專利名稱：用于微生物鑒定和分類的磁共振波譜分析的制作方法
參照相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2001年2月21日、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)枮镹o.60/270,367的專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及利用磁共振波譜分析和多因素分析對(duì)微生物如細(xì)菌和真菌進(jìn)行鑒定和分類。
在本申請(qǐng)的各個(gè)部分，各參考文獻(xiàn)在括號(hào)內(nèi)。在此，這些文獻(xiàn)的全文被并入本申請(qǐng)作為參考以更充分地描述與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)水平。這些文獻(xiàn)的書目可以在本申請(qǐng)的末尾、權(quán)利要求書之前找到。
微生物的微生物分類學(xué)分類包括通過(guò)如基于檢測(cè)微生物細(xì)胞的多種代謝物/化合物或分析遺傳物質(zhì)的特點(diǎn)將微生物分組。起源于被稱為祖先核糖體DNA基因(ancestral ribosomal DNA gene)的序列的“基因樹(shù)”，能將所有現(xiàn)存有機(jī)體區(qū)別到種(species)，有時(shí)候到單一株(strain)水平。如果將培養(yǎng)條件仔細(xì)地標(biāo)準(zhǔn)化，那么微生物的代謝物的模式(profile)也可以構(gòu)建數(shù)字算法和“樹(shù)”。在醫(yī)學(xué)方面，微生物病原體的鑒定容得臨床醫(yī)生去預(yù)測(cè)和開(kāi)始適當(dāng)?shù)闹委熞约疤峁┙o患者預(yù)后信息。
感染組織的部位混合了微生物細(xì)胞、宿主免疫細(xì)胞、和通常的感染部位的器官或組織的細(xì)胞。病理學(xué)的診斷傳統(tǒng)上是費(fèi)時(shí)和費(fèi)力的，依賴于組織病理學(xué)檢查以及通過(guò)形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)，或有時(shí)其他方法對(duì)微生物的鑒定。
在臨床和工業(yè)實(shí)驗(yàn)室兩者中，用于鑒定微生物的方法一直以來(lái)都根據(jù)多種表型特征，包括形態(tài)學(xué)特征和一組生化反應(yīng)。這些檢測(cè)在應(yīng)用上經(jīng)常是費(fèi)時(shí)和/或相當(dāng)昂貴的，以及有些是不精確的。最近，各種方法已經(jīng)被研究以打算發(fā)展一種特征性刻畫以及鑒定微生物的單一和快速的方法。這些方法包括傅立葉變換紅外線波譜法(Fouriertransform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIRS)(11)(14)，熱分解質(zhì)譜法(pyrolysis mass spectrometry，PyMS)(12)，電噴電離質(zhì)譜法(electrospray ionization mass spectrometry，EIMS)(7)，紫外線共振拉曼光譜學(xué)(UV resonance Raman spectroscopy，UVRRS)(15)，和蛋白電泳(16)。然而這些技術(shù)的報(bào)道只提示對(duì)某些微生物菌種有快速以及可靠鑒定的可能性，大多數(shù)測(cè)定了少量的數(shù)據(jù)組，以及除了FTIRS，它們都是用于分析細(xì)胞分解的產(chǎn)物的破壞性的技術(shù)。其共同的局限性是它們不能直接生成關(guān)于完整的活有機(jī)體的生物化學(xué)的信息。
相反的，活細(xì)胞的磁共振波譜分析(magnetic resonancespectroscopy，MRS)能提供大量的代謝物信息。最常見(jiàn)的MRS的生物應(yīng)用是利用該技術(shù)的無(wú)創(chuàng)的特點(diǎn)去研究活體系統(tǒng)中細(xì)胞的生物化學(xué)的方面(6)。
然而，不是所有MRS的應(yīng)用都要求或包括鑒定能產(chǎn)生MR波譜的代謝物。檢測(cè)與由演繹方法確定的因素(如病理狀態(tài))相關(guān)的總體波譜特征的模式識(shí)別技術(shù)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于組織和體液的MRS檢測(cè)。以對(duì)1H MR波譜數(shù)據(jù)的多因素分析為基礎(chǔ)的、用于對(duì)甲狀腺(21)，卵巢(23)、前列腺(9)、乳腺(13)和腦(20)的腫瘤進(jìn)行客觀性診斷的精確而可靠的分類器(classifier)已經(jīng)被發(fā)展并已得到驗(yàn)證。在一些病理情況下，MRS能在光鏡下看到形態(tài)學(xué)表現(xiàn)之前檢測(cè)到惡性病變。
新型隱球菌(C.neoformans)所引起的隱球菌病是一種對(duì)免疫抑制和健康宿主有著潛在致命的真菌病。新型隱球菌是真菌性腦膜炎(1)最常見(jiàn)的病因，以及局灶性的病變(隱球菌球)可以出現(xiàn)在肺和腦(2，3)。已經(jīng)由報(bào)道腦部隱球菌球最高可占澳大利亞隱球菌病患者的14％，這依賴于診斷時(shí)宿主的免疫狀態(tài)(4)。腦部病變通常在從組織或機(jī)體的其他部位的體液，或在腦脊液(CSF)中鑒定出新型隱球菌后才被診斷。
當(dāng)病變局限在腦部或缺乏其他的診斷材料，以及感染病變的病理不能被例如計(jì)算機(jī)斷層攝象(5)或磁共振成像(MRI)(6)等方法所區(qū)別時(shí)，腦活檢對(duì)于診斷是必需的。
質(zhì)子磁共振波譜分析(1H MRS)已經(jīng)被應(yīng)用于腫瘤、卒中和細(xì)菌感染(7-14)。以最初動(dòng)物模型的體外和體內(nèi)研究為基礎(chǔ)，對(duì)腦的體內(nèi)MRS檢測(cè)被發(fā)展并被廣泛地試驗(yàn)于人類腫瘤的診斷(7，9，13)。MRS檢測(cè)在人活體組織活檢中鑒定腫瘤病理有著非常高的敏感性和特異性(16-20)。
來(lái)自微生物和/或在宿主免疫反應(yīng)中新出現(xiàn)的細(xì)胞的MR可見(jiàn)化合物可以作為診斷和預(yù)后的標(biāo)記物。在隱球菌腦膜炎患者的CSF中鑒定出了新型隱球菌的細(xì)胞外糖和其他產(chǎn)物。能通過(guò)一種外在的多糖莢膜將新型隱球菌細(xì)胞從其他侵襲性的真菌病原體的細(xì)胞中區(qū)分出來(lái)，這種莢膜構(gòu)成了高比例的隱球菌生物量。純化的莢膜物質(zhì)已經(jīng)被1H和13C MRS所研究(22)。更多的最近的研究已經(jīng)利用MRS鑒定了體外培養(yǎng)的新型隱球菌的細(xì)胞外產(chǎn)物(23)。
致病性細(xì)菌和真菌一般通過(guò)它們的細(xì)胞形態(tài)和生化特征被鑒定和分類。傳統(tǒng)的方法通常是費(fèi)時(shí)的。當(dāng)要求一些生理學(xué)實(shí)驗(yàn)做出明確的鑒定時(shí)，對(duì)于酵母的一些菌種如念珠菌，其中只有很少的表型和化學(xué)型的差異存在，這些實(shí)驗(yàn)對(duì)于鑒定可能是困難的或甚至是失敗的。遺傳學(xué)方法是更準(zhǔn)確的但是需要大量的工作且價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種能夠鑒定各種微生物的統(tǒng)計(jì)學(xué)分類器，優(yōu)選地可達(dá)到物種群(species group)或種的水平。這里使用的名詞“微生物”意味著所有的顯微鏡下可見(jiàn)的有機(jī)體(也就是所有的單細(xì)胞或多細(xì)胞活體)包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒、原蟲和藻類。
根據(jù)本發(fā)明，微生物如細(xì)菌細(xì)胞懸液的一維1H MR波譜提供了含氫化合物的概貌。因此，相對(duì)于代表細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括固定的成分如細(xì)胞壁)而言，1H MR波譜更代表了細(xì)胞生理(代謝物池)。雖然許多不同的細(xì)菌物種群可以表達(dá)和利用完全相同的代謝途徑，但是當(dāng)不同的物種群生長(zhǎng)在相同的環(huán)境時(shí)，不同物種群中酶的不同水平的表達(dá)和活性能造成明顯不同水平的特定的代謝物。因此，提出代謝池大小的顯著不同能被測(cè)定為不同細(xì)菌物種群間1H MR波譜的差異。這在以往的選定細(xì)菌的1H MR波譜的對(duì)比研究中被提到，然而在該研究中只有少量的微生物被檢測(cè)且其所使用的定性的鑒定方法都不允許對(duì)物種群進(jìn)行自動(dòng)化和定量的比較。
根據(jù)本發(fā)明，利用線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)，對(duì)不同的微生物分離物如不同種的細(xì)菌的培養(yǎng)物進(jìn)行分析，能夠依據(jù)微生物的1H MR波譜，對(duì)細(xì)菌的種進(jìn)行可靠的、自動(dòng)化的鑒定。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種通過(guò)聯(lián)合質(zhì)子磁共振波譜法(1H MRS)和多因素統(tǒng)計(jì)分析來(lái)鑒定微生物、細(xì)菌的新的指紋技術(shù)。這使得對(duì)于常見(jiàn)的屬于細(xì)菌的臨床微生物，已經(jīng)形成了一種有效的鑒定策略，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和米氏鏈球菌(Streptococcus milleri)物種群。利用1H MRS檢測(cè)了總計(jì)104份不同的分離物的312份培養(yǎng)物。應(yīng)用步步為營(yíng)法(bootstrapping process)和LDA發(fā)展出了優(yōu)化的分離器，以提供波譜的客觀性分類。微生物的鑒定依據(jù)于對(duì)來(lái)自雙份培養(yǎng)物的波譜的分類，并獲得了與傳統(tǒng)鑒定方法94％的一致。被不正確地鑒定的微生物少于1％。剩下的5％的微生物的鑒定被認(rèn)為是不確定的(indeterminate)。檢測(cè)了少量鉛黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)和鶉雞腸球菌(E.gallinarum)的分離菌，并能與糞腸球菌區(qū)分，有著與傳統(tǒng)鑒定方法96％的一致。
根據(jù)本發(fā)明，MRS能識(shí)別出能鑒別和區(qū)分微生物的代謝物。當(dāng)聯(lián)合于LDA，MRS能鑒定屬于不同屬的致病細(xì)菌的種(65)。根據(jù)本發(fā)明，MRS和能夠鑒定致病微生物的LDA是分類學(xué)上緊密相關(guān)的，如Bourne等所描述的(63)。例如，根據(jù)本發(fā)明能鑒定出五種致病念珠菌屬和兩個(gè)致病酵母屬新型隱球菌的變種(gattii變種和新型變種)。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種通過(guò)取得統(tǒng)計(jì)學(xué)分類器將未知微生物菌種分類進(jìn)已知種的方法，包括(a)獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)在獲得的磁共振波譜中找出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)；和(c)選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分來(lái)交叉確認(rèn)波譜，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜，該系數(shù)和分類器波譜能被用于確定未知微生物的菌種。
