專利名稱：確定草藥品質(zhì)的新穎方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種確定草藥品質(zhì)的方法。特別是，本發(fā)明是利用生物芯片的技術(shù)檢測(cè)出存在于草藥中所需的生物活性成份。
背景技術(shù)：
許多年來，草藥(整株植物)已應(yīng)用于醫(yī)療上。通常是以熬煮液或茶的方式服用草藥，或以糊漿的方式外用糊覆草藥。然而，實(shí)際經(jīng)驗(yàn)顯示，相同品種的草藥的個(gè)體，當(dāng)以相同的方式處理時(shí)，可存有醫(yī)療功效上顯著的差異。
草藥的成份通常是許多化合物的混合物，其中某些化合物可能具有生物活性且可能對(duì)人體和動(dòng)物具有治療功效。草藥的成份中化合物種類和/或其相對(duì)含量可能會(huì)改變，該改變?nèi)Q于草藥個(gè)體的遺傳信息及該草藥生長時(shí)的天然條件，諸如栽種的地理位置，土壤組成，水質(zhì)，氣候(包括溫度和濕度)，陽光照射強(qiáng)度及生長時(shí)間。
草藥對(duì)人體和動(dòng)物的醫(yī)療功效取決于該草藥所含有的數(shù)種活性化合物及其相對(duì)含量。草藥個(gè)體所含有的活性化合物量愈高，該草藥個(gè)體顯示愈高的治療功效。科學(xué)上對(duì)檢測(cè)草藥所含有的所需活性成份及其相對(duì)含量并無指引，甚至當(dāng)該草藥已知具有特定的治療功效時(shí)也是這樣。判斷已知對(duì)人體和動(dòng)物具有治療功效的草藥個(gè)體的品質(zhì)，通?；谑煜げ菟幦耸康慕?jīng)驗(yàn)，其系藉由觀察草藥的體型、外觀及顏色、嗅聞草藥的氣味、和/或咀嚼草藥的組織。對(duì)人體和動(dòng)物具有治療功效的草藥，現(xiàn)有技術(shù)并未教示或暗示可藉由科學(xué)的方法能確定該草藥的品質(zhì)(即，存在所需的活性成份和/或其相對(duì)含量)。
美國專利號(hào)6,156,291揭示一種可重復(fù)萃取植物的化學(xué)成份的藥理活性混合物的方法，其中該方法可改進(jìn)該藥理活性成份的混合物的品質(zhì)控制。
為確定具有特定醫(yī)療用途的草藥個(gè)體的品質(zhì)，本領(lǐng)域首先需要發(fā)展出一種科學(xué)性方法，其能夠檢測(cè)出并確定草藥個(gè)體含有所需的醫(yī)療活性成份，使得該含有所需的醫(yī)療活性成份及治療功效的草藥個(gè)體能夠被篩選得到，而其它不含有該醫(yī)療活性成份的草藥個(gè)體，甚至包括相同物種的其它草藥個(gè)體，可被排除而不予使用。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種確定草藥品質(zhì)的方法，其是通過利用生物芯片的技術(shù)以檢測(cè)出存在于草藥中所需的生物活性成份。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種確定在不同地區(qū)所栽種的人參的品質(zhì)的方法，它是通過利用生物芯片的技術(shù)以檢測(cè)出存在于人參中能夠與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)專一性結(jié)合的生物活性成份。
附圖簡述

圖1A顯示韓國所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer；稱為高麗參)的粗干根的粉末的甲醇萃取液的高效液相層析(HPLC)的輪廓圖，及該HPLC分級(jí)液的熒光圖像。
圖1B顯示中國吉林地區(qū)所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer稱為吉林參)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級(jí)液的熒光圖像。
圖1C顯示韓國所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer稱為白高麗參)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級(jí)液的熒光圖像。
圖1D顯示中國長白山地區(qū)所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer稱為東洋參)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級(jí)液的熒光圖像。
圖1E顯示美國Wisconsin州所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer稱為西洋參)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級(jí)液的熒光圖像。
