專利名稱：抗骨橋蛋白抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人抗骨橋蛋白抗體以及使用該抗體治療自身免疫病、風濕病和風濕性關(guān)節(jié)炎的方法。
背景技術(shù)：
骨橋蛋白(以下稱為“OPN”)是骨中大量含有的酸性鈣結(jié)合糖蛋白，已知在人體中，由于mRNA剪接的不同，至少可產(chǎn)生3種同種型骨橋蛋白-a(以下稱為“OPN-a”)、骨橋蛋白-b(以下稱為“OPN-b”)和骨橋蛋白-c(以下稱為“OPN-c”)(Y.Saitoh等，(1995)LaboratoryInvestigation，72，55-63)，其中，OPN-a的前體具有后附序列表中SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列，認為是通過分泌時，信號肽被切除，得到I17-N314的成熟OPN-a。另外，成熟OPN在第168號精氨酸殘基的C末端一側(cè)被生物體內(nèi)的凝血酶切割，成為N末端片段和C末端片段2部分。
上述OPN承擔著多種生理學、病理學的重要機能，例如，具有細胞粘附、細胞遷移、致瘤、免疫應(yīng)答和抑制補體介導的細胞溶解等機能。上述各種機能是通過各種細胞表面受體介導的。OPN內(nèi)部具有RGD序列(例如OPN-a中的第159～161號殘基)，識別該RGD序列的αVβ3、αVβ1和αVβ5等整聯(lián)蛋白是OPN的主要受體，其中αVβ3、αVβ1和αVβ5整聯(lián)蛋白在血管的平滑肌細胞中介導細胞粘附，并且αVβ3與巨噬細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等的遷移有關(guān)。
以往的研究已闡明，OPN經(jīng)由SVVYGLR序列與α9β1、α4β1和α4β7整聯(lián)蛋白結(jié)合，但其中也發(fā)現(xiàn)下述的差異α4β1與未經(jīng)凝血酶切割的OPN(未經(jīng)切割型OPN)和被凝血酶切割的N末端片段(切割型OPN)兩者都結(jié)合，α9β1只與凝血酶切割型OPN結(jié)合。(Y.Yokosaki等，(1999)The Journal of Biological Chemistry 274，36328-36334/P.M.Green等，(2001)FEBS Letters 503，75-79/S.T.Barry等，(2000)Experimental Cell Research 258，342-351)。這些α9和α4、β1和β7整聯(lián)蛋白亞基其相互的氨基酸序列之間具有高相似性。α4β1和α4β7整聯(lián)蛋白主要在淋巴細胞和單核細胞中發(fā)現(xiàn)，但在中性粒細胞中只是極少表達。而α9β1則在中性粒細胞中選擇性地高表達，經(jīng)由VCAM-1和Tenascin-C等在中性粒細胞遷移中承擔必需機能。另外，在肌細胞、上皮細胞和肝細胞等中廣泛表達。如上所述，人們認為整聯(lián)蛋白亞基α4和α9的細胞質(zhì)域通過各有微妙不同的細胞信號傳導途徑，互相協(xié)同，促進白細胞向炎癥部位遷移和聚集，增強其浸潤活性，從而參與各種炎癥反應(yīng)。
如上所述，各種種類的整聯(lián)蛋白促進白細胞的遷移、參與炎癥反應(yīng)，因此認為抑制這些整聯(lián)蛋白活性的藥物應(yīng)具有作為潛在的抗炎藥的可能性。例如，整聯(lián)蛋白αVβ3在破骨細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等中表達，通過抑制αVβ3整聯(lián)蛋白與各種結(jié)合配體的結(jié)合，例如在關(guān)節(jié)中，可望具有抑制關(guān)節(jié)破壞的作用，抗αVβ3抗體的開發(fā)已實際進行。
但是，屬于整聯(lián)蛋白家族的受體在廣泛的組織中普遍地表達，承擔維持生命活動所必需的機能，因此，如果在風濕性關(guān)節(jié)炎和變形性關(guān)節(jié)炎的治療中使用抗整聯(lián)蛋白抗體，會出現(xiàn)其他部位也受到同樣抑制的可能性，有產(chǎn)生副作用的危險。