根據(jù)發(fā)明的另一方面，提供了一種確定未知微生物的菌種的方法，包括獲得未知微生物菌種的磁共振波譜，以及獲得的波譜與菌種分類器進(jìn)行比較，該分類器已經(jīng)通過(guò)以下步驟而獲得(a)獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)在獲得的磁共振波譜中找出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)；和(c)選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分來(lái)交叉確認(rèn)波譜，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)微生物菌種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜。并選擇與未知微生物菌種的波譜最接近的波譜的微生物作為未知微生物菌種。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種通過(guò)取得統(tǒng)計(jì)學(xué)分類器將未知微生物菌種分類進(jìn)已知種的方法，包括(a)獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)在獲得的磁共振波譜中找出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)；和(c)選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分來(lái)交叉確認(rèn)波譜，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜，該系數(shù)和分類器波譜能被用于確定未知微生物的菌種。


圖1A顯示了糞腸球菌、米氏鏈球菌、肺炎鏈球菌和釀膿鏈球菌的代表性的1HMR波譜。參照表3，大多數(shù)代謝物的一致造成波譜中每個(gè)重合區(qū)域。
圖1B顯示了表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳葡萄球菌的代表性的1HMR波譜。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌波譜中強(qiáng)的甜菜堿(betaine)峰和無(wú)乳葡萄球菌的GPC峰已經(jīng)被縮短以顯示較弱峰的細(xì)節(jié)。圖2中可以看到甜菜堿和GPC峰的相對(duì)強(qiáng)度。參照表3，大多數(shù)代謝物的一致造成波譜中每個(gè)重合區(qū)域。
圖2A和2B顯示了每個(gè)物種群的測(cè)定的重合強(qiáng)度的范圍，線條表示為平均±SD。
圖3顯示體外細(xì)胞體系的1HMR波譜A)新型隱球菌，B)白色念珠菌(Candida albicans)，C)煙曲菌(Aspergillus fumigatus)，D)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和E)C6細(xì)胞株。共振識(shí)別AA，氨基酸；ac，乙酸；CH，非特異性碳水化合物共振；lip，脂類；NCH，源自肌酸，GABA，賴氨酸殘基；N(CH3)3，源自含膽堿化合物(膽堿，PC，GPC)，甜菜堿和氨基乙磺酸；海藻糖，a，a-海藻糖(a，a-trehalose)。注意新型隱球菌波譜中的顯著的海藻糖共振，這沒(méi)有在其他的波譜中發(fā)現(xiàn)。
圖4顯示鼠腦組織樣本的1D和2D COSY MR波譜(a)對(duì)照腦組織，(b)新型隱球菌感染的腦組織，以及(c)膠質(zhì)瘤組織。共振識(shí)別A-G，甘油三酯共振(32)，AA，氨基酸殘基；ac，乙酸；ala，丙氨酸；chol，膽堿；EA，氨基乙醇；eth，乙醇；GABA，γ-氨基丁酸；glu/gln，谷氨酸/谷氨酰胺；GPC，甘油磷酸膽堿；h-tau，亞?；撬?；ile，異亮氨酸；lac，乳酸；leu，亮氨酸；lip，脂類；lys，賴氨酸；mI，內(nèi)消旋肌醇；NAA，N-乙酰天冬氨酸；NCHn，來(lái)自肌酸，磷酸肌酸，GABA，賴氨酸；N(CH3)3，來(lái)自含膽堿化合物(膽堿，PC，gPC)，甜菜堿和氨基乙磺酸PC，磷酸膽堿；PE，磷酸乙醇胺；tau，氨基乙磺酸；thr，蘇氨酸；tre，海藻糖；val，纈氨酸。列舉的氨基酸指的是氨基酸殘基，未必是各自游離的氨基酸；以及圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)系統(tǒng)的組方圖。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種通過(guò)取得統(tǒng)計(jì)學(xué)分類器將未知微生物菌種分類進(jìn)已知種的方法，包括(a)獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)在獲得的磁共振波譜中找出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)；和(c)選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分來(lái)交叉確認(rèn)波譜，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜，該系數(shù)和波譜能被用于確定未知微生物的菌種。
本發(fā)明的方法優(yōu)選地的進(jìn)一步包括將步驟(c)重復(fù)多次的步驟，每次選擇該種的波譜的不同部分作為波譜的第一部分，以獲得該種的一組不同的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)，并獲得這些線性判別分析系數(shù)的加權(quán)平均數(shù)以獲得最終的分類器波譜。交叉確認(rèn)波譜的步驟優(yōu)選地包括隨機(jī)地選擇波譜的一半對(duì)波譜進(jìn)行交叉確認(rèn)。將步驟(c)重復(fù)多次的步驟優(yōu)選地包括重復(fù)步驟(c)約1000次。
本發(fā)明的方法優(yōu)選地包括獨(dú)立地獲得多個(gè)分類器波譜的步驟，以及匯總這些獨(dú)立的分類器的結(jié)果以獲得一致的診斷。
微生物可以包括細(xì)菌，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌等菌種。微生物可以包括真菌，包括致病酵母如白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯念珠菌、平滑念珠菌、以及新型與gattii的隱球菌變種。這些微生物可以包括培養(yǎng)的細(xì)菌感染物和/或來(lái)自有著細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物的標(biāo)本。
每個(gè)不同種的磁共振波譜的數(shù)目?jī)?yōu)選為至少10個(gè)，且可以是至少30個(gè)。
根據(jù)發(fā)明的另一方面，提供了一種確定未知微生物的菌種的方法，包括獲得未知微生物菌種的磁共振波譜，以及獲得的波譜與菌種分類器進(jìn)行比較，上述分類器已經(jīng)通過(guò)以下步驟而獲得(a)獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)在獲得的磁共振波譜中找出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)；和(c)選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分來(lái)交叉確認(rèn)波譜，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜，并選擇與未知微生物菌種的波譜最接近的波譜的微生物作為未知微生物菌種。
本發(fā)明的方法優(yōu)選地進(jìn)一步包括將步驟(c)重復(fù)多次的步驟，每次選擇該種的波譜的不同部分作為波譜的第一部分，以獲得該種的一組不同的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)，并獲得這些線性判別分析系數(shù)的加權(quán)平均數(shù)以獲得最終的分類器波譜。交叉確認(rèn)波譜的步驟優(yōu)選地包括隨機(jī)地選擇波譜的一半對(duì)波譜進(jìn)行交叉確認(rèn)。將步驟(c)重復(fù)多次的步驟優(yōu)選的包括重復(fù)步驟(c)約1000次。方法優(yōu)選的包括獨(dú)立地獲得多個(gè)分類器波譜的步驟，以及匯總這些獨(dú)立的分類器的結(jié)果以獲得一致的診斷。
微生物可以包括細(xì)菌，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌等菌種。
微生物可以包括真菌，包括致病酵母如白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯念珠菌、平滑念珠菌以及新型與gattii的隱球菌變種。這些微生物可以包括培養(yǎng)的細(xì)菌感染物，和/或來(lái)自有著細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物的標(biāo)本。
每個(gè)不同種的磁共振波譜的數(shù)目?jī)?yōu)選為至少10個(gè)，且可以是至少30個(gè)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種將未知微生物菌種分類進(jìn)已知種的統(tǒng)計(jì)學(xué)分類器，包括(a)用于獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜的波譜儀，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)定位器，用于在獲得的磁共振波譜中定位出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)；和(c)交叉確認(rèn)器，用于通過(guò)以下步驟交叉確認(rèn)波譜選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜，該系數(shù)和分類器波譜能被用于確定未知微生物的菌種。
本發(fā)明的交叉確認(rèn)器優(yōu)選地將步驟(c)重復(fù)多次，每次選擇微生物菌種的波譜的不同部分作為波譜的第一部分，以獲得微生物菌種的一組不同的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)，并獲得這些線性判別分析系數(shù)的加權(quán)平均數(shù)以獲得最終的分類器波譜。交叉確認(rèn)器優(yōu)選地通過(guò)隨機(jī)地選擇波譜的一半對(duì)波譜進(jìn)行交叉確認(rèn)。分類器優(yōu)選地將步驟重復(fù)(c)約1000次。分類器優(yōu)選地獨(dú)立地獲得多個(gè)分類器波譜，以及匯總這些獨(dú)立的分類器的結(jié)果以獲得一致的診斷。
微生物可以包括細(xì)菌，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌等菌種。
微生物可以包括真菌，包括致病酵母如白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯念珠菌、平滑念珠菌，以及新型與gattii的隱球菌變種。這些微生物可以包括培養(yǎng)的細(xì)菌感染物和/或來(lái)自有著細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物的標(biāo)本。
每個(gè)不同種的磁共振波譜的數(shù)目?jī)?yōu)選為至少10個(gè)，且可以是至少30個(gè)。
以下將描述若干鑒定不同類型的微生物(具體為不同的細(xì)菌和真菌)的實(shí)施例。然而，本發(fā)明不限定于實(shí)施例中的細(xì)菌和真菌菌種，而是能被應(yīng)用于任何微生物使之能通過(guò)這里闡述的方法被鑒定。
實(shí)施例1細(xì)菌檢測(cè)1.細(xì)菌的儲(chǔ)存和培養(yǎng)分離物是來(lái)自悉尼臨床病理和醫(yī)學(xué)研究所的感染疾病和微生物學(xué)中心(CIDM)以及美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏菌，或是來(lái)自CIDM實(shí)驗(yàn)室服務(wù)處的臨床鑒定實(shí)驗(yàn)室最近的臨床分離菌。儲(chǔ)存菌于-70℃懸浮在10％甘油的營(yíng)養(yǎng)肉湯中。將無(wú)菌的馬血加到高壓滅菌的血瓊脂培養(yǎng)基(Oxoid(英國(guó))或Amyl Media(澳大利亞))中制成馬血瓊脂(HBA)。將從儲(chǔ)存菌中還原的菌傳代接種在5％馬血瓊脂上，并在37℃，5％ CO2條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)。新生長(zhǎng)的菌和儲(chǔ)存后傳代接種在HBA上的菌被接種在雙份的HBA培養(yǎng)皿上，并在37℃下培養(yǎng)18-24小時(shí)，然后在進(jìn)行波譜檢測(cè)前于室溫下(20-30℃)儲(chǔ)存3-9小時(shí)。