圖2A顯示中國西南地區(qū)所栽種的三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級(jí)液的熒光圖像。
圖2B顯示中國西南地區(qū)所栽種的三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的粗干根(稱為三七粒)的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級(jí)液的熒光圖像。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種確定草藥品質(zhì)的方法，它是通過利用生物芯片的技術(shù)以檢測(cè)出存在于草藥中所需的生物活性成份。
本發(fā)明的方法包括下述的步驟利用HPLC分級(jí)草藥萃取液以得到草藥萃取液的分級(jí)樣品，將該草藥萃取液的分級(jí)樣品以微陣列的方式加載至已經(jīng)預(yù)先處理過的涂覆塑料載片上，及進(jìn)行雜交反應(yīng)及信號(hào)檢測(cè)。
草藥系首先經(jīng)研磨成微細(xì)粉末并利用溶劑進(jìn)行萃取?？捎糜诒景l(fā)明的溶劑包括水、C1-6醇、C1-6醚，及其組合。隨后，離心該草藥萃取液，并濃縮所得到的上清液。利用HPLC分級(jí)該濃縮的上清液，同時(shí)監(jiān)控該分級(jí)液的吸光度。收集所得到的分級(jí)液。
塑料載片的材料可為同聚物或共聚物，其是由一種或多種單體的聚合所制備，該單體系選自乙烯、鹵化乙烯、丙烯、鹵化丙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丁二烯、丙烯腈、降冰片烯或苯乙烯，其中苯乙烯的聚合物是優(yōu)選的。該塑料載片的材料亦可為聚碳酸酯。該塑料載片的大小相當(dāng)于微陣列器或激光掃描儀所常用的載片大小。本發(fā)明的方法所使用的塑料載片的優(yōu)點(diǎn)在于可使用各種不同的化學(xué)藥劑以處理該塑料載片的表面，使得不僅是大分子(諸如蛋白質(zhì)和DNA)，亦包括小分子(諸如草藥的代謝物)可固定于該塑料載片的表面上。此優(yōu)點(diǎn)若對(duì)照常用的玻璃載片僅能用于固定大分子(諸如蛋白質(zhì)和DNA)的事實(shí)尤顯得重要。再者，塑料材料可易于模制成所需的形狀，且亦具有成本低的優(yōu)異性。于本發(fā)明的優(yōu)選體系中，該塑料載片具有2個(gè)凹槽。得自于草藥的分級(jí)液的樣品可欄格化地點(diǎn)樣于該凹槽的表面上，且隨后可將含有探針的溶液加到該凹槽上以進(jìn)行雜交反應(yīng)。該2個(gè)凹槽的深度可為相同或不同，且介于低于0.03毫米至高達(dá)0.5毫米的范圍內(nèi)。進(jìn)一步，經(jīng)模制后，每1個(gè)凹槽的相對(duì)2邊可分別含有欄桿以用于支撐蓋玻片，其中該蓋玻片用于防止蒸發(fā)或損失該加載至該凹槽上的含有探針的溶液。
該塑料載片的預(yù)先處理可利用多官能團(tuán)醛及隨后浸沒于提供NH2基團(tuán)的前體溶液中，以使得所生成的塑料載片在其表面上含有活性胺基。該提供NH2基團(tuán)的前體可以是有機(jī)物或無機(jī)物，且可選自NH4OH、伯胺，仲胺或叔胺，其中該伯胺，仲胺及叔胺的脂族和/或芳香族部份可用于充作額外的間隔子。對(duì)于該提供NH2基團(tuán)的前體，能直接提供自由NH2基團(tuán)的NH4OH是優(yōu)選的。
在本發(fā)明中，該塑料載片上的涂層可由多官能團(tuán)分子(例如，多官能團(tuán)環(huán)氧化物)所構(gòu)成，它起到間隔子的作用。該多官能團(tuán)環(huán)氧化物的作用將草藥所含的成份連接到該經(jīng)先期處理的塑料載片上。該多官能團(tuán)環(huán)氧化物的一端的活性環(huán)氧基與該經(jīng)先期處理的塑料載片的表面上的胺基反應(yīng)，而該多官能團(tuán)環(huán)氧化物的另一端的活性環(huán)氧基吸附草藥所含的成份或與草藥所含的成份反應(yīng)。具體說，草藥成份中含有自由羥基、巰基和/或胺基的化合物能與該多官能團(tuán)環(huán)氧化物的另一端的活性環(huán)氧基形成共價(jià)鍵，因而該化合物能夠連接至該經(jīng)涂覆的塑料載片上。該多官能團(tuán)環(huán)氧化物優(yōu)選含有6-24個(gè)碳原子長的化學(xué)鏈，使得草藥所含的成份不會(huì)直接地結(jié)合或吸附到該經(jīng)先期處理的塑料載片上。在本發(fā)明中，每1個(gè)點(diǎn)樣樣品對(duì)經(jīng)涂覆的塑料載片的結(jié)合是牢固的，甚至經(jīng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拿撾x沖洗后亦然。重要的是在本發(fā)明中，不僅是大分子(諸如蛋白質(zhì)和DNA)，亦包括小分子(諸如代謝物)都可以以均一相或非均一相的方式固定于該經(jīng)涂覆的塑料載片的表面上。