另外，WO 01/71358中公開了抑制α4整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白結(jié)合的物質(zhì)的篩選方法，以及使用篩選得到的物質(zhì)治療炎癥的方法等。
風濕性關(guān)節(jié)炎的病因有各種因素，已有很多報告，但都很不確定。另外，在其治療方法中，目前已知的都是對癥療法，也無法滿足需要。
因此，迫切需求明確風濕性關(guān)節(jié)炎的病因，提供更為優(yōu)異的治療方法，本發(fā)明的目的在于解決上述課題。
另外，風濕性關(guān)節(jié)炎難以與變形性關(guān)節(jié)病等區(qū)分，提供用于區(qū)別病癥的診斷方法也是本發(fā)明的課題之一。
發(fā)明的公開本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，風濕病患者和變形性關(guān)節(jié)病患者中，關(guān)節(jié)腔液的OPN濃度顯示較高值，還首次發(fā)現(xiàn)風濕病患者中，在所有OPN中經(jīng)凝血酶切割型的N末端片段所占比例增加。推斷OPN與這些疾病的發(fā)病有密切的關(guān)系。如后述參考例所示，通過使用OPN剔除小鼠進行的試驗，證實了這一事實。
另外，制備分別鑒別性地識別凝血酶切割的OPN的N末端片段以及C末端片段的抗體，用所述抗體進行試驗，發(fā)現(xiàn)在風濕性關(guān)節(jié)炎患者中的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，特別是被凝血酶切割的N末端片段顯示高濃度。
本發(fā)明人著眼于上述風濕性關(guān)節(jié)炎患者中高濃度出現(xiàn)的N末端片段中共同存在人整聯(lián)蛋白所識別的RGD序列和SVVYGLR序列的情況，推想同時阻斷兩個序列的抗體應(yīng)該可以廣泛抑制OPN與整聯(lián)蛋白的結(jié)合，對風濕性關(guān)節(jié)炎和變形性關(guān)節(jié)炎的治療有效。
并且，OPN也分布于腎臟、胎盤、卵巢、腦、皮膚等中，但主要在骨組織中表達。本發(fā)明人認為在治療風濕性關(guān)節(jié)炎時，最好是以對OPN一側(cè)更具特異性方法，來阻斷OPN與整聯(lián)蛋白的結(jié)合。此時，考慮到上述的各種各樣的整聯(lián)蛋白協(xié)同參與炎癥，因此，認為更廣泛地阻斷與這些各種整聯(lián)蛋白的結(jié)合應(yīng)是有效的方法。
，因此制備了抑制人OPN的RGD序列與整聯(lián)蛋白結(jié)合、人OPN的SVVYGLR序列與整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體，并通過細胞粘附和細胞遷移等實驗驗證了其效果。并獲得了抗小鼠OPN的該內(nèi)部序列所對應(yīng)的合成肽的抗體，使用小鼠關(guān)節(jié)炎病態(tài)模型研究了這種抗體作為治療藥物的效果。
即，在氨基酸序列中與人OPN同源的位置上，小鼠OPN上具有可為小鼠整聯(lián)蛋白所識別的RGD序列和SLAYGLR序列，因此獲得了同時阻斷這些序列的M5抗體。已證實該M5抗體與小鼠OPN及其凝血酶消化物的結(jié)合受到含有RGD序列的GRGDSP肽抑制，另外該M5抗體抑制被TNF-α活化的、來源于小鼠脾臟的單核細胞的遷移。用小鼠的顱蓋器官培養(yǎng)系研究該M5抗體時，觀察到抑制骨破壞的作用。并且，將上述抗體給與小鼠的膠原誘導性關(guān)節(jié)炎模型時，證實顯示出明確的治療效果。