為了測(cè)定短期方法的變異性，檢測(cè)了所有被檢測(cè)的菌株的雙份培養(yǎng)。為了測(cè)定長(zhǎng)期培養(yǎng)和方法的變異性，多種菌株在8個(gè)月時(shí)間內(nèi)被反復(fù)培養(yǎng)7次。分析包括的是3個(gè)鶉雞腸球菌和3個(gè)鉛黃腸球菌的波譜，它們是與鉛黃腸球菌和糞腸球菌緊密相關(guān)的(10)(表1)。每個(gè)物種群中被測(cè)定的不同的菌株數(shù)目和菌株被培養(yǎng)以及檢測(cè)的次數(shù)都可以從表1中得到。
2.細(xì)菌的傳統(tǒng)鑒定鑒定金黃色葡萄球菌依據(jù)于陽(yáng)性的凝固酶(用兔或人血漿)和脫氧核糖核酸酶實(shí)驗(yàn)。利用API ID32 staph試驗(yàn)(葡萄球菌試驗(yàn))(BioMerieux，法國(guó))鑒定表皮葡萄球菌。鏈球菌和腸球菌的鑒定是通過(guò)傳統(tǒng)方法——雙乙奎丁敏感性(肺炎鏈球菌)、鹽耐受性和膽汁七葉苷瓊脂(bile-esculin)陽(yáng)性(腸球菌屬)、乳膠凝集(無(wú)乳鏈球菌)、以及A PI ID32 staph試驗(yàn)(BioMerieux，法國(guó))。所有的試驗(yàn)都按廠家說(shuō)明書實(shí)施。通常，菌株在儲(chǔ)存之前僅在微生物實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)被鑒定一次。一些還原于儲(chǔ)存菌的菌株通過(guò)傳統(tǒng)方法被重新鑒定。
3.1H MR波譜法用塑料接種環(huán)將細(xì)菌菌落(濕重2-200mg)從HBA培養(yǎng)皿中輕輕地取出并通過(guò)渦旋震蕩懸浮在0.3ml含有D2O的磷酸緩沖液(pH7.2，室溫)(PBS/D2O)中。對(duì)于大部分培養(yǎng)，從培養(yǎng)皿中刮走了多于80％的細(xì)胞。對(duì)于生長(zhǎng)旺盛的培養(yǎng)，小于10％的細(xì)胞被收集，通常都取自第一象限。懸浮液被馬上轉(zhuǎn)移到一與5mm敏感度相匹配的MR樣本管(Sigma，美國(guó))。利用裝配有1H/13C探頭的Bruker Avance360MHz MR波譜儀在37℃進(jìn)行1H MRS檢測(cè)。采集1D波譜，其采集參數(shù)如下頻率360.13MHz，脈沖角90°(6-7ms)，重復(fù)時(shí)間ls，8k數(shù)據(jù)點(diǎn)，256或512過(guò)渡，波譜寬度3600Hz，總的采集時(shí)間10或20分鐘。范圍鎖定于D2O。選擇性激發(fā)野梯度法(DPFGSE，(3))進(jìn)行水的校正抑制。懸浮在PBS/D2O的細(xì)胞的波譜在37℃下至少穩(wěn)定2小時(shí)。
4.信號(hào)分配采集每個(gè)種中至少兩種分離物的二維同核和異核相關(guān)波譜以分配1D MR共振信號(hào)到特定的化合物。按幅值模式(magnitude-mode)進(jìn)行{1H，1H}梯度COSY試驗(yàn)。采集參數(shù)為t2相掃描寬度為3600赫茲，t2時(shí)間域?yàn)?K，每32或48采集的256倍增量，重復(fù)時(shí)間為ls。t1相應(yīng)用正弦鐘窗函數(shù)，和t2相應(yīng)用Gaussian-Lorentzian窗函數(shù)。利用零充盈將數(shù)據(jù)矩陣擴(kuò)展到1K。采集的TOCSY波譜具有40ms與150ms的混合時(shí)相以及2K數(shù)據(jù)點(diǎn)和32采集的256倍增量(1)。利用梯度HSQC脈沖程序獲得1H檢測(cè)模式下的{1H，13C}單鍵變換相關(guān)波譜(one-bond shift correlation spectra)(24)。1H MR波譜寬度為3600赫茲，而13C MR波譜寬度為15000赫茲。通過(guò)GARP-1完成采集過(guò)程中13C MR的解偶合(18)。40-64次采集的每次的演變時(shí)間(t)被增量以獲得400 FIDs以及包括2K數(shù)據(jù)點(diǎn)。重復(fù)時(shí)間為ls。t2相應(yīng)用正弦鐘函數(shù)，而t1相應(yīng)用Gaussian-Lorentzian函數(shù)。t1相在傅立葉轉(zhuǎn)換之前應(yīng)用1K的零充盈。利用與HSQC試驗(yàn)中除了13C MR波譜寬度為20KHz外均相同的參數(shù)采集{1H，13C}梯度異源核多鍵相關(guān)波譜(Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectra，HMBC)(24)。單鍵和長(zhǎng)程的相關(guān)試驗(yàn)通常分別被優(yōu)化為140赫茲的1JC，H以及7赫茲的nJC，H。在2D試驗(yàn)之前和之后采集一維1H MR波譜以確認(rèn)無(wú)代謝物的改變存在。
5.數(shù)據(jù)處理利用Bruker XWINNMR波譜儀軟件處理波譜。用零充盈將自由感應(yīng)衰減數(shù)據(jù)集擴(kuò)展到16K。在傅立葉轉(zhuǎn)換之前應(yīng)用指數(shù)窗函數(shù)以生成一1赫茲的線性擴(kuò)展。通過(guò)將波譜中心設(shè)定為4.64兆比率來(lái)進(jìn)行化學(xué)變換校正(在37℃的PBS/D2O中水共振相對(duì)于四甲基硅烷(tetramethylsilane)的額定位點(diǎn))。手動(dòng)將波譜校對(duì)到獲得一直線和平直的基線。
以代表性波譜(圖1)中出現(xiàn)的主峰為基礎(chǔ)主觀地選擇十六個(gè)連續(xù)的固定的重合區(qū)。個(gè)體的積分被標(biāo)準(zhǔn)化到16個(gè)積分的總和，為4.0和0.75兆比率之間。
6.線性判別分析積分表從微軟的Excel輸入到STATISTICA(StaSofi Pacific P/L，澳大利亞)以進(jìn)行LDA。每個(gè)16個(gè)被選擇的重合區(qū)的頭15個(gè)區(qū)(見(jiàn)結(jié)果)在LDA中都形成一個(gè)獨(dú)立的變量(標(biāo)準(zhǔn)方法，7組，容限0.01，相稱于組大小的推算的分類概率)。第16個(gè)區(qū)被刪除，因?yàn)閷?duì)于標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)集的判別分析有一個(gè)區(qū)是多余的。用STATISTICA計(jì)算分類函數(shù)和分類概率。
7.波譜分類和分離物鑒定這里使用的是以下的定義。術(shù)語(yǔ)分類(classification)指的是將細(xì)菌培養(yǎng)物的個(gè)體化波譜分配到物種群中。鑒定(identification)指的是將分離物分配到物種群中(以兩次重復(fù)菌株培養(yǎng)物的兩個(gè)獨(dú)立波譜的分類為基礎(chǔ))。正確分類(Correct classification)指的是將波譜分配到與傳統(tǒng)分類相同的物種群的分類概率大于75％。錯(cuò)誤分類(Misclassification)指的是將波譜分配到與傳統(tǒng)分類不同的物種群的分類概率大于75％。不確定分類(Indeterminate classification)指的是將波譜分配到任何物種群的分類概率小于等于75％。正確鑒定(Correct identification)指的是兩次重復(fù)培養(yǎng)物的波譜的分配與傳統(tǒng)鑒定一致，且平均分類概率百分比大于75％。錯(cuò)誤鑒定(Misidentification)指的是將兩次重復(fù)培養(yǎng)物的波譜分配到了相同的但不同于傳統(tǒng)鑒定的物種群，且平均分類概率百分比大于75％。不確定鑒定(Indeterminate identification)為將兩次重復(fù)培養(yǎng)物的波譜分配到了不同的組，或者相同的組但平均分類概率小于75％。
以Somorjai等(19)，(2)的穩(wěn)定引導(dǎo)程序(RBS)方法為基礎(chǔ)建立了對(duì)于所有7個(gè)物種群的優(yōu)化的分類器。開(kāi)始于所有的312個(gè)波譜，半數(shù)的波譜從每個(gè)物種群中隨機(jī)挑選，以及該訓(xùn)練組(training set)用于訓(xùn)練7組分類器(LDA)。得到的分類器然后被用于確認(rèn)剩下的波譜(測(cè)試組)。這個(gè)過(guò)程被重復(fù)B次(可以更改)，以及保存每次有效的LDA系數(shù)。加權(quán)平均這些B組的LDA系數(shù)形成最終的系數(shù)(B＝1000)。對(duì)于第m組的權(quán)數(shù)為Wm＝KmCm1/2，m＝1，....，B，其中0＜Cm＜1是crispness(定義為測(cè)試樣本的該部分被分配到某組的概率百分比為75％)，以及0＜Km＜1是Cohen一致性概率校正測(cè)量(Cohen′s chance-corrected measure of agreement)(4)，Km＝1意味著測(cè)試組的理想分類。權(quán)數(shù)Wm中應(yīng)用的B值不是那些引導(dǎo)程序訓(xùn)練組中獲得的，而是較少的理想的測(cè)試組中獲得的。有效的分類器用于鑒定所有的312個(gè)物種群。分類器的結(jié)果報(bào)告為分類概率百分比。
對(duì)于單獨(dú)的腸球菌的分類，以3個(gè)腸球菌種的62個(gè)波譜的RBS為基礎(chǔ)發(fā)展出了優(yōu)化的分類器(B＝200，LDA參數(shù)見(jiàn)上)。用STATISTICA，微軟EXCEL和微軟VISUAL BASIC forAPPLICATIONS(VBA)書寫RBS分類軟件，而且運(yùn)行在以奔騰為基礎(chǔ)的個(gè)人電腦。
8.1H MR波譜結(jié)果圖1顯示了7個(gè)物種群的每個(gè)物種群的代表性的波譜和選擇用于分析的16個(gè)重合區(qū)(integration region)。顯示了可獲得的ATCC型菌株的波譜，另外顯示了每個(gè)分離物相鄰于所有波譜的組的圖心(根據(jù)重合強(qiáng)度)的波譜。表3列舉了對(duì)于每個(gè)重合區(qū)鑒定最有價(jià)值的和用于統(tǒng)計(jì)分析的代謝物。
盡管不可能去顯示每個(gè)物種群中被測(cè)定的30-60個(gè)波譜中建立的波譜模式范圍，但圖2顯示了每個(gè)物種群測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化的重合強(qiáng)度(平均±SD)的范圍。
9.波譜分類和分離物鑒定表1顯示了根據(jù)優(yōu)化分類器對(duì)7個(gè)物種群的312個(gè)波譜的分類以及對(duì)104種分離物的鑒定的結(jié)果。表2顯示了實(shí)施分類和鑒定結(jié)果的摘要。小于2％的波譜被錯(cuò)誤地分類，而小于1％的分離物被錯(cuò)誤地鑒定。13個(gè)波譜被不確定分類。被不確定鑒定的9種分離物中有5種在不同日期的之后或之前的培養(yǎng)中被正確鑒定(剩下的4種沒(méi)有被保存在儲(chǔ)存庫(kù)中而不能被重新測(cè)試)。
表4顯示了計(jì)劃從糞腸球菌中分別分類出3種鉛黃腸球菌和3種鶉雞腸球菌的14個(gè)波譜的結(jié)果。雖然只檢測(cè)了少量的分離物，但是這些結(jié)果提示從從糞腸球菌中分別正確地分類出鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌是可能的。
10.波譜的可重復(fù)性對(duì)同時(shí)的、重復(fù)的培養(yǎng)物的以及1-8個(gè)月時(shí)間內(nèi)反復(fù)還原自儲(chǔ)存的分離物的獨(dú)立的波譜分析，確信了該分類方法是穩(wěn)定的，且不受各種因素如培養(yǎng)條件、微生物數(shù)目或分離物儲(chǔ)存條件等微小變化造成的短期或長(zhǎng)期程序上的變異性的影響。