在本發(fā)明的方法中，對(duì)將草藥萃取液的分級(jí)樣品以微陣列的方式加載至該經(jīng)涂覆的塑料載片上的步驟，該草藥萃取液的分級(jí)樣品系藉由應(yīng)用高密度欄格技術(shù)并利用微陣列器以微陣列的方式點(diǎn)樣且固定于該經(jīng)涂覆的塑料載片的欄格面積上，其中每1個(gè)樣品點(diǎn)可含有呈均一相或非均一相的草藥成份。在本發(fā)明的方法中，可使用整合性微小化技術(shù)(integrating miniaturizationtechnology)以增加該經(jīng)涂覆的塑料載片上欄格樣品的密度。
在本發(fā)明的方法中，檢測(cè)草藥中存在所需的生物活性成份以確定該草藥的品質(zhì)是基于標(biāo)的物導(dǎo)向的方式，其包括將含有標(biāo)記探針的溶液加載至該經(jīng)涂覆的塑料載片的凹槽上以進(jìn)行雜交反應(yīng)(其中可利用玻璃片蓋住每一個(gè)凹槽以防止該含有標(biāo)記探針的溶液的蒸發(fā))，及利用儀器(例如，激光掃描儀)以顯像并鑒定出能與該標(biāo)記探針結(jié)合或反應(yīng)的樣品點(diǎn)樣點(diǎn)。本發(fā)明的方法所使用的探針是基于已確定的分子機(jī)制且呈均一相或非均一相的已知標(biāo)的物，其可為，例如，拮抗諸如選擇的細(xì)胞、受體、肽或蛋白質(zhì)類的小分子化合物，競爭性配體、或抗體。該連接探針的標(biāo)記物可為染料或放射性物質(zhì)。
本發(fā)明的優(yōu)選方面是提供一種確定在不同地區(qū)所栽種的人參的品質(zhì)的方法，其是利用生物芯片的技術(shù)檢測(cè)出存在于人參中能夠與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)專一性結(jié)合的生物活性成份。具體的，經(jīng)生物素標(biāo)記的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和經(jīng)Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素(strepavidin)作為探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。在本發(fā)明的方法中，若觀察到顯示經(jīng)處理的塑料載片上樣品點(diǎn)樣點(diǎn)中的成份與經(jīng)生物素標(biāo)記的TNF-α結(jié)合的信號(hào)，其顯示該樣品點(diǎn)樣點(diǎn)的成份中存有至少1種候選化合物，其具有類似于拮抗TNF-α的生物活性。這些候選化合物可用于治療自身免疫疾病，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在功效上，本發(fā)明的方法可用簡單的方式迅速地檢測(cè)出存在于草藥中所需的生物活性成份并進(jìn)一步確定該草藥的品質(zhì)。
下述的實(shí)施例僅用于進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明的方法，但本發(fā)明的范圍不應(yīng)以下述的實(shí)施例為限。
實(shí)施例實(shí)施例1利用高效液相層析(HPLC)分級(jí)人參萃取液將栽種于不同地區(qū)所得到的干燥人參(參閱表1)研磨成微細(xì)粉末，隨后于真空下進(jìn)行包裝以利長期貯存。室溫下，對(duì)每一種人參的研磨粉末(50克)，利用甲醇(500毫升，HPLC等級(jí))藉由勻漿機(jī)(OMNI)進(jìn)行連續(xù)摻合5分鐘以完成萃取。在4℃和8000rpm下，離心所生成的萃取液達(dá)30分鐘，隨后以上述相同的方法，對(duì)該殘余物(片狀沉淀)進(jìn)行再次萃取和離心(重復(fù)2次)。收集所得到的澄清上清液，隨后利用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器(Laborota 4000，HEIDOLPH)將該上清液濃縮為最終體積30毫升。將由50％水和50％乙醇所組成的混合物加入到該濃縮的上清液中，使其體積為50毫升，隨后利用磁性攪拌棒進(jìn)行混合20分鐘。在4℃和8000rpm下，離心所生成的溶液30分鐘。在室溫和12000rpm下，離心所得到的澄清上清液10分鐘，隨后分析所生成的澄清上清液。
