專利名稱：并行檢測多個生物學信號的表面等離子體共振生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于表面等離子體共振原理的、可以并行檢測多個生物學信號的生物傳感器。
其中，光學方法由于其具有非破壞性和高靈敏度的特點被視為是最成熟和最好的生物傳感技術(shù)。自1902年，Wood在光學實驗中首次發(fā)現(xiàn)了表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)現(xiàn)象以來，SPR儀器和SPR生物傳感器的研究一直受到關(guān)注。
表面等離子體共振SPR是一種物理光學現(xiàn)象。形成SPR現(xiàn)象的必要條件之一是金屬和電介質(zhì)間的界面存在。當入射光以某一特定的角度入射時，其反射率會顯著減少，此入射角度即為SPR角。附著在金屬表面的物質(zhì)不同，其SPR角不同，而同一種物質(zhì)，附著在金屬表面的量不同，其SPR角也不相同。根據(jù)上述原理，SPR生物傳感器可以將已知的生物分子固定在幾十納米厚的金屬膜表面，當它與互補的目標生物分子結(jié)合時，由于表面結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致SPR角改變，并且根據(jù)SPR角的改變值，可以得知結(jié)合的目標生物分子的種類及濃度。目前，SPR傳感器已用于生物分析領(lǐng)域。
世界上已有一些基于SPR原理的生物傳感器產(chǎn)品，以瑞典的Biacore AB的Biacore系列生物傳感器為例，它的制備方法是將100nm厚的金膜固定在玻璃基質(zhì)上，將此玻璃片嵌在一個塑料平板夾里，用一種折射率與棱鏡匹配的聚合物將芯片耦合到玻璃棱鏡上。在芯片表面固定一層葡聚糖分子層，使它較容易與其它生物大分子偶聯(lián).它以發(fā)光二極管為光源，用線性陣列發(fā)光二極管作為檢測器，檢測不同入射角處的反射光強度.但這只完成了單點SPR的檢測，一次只能對一種物質(zhì)進行檢測，這在一定程度限制了它的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在現(xiàn)有SPR技術(shù)基礎(chǔ)上提供一種可以進行多點并行檢測的SPR生物傳感器。
本發(fā)明SPR生物傳感器依次由基質(zhì)、金屬膜、化學修飾物層、交聯(lián)劑層和生物單分子層構(gòu)成，此生物單分子層在不同位置含有不同的生物分子。
本發(fā)明的基質(zhì)可以是連續(xù)基質(zhì)，也可為不連續(xù)的基質(zhì)，材料可選用玻璃、硅片或其他硬質(zhì)固體材料。在基質(zhì)的外部鍍上厚度為20-90nm的金屬膜，金屬膜優(yōu)選Au膜或Ag膜。在金屬膜表面涂有化學修飾物層以產(chǎn)生一層多聚陰離子表面，此化學修飾物可以是11-巰基烷二酸(MUA)、氨基硫酚、氨基硫醇、巰基乙二胺、十六烷巰基醇或其他含硫試劑。在化學修飾物的表面聯(lián)有交聯(lián)劑，交聯(lián)劑可選用EDAC(1-Ethyl-3(3-Dimethylamino-propyl)carbodiimide)、戊二醛等，在交聯(lián)劑層上按一定順序點有多種生物分子，如抗原、抗體，激素、受體，生物素、抗生物素蛋白，底物、酶或輔酶，核酸分子等，形成生物單分子層。
上述生物傳感器與SPR檢測儀配套使用，可實現(xiàn)對生物樣品中多個生物學信號并行檢測。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供上述生物傳感器的制備方法。
本發(fā)明生物傳感器是通過下述技術(shù)方案獲得的1.在基質(zhì)的表面鍍上金膜，使金屬膜的厚度為20-90nm；2.此基質(zhì)依次在濃硫酸∶過氧化氫＝1.5-4∶1的溶液、丙酮溶液或酒精溶液、二次水溶液中超聲清洗，干燥；3.此基質(zhì)浸于含有巰基的化學修飾物溶液中組裝3-24小時；4.依次在酒精溶液和二次水溶液中清洗，干燥；5.在交聯(lián)劑中，組裝3-24小時；6.用加樣器將多種生物分子按一定順序定量點制在經(jīng)過上述步驟處理過的基質(zhì)表面的不同位置；點與點之間的距離大于lmm，各生物分子的濃度從0.05mg/ml2-0.0mg/ml不等。
7.浸于0.01-0.5％(w/v)BSA封閉液中封閉過夜，2-8℃保存。
本發(fā)明的再一目的是提供上述生物傳感器在多個生物學信號并行檢測中的應(yīng)用。
本發(fā)明生物傳感器可用于并行檢測待測樣品中的多種抗原、抗體、激素、受體、生物素、抗生物素蛋白、底物、酶或輔酶和核酸分子等。