11.討論a.1H MRS和多因素分析的獨(dú)立變量的選擇如圖1所見(jiàn)，很容易觀察一些菌種的典型的波譜之間可見(jiàn)的差異。然而，菌種如釀膿鏈球菌和肺炎鏈球菌的波譜之間的差異肉眼觀察是不明顯的，類似物種群間的可靠區(qū)分只可能依賴于數(shù)據(jù)的多因素分析。這種分析中的初始步驟是從包含有數(shù)千個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的波譜中提取出一組易控制的獨(dú)立變量，這些變量表現(xiàn)出任何組間顯著的差異。雖然選擇最佳的判別波譜區(qū)有著成熟的方法(21)，但是如圖1描述的，簡(jiǎn)單的劃分是將挑選的所有波譜按波譜上出現(xiàn)的高峰分為16個(gè)肉眼可見(jiàn)的連續(xù)的區(qū)域。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是如果能確定形成每個(gè)重合區(qū)中信號(hào)的代謝物，那么這些獨(dú)立變量的組合可能指向一特征性的生化意義(也就是，一個(gè)獨(dú)立的變量可能于特定的代謝物或代謝物的組合相關(guān))。盡管表3確定了形成圖1的波譜的一些主要代謝物，但是這里應(yīng)用的細(xì)菌鑒定方法不依賴于對(duì)形成MR信號(hào)的代謝物的識(shí)別或定量。然而，重要的是認(rèn)識(shí)到分類依據(jù)的測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的特征在實(shí)質(zhì)上是與常規(guī)鑒定中檢測(cè)的特征是不同的，與通過(guò)其他完整有機(jī)體指紋技術(shù)測(cè)定的特征也是不同的。
b.分類和鑒定策略依據(jù)LDA的分類要求源自訓(xùn)練組數(shù)據(jù)的LDA的一組函數(shù)能被用于分類測(cè)試組的數(shù)據(jù)，測(cè)試組優(yōu)選的是獨(dú)立于訓(xùn)練組(交叉確認(rèn))。訓(xùn)練組的功能是以源自MR波譜的n個(gè)獨(dú)立變量的形式說(shuō)明n維數(shù)據(jù)空間范圍對(duì)應(yīng)于每個(gè)演繹定義的組。如果訓(xùn)練組中定義的組在數(shù)據(jù)空間被很好地分開(kāi)，那么LDA將訓(xùn)練能把每個(gè)訓(xùn)練組的組分設(shè)定到它的演繹定義的組的分類函數(shù)。與特定的組，特定物種群的成員間的表型差別，以及也與相關(guān)于一物種群的一特定成員的重復(fù)培養(yǎng)和分類的程序(環(huán)境，生化和方法學(xué))差異相關(guān)的數(shù)據(jù)空間的范圍將增加。僅僅包括一特定物種群的少數(shù)隨機(jī)選擇的成員的訓(xùn)練組因此不大可能精確地代表被物種群的所有成員所占據(jù)的數(shù)據(jù)空間(表型范圍)。如果訓(xùn)練組僅僅包含每個(gè)分離物的單次測(cè)定，那么它也可能是不能說(shuō)明程序變異性。因此，預(yù)計(jì)當(dāng)建立于某一物種群的訓(xùn)練亞群的分類函數(shù)用于分類非訓(xùn)練組成員的組的成員時(shí)，將發(fā)生一些錯(cuò)誤分類。
分類器的穩(wěn)定性和可靠性要求訓(xùn)練組中的每個(gè)物種群的波譜的數(shù)目是獨(dú)立變量數(shù)目的5-10倍以上(19)。如此大的數(shù)據(jù)組是少見(jiàn)的，采集通常是困難的，尤其是如果生成的分類器被用于確認(rèn)獨(dú)立于訓(xùn)練組的測(cè)試組。穩(wěn)定引導(dǎo)程序方法通過(guò)允許依據(jù)所有獲得的數(shù)據(jù)建立交叉確認(rèn)分類器來(lái)部分解決這個(gè)問(wèn)題(19)。
對(duì)于某一特定臨床菌株的雙重或甚至三重培養(yǎng)的制備以及檢測(cè)，如這里所使用的，具有的優(yōu)點(diǎn)是能根據(jù)多個(gè)獨(dú)立變量分析獲得對(duì)分離物的一致的鑒定。這種分離物鑒定策略的特點(diǎn)在其他的微生物的完整有機(jī)體的指紋研究中沒(méi)有使用過(guò)(5，8)，那些研究最多僅僅使用雙重設(shè)置。在少數(shù)情況下，雙重培養(yǎng)可以被錯(cuò)誤地鑒定為不同的菌種。因此，依據(jù)對(duì)分離物單次亞培養(yǎng)分析的鑒定不能達(dá)到與依據(jù)獨(dú)立的雙重培養(yǎng)分類的鑒定相同的可信度。應(yīng)用傳統(tǒng)的方法報(bào)道的鑒定概率是依據(jù)于對(duì)分離物單次培養(yǎng)的分析，實(shí)踐中通常的方法是對(duì)鑒定概率為小于75％的分離物進(jìn)行重新鑒定。分析將被重復(fù)直到一單次測(cè)定得到的鑒定概率大于75％。通過(guò)本方法，對(duì)一分離物的所有實(shí)驗(yàn)的平均鑒定概率可以得到小于75％的測(cè)試結(jié)論。本方法總是測(cè)試雙重培養(yǎng)物并要求正確鑒定基于大于75％的平均概率，其具有更嚴(yán)格的和可靠的鑒定約束。在應(yīng)用(臨床實(shí)驗(yàn)室)方面，雙重測(cè)試作為一個(gè)常規(guī)方法，雙重測(cè)定指向物種群的差異應(yīng)該被認(rèn)為是對(duì)系統(tǒng)誤差的提示，以及這些分離物應(yīng)當(dāng)被補(bǔ)充方法重新測(cè)試或者檢查。
通過(guò)對(duì)每個(gè)物種群中至少11個(gè)分離物的檢測(cè)來(lái)確定物種群內(nèi)的表型變異。使用的分類方法的總的成就說(shuō)明物種群之間具有比方法或表型決定的種內(nèi)變異的標(biāo)準(zhǔn)范圍更大的顯著的且并立的波譜差異。
c.分類和鑒定結(jié)果對(duì)波譜非常少的錯(cuò)誤分類不能歸結(jié)于方法的任何特定的步驟。通過(guò)對(duì)所有分離物雙重培養(yǎng)的波譜進(jìn)行獨(dú)立分析，以及在最初培養(yǎng)和波譜測(cè)定的8個(gè)月后對(duì)25個(gè)分離物的波譜重新培養(yǎng)和分類可以排除短或長(zhǎng)時(shí)間的方法變異(使用不同批次的培養(yǎng)基，儲(chǔ)存的分離物等)造成的可重復(fù)性的潛在問(wèn)題。錯(cuò)誤鑒定的單個(gè)實(shí)施例(釀膿鏈球菌Lab.No.2212985)可能是污染的結(jié)果。對(duì)相同菌株的先前和隨后的測(cè)定都得到了正確的鑒定結(jié)果。這里應(yīng)用的方法有一些特點(diǎn)指出了鑒定的穩(wěn)定性。
首先，樣本的生長(zhǎng)條件不是嚴(yán)格控制的。例如，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的精確的組分在批次之間可能是不同的(使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)自馬血的兩個(gè)不同生產(chǎn)商以及多個(gè)批次)。接種物的大小在各培養(yǎng)皿之間可能是不同的。瓊脂皿上細(xì)菌的生長(zhǎng)必然是不均衡的，因?yàn)閾頂D生長(zhǎng)以及氧氣和其他營(yíng)養(yǎng)緩慢通過(guò)菌落和瓊脂。對(duì)所有菌株三重培養(yǎng)的早期實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在單一批次的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞的波譜缺少變異。因?yàn)榉N間在HBA培養(yǎng)皿上過(guò)夜生長(zhǎng)獲得的數(shù)目上有著很大的差異(米氏鏈球菌的生長(zhǎng)通常是很差的)，所以懸浮的細(xì)胞的濕重從2-200mg不等。當(dāng)MR信號(hào)直接地對(duì)應(yīng)于樣本濃度，貧瘠的細(xì)菌生長(zhǎng)只要求一擴(kuò)展數(shù)目的過(guò)渡以獲得一個(gè)適當(dāng)?shù)男盘?hào)干擾比。如實(shí)踐時(shí)，在波譜處理的相校正和重合步驟中，要求一些操作者主觀地輸入。方法中的這些差異將在數(shù)據(jù)中引進(jìn)一些額外的變異。利用幅值波譜和自動(dòng)化重合可以克服這些問(wèn)題(23)。其他的完整有機(jī)體的指紋技術(shù)要求對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的嚴(yán)格控制以及對(duì)對(duì)照培養(yǎng)物的反復(fù)標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定(12)，(11)。
檢測(cè)米氏鏈球菌組中有效數(shù)目的分離物以打算依據(jù)MRS將分離物指向到米氏鏈球菌組中三個(gè)菌種中的一種(咽峽鏈球菌、星座鏈球菌、中間鏈球菌)。然而，結(jié)果說(shuō)明這個(gè)組相比較于測(cè)定的七個(gè)物種群的多樣性是生理學(xué)同源的。相同的，比較于測(cè)定的鏈球菌和葡萄球菌種，所測(cè)定的鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌分離物在生理學(xué)上與糞腸球菌更相似。
d.生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇在選擇臨床診斷或相關(guān)實(shí)驗(yàn)室使用的最適合的培養(yǎng)基上，常用的生長(zhǎng)底物和樣本制作的容易性是最重要的。既然HBA是診斷性微生物實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基，以及很容易從HBA培養(yǎng)皿上收集到細(xì)菌細(xì)胞且不需要洗滌，因此該生長(zhǎng)培養(yǎng)基被選定為最符合目的的培養(yǎng)基。
這里獲得的波譜與發(fā)表的生長(zhǎng)在胰胨豆胨羊血瓊脂上的金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的波譜有著很大的差別(5)。在后者的研究中，據(jù)說(shuō)波譜的解釋不受選擇的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的影響，可能是因?yàn)槿庋圩R(shí)別以及用峰的位置而不是峰的強(qiáng)度來(lái)區(qū)分波譜模式。由于代謝物池大小的改變，造成生長(zhǎng)于不同的培養(yǎng)基(HBA對(duì)照于腦心浸液培養(yǎng)基)對(duì)于相對(duì)峰強(qiáng)度的影響比對(duì)峰位置的影響更顯著，而一些因素如細(xì)胞內(nèi)pH值可能只輕微地影響相對(duì)峰強(qiáng)度。
e.臨床應(yīng)用盡管只是依據(jù)一組局限的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，但結(jié)果說(shuō)明對(duì)完整細(xì)胞的1H MR波譜的測(cè)定對(duì)于現(xiàn)有的、自動(dòng)化的菌種鑒定方法是比較精確和準(zhǔn)確的。上述方法包括常用的實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)如VITEK(22)。方法的無(wú)創(chuàng)特性使得能夠在分析后保存活有機(jī)體以便以后進(jìn)行對(duì)污染或方法錯(cuò)誤的檢測(cè)。
使用比這里應(yīng)用的更成熟的模式識(shí)別方法(19)可以進(jìn)一步地提高判別力并允許在物種群內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立分類，盡管可能使生化信息的解釋更為復(fù)雜。因?yàn)樵搼?yīng)用針對(duì)于鑒定而不是特征性的描述，這將是可接受的讓步。樣本制備機(jī)器簡(jiǎn)單，生化信息的結(jié)果，快速的自動(dòng)化的鑒定，以及方法的穩(wěn)定性對(duì)于臨床和工業(yè)應(yīng)用都是有誘惑力的。事實(shí)上，這對(duì)于那些相對(duì)生長(zhǎng)緩慢或傳統(tǒng)方法難以鑒定的細(xì)菌菌種是最有價(jià)值的。
