專(zhuān)利名稱(chēng)：診斷試驗(yàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及基于核酸的試驗(yàn)，該試驗(yàn)可用于檢測(cè)病毒病原體，特別是乙肝病毒的存在。更特別地，本發(fā)明提供了檢測(cè)乙肝病毒核酸序列的一步擴(kuò)增試驗(yàn)。本發(fā)明的試驗(yàn)可以容易地適應(yīng)自動(dòng)化操作，并且可以使待測(cè)樣品快速流通。本發(fā)明還提供了試劑和含有所述試劑的試劑盒，所述試劑可用于進(jìn)行基于核酸的乙肝病毒檢測(cè)試驗(yàn)。
說(shuō)明書(shū)的末尾集中列出了說(shuō)明書(shū)中用數(shù)字提及的出版物的詳細(xì)目錄。
乙肝病毒(下文稱(chēng)之為“HBV”)可導(dǎo)致使人衰弱的疾病狀態(tài)，并可導(dǎo)致急性肝衰竭，肝硬化性出血和原發(fā)性肝癌。HBV每年感染數(shù)百萬(wàn)個(gè)體，每年導(dǎo)致至少一百萬(wàn)人死亡。
HBV是DNA病毒，該病毒的復(fù)制需借助于RNA中間體，其復(fù)制策略利用了逆轉(zhuǎn)錄。HBV基因組特性復(fù)雜，它具有部分雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)具有重疊的編碼多種病毒蛋白的開(kāi)放閱讀框。
盡管可以獲得HBV疫苗，但仍有幾億個(gè)體是此病毒的攜帶者。一般通過(guò)檢測(cè)HBV表面抗原(HBsAg)，病毒核心抗原(HBcAg)和抗HBeAg的抗體(抗-HBeAg)來(lái)鑒定HBV。
被HBV感染或用HBsAg免疫接種之后，血清出現(xiàn)抗HBsAg的抗體(抗-HBs)。這是免疫檢測(cè)HBsAg的基礎(chǔ)。這種檢測(cè)系統(tǒng)篩選的是HBsAg或抗-HBs。該試驗(yàn)已被用于在輸血前篩選血液中的HBV，檢測(cè)急性和慢性肝炎，肝硬化和原發(fā)性肝癌患者的HBV-相關(guān)肝病，和篩選例如移植受體和供體中的HBV攜帶者。
HBsAg含有被稱(chēng)為“a”決定簇的抗原區(qū)域(1)?！癮”決定簇構(gòu)象復(fù)雜，并且依賴于高度保守的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵?！癮”決定簇中的遺傳變異導(dǎo)致產(chǎn)生能逃避由常規(guī)疫苗所引起之免疫應(yīng)答的HBV突變體(2-6)。一個(gè)特別常見(jiàn)的突變是HBsAg氨基酸第145位的甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代(G145R)。此突變影響“a”表位區(qū)域。
HBV感染的治療或預(yù)防越來(lái)越依賴化學(xué)和免疫學(xué)干預(yù)，這導(dǎo)致越來(lái)越多地選擇出對(duì)干預(yù)療法具有抗性的HBV變體。由于HBV重疊的基因組結(jié)構(gòu)，可通過(guò)使用化學(xué)試劑或疫苗直接或間接選擇HBV變體。
因此，常規(guī)的基于抗體的HBsAg分析試驗(yàn)可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。這會(huì)對(duì)疾病傳播的控制和患者管理產(chǎn)生很?chē)?yán)重的影響。
在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，發(fā)明人想尋找另一種HBV測(cè)定法。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明人開(kāi)發(fā)出一種一步核酸擴(kuò)增試驗(yàn)，用于對(duì)顯示或未顯示免疫-可測(cè)病毒標(biāo)記的HBV中的HBV核酸序列進(jìn)行篩選。本發(fā)明基于核酸的分析試驗(yàn)提供了對(duì)HBV因子的敏感測(cè)定法，尤其當(dāng)所述HBV因子不能被常規(guī)的基于免疫的診斷試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)，本發(fā)明的試驗(yàn)特別有用。另外，本發(fā)明的試驗(yàn)允許根據(jù)HBV變體的保守區(qū)域開(kāi)發(fā)特異性的免疫球蛋白(如IgG)和疫苗。
縱觀本說(shuō)明書(shū)，除非上下文需要，否則術(shù)語(yǔ)“含有”應(yīng)被理解為暗指包括所提及的一個(gè)組成要素或整體或一組要素或整體，但不排除任何其它要素或整體或其它組要素或整體。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供對(duì)樣品中HBV-核酸靶序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生單鏈形式的所述靶序列；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在。
本發(fā)明的另一方面是提供對(duì)樣品中HBV-核酸靶序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生單鏈形式的所述靶序列；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物，其中選擇與特定區(qū)域雜交的引物，所述區(qū)域?qū)?yīng)于或側(cè)翼于編碼HBsAg的完整或部分核苷酸序列內(nèi)的保守核苷酸序列；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在。
本發(fā)明的另一方面是提供對(duì)樣品中HBV-DNA靶序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括任選使所述樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄條件以從HBV-mRNA產(chǎn)生單鏈或雙鏈cDNA分子；使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述靶序列的單鏈DNA分子；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條DNA鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-DNA靶序列的存在。
本發(fā)明的另一方面是提供對(duì)樣品中HBV-DNA靶序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括任選使所述樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄條件以從HBV-mRNA產(chǎn)生單鏈或雙鏈cDNA分子；使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述靶序列的單鏈DNA分子；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條DNA鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物，其中一種所述引物被能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記，其它所述引物被可捕獲的組分標(biāo)記；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的一條鏈上具有能提供可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子，另一條鏈上具有可被固體支持物捕獲的組分；經(jīng)由其可捕獲的組分使擴(kuò)增產(chǎn)物固定；然后篩選可測(cè)信號(hào)，其中信號(hào)的存在指示擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，即HBV-DNA靶序列的存在。
本發(fā)明的另一方面是提供對(duì)樣品中HBV-DNA靶序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括將所述樣品導(dǎo)入反應(yīng)管中，所述反應(yīng)管具有一種固定于固體支持物上的引物，和第二種位于溶液相中的引物，其中這兩種引物都能與HBV基因組中保守區(qū)域之內(nèi)，其鄰側(cè)或鄰近區(qū)中HBV-DNA單鏈上的互補(bǔ)核苷酸序列雜交，其中溶液相引物被能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記；使反應(yīng)管經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件；然后檢測(cè)可鑒定信號(hào)的存在，其中所述信號(hào)的存在指示HBV-DNA的存在。
本發(fā)明的另一方面涉及從相同或不同HBV毒株或變體中檢測(cè)一種或多種HBV-DNA靶序列的方法，所述方法包括使據(jù)推測(cè)含有單鏈形式的HBV-衍生DNA的樣品與兩種或多種引物接觸，所述引物單獨(dú)地，或以列陣的形式固定于反應(yīng)管中的固體支持物上，其中反應(yīng)管另外還含有溶液相引物，該引物具有固定于固體支持物上的配對(duì)物，其中固定化的引物及其溶液相的配對(duì)引物均能在擴(kuò)增條件下擴(kuò)增HBV-DNA區(qū)域，其中溶液相引物攜有能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子，使得固體支持物上確定位置處信號(hào)的存在能鑒定特定的HBV分離株或變體。
本發(fā)明的另一方面提供了固定于固體支持物的兩種或多種寡核苷酸引物一個(gè)列陣，所述引物能與HBV-DNA的互補(bǔ)核苷酸序列雜交。
本發(fā)明的另一方面提供了含有寡核苷酸列陣的基質(zhì)的用途，所述寡核苷酸由式a1a2...an定義，它在基質(zhì)上的坐標(biāo)為(x1y1)，(x2y2)...(xnyn)，其中a1a2...an表示相同或不同的寡核苷酸，總共為n個(gè)寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸可由方格坐標(biāo)(x1y1)，(x2y2)...(xnyn)確定，其中寡核苷酸具有由b1b2...bn定義的擴(kuò)增配對(duì)物，從而使寡核苷酸a1b1，a2b2...anbn能與HBV-DNA的互補(bǔ)鏈雜交，其中間插的DNA含有在兩種或多種HBV變體(如HBsAg變體)之間保守的核苷酸序列，其中所述基質(zhì)可用于檢測(cè)特定的HBV因子，所述因子的特征在于攜有所述HBV-衍生DNA的保守?cái)U(kuò)增區(qū)域。