上述結(jié)果強有力地表明同時阻斷RGD序列、SVVYGLR序列與人整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體抑制OPN與整聯(lián)蛋白的結(jié)合，對于風濕性關(guān)節(jié)炎等治療有效，并且，預期不僅對青少年關(guān)節(jié)風濕病和慢性風濕病等風濕病有效，對牛皮癬性關(guān)節(jié)炎和銀屑病的治療也有效。另外，器官移植后的慢性排斥的特征是出現(xiàn)血管和支氣管的閉塞性病變，從其組織學研究來看，認為是T細胞和巨噬細胞的活化導致產(chǎn)生細胞因子、增殖因子，引起血管內(nèi)皮細胞障礙，進一步由于血管平滑肌增殖引起纖維化等，向血管閉塞進一步發(fā)展(P.Freese等，(2001)Nephrol DialTransplant，16，2401-2406/J.R.Waller等，(2001)British Journal ofSurgery，88，1429-1441/S.R.Lehtonen等，(2001)Transplantation，72，1138-1144)。有報道指出在這些巨噬細胞活化和血管平滑肌纖維化的過程中，OPN作為必需蛋白發(fā)揮功能(A.O′Regan等，(2000)Int J ExpPathol，81，373-390)。本發(fā)明的OPN抑制抗體可通過抑制單核細胞和中性粒細胞的遷移，來抑制上述向纖維化發(fā)展的過程。因此預期可以抑制器官移植后的慢性排斥反應(yīng)，幫助器官存活，另外也對全身性自身免疫病、紅斑狼瘡、葡萄膜炎、貝切特病(Behcet’s disease)、多發(fā)性肌炎、增殖性腎小球腎炎、肉樣瘤病等自身免疫病的治療有效。
即本發(fā)明提供抑制識別RGD序列的整聯(lián)蛋白與OPN或其片段結(jié)合，且廣泛抑制識別SVVYGLR序列或其相當序列的整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段結(jié)合的抗骨橋蛋白抗體。
另外，本發(fā)明提供含有上述抗體作為有效成分的自身免疫病治療劑、風濕病治療劑以及風濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑。
本發(fā)明進一步提供將上述抗骨橋蛋白抗體給與風濕病患者以及風濕性關(guān)節(jié)炎患者，通過抑制骨橋蛋白的RGD序列與整聯(lián)蛋白結(jié)合和/或SVVYGLR序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合，治療自身免疫病、風濕病以及風濕性關(guān)節(jié)炎的方法。
另外，本發(fā)明進一步提供利用上述骨橋蛋白抗體的風濕病的診斷藥物以及診斷方法。
附圖簡述

圖1是顯示抑制RGD依賴型細胞粘附于OPN的圖。
圖2是顯示抗體2K1抑制α9轉(zhuǎn)化SW480細胞與nOPNRGD依賴型以及RGD非依賴型細胞粘附的圖。
圖3a是顯示OPN誘導細胞遷移的圖。
圖3b是顯示通過抗體抑制OPN誘導細胞遷移的圖。
圖4是顯示將觸發(fā)關(guān)節(jié)炎抗體混合劑/LPS分別給與OPN基因缺陷型小鼠和正常小鼠時關(guān)節(jié)炎計分隨時間的變化圖。
圖5是將觸發(fā)關(guān)節(jié)炎的抗體混合劑/LPS分別給與OPN基因缺陷型小鼠和正常小鼠時腕部腫大的比較圖。
圖6是顯示小鼠OPN與NIH3T3的濃度依賴型粘附的圖。
圖7是顯示GRGDSP肽抑制小鼠OPN與NIH3T3粘附的圖。
圖8是顯示抗體M5抑制小鼠OPN與NIH3T3粘附的圖。
實施發(fā)明的最佳方案本發(fā)明的抑制識別RGD序列的整聯(lián)蛋白與OPN或其片段結(jié)合、且抑制識別SVVYGLR序列或其相當?shù)男蛄械恼?lián)蛋白與OPN或其片段的結(jié)合的抗骨橋蛋白抗體(以下稱為“OPN抑制抗體”)，只要是可抑制識別RGD序列的整聯(lián)蛋白例如αvβ1、αvβ3和αvβ5等與OPN-a、OPN-b、OPN-c或其N末端片段結(jié)合，且可抑制識別SVVYGLR序列的整聯(lián)蛋白例如α9β1、α4β1和α4β7等與OPN-a、OPN-b、OPN-c或其N末端片段結(jié)合的抗體，則可以是任何抗體。SVVYGLR序列或其相當?shù)男蛄惺侵溉薕PN中從第162號絲氨酸到第168號精氨酸的序列，其相當?shù)男蛄惺侵钙渌溉閯游锏腛PN中相當于SVVYGLR的序列，例如在豬中與人類序列相同，為SVVYGLR；猴中為SVAYGLR；小鼠和大鼠中為SLAYGLR；牛中為SVAYGLK；兔中為SVAYRLK。本發(fā)明的OPN抑制抗體的制備方法并無特別限定，只要是制備保持上述性質(zhì)的抗體即可，例如可以使用包含OPN-a、OPN-b、OPN-c、它們的N末端片段或氨基酸序列RGDSVVYGLR序列或其相當序列的肽(以下將它們統(tǒng)稱為“OPN相關(guān)肽”)作為抗原來制備。這里所述OPN片段是指OPN經(jīng)過蛋白分解酶等分解的片段，例如經(jīng)過凝血酶分解的片段。