在此所描述的方法是簡(jiǎn)單的，快速的，可靠的，和有信息量的。其是可靠的，因?yàn)殍b定的結(jié)果是依據(jù)于對(duì)獨(dú)立培養(yǎng)和分析的雙重實(shí)驗(yàn)的分析。其是簡(jiǎn)單和快速的，因?yàn)槟芎苋菀椎剡M(jìn)行微生物的培養(yǎng)且可在20分鐘內(nèi)進(jìn)行分析。其是有信息量的，因?yàn)樗鼘?duì)分離的微生物歸屬于某一特定的組的可能性給出了定量化的估計(jì)。
該方法對(duì)于要求快速鑒定感染病原以進(jìn)行合適和安全治療的醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室是可行的。對(duì)于工業(yè)用途，方法將改進(jìn)方法的可靠性和有效性。
實(shí)施例2利用MRS在鼠和細(xì)胞培養(yǎng)中辨別隱球菌球和膠質(zhì)瘤1.序言利用MRS在培養(yǎng)物和實(shí)驗(yàn)鼠中特征性描述新型隱球菌的臨床分離菌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。從體外培養(yǎng)的真菌(新型隱球菌的16個(gè)菌株，3種白色念珠菌，3種煙曲菌，3種釀酒酵母)和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中采集1D和2D1H MR波譜。腦活檢取自健康鼠和實(shí)驗(yàn)感染的鼠或膠質(zhì)瘤(19個(gè)健康腦，19個(gè)隱球菌球和20個(gè)膠質(zhì)瘤)，利用同源和異源核2D相關(guān)波譜(COSY，TOCS，1H，13C-HSQC和HMBC)對(duì)細(xì)胞懸液與組織樣本進(jìn)行明確的信號(hào)分配。結(jié)果說(shuō)明新型隱球菌和腦部隱球菌球的MR波譜是受來(lái)自胞漿的雙糖a，a-海藻糖的共振所控制，但其他真菌，健康腦，或膠質(zhì)瘤的波譜卻不是。該波譜模式非常不同于受脂類和增高的膽堿/肌酸比控制的膠質(zhì)瘤的波譜以及健康腦的波譜。結(jié)果形成的結(jié)論是相對(duì)于其他MR可見(jiàn)代謝物的顯著高濃度的a，a-海藻糖可以診斷新型隱球菌。腦部隱球菌球在人類是少見(jiàn)的，但它是隱球菌病的嚴(yán)重表現(xiàn)。這些結(jié)果應(yīng)用于腦部隱球菌球的無(wú)創(chuàng)診斷將減少不必要的外科手術(shù)或活檢的危險(xiǎn)性與代價(jià)，以及促進(jìn)患者的處理。
2.材料和方法a.真菌和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的體外培養(yǎng)16種隱球菌菌株被用于體外培養(yǎng)和MRS的研究。這些菌株包括8種新型隱球菌血清A型臨床菌株(來(lái)自肺，血，CSF和腦的菌株)，7種血清B型菌株(臨床的(腦和CSF)，獸醫(yī)的和環(huán)境的菌株)以及1種有性型新型隱球菌-新生線狀黑粉菌的桿狀變種(AmericanType Culture Collection 32609)的臨床菌株。其他被體外培養(yǎng)和MRS研究的真菌包括酵母白色念珠菌(臨床菌株)和釀酒酵母(環(huán)境菌株和模式培養(yǎng)物)和霉菌煙曲菌(臨床菌株)每種的3種分離物。利用API 20C AUX系統(tǒng)(BioMerieux，March toile，法國(guó))進(jìn)行酵母的生化鑒定。隱球菌被生物分型(45)以及血清分型(Crypto Checkagglutination test，Iatron Labs)。真菌在沙氏葡萄糖瓊脂(SDA，DifcoLabs，Detroit，MI，USA)上培養(yǎng)24-48小時(shí)，然后27，30和/或37℃下培養(yǎng)在腦心浸液培養(yǎng)基(煙曲菌)和酵母氮源培養(yǎng)基(Difco)中的一種，其中含有1％葡萄糖，用0.345％重量/體積比的MOPS(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO，USA)將pH值緩沖在7.0。C6，一種鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，按文獻(xiàn)描述(51)維持并在3-30代內(nèi)使用。在使用前即刻，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的真菌細(xì)胞，或C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，洗滌和重懸在dulbecco′s磷酸緩沖液(PBS，Difco)中用于動(dòng)物模型，或重懸在含有99.5％重水(D2O)的PBS中用于MRS。
新型隱球菌的菌株(Mc Bride株)生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件是不同的以測(cè)試應(yīng)激對(duì)MR可見(jiàn)代謝物組合的影響。將這些菌株培養(yǎng)在緩沖的含有10mM葡萄糖的酵母氮源培養(yǎng)基(Difco Labs，Detroit，MI，USA)內(nèi)。下面的參數(shù)是不同的培養(yǎng)溫度(27，35和42℃)，pH值(5和7)，葡萄糖濃度(1，10，50mM)，用甘露糖(10mM)或蔗糖(10mM)代替葡萄糖，以及在無(wú)糖培養(yǎng)基上的延長(zhǎng)培養(yǎng)(0-100小時(shí))。
b.動(dòng)物研究將新型隱球菌血清B型的三個(gè)菌株(WM276，WM430，Mc Bride)和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將雄性的Wistar-furth和雌性的Fischer 344鼠(150-250g，Animal Research Council，Perth，WA)在腹腔內(nèi)注射氯胺酮(11.6mg/kg，Apex Laboratories，Sydney)和賽拉嗪(1.2mg/kg，Apex Laboratories，Sydney)之前用4％氟烷的100％氧氣吸入麻醉，同時(shí)允許呼吸室內(nèi)空氣。
為了形成腦部病變，將動(dòng)物的頭部固定在體位框架(David KopfInstruments，Tajunga，CA，USA)，通過(guò)一直的，平頭的26號(hào)針頭按3-6μl/分鐘的速度注射進(jìn)5μl的新型隱球菌血清B型或C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞。預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)懸浮在5μl體積的5×104菌落形成單位的隱球菌，以及也是在5μl體積的1×106C6細(xì)胞在術(shù)后的6-12天(隱球菌，n＝18只鼠)或12-30天(膠質(zhì)瘤，n＝26只鼠)能形成至少3mm直徑的病灶。微注射的理想位置為硬膜下2mm，相對(duì)于耳棒零點(diǎn)位置(ear barzero)側(cè)面3mm與前后2.4mm。利用這些定位，將用新型隱球菌血清B型菌株McBride注射的鼠(隱球菌球，n＝20，膠質(zhì)瘤，n＝19，對(duì)照，n＝19)用于MR的研究。從鹽水注射的鼠中得到對(duì)照組織。在合適的時(shí)候，鼠被處死，取出并在病灶位置橫切腦。用福爾馬林固定腦組織，并用石蠟包埋。得到7μm的切片，用蘇木精和cosin或高碘酸希夫試劑染色用于光鏡檢查。將取自每個(gè)隱球菌球或膠質(zhì)瘤以及對(duì)照動(dòng)物的腦組織標(biāo)本(直徑為4mm)懸浮在PBS/D2O中，在液氮中快速凍存，在-70℃保存4個(gè)月用于MRS分析。
依照澳大利亞國(guó)立衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)指南進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并得到了悉尼大學(xué)倫理委員會(huì)的倫理許可。
7.MR實(shí)驗(yàn)用裝配有5mm的{1H，13C}反向檢測(cè)雙重頻道探頭的BrukerAvance 360MHz波譜儀獲得1H MR波譜。溫度保持在37℃。利用選擇性門控輻射(46)或利用使用脈沖場(chǎng)梯度的選擇性刺激(47)抑制殘余水信號(hào)。相應(yīng)的，將化學(xué)轉(zhuǎn)換參照于外部的0.00ppm的3-三甲基硅丙磺酸鹽(3-(trimethylsilyl)propanesulfonate，TSP)或內(nèi)在水(4.65ppm)。
采集到的1D的1H MR波譜具有3600赫茲的波寬，8k的時(shí)間區(qū)，128或256個(gè)采集相，弛緩延遲1秒。在傅立葉轉(zhuǎn)換之前，相應(yīng)地將寬為1或3赫茲的線應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)和組織的樣本。將所有來(lái)自弛緩1H MR波譜的共振比用于細(xì)胞類型的比較。在20赫茲下旋轉(zhuǎn)Packed細(xì)胞懸浮液和樣本以避免細(xì)胞沉積在MR管上。應(yīng)用5秒的弛緩延遲以允許完全弛緩。
用二維MR波譜采集明確的信號(hào)分配。按幅值模式進(jìn)行{1H，1H}COSY試驗(yàn)(48)。采集參數(shù)為t2相掃描頻率為3600赫茲，t2時(shí)間域?yàn)?K，每32或48采集的256倍增量，弛緩延遲為ls。t1相應(yīng)用正弦鐘窗函數(shù)，和t2相應(yīng)用Gaussian-Lorentzian窗函數(shù)。利用零充盈將數(shù)據(jù)矩陣擴(kuò)展到1K。按描述的確定交叉峰值量(49)。
采集具有40ms與150ms的混合時(shí)相以及2K數(shù)據(jù)點(diǎn)和每增量48個(gè)掃描的TOCSY波譜以確認(rèn)分配(1)。
利用梯度HSQC脈沖程序獲得某些樣本的1H檢測(cè)模式的{1H，13C}單鍵變換相關(guān)波譜(50)以確認(rèn)分配。1H MR波譜寬度為3600赫茲，而13C MR波譜寬度為15000赫茲。通過(guò)GARP-1完成采集過(guò)程中13CMR的解偶合(8)。80次采集的每次的演變時(shí)間(t)被增量以獲得256FIDs以及包括2K數(shù)據(jù)點(diǎn)。弛緩延遲為ls。t2相應(yīng)用正弦鐘函數(shù)，而t1相應(yīng)用Gaussian-Lorentzian函數(shù)。t1相在傅立葉轉(zhuǎn)換之前應(yīng)用1K的零充盈。
采集所有真菌菌株，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株以及大鼠腦標(biāo)本(20個(gè)隱球菌球，19個(gè)膠質(zhì)瘤和19個(gè)對(duì)照)的1H MR波譜與2D {1H，1H}COSY。用TOCSY和HSQC確認(rèn)四個(gè)真菌種的每一種，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株以及不同的腦活檢樣本種的至少一個(gè)菌株或標(biāo)本。
8.結(jié)果a.細(xì)胞培養(yǎng)研究圖3比較了從體外培養(yǎng)的真菌以及C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株獲得的典型的一維(1D)和二維(2D)MR波譜。表5概述了2D波譜的主要的交叉峰?；蛲ㄟ^(guò)與公布的數(shù)據(jù)(32，40，44，51，52)的比較或通過(guò)與COSY，TOCSY以及HSQC波譜的原始分析來(lái)分配共振。列于表5和顯示于圖3的共振表現(xiàn)于來(lái)自相應(yīng)真菌的所有菌株以及C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的波譜。表6顯示了各菌株之間的共振強(qiáng)度的不同。
b.體外培養(yǎng)的新型隱球菌新型隱球菌的一維和二維COSY MR波譜受來(lái)自脂類和a，a-海藻糖信號(hào)的共振所支配。脂類波譜模式的特點(diǎn)是在0.9ppm，1.30ppm，1.60ppm，2.00ppm，2.30ppm和5.38ppm(51)的化學(xué)轉(zhuǎn)換。利用HSQC波譜儀的3.46ppm，3.66ppm，3.77-3.85ppm與5.19ppm的共振分配給細(xì)胞懸浮液種的a，a-海藻糖。相應(yīng)的分配為h1-C1(5.19-93.50ppm)，H2-C2(3.66-71.50ppm)，H3-C3(3.86-73.0ppm)，H4-C4(3.46-70.00ppm)，H5-C5(3.83-72.50ppm)和H6-C6(3.78和3.88/61.00ppm)。來(lái)自氨基酸殘基[賴氨酸(lys)，丙氨酸(ala)，蘇氨酸(thr)，谷氨酸/谷氨酰胺(glu/gln)]與乙醇的較小強(qiáng)度的交叉峰值在某些菌株中是明顯的(概述在表5和6)。占優(yōu)勢(shì)的MR可見(jiàn)的細(xì)胞外代謝物是乙酸(1.92ppm)和乙醇(1.16和3.63ppm)。