圖1圖解顯示了HBV表面抗原的結(jié)構(gòu)組織。(A)覆蓋保守“a”決定簇的主要親水環(huán)的定位(改編自Chen等(7))。顯示了以氨基酸殘基表示的全長(zhǎng)HBsAg的大小(1-400)。盒形圖下方示出了前S1(1-118)，前S2(119-174)和主要HBsAg(175-400)的位置。圖中還顯示了主要親水環(huán)相對(duì)于全長(zhǎng)HBsAg的位置。主要HBsAg(SHBsAg)內(nèi)的主要親水環(huán)的相應(yīng)位置為從氨基酸100至160，SHBsAg內(nèi)保守的“a”決定簇的相應(yīng)位置為從氨基酸124至147。(B)SHBsAg編碼區(qū)的基因組位置。盒形圖下方示出了編碼區(qū)5’-和3’-末端的位置(分別為HBV基因組核苷酸的第156和835位，第1位被定義為GenBank登記號(hào)為Z35717的野生型HBV EcoRI位點(diǎn)-GAATTC(<400>3)的第一個(gè)A核苷酸。盒形圖下方還示出了本發(fā)明提供的引物寡核苷酸(<400>1和<400>2)的位置(分別從HBV基因組的核苷酸第456位和689位開(kāi)始)。如盒形圖下方所示，利用本發(fā)明的引物寡核苷酸(<400>1和<400>2)經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段大小為233個(gè)堿基對(duì)(bp)。
圖2用照片顯示了使用本發(fā)明提供的引物寡核苷酸(<400>1和<400>2)，PCR-擴(kuò)增受試樣品得到的HBV片段的電泳模式，所述樣品經(jīng)免疫診斷試劑盒測(cè)定為HBsAg陰性，抗-HBc和抗-HBs陽(yáng)性。泳道4示出分子量標(biāo)志(100bp序列梯，MBI Fermentas)的遷移位置。泳道1對(duì)應(yīng)于表1中的第一個(gè)受試樣品；泳道2對(duì)應(yīng)于表1中的第二個(gè)受試樣品。泳道6和9分別對(duì)應(yīng)于表1中的第三個(gè)和第四個(gè)受試樣品。泳道3，5，7和8中未見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，這些泳道代表呈現(xiàn)類(lèi)似病毒標(biāo)記的受試樣品(即HBsAg陰性，抗-HBc和抗-HBs陽(yáng)性)。
本發(fā)明部分基于HBV變體中保守核苷酸序列的鑒定，以及所述序列用于開(kāi)發(fā)擴(kuò)增引物以對(duì)HBV進(jìn)行診斷分析的用途。
為了闡明本發(fā)明，下文給出了幾個(gè)術(shù)語(yǔ)的定義。
“擴(kuò)增混合物”指水溶液，其中含有擴(kuò)增靶病毒核酸序列所需的多種試劑。所述試劑包括酶，含水緩沖液，鹽，靶核酸和脫氧核苷三磷酸。
“擴(kuò)增系統(tǒng)”指用于擴(kuò)增核酸靶序列拷貝數(shù)的任何體外工具。
“擴(kuò)增試劑”指擴(kuò)增所需的多種緩沖液，酶，引物和脫氧核苷三磷酸。
“核酸”指單鏈或雙鏈形式的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸聚合物。
“聚合酶”指能催化由核苷三磷酸前體合成DNA的酶。在本發(fā)明的PCR擴(kuò)增中，聚合酶優(yōu)選需要模板，具有熱穩(wěn)定性，且一般在被延長(zhǎng)的DNA聚合物的3’-末端添加核苷酸。
“寡核苷酸”指由兩個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸組成的分子。
“引物”指天然或合成的寡核苷酸，它能在誘導(dǎo)合成引物延伸產(chǎn)物的條件下用作DNA合成的起點(diǎn)，所述延伸產(chǎn)物與靶核酸鏈互補(bǔ)。這些條件包括溶于適當(dāng)緩沖液中，且處于適當(dāng)溫度下的4種不同的核苷三磷酸和聚合酶。優(yōu)選引物是單鏈寡脫氧核苷酸。引物的適當(dāng)長(zhǎng)度取決于使用引物的目的和條件(包括靶核酸的序列保守性，PCR循環(huán)條件和引物的組成)。
本發(fā)明提供了對(duì)樣品中HBV-核酸靶序列進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生單鏈形式的所述靶序列；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，靶序列對(duì)應(yīng)于HBV基因組上的區(qū)域，該區(qū)域在各種HBV變體，特別是具有經(jīng)改變的HBsAg的HBV變體之間是保守的。經(jīng)改變的HBsAg可含有單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，缺失和/或添加，它們是由在編碼HBsAg的核苷酸序列中取代，缺失和/或添加單個(gè)或多個(gè)核苷酸引起的。有人提出盡管HBsAg已經(jīng)有免疫學(xué)變化，但HBV基因組中的保守區(qū)域，特別是編碼HBsAg的核苷酸序列中的保守區(qū)域仍保持相對(duì)穩(wěn)定。因此，本發(fā)明認(rèn)為用基于免疫的HBsAg測(cè)定法無(wú)法檢測(cè)的HBV變體仍能通過(guò)HBsAg基因中的保守區(qū)域來(lái)檢測(cè)。然而，本發(fā)明可延伸至使用本發(fā)明的方法鑒定HBV基因組的可變區(qū)，如導(dǎo)致(例如在HBsAg上)經(jīng)修飾的表位或新表位的那些可變區(qū)。
HBsAg變體也包括其它重疊基因，如DNA聚合酶的變體。
本發(fā)明的這些和其它方面并不受諸如“編碼…的核酸分子”，“編碼…的核苷酸序列”和“編碼…的基因序列”等術(shù)語(yǔ)中所含術(shù)語(yǔ)“基因”的限制。
術(shù)語(yǔ)“基因”以其最廣義的概念被使用，它包括對(duì)應(yīng)于基因外顯子的cDNA。因此，本文所述的“基因”包括(i)經(jīng)典的基因組基因，它由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列和/或編碼區(qū)和/或非-翻譯序列(即內(nèi)含子，5’-和3’-非翻譯序列)組成；或(ii)對(duì)應(yīng)于基因編碼區(qū)(即外顯子)和5’-和3’-非翻譯序列的mRNA或cDNA。
術(shù)語(yǔ)“基因”也用于描述編碼所有或部分表達(dá)產(chǎn)物的合成的或融合的分子。在特定的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”和“基因”可以互換使用。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了檢測(cè)樣品中HBV-核酸靶序列的方法，所述方法包括使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生單鏈形式的所述靶序列；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物，選擇與特定區(qū)域雜交的引物，所述區(qū)域?qū)?yīng)于或側(cè)翼于編碼HBsAg的完整或部分核苷酸序列內(nèi)的保守核苷酸序列；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在。
樣品一般是，但也不只是含有組織或組織提取物，流體如血液等，或排泄物，或任何可能含有HBV顆?；騂BV DNA，mRNA或RNA復(fù)制中間體之材料的其它生物樣品。因此，第一步一般包括從哺乳動(dòng)物受試者(在優(yōu)選實(shí)施方案中，包括人受試者)分離樣品。樣品也可以是環(huán)境樣品或得自潛在HBV污染源的樣品。
盡管本發(fā)明特別地涉及“逃避”型HBV變體，即基本上不再與抗至少一種HBsAg形式的抗體相互作用的變體，但本發(fā)明進(jìn)一步延及HBV基因組的任何區(qū)域，所述區(qū)域在HBV變體，特別是臨床相關(guān)的HBV變體之間是保守的，并可用作有用的靶序列。HBV基因組上特別有用的區(qū)域是編碼新的表位或HBsAg的區(qū)域。這種區(qū)域可用于產(chǎn)生診斷所用的重組肽。
因此，本發(fā)明提供了通過(guò)檢測(cè)HBV-核酸序列來(lái)檢測(cè)HBV的方法?！癏BV-”核酸序列包括HBV基因組自身，其單鏈DNA形式，RNA復(fù)制中間體以及使用逆轉(zhuǎn)錄酶制備的cDNA單鏈或雙鏈分子。關(guān)于后者，可對(duì)得自HBV-核苷酸序列的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生互補(bǔ)DNA鏈。然后對(duì)所述DNA鏈和/或其DNA互補(bǔ)物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。檢測(cè)出RNA復(fù)制中間體和/或?qū)?yīng)于HBV-mRNA的cDNA也是活性病毒復(fù)制的指征。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可以使用任何形式的擴(kuò)增反應(yīng)，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接鏈反應(yīng)，基于核酸序列的擴(kuò)增，基于Q復(fù)制酶的擴(kuò)增，鏈置換法，滾環(huán)擴(kuò)增和再循環(huán)等位基因-特異性引物延伸。然而，優(yōu)選使用PCR。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了檢測(cè)樣品中HBV-DNA靶序列的方法，所述方法包括任選使所述樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄條件以從HBV-mRNA產(chǎn)生單鏈或雙鏈cDNA分子；使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述靶序列的單鏈DNA分子；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條DNA鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-DNA靶序列的存在。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在編碼HBsAg的核苷酸序列內(nèi)選擇引物。最優(yōu)選引物是<400>1[有義引物]和<400>2[反義引物]。本發(fā)明還延及與<400>1或<400>2具有至少約70％相似性的寡核苷酸引物，以及能在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與<400>1或<400>2或它們的互補(bǔ)物雜交的引物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“相似性”包括相比較的序列之間在核苷酸水平上的精確的同一性。當(dāng)在核苷酸水平上無(wú)同一性時(shí)，“相似性”包括序列之間的差異，這些差異導(dǎo)致相互不同但在結(jié)構(gòu)，功能，生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上彼此相關(guān)的氨基酸。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在同一性而不是相似性水平上進(jìn)行核苷酸序列比較。