利用HPLC進(jìn)行分析。將上述所生成的澄清上清液(0.1毫升)加載TSK凝膠ODS-80TM管柱(4.6毫米×15厘米，5微米填料，TOSOH，先前已用水平衡)中，隨后以0-100％乙醇的二次蒸餾水梯度溶液進(jìn)行洗脫(流速0.75毫升/分鐘)96分鐘。在波長205納米下，持續(xù)監(jiān)控洗脫液的吸光度。該吸光度的結(jié)果顯示于圖中，其中圖1E(關(guān)于栽種于美國Wisconsin州的人參)所顯示的輪廓圖系不同于圖1A、1B、1C和1D所顯示的輪廓圖，此結(jié)果顯示該HPLC輪廓圖的差異是由于栽種人參的地理區(qū)域的不同。在該0到96分鐘期間，以0.75毫升/分鐘/分級(jí)液的方式收集洗脫液，其中每一個(gè)分級(jí)液(含有人參的成份)的0.225毫升是由利用自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)(MultiProbe II，PACKARD)轉(zhuǎn)移到一式三份的每一個(gè)96孔圓底微量滴定板上。所生成的含有干燥的人參成份的微量滴定板可立即進(jìn)行活性分析或可加以貯存以便于以后使用。
實(shí)施例2預(yù)先處理塑料載片及制備經(jīng)涂覆的塑料載片利用苯乙烯的聚合物制備模制的塑料載片，它含有2個(gè)凹槽。該模制塑料載片的大小相當(dāng)于微陣列器或激光掃描儀所使用的常用玻璃載片，其中該凹槽的深度是0.05毫米。
首先，在室溫下將該模制塑料載片浸沒于0.4％戊二醛溶液(pH5.0)中達(dá)4小時(shí)，隨后經(jīng)水沖洗并在60℃下浸漬于3M NH4OH(pH11.0)的溶液中達(dá)4小時(shí)。在37℃下，利用100mM 1，4-丁二醇二醛水甘油醚(pH11.0)過夜處理所生成的塑料載片。最終，利用0.1M NaHCO3溶液(pH8.0)沖洗該塑料載片，并令其干燥。
實(shí)施例3利用微陣列方式加載樣品至經(jīng)涂覆的塑料載片上利用微陣列器(BioGrid II，BIOROBOTIC)將樣品點(diǎn)樣至實(shí)施例2所制備的經(jīng)涂覆的塑料載片上。令上述實(shí)施例1的微量滴定板所含有的干燥人參成份溶解在30％ DMSO/0.1M碳酸鈉緩沖液(pH9.5)中以形成最終體積為16微升/孔。利用4號(hào)針(內(nèi)徑0.4毫米)管件，將該人參成份樣品自該96孔微量滴定板加到該經(jīng)涂覆的塑料載片的凹槽表面上。將生物素肼(biotin hydrazide)溶液(20微克/毫升)點(diǎn)樣于該經(jīng)涂覆的塑料載片的凹槽表面上，作為對(duì)照組。在該經(jīng)涂覆的塑料載片的凹槽表面上的斑點(diǎn)經(jīng)干燥后，將所生成的塑料載片在37℃下浸沒于1M乙醇胺溶液(pH8.0)中達(dá)2小時(shí)。
實(shí)施例4雜交反應(yīng)及信號(hào)檢測(cè)利用生物素化的腫瘤壞死因子-α(B-TNF-α)和經(jīng)Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素(strepavidin)作為進(jìn)行雜交反應(yīng)的探針。對(duì)實(shí)施例3的每一個(gè)經(jīng)處理的塑料載片的2個(gè)凹槽分別覆蓋玻璃片(22毫米×22毫米)，隨后將20微升B-TNF-α的TBST緩沖液(0.5微克/毫升，含有50mM Tris-HCl，pH7.3，0.15M NaCl和0.05％Tween 20)加到該經(jīng)處理的塑料載片的凹槽上，并于37℃下進(jìn)行培育2小時(shí)。利用該TBST緩沖液沖洗經(jīng)處理的塑料載片4次，隨后在37℃下干燥，并覆蓋如上所述的玻璃片。對(duì)每一個(gè)凹槽加載經(jīng)Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素(20微升)。隨后令該塑料載片于37℃下靜置2小時(shí)，進(jìn)而利用該TBST緩沖液沖洗4次，并利用二次蒸餾水輕洗4次。令經(jīng)處理的塑料載片于37℃下干燥，并利用激光掃描儀(GenePix4000，AXON)進(jìn)行掃描。該掃描的圖像如圖所示。
圖像上的綠色熒光斑點(diǎn)顯示在該人參樣品中存有至少一種活性成份，它能與B-TNFα結(jié)合。自圖像上所顯示的人參(Pana ginseng C.A.Meyer)樣品的顯影結(jié)果可知，僅有源自于圖1A的分級(jí)液60-72(其得自于韓國所栽種的人參粗干根的萃取液)的樣品顯示與B-TNFα結(jié)合的活性。該存在于上述的分級(jí)液60-72中具有與B-TNFα結(jié)合的活性的活性成份可能系一種人參皂苷(ginsenoside)，因?yàn)槿藚⒃碥帐侨藚⒅饕木呱锘钚缘幕衔?，且已顯示于鼠或人體的巨噬細(xì)胞中作為TNFα拮抗劑(參閱文獻(xiàn)Planta Med.2001 67213-218)。另外，源自于圖2B的分級(jí)液3-16(其系得自于三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的粗干根的萃取液)的樣品，亦顯示能與B-TNFα結(jié)合的活性。
表1

權(quán)利要求