c.應(yīng)激對(duì)隱球菌細(xì)胞的影響既然已經(jīng)報(bào)道海藻糖能保護(hù)真菌抵抗不利條件(熱、干燥、滲透以及氧化應(yīng)激等)(54-57)。考慮到MR可見(jiàn)的海藻糖能根據(jù)環(huán)境條件而改變的可能。測(cè)定了按材料和方法中指定的溫度、pH值、葡萄糖濃度、替代葡萄糖的其他糖和孵育時(shí)間的影響。四個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)條件相關(guān)的因素中的一個(gè)就能改變相應(yīng)的共振比(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。脂類和海藻糖信號(hào)在1D和COSY波譜中仍是明顯的，與培養(yǎng)條件無(wú)關(guān)。
d.體外培養(yǎng)的其他真菌的MRS研究了其他兩個(gè)臨床重要的、致病的真菌，白色念珠菌和煙曲霉，以及釀酒酵母的MRS，找到了它們與新型隱球菌的差異。白色念珠菌(圖3b)和釀酒酵母(圖3d)的1D和2D COSY波譜顯示出顯著的脂類，而煙曲霉(圖3c)的波譜的特點(diǎn)為氨基酸殘基和糖的共振。這些真菌的糖的共振比新型隱球菌的糖的共振有著更弱的強(qiáng)度，以及不能被分配到特異的單糖殘基中。如果暴露于高溫(37-43℃)，僅在釀酒酵母的三個(gè)菌株的兩個(gè)的COSY波譜中能鑒定到非常少數(shù)目的MR可見(jiàn)的a，a-海藻糖(比新型隱球菌中的低20倍)，白色念珠菌中沒(méi)有檢測(cè)到。在兩個(gè)酵母菌種中鑒定到乙醇。在白色念珠菌與煙曲霉的培養(yǎng)上清的波譜中可見(jiàn)乙酸(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。
e.C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株體外培養(yǎng)的懸浮C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的波譜中占優(yōu)勢(shì)的是來(lái)自氨基酸的共振。C6細(xì)胞的2D波譜顯示出沒(méi)有糖的交叉峰。出現(xiàn)了來(lái)自膽堿(chol)，磷酸膽堿(PC)和甘油磷酸膽堿(GPC)以及相當(dāng)大量的氨基乙磺酸(tau)和氨基酸殘基亮氨酸(leu)和glu/gln的強(qiáng)交叉峰，象已經(jīng)報(bào)道的腫瘤細(xì)胞株一樣(51)。相應(yīng)地代表著含膽堿和肌酸的化合物的3.25到3.05ppm的共振比比真菌波譜中的更高(表6)。
f.動(dòng)物研究大鼠腦活檢樣本的組織病理學(xué)顯示隱球菌球的生物物質(zhì)主要由隱球菌構(gòu)成，象人感染所見(jiàn)的一樣，以及驗(yàn)證了大鼠模型中生長(zhǎng)的腫瘤病理(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。圖4顯示了對(duì)照大鼠、腦隱球菌球大鼠和膠質(zhì)瘤大鼠的代表性的1D1H MR和2D COSY波譜。表6概述了共振比。
對(duì)照腦組織的波譜中占優(yōu)勢(shì)的是在2.00ppm的N-乙酰天冬氨酸(NAA)。更低強(qiáng)度的特征性信號(hào)包括合成峰在2.0-2.2ppm(谷氨酰胺/谷氨酸)，在3.0ppm(肌酸、磷酸肌酸、(y-氨基)丁酸(GABA)和lys殘基)；在3.2ppm[膽堿的N(CH3)3基團(tuán)、PC和GPC等]以及在3.6到3.9ppm(Ha氨基酸殘基和內(nèi)消旋肌醇)，氨基酸GABA、chol、PC、以及GPC信號(hào)也出現(xiàn)在COSY波譜。在1.3ppm處找到了不同強(qiáng)度的乳酸信號(hào)，是切除和凍存間發(fā)生無(wú)氧代謝的產(chǎn)物。
隱球菌球給出了有著如上述的隱球菌海藻糖和脂類的典型模式的1D與COSY MR波譜。5.38ppm的脂類共振到5.19ppm的海藻糖共振的強(qiáng)度波動(dòng)于較寬的范圍(表6)。此外，比較于對(duì)照腦組織，提高了3.2∶3.0ppm共振比。NAA信號(hào)戲劇性地減少以及在一些標(biāo)本中不能檢測(cè)到。在正常腦組織中沒(méi)有觀察到起于在一些但不是全部波譜中的乙酸(1D波譜)和乙醇(2D COSY)的其他共振。起于GPC的顯著的交叉峰也比對(duì)照和膠質(zhì)瘤波譜有著更高的強(qiáng)度。當(dāng)比較于對(duì)照腦組織，COSY波譜的內(nèi)消旋肌醇和GABA交叉峰強(qiáng)度相對(duì)于氨基酸交叉峰是減少了。
腫瘤活檢波譜中占優(yōu)勢(shì)的是脂類信號(hào)和增高的3.20∶3.00ppm的共振比，這與文獻(xiàn)中的許多報(bào)道一致(32，58，59)。對(duì)于大多數(shù)標(biāo)本，脂類信號(hào)的相對(duì)增加和3.2∶3.0ppm比的增高要比隱球菌球中發(fā)現(xiàn)的增高更大(表6)。脂類的共振比是多種多樣的。在許多腫瘤標(biāo)本中，NAA仍是檢測(cè)不到的，提示缺乏神經(jīng)元活性。相比于其他氨基酸殘基的交叉峰(例如賴氨酸、亮氨酸等)增加的不同于脂類的交叉峰是氨基乙磺酸(3.28-3.50ppm)、膽堿(3.50-4.07ppm)、PC(3.61-4.19ppm)和磷酸氨基乙醇(3.22-3.98ppm)的交叉峰。
9.討論通過(guò)MRS將新型隱球菌與其他酵母、絲狀真菌煙曲霉和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞明確區(qū)分，歸結(jié)于大量的非還原性雙糖，海藻糖。這些差異存在于來(lái)自體外培養(yǎng)細(xì)胞以及組織學(xué)明確診斷的大鼠皮質(zhì)感染組織的波譜中。MRS因此提供了一種將活檢標(biāo)本的隱球菌球與健康腦及腦腫瘤組織區(qū)別開(kāi)的方法。
被感染組織中的新型隱球菌被一莢膜所包裹，它典型的是真菌細(xì)胞體積的許多倍。這個(gè)莢膜主要由具有疏松針織樣纖維結(jié)構(gòu)的glucuroxylomannans(GXM)構(gòu)成，來(lái)自體外培養(yǎng)的樣本，或來(lái)自組織活檢的細(xì)胞相關(guān)的GXM都不是MR可見(jiàn)的，提示天然的莢膜多糖在MRS下的易變性尚不足以被發(fā)現(xiàn)。
相反的，鑒定出了非常大量的細(xì)胞漿化合物，海藻糖。海藻糖存在于酵母和其他真菌，因此本質(zhì)上它不是新型隱球菌的獨(dú)特的特性。它是對(duì)熱狀態(tài)(57)、滲透應(yīng)激(61)、脫水(56)、干燥以及其他狀態(tài)(綜述見(jiàn)于(54)和(55))的重要的保護(hù)劑。然而培養(yǎng)在25℃的新型隱球菌的海藻糖水平超過(guò)釀酒酵母在熱應(yīng)激狀態(tài)(37℃)下的20倍。改變培養(yǎng)條件不減少新型隱球菌的海藻糖信號(hào)的強(qiáng)度。
相對(duì)于新型隱球菌波譜中其他MR可見(jiàn)化合物的大量的海藻糖確定了海藻糖能作為一種用于鑒別新型隱球菌與其他真菌的標(biāo)記物。隱球菌中如此高水平的海藻糖可能是對(duì)環(huán)境應(yīng)激，尤其是溫度，脫水和饑餓的進(jìn)化反應(yīng)。適應(yīng)于在生理溫度下的生存和生長(zhǎng)，新型隱球菌的一種公認(rèn)的毒性決定簇(62)與細(xì)胞內(nèi)高濃度的海藻糖是一致的。
利用1H MRS在來(lái)自細(xì)菌性腦膿腫患者的膿標(biāo)本中鑒定了細(xì)菌的代謝物，但不是a，a-海藻糖(5，34，35，39)。乙醇，一種酵母中葡萄糖發(fā)酵的產(chǎn)物，被報(bào)道出現(xiàn)在隱球菌腦膜炎患者的CSF中(63)。本研究和Bubb等發(fā)現(xiàn)的大量細(xì)胞外代謝物(乙酸，乙醇)都不適合于體外或體內(nèi)確診隱球菌，因?yàn)槠渌虏⌒缘奈⑸镆采a(chǎn)這些代謝物(5)。然而，出現(xiàn)于許多隱球菌球，但不是健康或腫瘤組織的顯著的乙酸信號(hào)是感染的一種有用的診斷提示物。細(xì)菌產(chǎn)生的乙酸已經(jīng)被MRS在細(xì)菌膿腫中鑒定(34，35，39)以及在本研究的新型隱球菌和隱球菌球中鑒定。
上面討論的結(jié)果提示MRS能正確地區(qū)分出大鼠的健康腦、試驗(yàn)性隱球菌球以及膠質(zhì)瘤。高水平的來(lái)自隱球菌球的MR可見(jiàn)的a，a-海藻糖提供了腦隱球菌球病理診斷的方法基礎(chǔ)。當(dāng)這個(gè)方法被應(yīng)用于人腦隱球菌球的體內(nèi)診斷時(shí)，腦隱球菌球?qū)⒉辉贂?huì)被傳統(tǒng)的影象學(xué)方法誤診為惡性腫瘤。早期和正確的診斷將減少診斷延誤所引起的高發(fā)病率和死亡率(27)。將體內(nèi)MRS用作為腦部感染性病灶的無(wú)創(chuàng)診斷的方法將減少非必要的外科手術(shù)或活檢的危險(xiǎn)與代價(jià)，以及促進(jìn)處理病人的決心。
實(shí)施例3致病性真菌的鑒定1.微生物將致病性酵母白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母的205種培養(yǎng)物在30℃沙氏葡萄糖瓊脂上培養(yǎng)48小時(shí)。將致病性酵母新型隱球菌變種新型和變種gattii的69和70種分離物分別地在37℃沙氏葡萄糖瓊脂上培養(yǎng)48小時(shí)。利用API 20C AUX系統(tǒng)(BioMerieux，Marcy 1′Etoile，法國(guó))生化鑒定酵母。將隱球菌進(jìn)行生物分型和血清分型(Crypto Check agglutinationtest，Iatron Labs)。另外，將指紋PCR用于比較相應(yīng)菌種的血清型。在MR試驗(yàn)之前，從培養(yǎng)皿上刮取菌落并馬上懸浮在PBS/D2O中。
2.MR波譜檢測(cè)用裝配有5mm的{1H，13C}反向檢測(cè)探頭的Bruker Avance 360MHz MR波譜儀采集MR波譜。利用COSY、TOCSY(tm＝40，150ms)、1H，13C HSQC(優(yōu)化為1J＝130Hz)以及1H，13C HMBC(優(yōu)化為nJ＝7Hz)進(jìn)行信號(hào)分配。
3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分類策略(SCS)(9)將5種念珠菌菌種分為相應(yīng)的包括2或3種的菌株的2組。用Pair-wise分類法進(jìn)行組間區(qū)別，以及后來(lái)進(jìn)行每組內(nèi)菌種間的區(qū)別。對(duì)兩個(gè)新型隱球菌變種實(shí)行Pair-wise分類法。將幅值MR波譜標(biāo)準(zhǔn)化到總積分，并用基于遺傳算法的優(yōu)化區(qū)域選擇器(geneticalgorithm-based Optimal Region Selector)(66)分析以確認(rèn)出三個(gè)最大差異的亞區(qū)，其使用排序?yàn)榈谝坏牟ㄗV產(chǎn)生物(rank-ordered first derivatives of the spectra)(9)。利用這三個(gè)分區(qū)發(fā)展出了以線性判別分析為基礎(chǔ)的分類器。用引導(dǎo)程序?yàn)榛A(chǔ)(67)的交叉確認(rèn)(1000次重復(fù))(9)測(cè)定了分類器的穩(wěn)定性。如果分類可能性大于0.75，那么分類分配則被稱為crisp。
4.結(jié)果所有酵母(念珠菌屬和隱球菌變種)的MR波譜中占優(yōu)勢(shì)的是脂類、糖(海藻糖、葡萄糖)、多元醇(甘油、甘露醇、山梨糖醇與其他)、乙醇和氨基酸殘基的信號(hào)。
a.念珠菌屬對(duì)念珠菌屬1D MR波譜的肉眼分析將差別分為兩組(A)克魯斯假絲酵母和光滑假絲酵母；(B)白色念珠菌、近平滑假絲酵母與熱帶假絲酵母。這些差別主要是因?yàn)榻MA中具有更高的糖和乙醇成分。這些分組與以部分肌動(dòng)蛋白基因序列64為基礎(chǔ)的系統(tǒng)生命樹(shù)是一致的。組A和B之間，以及每組的菌種間的Pair-wise分類造成總的準(zhǔn)確率達(dá)到99％。