用于描述兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括“參照序列”，“比較窗”，“序列相似性”，“序列同一性”，“序列相似性的百分比”，“序列同一性的百分比”，“基本上相似”和“基本上相同”?！皡⒄招蛄小卑ê塑账岷桶被釟埢溟L(zhǎng)度至少為12個(gè)，但經(jīng)常至少為15至18個(gè)單體單位，經(jīng)常至少為25個(gè)，或更多個(gè)，如30個(gè)單體單位。由于兩個(gè)多核苷酸各含有(1)兩個(gè)多核苷酸之間相似的序列(即僅為完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)兩個(gè)多核苷酸之間不同的序列，因此兩個(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間的序列比較一般是通過(guò)在“比較窗”范圍內(nèi)比較兩個(gè)多核苷酸的序列，來(lái)鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性?！氨容^窗”指與參照序列相比較的，一般為12個(gè)鄰接殘基的概念區(qū)段。為了使兩個(gè)序列的對(duì)比最佳化，與(不含添加或缺失的)參照序列相比，比較窗可含有約20％或更少的添加或缺失(即缺口)?？赏ㄟ^(guò)用計(jì)算機(jī)運(yùn)行的算法(Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA)，或通過(guò)檢查和由選定的多種方法中的任一種產(chǎn)生的最佳序列對(duì)比(即導(dǎo)致比較窗范圍內(nèi)同源性百分比最高)，來(lái)進(jìn)行比較對(duì)比窗中的最佳序列對(duì)比。也可參考BLAST家族的程序，例如Altschul等所公開(kāi)的程序(8)。有關(guān)序列分析的詳細(xì)討論可參見(jiàn)Altschul等，19.3單元(9)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“序列相似性”和“序列同一性”指在比較窗范圍內(nèi)，序列在一個(gè)接一個(gè)的核苷酸的基礎(chǔ)上相同或功能或結(jié)構(gòu)相似的程度。因此，例如，可通過(guò)在比較窗范圍內(nèi)比較兩個(gè)最佳對(duì)比的序列，測(cè)定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(如A，T，C，G，I)的位置的數(shù)量以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量，用匹配位置數(shù)除以比較窗內(nèi)的位置總數(shù)(即比較窗大小)，將結(jié)果乘以100產(chǎn)生序列同一性的百分比，從而計(jì)算出“序列同一性的百分比”。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)理解“序列同一性”指通過(guò)DNASIS計(jì)算機(jī)程序(對(duì)Windows而言為版本2.5；可得自Hitachi Software工程有限公司，South San Francisco，California，USA)計(jì)算出的“匹配百分比”，所述程序中使用了軟件所附參考手冊(cè)中所用的標(biāo)準(zhǔn)缺省值。關(guān)于序列相似性的內(nèi)容與上述序列同一性的內(nèi)容相似。
本文所述的低嚴(yán)謹(jǐn)度包括和包含雜交所用的從至少約0至至少約15％v/v甲酰胺，和從至少約1M至至少約2M鹽，和洗滌條件所用的至少約1M至至少約2M鹽。通常，低嚴(yán)謹(jǐn)度是從約25-30℃至約42℃。溫度可以改變，可使用較高的溫度替代甲酰胺和/或給出另一種嚴(yán)謹(jǐn)條件。必要時(shí)可使用另一種嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如中度嚴(yán)謹(jǐn)條件，其包括和包含雜交所用的從至少約16％v/v至至少約30％v/v甲酰胺，和從至少約0.5M至至少約0.9M鹽，和洗滌條件所用的至少約0.5M至至少約0.9M鹽，或者高嚴(yán)謹(jǐn)條件，其包括和包含雜交所用的從至少約31％v/v至至少約50％v/v甲酰胺，和從至少約0.01M至至少約0.15M鹽，和洗滌條件所用的至少約0.01M至至少約0.15M鹽。通常，在Tm＝69.3＋0.41(G＋C)％時(shí)進(jìn)行洗滌(10)。然而，雙鏈體DNA的Tm每降低1℃，錯(cuò)配堿基對(duì)的數(shù)目將會(huì)增加1％(11)。在這些雜交條件中，甲酰胺是任選的。因此，特別優(yōu)選的嚴(yán)謹(jǐn)水平的定義如下低嚴(yán)謹(jǐn)度是6×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS，25-42℃；中嚴(yán)謹(jǐn)度是2×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS，溫度范圍為20℃-65℃；高嚴(yán)謹(jǐn)度是0.1×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS，溫度至少為65℃。
本文所述的“引物”在結(jié)構(gòu)，大小或功能上不受任何限制。引物可用作擴(kuò)增分子，或可用作雜交所用的探針。此分子的優(yōu)選形式是作為擴(kuò)增所用的核酸引物。
本文所述的“核酸引物”包括含有至少3個(gè)核苷酸的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。通常，核酸引物含有約3個(gè)至約100個(gè)核苷酸，優(yōu)選為約5個(gè)至約50個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選為約5個(gè)至約25個(gè)核苷酸。本文將含有少于50個(gè)核苷酸的引物稱(chēng)為“寡核苷酸引物”?？赏ㄟ^(guò)例如逐步添加核苷酸來(lái)合成本發(fā)明的引物，或者，所述引物可以是其它核苷酸分子的片段，部分或延伸產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“引物”以最普通的含義被使用，它包括任何長(zhǎng)度的核苷酸，當(dāng)用于擴(kuò)增目的時(shí)，可提供游離的3’羥基以便由DNA聚合酶起始DNA合成。DNA合成導(dǎo)致引物延伸，產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物，其與引物所雜交的核酸鏈互補(bǔ)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”的定義中包括雜交的引物延伸產(chǎn)生延伸產(chǎn)物。擴(kuò)增一般在依次為變性，引物雜交和延伸的循環(huán)中發(fā)生。本發(fā)明包含約1個(gè)循環(huán)至約120個(gè)循環(huán)，優(yōu)選為約2個(gè)至約70個(gè)循環(huán)，甚至更優(yōu)選為約5個(gè)至約40個(gè)循環(huán)，包括約10，15，20，25和30個(gè)循環(huán)。
可通過(guò)任何便利的方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(也被稱(chēng)為擴(kuò)增子)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行溴化乙錠染色之后使用例如紫外線觀察結(jié)果?；蛘?，使用多種形式的層析，如HPLC或光譜學(xué)，如MALDI-TOF和質(zhì)譜分析法分辨擴(kuò)增產(chǎn)物。或者使用經(jīng)報(bào)道分子標(biāo)記的引物。關(guān)于后者，可以用報(bào)道分子標(biāo)記其中一個(gè)引物，而用捕獲組分標(biāo)記其它引物以將擴(kuò)增子錨著在固體支持物上，然后經(jīng)由報(bào)道分子的信號(hào)鑒定擴(kuò)增子?？梢杂脭U(kuò)增所用的一套引物，或者用第二套嵌套引物實(shí)施此實(shí)施方案。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅使用一套引物以使試驗(yàn)為單步驟擴(kuò)增試驗(yàn)。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了檢測(cè)樣品中HBV-DNA靶序列的方法，所述方法包括任選使所述樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄條件以從HBV-mRNA產(chǎn)生單鏈或雙鏈cDNA分子；使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述靶序列的單鏈DNA分子；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條DNA鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物，其中一種所述引物被能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記，其它所述引物被可捕獲的組分標(biāo)記；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的一條鏈上具有能提供可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子，另一條鏈上具有可被固體支持物捕獲的組分；經(jīng)由其可捕獲的組分固定化擴(kuò)增產(chǎn)物；然后篩選可測(cè)信號(hào)，其中該信號(hào)的存在指示擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，即HBV-DNA靶序列的存在。
上述試驗(yàn)的多種變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。例如，可在具有捕獲分子的試管或微滴孔中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述捕獲分子被固定于試管壁或孔壁上。捕獲分子可以是例如能雜交和捕獲擴(kuò)增子內(nèi)核苷酸序列的引物，或與其中一個(gè)引物的可捕獲組分上的捕獲分子互補(bǔ)的核苷酸序列。或者，捕獲分子可以是能特異性識(shí)別其中一個(gè)引物的可捕獲組分的DNA結(jié)合蛋白。捕獲分子也可參與擴(kuò)增反應(yīng)。