上述人OPN抑制抗體優(yōu)選使用含有RGDSVVYGLR序列的肽作為抗原來制備。更優(yōu)選例如以連續(xù)含有所述兩個序列的OPN-a的由第153號纈氨酸殘基至第169號絲氨酸殘基的肽(VDTYDGRGDSVVYGLRS)作為抗原使用，可以按照下述常規(guī)方法進行處理而獲得的抗體。為了提高抗原性，優(yōu)選以上述OPN相關(guān)肽與生物高分子化合物的結(jié)合物作為抗原使用。
另外，使用小鼠作為實驗動物進行與OPN有關(guān)的疾病等研究時，優(yōu)選使用針對小鼠OPN的OPN抑制抗體，這樣的抗體優(yōu)選使用含有RGDSLAYGLR序列的肽作為抗原來制備。
與上述OPN相關(guān)肽結(jié)合的生物高分子化合物的例子有匙孔血藍蛋白(以下稱為“KLH”)、卵清蛋白(以下稱為“OVA”)、牛血清白蛋白(以下稱為“BSA”)、兔血清白蛋白(以下稱為“RSA”)、甲狀腺球蛋白等，其中更優(yōu)選KLH和甲狀腺球蛋白。
上述OPN相關(guān)肽與生物高分子化合物的結(jié)合可以通過例如混合酸酐方法(B.F.Erlanger等，(1954)J.Biol.Chem.234，1090-1094)或活化酯法(A.E.Karu等，(1994)J.Argric.Food Chem.，42，301-309)等公知的的方法進行。
在混合酸酐方法中使用的混合酸酐可以使OPN相關(guān)肽通過通常的Schotten-Baumann反應(yīng)來獲得，將其與生物高分子化合物反應(yīng)，來制備目標肽-高分子化合物結(jié)合物。該混合酸酐方法中使用的鹵代甲酸酯包括例如氯代甲酸甲酯、溴代甲酸甲酯、氯代甲酸乙酯、溴代甲酸乙酯、氯代甲酸異丁酯等。該方法中的肽、鹵代甲酸酯及高分子化合物的使用比例可以在廣范圍內(nèi)進行適當選擇。
Schotten-Baumann反應(yīng)是在堿性化合物的存在下進行的，該反應(yīng)所使用的堿性化合物是Schotten-Baumann反應(yīng)所常用的化合物，例如可以使用三乙胺、三甲胺、吡啶、二甲基苯胺、N-甲基嗎啉、二氮雙環(huán)壬烯(DBN)、二氮雙環(huán)十一碳烯(DBU)、二氮雙環(huán)辛烷(DABCO)等有機堿；碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉等無機堿等。
另外上述反應(yīng)通常在-20℃至100℃，優(yōu)選在0℃-50℃下進行，反應(yīng)時間為5分鐘-10小時左右，優(yōu)選5分鐘-2小時。
得到的混合酸酐與生物高分子化合物的反應(yīng)通常在-20℃至150℃，優(yōu)選在0℃-100℃下進行，反應(yīng)時間為5分鐘-10小時左右，優(yōu)選5分鐘-5小時?；旌纤狒椒ㄍǔＴ谌軇┲羞M行，溶劑可以使用混合酸酐方法所常用的任一種溶劑，具體包括二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等鹵化烴；苯、甲苯、二甲苯等芳烴類；二乙醚、二噁烷、四氫呋喃、二甲氧基乙烷等醚類；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯類；N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、六甲替磷酰三胺等非質(zhì)子性極性溶劑等。
另一方面，活化酯法通?？梢匀缦逻M行。首先將OPN相關(guān)肽溶解于有機溶劑，在偶合劑存在下與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，生成N-羥基琥珀酰亞胺活化酯。