b.隱球菌變種肉眼觀察不能區(qū)別出新型隱球菌變種的1D和2DMR波譜。但是，利用Pair-wise統(tǒng)計(jì)學(xué)分類策略對(duì)1D MR波譜的SCS區(qū)別新型和gattii變種有著98.6％的正確率。
5.討論將SCS分析的MRS數(shù)據(jù)比較目前使用的生化鑒定試驗(yàn)和分子生物學(xué)方法(指紋PCR)。對(duì)MR波譜應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分類策略能鑒別真菌的不同菌種以及變種。在這些特殊的系統(tǒng)中對(duì)真菌的分類學(xué)等級(jí)以下的高準(zhǔn)確程度的鑒定是可能的。SCS算法能在少于10分鐘內(nèi)分析采集和加工好的MR數(shù)據(jù)，這樣的快速性使得這對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)是一個(gè)很吸引人的選擇。因此，根據(jù)本發(fā)明，MR數(shù)據(jù)的SCS分析能比其他常規(guī)方法更快地鑒定出真菌的菌種與變種，且具有高水平的準(zhǔn)確率。
圖5顯示了裝配有計(jì)算機(jī)的波譜儀10，它可以是Bruker Avance360MHz的磁共振波譜儀。統(tǒng)計(jì)學(xué)分類策略(SCS)計(jì)算機(jī)12儲(chǔ)存了SCS與其他這里描述的程序。臨床數(shù)據(jù)庫(kù)包括來(lái)自采集數(shù)據(jù)和已知微生物鑒定的信息，以及類似的被計(jì)算機(jī)12用于發(fā)展分類器16的信息。
盡管描述的實(shí)施例是關(guān)于體外分析，但是本發(fā)明能被用于體內(nèi)分析，其中需要在波譜儀中安裝更強(qiáng)的磁體。
盡管本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案已經(jīng)被顯示和描述，但是本領(lǐng)域人員可以變更和調(diào)整。本發(fā)明不局限于優(yōu)選的實(shí)施方案，其范圍僅由附加的權(quán)利要求書而確定。
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表1.優(yōu)化的分類器的分類和鑒定結(jié)果

表皮葡萄球菌ATCC 12228 100，100 100，100100，98100，10050，84 不確定14分離物 003-1283 100，100 75，100c40培養(yǎng)物 141-1667 100，100c162-2710 100，100c170-1085 100，99 c174-2177 100，89 c177-132061，99金黃色葡萄球菌不確定270-0170 100，100c281-0122 100，100c289-1072 95，99 c319-1923 100，100c323-1622 100，100c326-2592 100，100c327-2569 100，100c無(wú)乳鏈球菌 048-1676 100，100c15分離物 159-2821 100，100c36培養(yǎng)物 165-104698，97米氏鏈球菌不確定176-0797 100，100 100，100100，100 c183-2646 100，100c208-2835 100，100c242-1786 100，100c260-1829 100，100c269-0712 100，100c269-1137 100，100c269-1160 100，100c270-1106 100，100c285-2806 100，100c290-1094 100，100c201-1523 100，100c米氏鏈球菌 073-0596 100，100c11分離物 097-1166 100，100c30培養(yǎng)物 141-0714 100，100 99，100c141-1834 99，100 c150-1172 100，100c154-0507 98，89 c185-1175 100，100 100，99c291-0591 98， 96c291-1767 42，84 100，99 肺炎鏈球菌不確定349-248642，4792，84 肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌不確定408-0803 100，100 c
肺炎鏈球菌ATCC 630599，100100，10097，100100，99100，100100，99100，100釀膿鏈球菌不確定15分離物 221-2745 78，74c42培養(yǎng)物 221-2755 100，100 c230-2817 100，99 c234-1207 91，100 c235-2193 94，100 c241-1187 100，92 c259-1456 100，100 c272-0604 100，96 c278-172364，73釀膿鏈球菌(兩者)不確定278-1727 97，100 c324-1010 100，100 c404-0191 100，98 c467143 100，100 c480837 72，90c釀膿鏈球菌ATCC 19615 96，99 99，100 100，100 100，100 100，100 100，100 c13分離物 162-191599，59 肺炎鏈球菌不確定48培養(yǎng)物 213-0136 100，70100，100 c221-1798 99，10099，99 c221-2985 99，9595，9596，95 糞腸球菌(兩者)不確定223-2690 99，100100，100 c235-3096 94，87c236-1570 98，100 c260-2388 88，100 93，96 c312-2457 99，99c3/12/200698，99c326-0413 95，100 c3-61-70 89，90ca.數(shù)值為雙份培養(yǎng)物中每一種的波譜的分類概率(％)。分類概率小于75％以粗體字顯示。陰影內(nèi)顯示的為雙份培養(yǎng)物之一或兩者的波譜是錯(cuò)誤分類的。
b.錯(cuò)誤組波譜被錯(cuò)誤地分配至某一菌種。
c.分離物鑒定結(jié)果(c＝正確)。
表2.分類和鑒定結(jié)果小結(jié)


表3.重合區(qū)域和作用最強(qiáng)的代謝物

縮寫AA，氨基酸(非特異性)；PA，多胺。
GPC，甘油磷酸膽堿；GPE，甘油磷酸乙醇胺；EA，乙醇胺。
表4.腸球菌的波譜分類

注釋同表1所示。
表5由交叉峰值鑒定的COSY波譜中的主要組分No. A*B*C*F*Chol PCGPCtre tre tre ala lystau inosglu/ gabaNAA eth化學(xué)位移樣品/(H1/H2) (H2/H3) (H4/H3.5) gln(ppm) 分離物0.9- 1.3- 2.02- 1.6- 3.5- 3.61 3.67- 5.19- 3.66- 3.47- 1.49- 1.72 3.283.25-2.1- 1.9-2.58- 1.16-1.32.08 5.32.3 4.07 -4.2 4.33 3.66 3.86 3.83.79-3.0 -3.53.64 2.47 2.314.4 3.63培養(yǎng)物新型隱球菌 16/16 3-43-42 3-4- - - 3 4 4 1-2 1-3- -1ψ1ψ- 1-2白色念珠菌 5/34 4 3 4 - - - - - - 1 2-31ψ- 1-2 - 2-3煙曲菌 3/32-32-31-22-3- -- - - 1-2 4 1ψ-1-21ψ- 1釀酒酵母 6/33 3 2 2-3- -- 1ψ1ψ3-4 3 - -2-42 - 1-2C6膠質(zhì)細(xì)胞 3/11-31-31-22-31-2 2 1ψ- - - 2-4 2-4 3-4 -3-4- - -動(dòng)物研究 -對(duì)照腦 19 1 - - - 2 1-2 - - - - 3-4 2 3-4 3-4 2-31-2 2-3 -神經(jīng)膠質(zhì)瘤 19 4 4 2-33-43-4 1 2-3- - - 2 2 221-2- - -隱球菌 20 3 3 1 2 1 - 1-22 3-43-41-2 2 11ψ3 - - -將交叉峰值與相應(yīng)的COSY-波譜中的最強(qiáng)交叉峰相比較。如果信號(hào)的值為60-100％，則將其分類為4，如為30-60％，分類為3，如為10-30％，分類為2，而如果值小于最強(qiáng)峰值的10％，則分類為1。*甘油三酯峰(32)。ψ所有樣品均未檢測(cè)到。其他縮寫ala，丙氨酸；chol，膽堿；eth，乙醇；gaba，γ-氨基丁酸；glu/gln.，谷氨酰胺/谷氨酸；GPC，甘油磷酸膽堿；lys，賴氨酸；inos，肌醇；NAA，N-乙酰天冬氨酸；PC，磷酸膽堿；tau.?；撬?；tre，α，α-海藻糖。注意檢測(cè)到的氨基酸殘基不一定代表游離氨基酸。以上包括了來(lái)自于一些個(gè)別分離物的重復(fù)培養(yǎng)物的波譜。
表6選定的1H MR信號(hào)的峰值比樣品*樣品/ 3.25 ppm∶3.05 ppm 5.18 ppm∶3.05 ppm5.38 ppm∶3.05 ppm 2.00 ppm∶3.05 ppm5318 ppm∶5.18 ppm分離物的 平均值±SD 平均值±SD 平均值±SD 平均值±SD 平均值±SD數(shù)量 (最小-最大) (最小-最大)(最小-最大) (最小-最大) (最小-最大)培養(yǎng)物新型隱球菌 24/16 2.1±0.6(1.4-3.0)4.7±2.3(0.5-8.0) 1.5±0.6(0.6-2.3)n.d 0.4±0.3(0.2-2.0)白色念珠菌 5/3 1.5±0.3(0.8-2.2)0.1±0.1(n.d.-0.1) 0.9±0.3(0.4-1.9)n.d 15±7(10-20)煙曲菌 3/3 1.7±0.4(1.1-2.1)n.d 0.4±0.4(n.d.-1.0) n.d n.d釀酒酵母6/4 1.4±0.3(1.0-1.9)0.1±0.1(n.d.-0.2) 0.3±0.2(0.1-0.8)n.d 7±2(5-10)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤3/1 3.6±1(2.0-8.0) n.d 0.5±0.2(n.d.-0.6) n.d n.d細(xì)胞系動(dòng)物研究對(duì)照腦 191.2±0.3(0.8-1.7)n.d n.d 2.1±0.4(1.5-3.0)n.d隱球菌 201.5±0.3(1.0-1.9)0.8±0.4(0.2-1.8) 0.4±0.2(0.1-0.7) 1.0±0.7(n.d.-2) 0.6±0.3(0.3-1.2)神經(jīng)膠質(zhì)瘤 191.9±0.4(1.2-2.4)n.d 1.3±0.7(0.2-3.0) 0.9±0.7(n.d.-2) n.d比值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。括號(hào)內(nèi)為相應(yīng)比值的最大和最小值(最小-最大)；n.d.-未檢測(cè)到。一些信號(hào)為復(fù)合峰值。指定信號(hào)的主要成分為2.00ppm-NAA和其他乙?；?；3.05ppm-肌酸，磷酸肌酸，lya殘基，gaba和含NCHa-基團(tuán)的化合物；3.25ppm-膽堿，PC，GPC，甜菜堿，tau，其他含N(CH3)3基團(tuán)的化合物；5.18ppm-α，α-海藻糖的H-1，對(duì)于所有新型隱球菌細(xì)胞和動(dòng)物模型樣品或其他體外培養(yǎng)的非新型隱球菌的真菌的其他碳水化合物殘基的異質(zhì)子；5.38ppm-甘油三酯?；湹南?CH＝CH)的質(zhì)子(縮寫見(jiàn)表1的圖例)。*對(duì)于有些分離物n＞1個(gè)樣品。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)分類器將未知微生物菌種分類進(jìn)已知種的方法，其包括(a)獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)在獲得的磁共振波譜中找出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)；和(c)如下交叉確認(rèn)波譜選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜，該系數(shù)和分類器波譜能被用于確定未知微生物的菌種。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將步驟(c)重復(fù)多次的步驟，每次選擇所述菌種的波譜的不同部分作為波譜的第一部分，以獲得所述菌種的一組不同的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)，并獲得這些線性判別分析系數(shù)的加權(quán)平均數(shù)以獲得最終的分類器波譜。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述交叉確認(rèn)波譜的步驟包括通過(guò)隨機(jī)選擇大約一半的波譜對(duì)波譜進(jìn)行交叉確認(rèn)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中將步驟(c)重復(fù)多次的步驟包括重復(fù)步驟(c)約1000次。