檢測時，可用激光光源發(fā)出的單束激光對傳感器進行掃描，也可用空間濾波器(Spatial Filter)對單束激光進行擴束，使其可以同時照射傳感器的整個表面。當待測溶液接觸SPR生物傳感器時，其生物單分子層的各生物分子與待測樣品溶液中的目標分子特異性結(jié)合，形成復(fù)合物，使生物單分子層的表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這一變化可導(dǎo)致該單分子層上各生物分子處的SPR現(xiàn)象的改變，通過SPR檢測儀可檢測SPR角的變化。
本發(fā)明所述SPR生物傳感器通過下述方式實現(xiàn)多個生物學信號并行檢測1)用完全相同的上述SPR生物傳感器分別檢測幾份含有多種可與生物傳感器上的生物分子特異性結(jié)合的目標分子，且各目標分子濃度已知并依次遞增的樣品，通過SPR檢測儀記錄不同時刻t、生物傳感器上各生物分子處的SPR角ω的變化，根據(jù)ω與t的關(guān)系作動力學曲線。
2)由動力學曲線可以得到反應(yīng)達到平衡后，生物傳感器上各生物分子的SPR平衡角ω0值，作此角度值與該點對應(yīng)的目標分子濃度C的相關(guān)曲線，即得到對應(yīng)于各目標分子的ω0/C曲線(稱為標準曲線)，上述標準曲線置于檢測儀數(shù)據(jù)庫中備用。
3)當檢測未知濃度的溶液時，同1)仍根據(jù)生物傳感器上各點的SPR角ω與時間t的關(guān)系作動力學曲線。
4)同2)，由動力學曲線找出各SPR平衡角ω0值，將ω0值與對應(yīng)的目標分子的標準曲線對照，可得出該目標分子的濃度。從而達到對多種目標分子進行定量檢測的目的。
目前的單點SPR檢測主要應(yīng)用在研究領(lǐng)域，本發(fā)明的多點SPR檢測，它的意義在于臨床上的應(yīng)用。如目前對于腫瘤的早期檢測，大多采用生化檢測，但是，單指標(單一的腫瘤標志物)的檢測并不足以幫助醫(yī)生作出正確的判斷，因為單指標檢測的假陽性和假陰性都相當高，因此對多個腫瘤標志物進行并行檢測，可以大大提高診斷的準確度。
本發(fā)明所述并行檢測多個生物學信號的表面等離子體共振生物傳感器，使用方便，檢測靈敏，有助于準確檢測各種疾病，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。
圖2 傳感器上生物分子點樣示意3 ω/t動力學曲線示意4 標準曲線示意5 A1、A2、B1、B2分別表示實施例1點樣點，5.1、5.2、5.3、5.4是對應(yīng)于點A1、A2、B1、B2的反射率I/入射角A的曲線圖6 6.1、6.2、6.3、6.4分別是圖5中A1、A2、B1、B2點對應(yīng)的ω/t動力學曲線圖7 7.1、7.2、7.3、7.4分別是實施例1AFP、CEA、PSA、Ferritin的ω0/C標準曲線上述單抗均來源于美國Biodesign公司5)血清樣品來源于上海市第六人民醫(yī)院。制備方法1)將鍍有Au膜的玻璃片在濃硫酸∶過氧化氫＝7∶3的溶液、酒精溶液、二次水溶液中各超聲清洗5分鐘，室溫吹干；2)將上述玻片浸于11-巰基烷二酸(MUA)中室溫組裝24小時；3)依次在酒精溶液和二次水溶液中各清洗5分鐘，室溫吹干；4)浸于交聯(lián)劑0.1％EDAC溶液中，室溫組裝24小時5)用微量加樣器將0.6mg/ml的抗AFP單抗、1.0mg/ml的抗CEA單抗0.5mg/ml的抗PSA單抗、0.5mg/ml的抗free-PSA單抗如圖5所示定量點制在上述基質(zhì)表面的不同位置；點與點之間的距離為2.5mm，點樣量為1ul。
如圖5，點A1抗AFP單抗，點A2抗CEA單抗，點B1抗PSA單抗，點B2抗Ferritin單抗6)、浸于0.1％(W/V)BSA封閉液中封閉過夜。
用上述生物傳感器來檢測血清。將上述生物傳感器置于光學耦合器件如

圖1(3)上，使待測血清接觸其表面，光電檢測器(4)可記錄生物傳感器上各單抗處的SPR現(xiàn)象的變化，如圖5中5.1，5.2，5.3，5.4所示，經(jīng)過計算機處理可得出各點的ω/t動力學曲線，各點的動力學曲線如圖6所示。從圖6.1至6.4，可分別以得出抗AFP、CEA、PSA、Ferritin的SPR平衡角ω0，將平衡角ω0與各目標分子的標準曲線對應(yīng)，如圖7，從圖7.1至7.4，可得出此血清中AFP、CEA、PSA、Ferritin的濃度CEA濃度為24ng/ml；AFP濃度為17ng/ml；PSA濃度為3ng/ml；Ferritin濃度為205ng/ml。
權(quán)利要求