偶合劑可以使用縮合反應(yīng)中常用的偶合劑，例如二環(huán)己基碳二亞胺、羰基二咪唑、水溶性碳二亞胺等。另外，有機溶劑可以使用例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜、二噁烷等。反應(yīng)中使用的肽與N-羥基琥珀酰亞胺等偶合劑的摩爾比優(yōu)選1∶10-10∶1，最優(yōu)選1∶1。反應(yīng)溫度為0℃-50℃，優(yōu)選22℃-27℃，反應(yīng)時間為5分鐘-24小時，優(yōu)選1-2小時。反應(yīng)溫度可以在各物質(zhì)的熔點以上、沸點以下進行。
偶聯(lián)反應(yīng)后，向溶解了生物高分子化合物的溶液中加入反應(yīng)液，使其進行反應(yīng)，例如當生物高分子化合物含有游離氨基時，該氨基與肽的羧基之間生成酰胺鍵。反應(yīng)溫度為0-60℃，優(yōu)選5-40℃，更優(yōu)選22℃-27℃，反應(yīng)時間為5分鐘-24小時，優(yōu)選1-16小時，更優(yōu)選1-2小時。
將上述方法得到的OPN相關(guān)肽與生物高分子化合物的反應(yīng)物通過透析、脫鹽柱等進行純化，可以得到OPN相關(guān)肽與生物高分子化合物的結(jié)合物(以下可以簡稱為“結(jié)合物”)。
下面，對使用如上所述得到的結(jié)合物作為抗原制備抗體的方法以及使用該抗體的免疫化學測定方法進行說明。另外，制備抗體時，可以適當采用公知的方法，例如續(xù)生化學實驗講座、免疫生化學研究法(日本生化學會編)等中記載的方法。
使用上述結(jié)合物制備本發(fā)明的多克隆抗體時，可以用該結(jié)合物免疫動物，從該動物中收集抗體。
即，首先例如將OPN相關(guān)肽-甲狀腺球蛋白結(jié)合物等的結(jié)合物溶解于磷酸鈉緩沖液(以下稱為“PBS”)，將其與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑、或明礬等輔助劑混合后的混合物作為免疫原免疫哺乳動物。
被免疫的動物只要是該領(lǐng)域常用的即可，可以使用任一種動物，例如可以例舉小鼠、大鼠、兔、山羊、馬等。另外，免疫時免疫原的給與方法可以是皮下注射、腹膜為注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射中的任一形式，優(yōu)選皮下注射或腹膜內(nèi)注射。免疫可以進行一次或以適當間隔進行多次，優(yōu)選以1周至5周的間隔進行多次。
接著，按照常規(guī)方法采集免疫動物的血液，分離血清，純化多克隆抗體級分，可以獲得OPN抑制抗體。
另外，根據(jù)常規(guī)方法，將用上述結(jié)合物免疫動物而獲得的免疫細胞與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤，從該雜交瘤的培養(yǎng)物中收集抗體，可以得到作為單克隆抗體的OPN抑制抗體。
在將本發(fā)明的抗體用于人或動物的治療用途時，優(yōu)選使用通過基因工程、對所得到的OPN抑制抗體的恒定區(qū)進行修飾而具有與作為治療對象的人或動物的抗體相同的恒定區(qū)的嵌合抗體(參照歐洲專利公開公報EP0125023)；以及使用所述動物化抗體(參照歐洲專利公開公報EP0239400或EP045126)?；蛘邇?yōu)選利用人為地導入了與作為治療對象的人或動物的抗體產(chǎn)生有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)基因動物所制備的單克隆抗體(該動物型抗體)(參照歐洲專利公開公報EP0546073或WO97/07671)。
例如當治療對象為人、產(chǎn)生OPN抑制抗體的動物為小鼠時，優(yōu)選使用人鼠嵌合抗體或人源化抗體，進一步優(yōu)選使用導入了與抗體產(chǎn)生有關(guān)的人類基因的小鼠等的轉(zhuǎn)基因動物，來制備人單克隆抗體。另外，為了產(chǎn)生抗體，也可以使用噬菌體展示法。
對于如上所述得到的OPN抑制抗體，還可以以抗原識別區(qū)經(jīng)蛋白酶等切割后的Fv、Fab或F(ab′)2的形式使用。