可通過(guò)任何便利的方法將捕獲分子固定于固相。固相可以是任何結(jié)構(gòu)，其表面可被衍生化以錨著核酸引物或其它捕獲分子。優(yōu)選固相為平面材料，例如微滴孔的側(cè)壁或探頭(dipstick)的側(cè)壁。
本文所希望的固體支持物一般是玻璃或聚合物，例如但不限于纖維素，陶瓷材料，硝酸纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯及其衍生物，聚偏二氟乙烯(PVDF)，異丁烯酸酯及其衍生物，聚氯乙烯或聚丙烯。硝酸纖維素特別有用。固體支持物也可以是混合體，例如由玻璃或聚合物基質(zhì)支持的硝酸纖維素膜?！盎旌象w”包括上述兩種或多種玻璃或聚合物表面的分層排列。固體支持物也可以采取以下形式膜或管，珠，盤(pán)或微型平板，探頭，微滴盤(pán)的孔或任何其它適用于所述分析試驗(yàn)的表面。
在一個(gè)實(shí)施方案中，錨著的核酸通過(guò)雜交捕獲靶核酸分子，并任選參與擴(kuò)增反應(yīng)?；蛘撸^著的核酸分子捕獲擴(kuò)增的核酸分子。
使核酸分子與固體支持物相連的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。使引物與固體支持物相連的方法包括酰胺連接，酰胺化物連接，硫醚連接和在固相上導(dǎo)入氨基。與固相連接的例子可參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/AU92/00587[WO93/09250]。
錨著引物可以與溶液相引物一起參與擴(kuò)增反應(yīng)。或者，將“通用(generic)”引物錨著于固體支持物以擴(kuò)增含有靶序列的核酸分子。然后通過(guò)溶液相引物進(jìn)行靶序列的特異性擴(kuò)增。
可使用能提供可測(cè)信號(hào)的一系列標(biāo)記。標(biāo)記可以與特定的核酸分子或核苷酸相連接，或者可以與中間體結(jié)合，所述中間體隨后可以與核酸分子或核苷酸結(jié)合。
標(biāo)記可以選自色素原，催化劑，酶，熒光團(tuán)，發(fā)光分子，化學(xué)發(fā)光分子，鑭系元素的離子(如銪(Eu34))，放射性同位素和肉眼直接可見(jiàn)的標(biāo)記。關(guān)于肉眼直接可見(jiàn)的標(biāo)記，可以使用膠體金屬或非-金屬顆粒，染料顆粒，酶或底物，有機(jī)聚合物，乳膠顆粒，脂質(zhì)體，或其它含有能產(chǎn)生信號(hào)之物質(zhì)的載體等等。適于用作標(biāo)記的多種酶公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利4366241，4843000和4849338?？捎糜诒景l(fā)明的適當(dāng)酶標(biāo)記包括堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，螢光素酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，溶菌酶，蘋(píng)果酸脫氫酶等。酶標(biāo)記可以單獨(dú)使用，或者與溶液中的第二種酶聯(lián)合使用。另外，可用作本發(fā)明中的適當(dāng)標(biāo)記的熒光團(tuán)包括但不限于熒光素，羅丹明，德克薩斯紅，螢光黃或R-藻紅蛋白。
在另一實(shí)施方案中，其中一個(gè)引物錨著于固體支持物，如管壁或微滴孔的壁上，其它引物位于溶液相中。一般用報(bào)道分子標(biāo)記溶液相引物。擴(kuò)增反應(yīng)之后，可測(cè)信號(hào)的存在表示擴(kuò)增子的存在。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了檢測(cè)樣品中HBV-DNA靶序列的方法，所述方法包括將所述樣品導(dǎo)入反應(yīng)管中，所述反應(yīng)管具有一種固定于固體支持物上的引物，和第二種位于溶液相中的引物，其中這兩種引物都能與HBV基因組中保守區(qū)域之內(nèi)，其鄰側(cè)或鄰近區(qū)中HBV-DNA單鏈上的互補(bǔ)核苷酸序列雜交，其中溶液相引物被能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記；使反應(yīng)管經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件；然后檢測(cè)可鑒定信號(hào)的存在，其中所述信號(hào)的存在指示HBV-DNA的存在。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明利用了針對(duì)HBV基因組不同區(qū)域的引物列陣，例如針對(duì)HBV基因組中的保守區(qū)域或保守區(qū)域和可變區(qū)域的引物列陣。這對(duì)“定型”HBV或鑒定HBV可變區(qū)特別有用。在一個(gè)有用的實(shí)施方案中，將針對(duì)HBV基因組的不同區(qū)域的多個(gè)引物固定于固體支持物，例如微型芯片，反應(yīng)管壁，探頭，載玻片或其它基質(zhì)上。一般在具有特定坐標(biāo)的列陣中安置引物以鑒定引物。然而，術(shù)語(yǔ)“列陣”并不暗指任何特定的次序，“列陣”也可包括整個(gè)模式中的隨機(jī)點(diǎn)。
在任何事件中，每個(gè)固定化的引物一般都具有第二個(gè)溶液相引物，以使HBV基因組的特定區(qū)域能被靶向擴(kuò)增。溶液相引物一般攜有能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子。通過(guò)擴(kuò)增，利用列陣中確定位置處信號(hào)的存在來(lái)定型特定的HBV。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及從相同或不同HBV毒株或變體中檢測(cè)一種或多種HBV-DNA靶序列的方法，所述方法包括使據(jù)推測(cè)含有單鏈形式的HBV-衍生DNA的樣品與兩種或多種引物接觸，所述引物單獨(dú)地，或以列陣的形式固定于反應(yīng)管中的固體支持物上，其中反應(yīng)管另外還含有溶液相引物，這些引物具有固定于固體支持物上的配對(duì)物，其中固定化的引物及其溶液相的配對(duì)引物能在擴(kuò)增條件下擴(kuò)增HBV-DNA區(qū)域，其中溶液相引物攜有能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子，使得固體支持物上確定位置處信號(hào)的存在能鑒定特定的HBV分離株或變體。
如上所述，優(yōu)選引物如<400>1和<400>2所示，或者為與<400>1或<400>2具有至少約70％相似性的引物，以及能在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與<400>1或<400>2或它們的互補(bǔ)物雜交的引物。優(yōu)選通過(guò)化學(xué)合成制備這些引物，然而，也可以以核酸分子片段(包括但不限于限制性片段)的形式制備引物?？筛鶕?jù)已知HBV毒株的序列對(duì)比結(jié)果方便地選擇引物，所述HBV毒株包括變體，如在HBsAg的主要親水環(huán)中攜有突變的變體。當(dāng)經(jīng)證實(shí)約有20個(gè)鄰接的核苷酸是保守的時(shí)，可選擇這些核苷酸作為HBV基因組保守區(qū)域的候選引物。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了固定于固體支持物上的兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸引物的一個(gè)列陣，所述引物能與HBV-DNA的互補(bǔ)核苷酸序列雜交。
與引物雜交的區(qū)域優(yōu)選位于或鄰近于在兩個(gè)或多個(gè)HBsAg變體中保守的，長(zhǎng)度為約10至約50個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
優(yōu)選的列陣形式是生物芯片或其它微型-基質(zhì)，微滴孔的壁，載玻片，探頭或其它適當(dāng)?shù)幕|(zhì)。
列陣也適于通過(guò)計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行分析，所述程序能檢測(cè)提供可測(cè)信號(hào)的固定化擴(kuò)增子的存在。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了借助于計(jì)算機(jī)程序的，用于檢測(cè)或鑒定HBV-核酸序列的方法，所述方法包括(i)使用一套引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的方法，所述的一套引物含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與靶序列的一條鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交；和(ii)記錄可鑒定信號(hào)之存在的數(shù)據(jù)處理方法。
本發(fā)明的另一方面提供了含有寡核苷酸列陣的基質(zhì)的用途，所述寡核苷酸由式a1a2...an定義，它在基質(zhì)上的坐標(biāo)為(x1y1)，(x2y2)...(xnyn)，其中a1a2...an表示相同或不同的寡核苷酸，總共為n個(gè)寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸可由方格坐標(biāo)(x1y1)，(x2y2)...(xnyn)確定，其中寡核苷酸具有由b1b2...bn定義的擴(kuò)增配對(duì)物，從而使寡核苷酸a1b1，a2b2...anbn能與HBV-DNA的互補(bǔ)鏈雜交，其中間插的DNA含有在兩種或多種HBV變體(如HBsAg變體)之間保守的核苷酸序列，其中所述基質(zhì)可用于檢測(cè)特定的HBV因子，所述因子的特征在于攜有HBV基因組的所述保守?cái)U(kuò)增區(qū)域。
本發(fā)明的引物寡核苷酸在擴(kuò)增反應(yīng)中使用，所述擴(kuò)增反應(yīng)如PCR擴(kuò)增靶HBV核酸。盡管擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域眾所周知的，但為了更清楚表達(dá)，下文將著重說(shuō)明本發(fā)明所用PCR方法的一些一般信息。
為了擴(kuò)增受試樣品中的靶HBV核酸序列，需要使該序列與擴(kuò)增系統(tǒng)的組分接觸。這可通過(guò)在PCR擴(kuò)增之前，從所述樣品中分離出HBV靶核酸而實(shí)現(xiàn)。從生物樣品中提取核酸分子的技術(shù)是較成熟的，且被廣泛使用的技術(shù)(12)。