5.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括獨(dú)立地獲得多個(gè)分類器波譜，以及匯總這些獨(dú)立的分類器的結(jié)果以獲得一致的診斷的步驟。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物包括細(xì)菌。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌種。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述的細(xì)菌包括糞腸球菌、鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌菌種。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述的細(xì)菌包括肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌菌種。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物包括真菌。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的真菌包括致病性酵母。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的致病性酵母包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯念珠菌和平滑念珠菌。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述的致病性酵母包括隱球菌變種。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的隱球菌變種包括新型隱球菌和Cryptococcus gattii。
15.權(quán)利要求1的方法，其中每種不同的菌種的所述多個(gè)磁共振波譜至少是10個(gè)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中每種不同的菌種的所述多個(gè)磁共振波譜至少是30個(gè)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物包括培養(yǎng)的細(xì)菌感染物。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物包括來(lái)自被細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物的標(biāo)本。
19.一種確定未知微生物的菌種的方法，其包括獲得未知微生物菌種的磁共振波譜，以及將獲得的波譜與菌種分類器進(jìn)行比較，該分類器已經(jīng)通過(guò)以下步驟而獲得(a)獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)在獲得的磁共振波譜中找出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)；和(c)如下交叉確認(rèn)波譜選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜；并選擇與未知微生物菌種的波譜最接近的波譜的微生物作為未知微生物的菌種。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述獲得分類器的步驟進(jìn)一步包括將步驟(c)重復(fù)多次的步驟，每次選擇微生物菌種的波譜的不同部分作為波譜的第一部分，以獲得微生物菌種的一組不同的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)，并獲得這些線性判別分析系數(shù)的加權(quán)平均數(shù)以獲得最終的分類器波譜。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述交叉確認(rèn)波譜的步驟包括通過(guò)隨機(jī)選擇大約一半的波譜對(duì)波譜進(jìn)行交叉確認(rèn)。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述將步驟(c)重復(fù)多次的步驟包括重復(fù)步驟(c)約1000次。
23.權(quán)利要求19的方法，其進(jìn)一步包括獨(dú)立地獲得多個(gè)分類器波譜，以及匯總這些獨(dú)立的分類器的結(jié)果以獲得一致的診斷的步驟。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述的微生物包括細(xì)菌。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌種。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述的細(xì)菌包括糞腸球菌、鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌菌種。
27.權(quán)利要求6的方法，其中細(xì)菌包括肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌，無(wú)乳鏈球菌菌種。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物包括真菌。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的真菌包括致病性酵母。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的致病性酵母包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯念珠菌和平滑念珠菌。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述的致病性酵母包括隱球菌變種。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述的隱球菌變種包括新型隱球菌和Cryptococcus gattii。
33.權(quán)利要求19的方法，其中每種不同的菌種的所述多個(gè)磁共振波譜至少是10個(gè)。
34.權(quán)利要求19的方法，其中每種不同的菌種的所述多個(gè)磁共振波譜至少是30個(gè)。
35.權(quán)利要求19的方法，其中所述的微生物包括培養(yǎng)的細(xì)菌感染物。
36.權(quán)利要求19的方法，其中所述的微生物包括來(lái)自被細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物的標(biāo)本。
37.一種將未知微生物菌種分類進(jìn)已知種的統(tǒng)計(jì)學(xué)分類器，其包括(a)用于獲得多種不同微生物菌種中的每一種微生物的多個(gè)磁共振波譜的波譜儀，所述微生物菌種是已知微生物菌種；(b)用于在獲得的磁共振波譜中定位出多個(gè)有著最大差異的亞區(qū)的定位器；和(c)用于通過(guò)以下步驟來(lái)交叉確認(rèn)波譜的交叉確認(rèn)器選擇每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分，從每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分發(fā)展出線性判別分析分類器，以及利用來(lái)自每個(gè)微生物菌種的波譜的第一部分的分類器確認(rèn)每個(gè)微生物菌種的波譜的剩余部分以獲得每個(gè)已知種的微生物的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)和分類器波譜，該系數(shù)和分類器波譜能被用于確定未知微生物的菌種。
38.權(quán)利要求37的分類器，其中所述的交叉確認(rèn)器多次重復(fù)步驟(c)的步驟，每次選擇該種的波譜的不同部分作為波譜的第一部分，以獲得該種的一組不同的優(yōu)化的線性判別分析系數(shù)，并獲得這些線性判別分析系數(shù)的加權(quán)平均數(shù)以獲得最終的分類器波譜。
39.權(quán)利要求37的分類器，其中所述的交叉確認(rèn)器通過(guò)隨機(jī)選擇大約一半的波譜對(duì)波譜進(jìn)行交叉確認(rèn)。
40.權(quán)利要求38的分類器，其中所述的分類器重復(fù)步驟(c)約1000次。
41.權(quán)利要求37的分類器，其中所述的分類器獨(dú)立地獲得多個(gè)分類器波譜，以及匯總這些獨(dú)立的分類器的結(jié)果以獲得一致的診斷。
42.權(quán)利要求37的分類器，其中所述的微生物包括細(xì)菌。
43.權(quán)利要求42的分類器，其中所述的細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌種。
44.權(quán)利要求42的分類器，其中所述的細(xì)菌包括糞腸球菌、鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌菌種。
45.權(quán)利要求42的分類器，其中所述的細(xì)菌包括肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌菌種。
46.權(quán)利要求37的分類器，其中所述點(diǎn)微生物包括真菌。
47.權(quán)利要求46的分類器，其中所述的真菌包括致病性酵母。
48.權(quán)利要求47的分類器，其中所述的致病性酵母包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯念珠菌和平滑念珠菌。
49.權(quán)利要求47的分類器，其中所述的致病性酵母包括隱球菌變種。
50.權(quán)利要求49的分類器，其中所述的隱球菌變種包括新型隱球菌和Cryptococcus gattii。
51.權(quán)利要求37的分類器，其中每種不同的菌種的所述多個(gè)磁共振波譜至少是10個(gè)。
52.權(quán)利要求37的分類器，其中每種不同的菌種的所述多個(gè)磁共振波譜至少是30個(gè)。
53.權(quán)利要求1的分類器，其中所述的微生物包括培養(yǎng)的細(xì)菌感染物。
54.權(quán)利要求1的分類器，其中所述的微生物包括來(lái)自被細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物的標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用磁共振波譜分析和多因素分析對(duì)微生物如細(xì)菌和真菌進(jìn)行鑒定的統(tǒng)計(jì)學(xué)分類器。所述的細(xì)菌可以包括葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌的菌種。所述的真菌可以包括致病性酵母，包括念珠菌和隱球菌的菌種。
文檔編號(hào)G01R33/46GK1582400SQ02808627
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2002年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月21日
發(fā)明者雷蒙德·L·召莫爾堯伊, 塔尼亞·佐雷爾, 卡羅琳·E·芒福德, 烏韋·希默爾賴希, 羅杰·伯恩 申請(qǐng)人:加拿大國(guó)立研究院, 磁共振研究學(xué)院, 悉尼大學(xué)