1.并行檢測多個生物學信號的SPR生物傳感器，該生物傳感器依次由基質(zhì)，金屬膜，化學修飾物層，交聯(lián)劑層和生物單分子層構(gòu)成，其特征在于此生物單分子層的不同位置含有不同的生物分子
2.如權(quán)利要求1所述的并行檢測多個生物學信號的SPR生物傳感器，其特征在于其中所述的生物單分子層點有抗原、抗體，激素、受體，生物素、抗生物素蛋白，底物、酶或輔酶和核酸分子。
3.如權(quán)利要求1所述的并行檢測多個生物學信號的SPR生物傳感器，其特征在于其中所述的基質(zhì)選用玻璃、硅片或其他硬質(zhì)固體材料。
4.如權(quán)利要求l所述的并行檢測多個生物學信號的SPR生物傳感器，其特征在于其中所述的基質(zhì)為連續(xù)或不連續(xù)的基質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1所述的并行檢測多個生物學信號的SPR生物傳感器，其特征在于其中所述的金屬膜為厚度在20-90nm的Au膜或Ag膜。
6.如權(quán)利要求1所述的并行檢測多個生物學信號的SPR生物傳感器，其特征在于其中所述的化學修飾物層所用的化學修飾劑為11-巰基烷二酸、氨基硫酚、氨基硫醇、巰基乙二胺、十六烷巰基醇或其他含硫試劑。
7.如權(quán)利要求1所述的并行檢測多個生物學信號的SPR生物傳感器，其特征在于其中所述的交聯(lián)劑層選用的交聯(lián)劑為EDAC或戊二醛。
8.如權(quán)利要求1所述的并行檢測多個生物學信號的SPR生物傳感器的制備方法，其特征在于該生物傳感器是通過下述技術(shù)方案獲得的1)在基質(zhì)的表面鍍上金膜，使金屬膜的厚度為20-90nm；2)此基質(zhì)依次在濃硫酸∶過氧化氫＝1.5-4∶l的溶液、丙酮溶液或酒精溶液、二次水溶液中超聲清洗，干燥；3)此基質(zhì)浸于含有巰基的化學修飾物溶液中組裝3-24小時；4)依次在酒精溶液和二次水溶液中清洗，干燥；5)在交聯(lián)劑中，組裝3-24小時；6)用加樣器將多種生物分子按一定順序定量點制在上述基質(zhì)表面的不同位置；點與點之間的距離大于lmm，所用的生物分子的濃度從0.05mg/ml-20.0mg/ml不等；7)浸于0.01-0.5％(w/v)BSA封閉液中封閉過夜，2-8℃保存。
9.如權(quán)利要求1所述的SPR生物傳感器在多個生物學信號并行檢測中的應(yīng)用，其特征在于該傳感器可用于并行檢測多種抗原、抗體，激素、受體，生物素、抗生物素蛋白，底物、酶或輔酶和核酸分子。
10.如權(quán)利要求8所述的SPR生物傳感器在多個生物學信號并行檢測中的應(yīng)用，其特征在于它的檢測是通過下述方式來實現(xiàn)的a)用完全相同的上述SPR生物傳感器分別檢測幾份含有多種可與生物傳感器上的生物分子特異性結(jié)合的目標分子，且各目標分子濃度已知并依次遞增的樣品，通過SPR檢測儀記錄不同時刻t、生物傳感器上各生物分子處的SPR角ω的變化，根據(jù)ω與t的關(guān)系作動力學曲線；b)由動力學曲線可以得到反應(yīng)達到平衡后，生物傳感器上各生物分子的SPR平衡角ω0值，作此角度值與該點對應(yīng)的目標分子濃度C的相關(guān)曲線，即得到對應(yīng)于各目標分子的ω0/C標準曲線，該標準曲線置于檢測儀數(shù)據(jù)庫中備用；c)當檢測未知濃度的溶液時，同1)仍根據(jù)生物傳感器上各點的SPR角ω與時間t的關(guān)系作動力學曲線；d)由動力學曲線找出各SPR平衡角ω0值，將ω0值與對應(yīng)的目標分子的標準曲線對照，可得出該目標分子的濃度。從而達到對多種目標分子進行定量檢測的目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于表面等離子體共振(SPR)原理、可以并行檢測多個生物學信號的生物傳感器。該生物傳感器依次由基質(zhì)，金屬膜，化學修飾層，交聯(lián)劑層和生物單分子層構(gòu)成，其特征在于在生物單分子層的不同位置結(jié)合了多種生物分子，可并行定量檢測生物樣品中特定目標分子的濃度，并可以應(yīng)用于疾病指標的檢測，具有臨床診斷應(yīng)用的價值。本發(fā)明還提供了該生物傳感器的制備方法和使用方法。本發(fā)明所述生物傳感器使用方便，檢測靈敏。
文檔編號G01N33/53GK1421699SQ01132289
公開日2003年6月4日 申請日期2001年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月23日
發(fā)明者胡賡熙 申請人:上海數(shù)康生物科技有限公司