根據(jù)需要，對如此得到的OPN抑制抗體進一步純化后，可以按照常規(guī)方法制成制劑，用于風濕性關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)風濕病和慢性風濕病等風濕病、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、銀屑病等的治療；抑制器官移植后的慢性排斥反應(yīng)；全身性自身免疫病、紅斑狼瘡、葡萄膜炎、貝切特病、多發(fā)性肌炎、增生性腎小球腎炎、肉樣瘤病等自身免疫病的治療。
本發(fā)明的OPN抑制抗體優(yōu)選可以作為風濕病治療藥或風濕性關(guān)節(jié)炎治療藥使用。這些風濕病治療藥等的劑型例如可以是注射劑、輸液等胃腸外制劑，優(yōu)選通過靜脈給藥、皮下給藥等的給藥途徑(作為自身免疫病治療藥時也可按照該途徑)。另外制成制劑時，可在藥學上可接受的范圍內(nèi)使用適合這些劑型的載體和添加劑。
制造上述制劑時，OPN抑制抗體的添加量根據(jù)患者的癥狀程度、年齡和所用制劑的劑型或OPN抑制抗體的結(jié)合效價等而不同，例如可以使用約0.1mg/kg至100mg/kg。
預計如上所述得到的本發(fā)明的治療藥通過有效成分OPN抑制抗體與OPN的RGD序列和SVVYGLR序列的強結(jié)合，抑制OPN的該部分與整聯(lián)蛋白的結(jié)合，從而可以抑制風濕病和風濕性關(guān)節(jié)炎以及除此之外的自身免疫病的癥狀的惡化。
本發(fā)明的OPM抑制抗體不是與整聯(lián)蛋白一側(cè)，而是與OPN一例特異性結(jié)合，因此預期減少抑制整聯(lián)蛋白的其他重要功能的危險性，避開副作用的問題。
本發(fā)明的OPN抑制抗體也可以進一步用于篩選自身免疫病治療藥的目的。即，如上所述，抑制OPN的RGD序列與整聯(lián)蛋白結(jié)合以及SVVYGLR序列與整聯(lián)蛋白結(jié)合的化合物均可以作為自身免疫病的治療藥。因此，向存在一定量的OPN和整聯(lián)蛋白的測定系統(tǒng)內(nèi)，競爭性地加入要篩選的物質(zhì)(受試物質(zhì))和OPN抑制抗體，構(gòu)成反應(yīng)系統(tǒng)，測定相對于所使用的OPN抑制抗體的量，OPN-整聯(lián)蛋白之間結(jié)合的抑制程度，則可評價受試物質(zhì)作為自身免疫病治療藥的應(yīng)用性。
同樣地，抑制OPN的RGD序列與整聯(lián)蛋白結(jié)合以及SVVYGLR序列與整聯(lián)蛋白結(jié)合的化合物可以作為風濕病或風濕性關(guān)節(jié)炎的治療藥，因此使用OPN抑制抗體，構(gòu)成與上述同樣的反應(yīng)系統(tǒng)，可以用于風濕病或風濕性關(guān)節(jié)炎的篩選。
另外，本發(fā)明的OPN抑制抗體可以用作風濕病診斷劑。如前所述，在風濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)中，特別發(fā)現(xiàn)經(jīng)過凝血酶切割的OPN的N末端片段的濃度高。因此，使用該OPN抑制抗體測定試樣中OPN或其末端片段的量，則可用于風濕病的診斷。其方法可以利用放射性同位素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvall等，(1980)Methods inEnzymol.，70，419-439)、熒光抗體法、噬斑法、斑點法、凝集法、Ouchterlony法等通常免疫化學測定方法中使用的各種方法(“雜交瘤方法與單克隆抗體”“Hybridoma Method and Monoclonal Antibody”，株式會社R&D Planning發(fā)行、第30-53頁，1982年3月5日)。
可以從各種觀點適當選擇上述方法，但從靈敏度、簡便性等方面考慮，優(yōu)選ELISA法。更優(yōu)選的方法有例如將本發(fā)明的OPN抑制抗體固定化于載體上，通過標記識別OPN上與本發(fā)明的OPN抑制抗體所識別的位點不同的位點的抗體，可以檢出OPN或其N末端片段，可以以此作為風濕性關(guān)節(jié)炎的診斷劑。