每個(gè)PCR擴(kuò)增循環(huán)的第一步包括通過(guò)例如在適當(dāng)溫度，如95℃加熱樣品來(lái)分離HBV核酸雙鏈體。一旦分離出鏈，PCR的下一步包括使分離的鏈與側(cè)翼于靶序列的引物雜交。然后延伸引物以形成靶鏈的互補(bǔ)拷貝。為了進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物，以使每個(gè)引物沿著雙鏈體序列雜交的位置能夠使由一個(gè)引物合成的延伸產(chǎn)物當(dāng)與模板分開(kāi)時(shí)能用作另一引物延伸的模板。將變性，雜交和延伸的循環(huán)重復(fù)1至約120個(gè)循環(huán)，但一般重復(fù)約35個(gè)循環(huán)以使在PCR擴(kuò)增過(guò)程中導(dǎo)入擴(kuò)增產(chǎn)物中的突變數(shù)目最小化。
在含有適當(dāng)?shù)柠}，金屬陽(yáng)離子和pH緩沖系統(tǒng)的反應(yīng)介質(zhì)中，在足量的4種脫氧核糖核苷三磷酸(一般為dATP，dGTP，dCTP和dTTP)的存在下，通過(guò)聚合劑催化PCR擴(kuò)增中依賴于模板的引物延伸。適當(dāng)?shù)木酆蟿┦且阎艽呋蕾囉谀０宓腄NA合成的酶。所述酶包括Taq聚合酶，分離自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的熱-穩(wěn)定性DNA聚合酶，和高保真性的Pfu聚合酶。后一種酶被廣泛用于高精確度擴(kuò)增。通常，使用熱穩(wěn)定性酶自動(dòng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在此方法中，反應(yīng)混合物的溫度經(jīng)變性期，引物退火期和延伸反應(yīng)期而循環(huán)。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)量以免其它反應(yīng)和非-特異性擴(kuò)增所得的經(jīng)擴(kuò)增核酸污染PCR擴(kuò)增。為了避免被其它反應(yīng)污染，在260nm下用UV照射每種反應(yīng)混合物5分鐘，所述混合物含有適當(dāng)?shù)柠}，金屬陽(yáng)離子和pH緩沖系統(tǒng)，足量的4種脫氧核糖核苷三磷酸(一般為dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，DNA聚合酶和引物寡核苷酸，但不含分離自生物樣品的病毒靶核酸。這種處理消除了預(yù)-擴(kuò)增的反應(yīng)混合物中所有潛在的雙鏈DNA分子，而保留了單鏈引物寡核苷酸和完整反應(yīng)混合物中的其它上述組分。另一方面，對(duì)經(jīng)擴(kuò)增的病毒核酸所作的測(cè)序分析不僅可消除非-特異性擴(kuò)增的污染，也可測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的特性，特別是主要親水環(huán)上潛在的突變，所述突變導(dǎo)致使用目前基于免疫的診斷分析試驗(yàn)檢測(cè)不到所述病毒。
因此，本發(fā)明包括新的HBV變體，例如根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的變體。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了HBV變體，通常是分離形式的HBV變體，通過(guò)HBV-核酸靶序列的檢測(cè)方法可鑒定所述HBV變體，所述方法包括使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生單鏈形式的所述靶序列；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在；然后分離檢測(cè)到的所述HBV。
本發(fā)明的另一方面提供了鑒定表達(dá)產(chǎn)物的方法，所述表達(dá)產(chǎn)物包括例如可用作免疫標(biāo)記和/或用于產(chǎn)生診斷和/或治療所用的免疫球蛋白的肽，多肽或蛋白質(zhì)。
通過(guò)本發(fā)明鑒定的HBV的核苷酸序列可用于多種重組表達(dá)系統(tǒng)。所述核苷酸序列可以是保守的或是可變的。后者的例子是HBsAg上經(jīng)修飾的或新的表位。所述表達(dá)系統(tǒng)能充分表達(dá)所需基因，特別是編碼HBsAg的基因或其變體。在原核和/或真核宿主中重組表達(dá)核苷酸序列是較成熟的技術(shù)，這些經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)可用于產(chǎn)生特異于特定HBsAg的免疫球蛋白。然后可將所述免疫球蛋白用于試驗(yàn)中以檢測(cè)病毒的存在。蛋白質(zhì)也可用于檢測(cè)感染HBV的患者體內(nèi)是否存在抗體。
一般將所需病毒序列插入適當(dāng)載體，然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物，酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞系以進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)選在中間克隆步驟中使用原核生物，但原核生物可有效地用于所需病毒序列的高水平誘導(dǎo)型表達(dá)。
對(duì)將經(jīng)改變的遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞以表達(dá)病毒序列所用的特定方法沒(méi)有特別嚴(yán)格的要求。可以使用任何眾所周知的將外源核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。這些方法包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染，電穿孔，脂質(zhì)體，質(zhì)粒載體，病毒載體的方法，和任何導(dǎo)入克隆的病毒DNA，特別是導(dǎo)入由本發(fā)明從受試樣品中鑒定出的病毒DNA的其它成熟方法，所述樣品顯示或未顯示出病毒標(biāo)記，所述病毒標(biāo)記可以或不能被基于免疫的診斷試驗(yàn)檢測(cè)到。
對(duì)將遺傳信息運(yùn)送至細(xì)胞所用的特定載體沒(méi)有特別嚴(yán)格的要求?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的用于在真核細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白的載體。
表達(dá)載體含有真核轉(zhuǎn)錄單位或表達(dá)盒，其中含有在真核細(xì)胞中表達(dá)病毒核酸序列所需的所有元件。典型的表達(dá)盒含有與編碼病毒蛋白的DNA序列可操作相連的啟動(dòng)子，和使轉(zhuǎn)錄的mRNA有效聚腺苷酸化所需的信號(hào)。
本發(fā)明的表達(dá)載體一般含有便于將載體克隆至細(xì)菌(如大腸桿菌)的原核序列，以及一個(gè)或多個(gè)僅在真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的真核轉(zhuǎn)錄單位。載體可以含有或不含真核復(fù)制子。如果存在復(fù)制子，使用適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記就可以在真核細(xì)胞中復(fù)制載體。如果載體不含有真核復(fù)制子，就無(wú)法進(jìn)行附加型擴(kuò)增。在這種條件下，轉(zhuǎn)染的DNA整合至宿主細(xì)胞基因組，由表達(dá)載體上共整合的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)病毒基因的表達(dá)。
表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞之后，在有利于表達(dá)病毒蛋白的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中純化蛋白質(zhì)。可以使用多種用于純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如親和層析，大小排阻層析和離子交換層析。
除了使用由所需病毒基因組編碼的蛋白質(zhì)外，也可以使用模擬病毒特異性表位的肽來(lái)產(chǎn)生病毒特異性抗體。
然后，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，用上述純化的多肽或合成肽產(chǎn)生抗體。免疫球蛋白有多種用途。例如，可用于檢測(cè)受試樣品中病毒的存在，或者利用例如親和層析來(lái)純化病毒抗原。也可用于中和相應(yīng)的病毒蛋白，包括抑制完整病毒的感染性。因此，可以容易地使用多種用于產(chǎn)生和操作各種免疫球蛋白的技術(shù)，來(lái)產(chǎn)生可用于診斷和檢測(cè)受試樣品中的特定HBV毒株的分子，所述樣品顯示或未顯示出病毒標(biāo)記，所述病毒標(biāo)記可以或不能被基于免疫的診斷試驗(yàn)檢測(cè)到。
可通過(guò)多種方法產(chǎn)生能與目標(biāo)HBV毒株的特異性表位結(jié)合的抗體。非-人單克隆抗體(如鼠)的產(chǎn)生是眾所周知的，通過(guò)用含有病毒或其片段的制品免疫動(dòng)物即可實(shí)現(xiàn)此目的。使得自經(jīng)免疫動(dòng)物的抗體生產(chǎn)細(xì)胞無(wú)限增殖化，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)篩選所述細(xì)胞。
然后，可在多種診斷試驗(yàn)中使用按上述方法產(chǎn)生的免疫球蛋白，所述試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)受試樣品中HBV毒株的存在，所述樣品顯示或未顯示出病毒標(biāo)記，所述病毒標(biāo)記可以或不能被基于免疫的診斷試驗(yàn)檢測(cè)到。例如，可在包括下列步驟的試驗(yàn)中使用經(jīng)標(biāo)記的免疫球蛋白，所述步驟是使免疫球蛋白與懷疑含有HBV毒株的受試樣品接觸，所述樣品顯示或未顯示出病毒標(biāo)記，所述病毒標(biāo)記可以或不能被基于免疫的診斷試驗(yàn)檢測(cè)到；檢測(cè)是否形成復(fù)合物。可以使用多種標(biāo)記與免疫球蛋白偶聯(lián)。常用的檢測(cè)方法是使用125I或35S進(jìn)行放射自顯影。也可使用非放射性的標(biāo)記。這類(lèi)標(biāo)記包括化學(xué)發(fā)光劑和酶。這些非放射性的標(biāo)記經(jīng)常通過(guò)間接的方式結(jié)合。通常，配體分子(如生物素)與所述分子共價(jià)結(jié)合。然后，配體與抗-配體(如鏈霉抗生物素蛋白)分子結(jié)合，所述抗配體分子要么本來(lái)就是可測(cè)的，要么與信號(hào)系統(tǒng)，如可測(cè)的酶，熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物共價(jià)結(jié)合。
