制備精子懸浮液，用于生物分析的方法，所述方法包括下列步驟a.收集有生育能力的雄性大鼠和小鼠的精子，用BWW培養(yǎng)基稀釋，用油覆蓋、37℃、在CO2恒溫箱、空氣中有5％的CO2，平衡培養(yǎng)基，b.再次培育精子懸浮液，使精子懸浮起來，c.收集有高運動活力的精子懸浮液，其具有至少70％向前游動力。d.精子懸浮液離心5-10分鐘，稀釋球狀精子，得到40-50μl具有所需濃度(2.0×105-2.5×105個精子)的溶液。
14.一種能夠內用或外用于哺乳動物的抗生育混合物，該混合物從屬于節(jié)肢動物門的蚯蚓Pheretima posthuma中得到。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的、從屬于節(jié)肢動物門的蚯蚓Pheretima posthuma中分離到的、引起精子不能游動的蛋白,該蛋白可以作為抗致育因子。本發(fā)明還提供了從蚯蚓成熟樣本的體腔分離活性因子的方法,可以由普通方式從屬于節(jié)肢動物門的蚯蚓Pheretima posthuma獲得成熟樣本,該因子可以作為抗致育因子。
文檔編號G01N30/88GK1377889SQ0111243
公開日2002年11月6日 申請日期2001年3月30日 優(yōu)先權日2001年3月30日
發(fā)明者穆華·慕克吉, 沙姆帕·比斯瓦斯, 馬拉比卡·達塔, 薩米爾·巴塔查里亞, 蘭簡·巴德拉, 阿洛科·帕爾 申請人:科學和工業(yè)研究委員會