1.一種確定草藥品質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括步驟利用高效液相層析(HPLC)分級(jí)草藥萃取液，得到草藥萃取液之分級(jí)樣品；將該草藥萃取液的分級(jí)樣品以微陣列方式加到已經(jīng)預(yù)先處理的涂層塑料載片上；和進(jìn)行雜交反應(yīng)及信號(hào)檢測(cè)以檢測(cè)出存在于該草藥中所需的生物活性成份。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在該方法中首先利用溶劑萃取所述草藥，所述溶劑選自水、C1-6醇、C1-6醚，或其組合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過HPLC所得到的草藥分級(jí)液呈均一相或非均一相。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述草藥分級(jí)液含有所述草藥的二級(jí)代謝物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該塑料載片具有2個(gè)凹槽且該分級(jí)樣品固定于該凹槽表面。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該塑料載片的材料是聚碳酸酯、或由1種或多種單體所制備的同聚物或共聚物，所述單體選自乙烯、鹵化乙烯、丙烯、鹵化丙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丁二烯、丙烯腈、降冰片烯或苯乙烯。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該塑料載片的材料是苯乙烯的聚合物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在涂覆所述塑料載片前，利用多官能團(tuán)醛和隨后浸沒于提供NH2基團(tuán)的前體溶液中以預(yù)先處理該塑料載片。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述多官能團(tuán)醛是戊二醛。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述提供NH2基團(tuán)的前體是NH4OH。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述涂層是由多官能團(tuán)分子所構(gòu)成的。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述多官能團(tuán)分子是在每1個(gè)末端含有至少1個(gè)環(huán)氧基的多官能團(tuán)環(huán)氧化物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，在該多官能團(tuán)環(huán)氧化物的一端的環(huán)氧基與該經(jīng)預(yù)先處理的塑料載片的表面上的胺基反應(yīng)。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，在該多官能團(tuán)環(huán)氧化物另一端的環(huán)氧基與草藥成份的自由羥基、巰基或胺基反應(yīng)。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，該多官能團(tuán)環(huán)氧化物含有6-24個(gè)碳原子長的化學(xué)鏈。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該草藥是人參。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，該人參栽種在不同的地區(qū)。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，該人參所含的所需的生物活性成份能夠與腫瘤壞死因子-α專一性結(jié)合。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法利用含有標(biāo)記探針的溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，該含有標(biāo)記探針的溶液呈均一相或非均一相。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，該標(biāo)記是染料或放射性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種確定草藥品質(zhì)的新穎方法，它包括利用生物芯片技術(shù)檢測(cè)出存在于草藥中所需的生物活性成份。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1459631SQ0212005
公開日2003年12月3日 申請(qǐng)日期2002年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者徐立偉, 張素真 申請(qǐng)人:先進(jìn)基因股份有限公司