所述分子也可以通過(guò)與酶偶聯(lián)而直接與產(chǎn)生信號(hào)的化合物偶聯(lián)?？捎米鳂?biāo)記的目的酶是磷酸酶或過(guò)氧化物酶。
為了檢測(cè)復(fù)合物的存在，應(yīng)將混合物與能結(jié)合免疫球蛋白Fc區(qū)域的蛋白質(zhì)接觸，所述蛋白質(zhì)如第二抗體，A蛋白或G蛋白。優(yōu)選將蛋白質(zhì)固定于固體表面，洗滌固體表面以除去未結(jié)合的特異于所需病毒的免疫球蛋白。可使用多種固定化生物分子的方法。例如，固體表面可以是膜(如硝酸纖維素)，微滴盤(pán)(如聚苯乙烯)或珠。所需組分可以共價(jià)結(jié)合或通過(guò)非特異性連鍵非-共價(jià)結(jié)合。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入標(biāo)記。
重組表達(dá)并純化的病毒蛋白或病毒裂解物也可在診斷方法中使用。這些方法一般包括接觸懷疑含有抗HBV抗體的生物樣品(如血清)，并檢測(cè)免疫反應(yīng)。優(yōu)選使用上述標(biāo)記蛋白檢測(cè)所述反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的方法可用于鑒定HBV基因組的保守區(qū)域，所述區(qū)域?qū)?yīng)于HBV蛋白質(zhì)(如HBsAg)的保守區(qū)域。所述方法也可鑒定可變區(qū)。因此，對(duì)應(yīng)于所述保守區(qū)域的肽，多肽和蛋白質(zhì)可用作疫苗組分和用于診斷檢驗(yàn)。類(lèi)似地，覆蓋可變區(qū)的肽，多肽和蛋白質(zhì)可用于針對(duì)特定HBV變體的特異性疫苗，或者可用作診斷試劑。
因此，本發(fā)明提供了重組或化學(xué)合成的肽，多肽和蛋白質(zhì)或其衍生物，同系物或類(lèi)似物，它們含有的氨基酸序列中包含兩個(gè)或多個(gè)HBV分離株或與HBV野生型不同的HBV分離株之間保守的氨基酸序列。據(jù)認(rèn)為HBV野生型含有源自HBV基因型E和A至F的復(fù)合物或共有的核苷酸或氨基酸序列(13)。
“衍生物”包括多肽的部分，片段，節(jié)段或區(qū)域，其中包括含有單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，添加和/或缺失的多肽。為了簡(jiǎn)明起見(jiàn)，將肽和蛋白質(zhì)包含在術(shù)語(yǔ)“多肽”中。
本發(fā)明延伸至所述多肽的化學(xué)類(lèi)似物，包括側(cè)鏈具有修飾的和/或摻入了非天然氨基酸的多肽類(lèi)似物。這種經(jīng)化學(xué)修飾或合成的多肽類(lèi)似物能更加穩(wěn)定地用作診斷試劑或用于治療。
本發(fā)明所涉及的側(cè)鏈修飾有對(duì)氨基的修飾，如通過(guò)與醛反應(yīng)再用NaBH4還原而還原烷基化；用甲基乙酰亞胺(methylacetimidate)進(jìn)行的脒化反應(yīng)；用乙酸酐進(jìn)行的?；磻?yīng)；用氰酸鹽使氨基甲氨?；?；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基三硝基苯化；用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐使氨基?；缓陀眠炼呷?5-磷酸使賴氨酸吡哆醛化再用NaBH4還原。
精氨酸殘基的胍基可通過(guò)與諸如2，3-丁二酮，苯基乙二醛和乙二醛等試劑形成雜環(huán)縮合物來(lái)修飾。
羧基可通過(guò)O-?；愲宓男纬煞磻?yīng)激活碳二亞胺，再衍生為例如相應(yīng)的酰胺而修飾。
巰基(sulphydryl)可通過(guò)下列方法修飾，如用碘乙酸或碘乙酰胺進(jìn)行的羧甲基化；用過(guò)甲酸使半胱磺酸氧化；與其它硫醇類(lèi)化合物形成混合的二硫化物；與馬來(lái)酰亞胺，馬來(lái)酐或其它取代的馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)；使用4-氯汞苯甲酸鹽，4-氯汞苯磺酸，苯基氯化汞，2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞化合物形成汞化合物的衍生物；在堿性pH下用氰酸鹽進(jìn)行的甲氨?；?。
色氨酸殘基可通過(guò)例如用N-溴琥珀酰亞胺進(jìn)行的氧化或用2-羥基-5-硝基芐基溴化物或烴硫基鹵化物使吲哚環(huán)烷基化而修飾。另一方面，酪氨酸殘基可通過(guò)用四硝基甲烷進(jìn)行的硝化反應(yīng)形成3-硝基酪氨酸衍生物來(lái)改變。
組氨酸殘基的咪唑環(huán)可通過(guò)碘乙酸衍生物的烷基化或焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化來(lái)修飾。
在合成肽的過(guò)程中摻入的非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，叔丁基甘氨酸，正纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥(niǎo)氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。表1示出了本文涉及的非天然氨基酸。
表1非-常規(guī)氨基酸 代碼非-常規(guī)氨基酸 代碼α-氨基丁酸Abu L-N-甲基丙氨酸Nmalaα-氨基--甲基丁酸酯Mgabu L-N-甲基精氨酸Nmarg氨基環(huán)丙烷羧酸酯 CproL-N-甲基天冬酰胺 Nmasn
L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp氨基異丁酸Aib L-N-甲基半胱氨酸 Nmcys氨基降冰片基羧酸酯NorbL-N-甲基谷氨酰胺 NmglnL-N-甲基谷氨酸 Nmglu環(huán)己基丙氨酸 Chexa L-N-甲基組氨酸 Nmhis環(huán)戊基丙氨酸 CpenL-N-甲基異亮氨酸 NmileD-丙氨酸 Dal L-N-甲基亮氨酸 NmleuD-精氨酸 DargL-N-甲基賴氨酸 NmlysD-天冬氨酸DaspL-N-甲基甲硫氨酸 NmmetD-半胱氨酸DcysL-N-甲基正亮氨酸 NmnleD-谷氨酰胺DglnL-N-甲基正纈氨酸 NmnvaD-谷氨酸 DgluL-N-甲基鳥(niǎo)氨酸 NmomD-組氨酸 DhisL-N-甲基苯丙氨酸 NmpheD-異亮氨酸DileL-N-甲基脯氨酸 NmproD-亮氨酸 DleuL-N-甲基絲氨酸 NmserD-賴氨酸 DlysL-N-甲基蘇氨酸 NmthrD-甲硫氨酸DmetL-N-甲基色氨酸 NmtrpD-鳥(niǎo)氨酸 Dom L-N-甲基酪氨酸 NmtyrD-苯丙氨酸DpheL-N-甲基纈氨酸 NmvalD-脯氨酸 DproL-N-甲基乙基甘氨酸 NmetgD-絲氨酸 DserL-N-甲基-叔丁基甘氨酸 NmtbugD-蘇氨酸 DthrL-正亮氨酸 NleD-色氨酸 DtrpL-正纈氨酸 NvaD-酪氨酸 Dtyrα-甲基-氨基異丁酸酯 MaibD-纈氨酸 Dvalα-甲基-γ-氨基丁酸酯 MgabuD-α-甲基丙氨酸 Dmala α-甲基環(huán)己基丙氨酸MchexaD-α-甲基精氨酸 Dmarg α-甲基環(huán)戊基丙氨酸McpenD-α-甲基天冬酰胺 Dmasn α-甲基-α-萘基丙氨酸 ManapD-α-甲基天冬氨酸 Dmasp α-甲基青霉胺 MpenD-α-甲基半胱氨酸 Dmcys N-(4-氨基丁基)甘氨酸 NgluD-α-甲基谷氨酰胺 Dmgln N-(2-氨基乙基)甘氨酸 NaegD-α-甲基組氨酸 Dmhis N-(3-氨基丙基)甘氨酸 NornD-α-甲基異亮氨酸 Dmile N-氨基-α-甲基丁酸 NmaabuD-α-甲基亮氨酸 Dmleu α-萘基丙氨酸 AnapD-α-甲基賴氨酸 Dmlys N-芐基甘氨酸 NpheD-α-甲基甲硫氨酸 Dmmet N-(2-氨甲酰基乙基)甘氨酸 NglnD-α-甲基鳥(niǎo)氨酸 DmornN-(氨甲?；谆?甘氨酸 NasnD-α-甲基苯丙氨酸DmpheN-(2-羧乙基)甘氨酸 NgluD-α-甲基脯氨酸 DmproN-(羧甲基)甘氨酸 NaspD-α-甲基絲氨酸 DmserN-環(huán)丁基甘氨酸 NcbutD-α-甲基蘇氨酸 DmthrN-環(huán)庚基甘氨酸 NchepD-α-甲基色氨酸 DmtrpN-環(huán)己基甘氨酸 NchexD-α-甲基酪氨酸 Dmty N-環(huán)癸基甘氨酸 NcdecD-α-甲基纈氨酸 DmvalN-環(huán)十二烷基甘氨酸 NcdodD-N-甲基丙氨酸 Dnmala N-環(huán)辛基甘氨酸 NcoctD-N-甲基精氨酸 Dnmarg N-環(huán)丙基甘氨酸 NcproD-N-甲基天冬酰胺 Dnmasn N-環(huán)十一烷基甘氨酸 NcundD-N-甲基天冬氨酸 Dnmasp N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸NbhmD-N-甲基半胱氨酸 Dnmcys N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸NbheD-N-甲基谷氨酰胺 Dnmgln N-(3-胍基丙基)甘氨酸 NargD-N-甲基谷氨酸 Dnmglu N-(1-羥基乙基)甘氨酸 NthrD-N-甲基組氨酸 Dnmhis N-(羥基乙基)甘氨酸 NserD-N-甲基異亮氨酸 Dnmile N-(咪唑基乙基)甘氨酸 NhisD-N-甲基亮氨酸 Dnmleu N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸 NhtrpD-N-甲基賴氨酸 Dnmlys N-甲基-γ-氨基丁酸酯 NmgabuN-甲基環(huán)己基丙氨酸 Nmchexa D-N-甲基甲硫氨酸 DnmmetD-N-甲基鳥(niǎo)氨酸 DnmomN-甲基環(huán)戊基甘氨酸 NmcpenN-甲基甘氨酸 Nala D-N-甲基苯丙氨酸 DnmpheN-甲基氨基異丁酸酯 NmaibD-N-甲基脯氨酸 DnmproN-(1-甲基丙基)甘氨酸 Nile D-N-甲基絲氨酸 DnmserN-(2-甲基丙基)甘氨酸 Nleu D-N-甲基蘇氨酸 DnmthrD-N-甲基色氨酸 Dnmtrp N-(1-甲基乙基)甘氨酸 NvalD-N-甲基酪氨酸 Dnmtyr N-甲基-萘基甘氨酸NmanapD-N-甲基纈氨酸 Dnmval N-甲基青霉胺 Nmpenγ-氨基丁酸 Gabu N-(對(duì)羥基苯基)甘氨酸 NhtyrL-叔丁基甘氨酸 Tbug N-(硫代甲基)甘氨酸 NcysL-乙基甘氨酸 Etg 青霉胺 PenL-同型苯丙氨酸 Hphe L-α-甲基丙氨酸 MalaL-α-甲基精氨酸 Marg L-α-甲基天冬酰胺MasnL-α-甲基天冬氨酸Masp L-α-甲基-叔丁基甘氨酸 MtbugL-α-甲基半胱氨酸Mcys L-甲基乙基甘氨酸 MetgL-α-甲基谷氨酰胺Mgln L-α-甲基谷氨酸 MgluL-α-甲基組氨酸MhisL-α-甲基同型苯丙氨酸 MhpheL-α-甲基異亮氨酸 MileN-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸 NmetL-α-甲基亮氨酸MleuL-α-甲基賴氨酸MlysL-α-甲基甲硫氨酸 MmetL-α-甲基正亮氨酸 MnleL-α-甲基正纈氨酸 MnvaL-α-甲基鳥(niǎo)氨酸MomL-α-甲基苯丙氨酸 MpheL-α-甲基脯氨酸MproL-α-甲基絲氨酸MserL-α-甲基蘇氨酸MthrL-α-甲基色氨酸MtrpL-α-甲基酪氨酸MtyrL-α-甲基纈氨酸MvalL-N-甲基同型苯丙氨酸 NmhpheN-(N-(2，2-二苯基乙基) Nnbhm N-(N-(3，3-二苯基丙基)氨甲 Nnbhe氨甲酰基甲基)甘氨酸?；谆?甘氨酸1-羧基-1-(2，2-二苯基乙Nmbc基氨基)環(huán)丙烷本發(fā)明的多肽可用于藥物組合物，以針對(duì)抗HBV或HBV變體進(jìn)行免疫接種。所述藥物組合物含有本發(fā)明的多肽以及一種或多種可藥用載體和/或稀釋劑。