標記上述抗體所使用的標記物有辣根過氧化物酶(以下稱為“HR”)、堿性磷酸酶(以下稱為“AP”)等酶；異氰酸熒光素、羅丹明等熒光物質(zhì)；32P、125I等放射性物質(zhì)；化學發(fā)光物質(zhì)等。下面以夾心法為例，對更具體的OPN同種型的檢測方法的順序進行說明。首先(a)將本發(fā)明OPN同種型抗體固定化于載體上，然后，(b)用與抗原無關(guān)的例如蛋白質(zhì)來封閉為固定化抗體的載體表面。進一步(c)向其中加入含有各種濃度OPN同種型的試樣，生成OPN同種型-抗體復合物，(d)加入標記的抗OPN同種型抗體，與固定化抗原-抗體復合物結(jié)合，最后，(e)通過測定與載體結(jié)合的標記量，可以從事先制作的標準曲線中確定試樣中游離OPN同種型的量。
首先，在(a)步驟中，用于固定化抗體的載體并無特別限定，可以使用任何免疫化學測定方法中常用的載體。例如有聚苯乙烯制的96孔微量滴定板或氨基結(jié)合型的微量滴定板。另外，使抗體固定化時，例如可以向載體上加入含有抗體的緩沖液進行溫育?？梢允褂霉木彌_液，例如10mM的PBS。緩沖液中的抗體濃度可從較寬范圍內(nèi)選擇，通常為約0.01-100μg/ml，優(yōu)選0.1-20μg/ml。另外，使用96孔微量滴定板作為載體時，緩沖液的量為300μl/孔以下，更優(yōu)選約20-150μl/孔。溫育的條件并無特別限定，通常在4℃左右溫育過夜。
另外，由于在下面的步驟中添加的試樣中的OPN存在與抗原抗體反應(yīng)無關(guān)的吸附在載體上的情況，因此(b)的封閉步驟是為了防止這樣非特異性吸附而進行的。封閉劑可以使用例如牛血清清蛋白(BSA)和脫脂乳溶液?；蛘咭部墒褂檬惺鄣腂lock-Ace(大日本制藥Code No.UK-25B)等封閉劑。對此無具體限制，例如向固定化抗原的部分加入適量的Block-Ace，在約4℃下溫育過夜后，用緩沖液洗滌。對于緩沖液也無特別限定，例如可以是采用10mM PBS(pH 7.2)、0.8％(w/v)NaCl、0.02％(w/v)KCl和0.02％(v/v)吐溫20組成的緩沖液。
在(c)步驟中，通過使含有OPN同種型的試樣與固定化抗體接觸，用固定化抗體捕捉OPN同種型，生成固定化抗體-OPN同種型復合物?？梢栽?7℃左右反應(yīng)1小時，但反應(yīng)并不受此限定。反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖液洗滌載體，除去未反應(yīng)的蛋白質(zhì)等。該反應(yīng)中使用的緩沖液優(yōu)選為10mM PBS(pH7.2)、0.05％(v/v)吐溫20組成的緩沖液。
進一步在(d)步驟中，加入識別被固定化抗體捕捉的OPN同種型的其他表位的標記抗體，形成固定化抗體-OPN同種型-標記抗體復合物。優(yōu)選在該反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖液洗滌載體，除去未反應(yīng)的蛋白質(zhì)。該反應(yīng)使用的緩沖液可以使用上述(c)步驟中所述的緩沖液。
在上述(d)步驟中使用的標記抗體，要求識別與(a)步驟中的固定化抗體所識別的表位不同的表位。例如使用識別OPN同種型的前半?yún)^(qū)的多克隆抗體作為固定化抗體時，作為結(jié)合酶(例如HRP或AP等)的標記抗體，優(yōu)選使用識別OPN同種型的后半?yún)^(qū)的多克隆抗體。如上所述，通過使用識別不同位點的抗體，可以高靈敏度且特異性地測定因可變剪接而產(chǎn)生的OPN同種型。
(d)步驟中使用的標記抗體的量相對于與載體結(jié)合的固定化抗體為約5,000-10,000倍，優(yōu)選與稀釋的標記抗體反應(yīng)，以使最終測定時的最大吸光度為1.5-2.0?？梢允褂镁彌_液進行稀釋，在約37℃反應(yīng)約30分鐘，但反應(yīng)并不受此限定，優(yōu)選反應(yīng)后用緩沖液洗滌。通過上述反應(yīng)，可以使抗體-OPN同種型-標記抗體復合物與載體結(jié)合。
最后，在(e)步驟中，加入與固定化抗體-OPN同種型-標記抗體復合物的標記物反應(yīng)的顯色底物溶液，通過測定吸光度，可由標準曲線計算OPN的量。