可藥用載體和/或稀釋劑包括任何和所有溶劑，分散介質(zhì)，包被劑，抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，等滲劑和吸收延遲劑等。所述介質(zhì)和試劑作為藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。除了不能與所述活性成分相容的介質(zhì)或試劑以外，治療性組合物中可以使用任何常規(guī)的介質(zhì)或試劑。也可將補(bǔ)加的活性成分摻入組合物中。
藥物組合物也可含有遺傳分子，例如能轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的載體，其中所述載體攜有編碼本發(fā)明多肽或編碼核酶的核酸分子或HBV-基因序列的反義分子。載體可以是例如病毒，細(xì)菌或真核載體。
如上所述，本發(fā)明進(jìn)一步延及抗本發(fā)明多肽的抗體。所述抗體可以是單克隆或多克隆抗體。所述抗體可用于治療和診斷試驗(yàn)。
本發(fā)明的另一方面提供了檢測(cè)受試者生物樣品中HBV的方法，所述方法包括在足以形成抗體-HBV復(fù)合物的條件下，使所述生物樣品與特異于HBV或其變體的抗體接觸一段時(shí)間；然后檢測(cè)所述復(fù)合物。
可以用任意多種方法，例如Western印跡和ELISA法測(cè)定HBV的存在。可以使用多種免疫分析技術(shù)，可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4016043，4424279和4018653。這些技術(shù)包括非-競(jìng)爭(zhēng)型的單點(diǎn)和兩點(diǎn)試驗(yàn)或“夾心”試驗(yàn)，以及傳統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。這些試驗(yàn)也包括使標(biāo)記抗體與靶直接結(jié)合。
夾心試驗(yàn)是最有效的，也是最常用的試驗(yàn)，本發(fā)明使用該試驗(yàn)較為有利。夾心試驗(yàn)技術(shù)有多個(gè)變化的版本，本發(fā)明欲包括所有夾心試驗(yàn)技術(shù)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在典型的早期試驗(yàn)中，將未經(jīng)標(biāo)記的抗體固定于固體底物上，使待試樣品與固相分子接觸。保溫適當(dāng)?shù)囊欢螘r(shí)間以充分形成抗體-抗原復(fù)合物，然后，加入抗原特異性的第二抗體，所述抗體已被能產(chǎn)生可測(cè)信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記，保溫一段時(shí)間以充分形成另一種抗體-抗原-經(jīng)標(biāo)記抗體復(fù)合物。洗去任何未反應(yīng)的物質(zhì)，通過(guò)觀察報(bào)道分子產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)測(cè)定抗原的存在?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單地觀察可見(jiàn)信號(hào)來(lái)定性結(jié)果，也可以通過(guò)與含有已知量半抗原的對(duì)照樣品相比較來(lái)定量結(jié)果。對(duì)早期試驗(yàn)所作的改變包括同時(shí)試驗(yàn)，其中將樣品和經(jīng)標(biāo)記的抗體同時(shí)加入固相抗體中。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，它包括對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的任何微小改變。根據(jù)本發(fā)明，樣品可以是含有HBV或HBV-多肽的樣品，包括細(xì)胞提取物，組織活檢標(biāo)本或可能為血清，唾液，粘膜分泌物，淋巴，組織液和呼吸液體。因此，樣品一般是含有生物液體的生物樣品，但也延及發(fā)酵液和得自例如細(xì)胞培養(yǎng)的上清液。
在典型的早期試驗(yàn)中，對(duì)HBV或其抗原性部分具有特異性的第一抗體與固體表面共價(jià)結(jié)合或被動(dòng)結(jié)合。固體表面一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物也可以采取以下形式試管，珠，微型平板，或任何其它適用于進(jìn)行免疫分析試驗(yàn)的表面。結(jié)合方法是本領(lǐng)域眾所周知的，一般由交聯(lián)共價(jià)結(jié)合或物理吸附組成，用受試樣品制品洗滌聚合物-抗體復(fù)合物。然后在該固相復(fù)合物中加入待試樣品的等分試樣，在允許結(jié)合抗體中任何亞單位的適當(dāng)條件下(如從室溫至約37℃，如約25℃)保溫足夠的一段時(shí)間(如2-40分鐘，或如果方便的話保溫過(guò)夜)。保溫之后，洗滌抗體亞單位固相，干燥，并與特異于所述半抗原部分的第二抗體保溫。第二抗體與報(bào)道分子相連，所述報(bào)道分子可用于指示第二抗體與半抗原的結(jié)合。
另一種方法包括固定生物樣品中的靶分子，然后將固定化的靶暴露于能或不能被報(bào)道分子標(biāo)記的特異性抗體。根據(jù)靶的量和報(bào)道分子信號(hào)的強(qiáng)度，通過(guò)直接用抗體標(biāo)記即可檢測(cè)到結(jié)合的靶。
或者，將特異于第一抗體的第二標(biāo)記抗體暴露于靶-第一抗體復(fù)合物以形成靶-第一抗體-第二抗體三重復(fù)合物。通過(guò)報(bào)道分子發(fā)出的信號(hào)可檢測(cè)該復(fù)合物。
本說(shuō)明書(shū)中所用的“報(bào)道分子”指其化學(xué)特性能提供可分析鑒定的信號(hào)的分子，通過(guò)所述信號(hào)能檢測(cè)到與抗原結(jié)合的抗體。檢測(cè)可以是定性的或定量的。在這種類(lèi)型的試驗(yàn)中，最常用的報(bào)道分子是酶，熒光團(tuán)或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化學(xué)發(fā)光分子。
在酶免疫分析試驗(yàn)中，酶一般通過(guò)戊二醛或過(guò)碘酸與第二抗體偶聯(lián)。然而，人們會(huì)容易地認(rèn)為，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地獲得多種不同的偶聯(lián)技術(shù)。常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶，葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。選擇與特定的酶一起使用的底物，使得所述底物通過(guò)被相應(yīng)的酶水解可產(chǎn)生可測(cè)的顏色變化。適當(dāng)酶的例子包括堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶。也可以使用能產(chǎn)生熒光的底物，所述底物產(chǎn)生熒光產(chǎn)物而不是上述生色底物。在所有的情況下，在第一抗體半抗原復(fù)合物中加入酶-標(biāo)抗體，使它們結(jié)合，然后洗去過(guò)量的試劑。在抗體-抗原-抗體復(fù)合物中加入含適當(dāng)?shù)孜锏娜芤?。底物與第二抗體所偶聯(lián)的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可見(jiàn)信號(hào)，通常用分光光度計(jì)進(jìn)一步定量該信號(hào)，以指示樣品中存在的半抗原的量?！皥?bào)道分子”還可用于細(xì)胞凝集或凝集抑制，如乳膠珠上的紅細(xì)胞等。
或者，使諸如熒光素和羅丹明等熒光化合物與抗體通過(guò)化學(xué)方法偶聯(lián)，而不改變抗體的結(jié)合能力。當(dāng)通過(guò)用特定波長(zhǎng)的光照射而被激活時(shí)，被熒光染料標(biāo)記的抗體吸收光能，誘導(dǎo)分子的激發(fā)態(tài)，接著發(fā)出用光學(xué)顯微鏡肉眼可測(cè)的具有特征性顏色的光。在EIA中，使熒光標(biāo)記抗體與第一抗體-半抗原復(fù)合物結(jié)合，洗去未結(jié)合的試劑之后，將殘留的三重復(fù)合物暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光，觀察到的熒光指示目的半抗原的存在。免疫熒光和EIA技術(shù)都是本領(lǐng)域中很成熟的技術(shù)，本發(fā)明特別優(yōu)選使用這兩種技術(shù)。然而，也可使用其它報(bào)道分子，例如放射性同位素，化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。
下列非-限制性的實(shí)施例將進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1在具有高抗-HBs水平但表面抗原為陰性的新加坡成人和經(jīng)接種的未成年人中檢測(cè)和鑒定HBV表面抗原突變體使用本發(fā)明提供的引物寡核苷酸，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增來(lái)研究HBsAg陰性的新加坡成人和經(jīng)接種未成年人體內(nèi)是否存在HBV DNA。選擇來(lái)自不同少數(shù)民族組的63個(gè)成人和15個(gè)經(jīng)接種的未成年人(小于15歲，用重組疫苗接種)，通過(guò)4種獨(dú)立的基于免疫的商用診斷試劑盒檢測(cè)，皆為HBsAg陰性(表2)。他們均為HBV核心抗原之總抗體(抗-HBc)(Corzyme，Abbott Laboratories，USA)陽(yáng)性。所有人也都是抗-HBs(Ausab，AbbottLaboratories，USA)陽(yáng)性(表2)。通過(guò)蛋白酶K處理，接著用氯仿/苯酚提取和乙醇沉淀，從100μl血清中提取DNA。在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增中使用本發(fā)明提供的寡核苷酸和Pfu DNA聚合酶(Stratagene，USA)。進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由94℃變性(1分鐘)，50℃退火(2分鐘)和73℃延伸(3分鐘)組成。結(jié)果表明使用本發(fā)明提供的引物寡核苷酸，在15個(gè)未成年人的3個(gè)(20％)和63個(gè)成年人中的8個(gè)(13％)中擴(kuò)增出HBV DNA。在這組HBsAg陰性的未成年人中鑒定出HBsAg突變體，這與我們以前所報(bào)道的，在經(jīng)檢測(cè)為HBsAg陽(yáng)性的經(jīng)接種新加坡未成年人中檢測(cè)到HBsAg突變體的情況有所不用。使用本發(fā)明提供的引物寡核苷酸擴(kuò)增這組經(jīng)接種的未成年人的所有樣品中的HBVDNA。
對(duì)擴(kuò)增的DNA片段直接測(cè)序，結(jié)果表明在這些樣品中多個(gè)MHR位置上具有突變(表2)。這些包括在6例中最常見(jiàn)的疫苗逃避G145R。還有3例具有G130D突變(表2)，該突變最近剛在一例中報(bào)道與拉米夫啶(lamivudine)療法有關(guān)。另外，在4例中鑒定出T131N突變。與所報(bào)道的，在HBsAg上總是同時(shí)攜有T114S與T131N的基因型-相關(guān)突變不同的是，使用本發(fā)明提供的引物寡核苷酸鑒定出的T131N突變?cè)跉埢?14處具有野生型S(絲氨酸)。這反過(guò)來(lái)表明它可能是能逃避檢測(cè)的變體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本文所述的發(fā)明并不僅是具體描述的那樣，可以對(duì)其進(jìn)行改動(dòng)和修飾。應(yīng)理解本發(fā)明包括所有這種改動(dòng)和修飾。本發(fā)明還包括本說(shuō)明書(shū)中單獨(dú)或集中所指或所述的所有步驟，特征，組合物和化合物，以及任何兩個(gè)或多個(gè)所述步驟或特征的任何和所有組合。
表2 HBsAg陰性/抗-HBc陽(yáng)性的HBV新加坡成人和經(jīng)接種的未成年人中的HBsAg突變體
文獻(xiàn)目錄1.Carman等，胃腸學(xué)，102711-719，19922.Carman等，柳葉刀，336325-329，19903.Okamoto等，兒科學(xué)研究，32264-26，19924.McMahon等，肝臟學(xué)，15757-766，19925.Fuji等，Biochem.Biophys.Res.Commun，1841152-1157，19926.Harrison等，肝臟學(xué)雜志，135105-5107，19917.Chen等，F(xiàn)EBS Lett，453237-242，19998.Altschul等，核酸研究，253389，19979.Ausubel等，“最新分子生物學(xué)方法”，John Wiley&Sons Inc，1994-1998，第15章10.Bonner和Laskey，歐洲生物化學(xué)雜志，4683，197411.Marmur和Doty，分子生物學(xué)雜志，5109，196212.Oon等，疫苗，13699-702，1999
序列表<110>溫崇仁<120>診斷試驗(yàn)<130>2269257/EJH<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1caaggtatgt tgcccgtttg t 21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2tggctcagtt tactagtgcc att23<210><211>6<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>3gaattc 權(quán)利要求
1.檢測(cè)樣品中HBV-核酸靶序列的方法，所述方法包括使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生單鏈形式的所述靶序列；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物與以下區(qū)域雜交，所述區(qū)域?qū)?yīng)于或側(cè)翼于編碼HbsAg之完整或部分核苷酸序列內(nèi)的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述引物與以下區(qū)域雜交，所述區(qū)域?qū)?yīng)于或側(cè)翼于編碼HbsAg之核苷酸序列的一部分中的保守核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1或2或3的方法，其進(jìn)一步包括首先使樣品經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄條件以從HBV-mRNA產(chǎn)生單鏈或雙鏈cDNA分子。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物之一用能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記，所述引物之另一用可捕獲的組分標(biāo)記。
6.檢測(cè)樣品中HBV-DNA靶序列的方法，所述方法包括將所述樣品導(dǎo)入反應(yīng)管中，所述反應(yīng)管含有一種固定于固體支持物上的引物，和第二種位于溶液相中的引物，其中這兩種引物都能與HBV基因組保守區(qū)域之內(nèi)、其鄰側(cè)或鄰近區(qū)中HBV-DNA單鏈的互補(bǔ)核苷酸序列雜交，其中所述溶液相引物用能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記；使反應(yīng)管經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件；然后檢測(cè)可鑒定信號(hào)的存在，其中所述信號(hào)的存在指示HBV-DNA的存在。
7.從相同或不同HBV毒株或變體中檢測(cè)一種或多種HBV-DNA靶序列的方法，所述方法包括使據(jù)推測(cè)含有單鏈形式的HBV-衍生DNA的樣品與兩種或多種引物接觸，所述引物單獨(dú)地，或以列陣的形式固定于反應(yīng)管中的固體支持物上，其中反應(yīng)管另外還含有溶液相引物，該引物具有固定于所述固體支持物上的配對(duì)物，其中固相引物及其溶液相的配對(duì)引物能在擴(kuò)增條件下擴(kuò)增HBV-DNA的區(qū)域，其中溶液相引物攜有能給出可鑒定信號(hào)的報(bào)道分子，使得固體支持物上確定位置處信號(hào)的存在能鑒定特定的HBV分離株或變體。
8.固定于固體支持物上的兩種或多種寡核苷酸引物的一種列陣，所述引物能與HBV-衍生DNA的互補(bǔ)核苷酸序列雜交。
9.權(quán)利要求8的列陣，其中列陣由在基質(zhì)上坐標(biāo)為(x1y1)，(x2y2)...(xnyn)的式a1a2...an定義，其中a1a2...an表示相同或不同的寡核苷酸，總共為n個(gè)寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸可由方格坐標(biāo)(x1y1)，(x2y2)...(xnyn)確定，其中寡核苷酸具有由b1b2...bn定義的擴(kuò)增配對(duì)物，從而使寡核苷酸a1b1，a2b2...anbn能與HBV-DNA的互補(bǔ)鏈雜交，其中間插的DNA含有在兩種或多種HBV變體，如HBsAg變體之間保守的核苷酸序列，其中所述基質(zhì)可用于檢測(cè)特定的HBV因子，所述因子的特征在于攜有所述HBV-衍生DNA的保守?cái)U(kuò)增區(qū)域。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物選自<400>1和<400>2，或者與其具有至少約70％相似性的引物，或能在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與<400>1或<400>2雜交的引物。
11.HBV變體，通常是分離形式，其可通過(guò)檢測(cè)HBV-核酸靶序列的方法鑒定，所述方法包括使樣品經(jīng)受變性條件以產(chǎn)生單鏈形式的所述靶序列；使該變性樣品與一套引物接觸，所述引物套含有至少兩種引物，其中至少一種引物能與所述靶序列的一條鏈雜交，其中至少一種其它的引物能與所述第一條鏈的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述引物能從它們的3’末端延伸，形成與每種所述引物所雜交的鏈互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物；使樣品經(jīng)受有利于擴(kuò)增的條件，產(chǎn)生含有互補(bǔ)延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示所述HBV-核酸靶序列的存在；然后分離檢測(cè)到的所述HBV。
12.鑒定表達(dá)產(chǎn)物的方法，所述表達(dá)產(chǎn)物如肽，多肽或蛋白質(zhì)，它們可作為免疫標(biāo)志使用和/或用于產(chǎn)生診斷和/或治療所用的免疫球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及基于核酸的分析試驗(yàn),該試驗(yàn)可用于檢測(cè)病毒病原體,特別是乙肝病毒的存在。更特別地,本發(fā)明提供了檢測(cè)乙肝病毒核酸序列的一步擴(kuò)增試驗(yàn)。本發(fā)明的試驗(yàn)可以容易地適應(yīng)自動(dòng)化操作,并且可以使待測(cè)樣品快速流通。本發(fā)明還提供了試劑和含有所述試劑的試劑盒,所述試劑可用于進(jìn)行基于核酸的乙肝病毒檢測(cè)試驗(yàn)。
文檔編號(hào)G01N33/566GK1333378SQ01122929
公開(kāi)日2002年1月30日 申請(qǐng)日期2001年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月18日
發(fā)明者溫崇仁, 陳維寧 申請(qǐng)人:新加坡共和國(guó)政府