使用過氧化物酶作為標記抗體的標記物時，例如可以使用含有過氧化氫和3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)的顯色底物溶液?？梢约尤腼@色底物溶液，在約25℃下反應(yīng)約20分鐘，然后加入1N硫酸，使酶促反應(yīng)終止，但顯色反應(yīng)并不受此限定。使用TMB的情況下，通過測定450nm的吸光度來測定顯色。另一方面，使用酶AP作為標記物的情況下，以對硝基苯磷酸(pMPP)作為底物顯色，加入2NNaOH使酶促反應(yīng)終止，在415nm下測定吸光度的方法是合適的。
事先通過添加了已知濃度的OPN同種型的反應(yīng)液的吸光度制作標準曲線，使用該標準曲線，可以計算試樣中的OPN同種型的濃度。
上述本發(fā)明的OPN同種型的檢測方法可用于闡明OPN的作用、OPN相關(guān)疾病的診斷、治療，該使用方法的例子有通過鑒別性地檢測經(jīng)凝血酶切割的OPN的N末端片段與未經(jīng)切割型OPN，可以檢測是否有炎癥異常，例如鑒別風濕病與變形性關(guān)節(jié)病的炎癥異常檢測試劑盒。
如上所述，在風濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，特別顯示出經(jīng)凝血酶切割的OPN的N末端片段的濃度高，但在變形性關(guān)節(jié)炎患者中，該傾向則顯著降低。由于每位患者中在上述關(guān)節(jié)腔內(nèi)OPN中N末端片段所占比例各有不同，因此為了鑒別性地診斷風濕病與變形性關(guān)節(jié)病，只要測定所有OPN中N末端片段所占的比例即可。
作為更具體的例子，可以針對OPN的三種同種型OPN-a、OPN-b和OPN-c均共同存在的下述三種序列，制備分別抗每種肽的抗體。
C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S(C+V153至S169) (1)K S K K F R R P D I Q Y P D A T D E C(K170至E187+C) (2)I P V K Q A D S G S S E E K Q C(I17至Q31+C)(3)其中，序列(1)存在于凝血酶切割位點的N末端一側(cè)，在凝血酶未切割型的全長OPN和N末端一側(cè)片段上都存在。而序列(2)存在于凝血酶切割位點至C末端一側(cè)，在凝血酶未切割型的全長OPN上存在，但在N末端一側(cè)片段上不含此序列。另外，序列(3)對應(yīng)于OPN的N末端一側(cè)第17號至第31號的氨基酸殘基，在凝血酶未切割型的全長OPN和N末端一側(cè)片段上都存在。用于鑒別風濕病患者與變形性關(guān)節(jié)病患者的診斷試劑盒可以由使用分別抗上述三種序列的肽的抗體中的2種的免疫檢測試劑構(gòu)成。即在第一免疫檢測試劑中，使用抗上述序列(3)和(2)所示肽的2種抗體，來定量測定試樣中被2種抗體共同識別的凝血酶未切割型OPN。此時，例如將抗序列(3)的肽的抗體固定化于載體上，使其與來源于患者的試樣反應(yīng)，洗滌后，可以加入抗序列(2)的肽的抗體作為標記抗體，根據(jù)與上述相同的夾心法檢測。另外，在第二免疫檢測試劑中，使用抗上述序列(1)和(3)所示肽的2種抗體，來定量測定試樣中被2種抗體共同識別的凝血酶未切割型OPN以及經(jīng)凝血酶切割而生成的N末端一側(cè)的片段兩者的總量。此時，例如將抗序列(1)的肽的抗體固定化于載體上，使其與來源于患者的試樣反應(yīng)，洗滌后，可以加入抗序列(3)的肽的抗體作為標記抗體，根據(jù)與上述相同的夾心法檢測。通過對同一患者的試樣用上述2種免疫檢測試劑檢測的結(jié)果進行比較，即可確定該患者的所有OPN中經(jīng)凝血酶切割而生成的N末端一側(cè)片段所占比例，從而可以鑒別風濕病和變形性關(guān)節(jié)病。
實施例下面例舉實施例和參考例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例等的任何限制。
實施例1GST-OPN融合蛋白的克隆、構(gòu)建、純化以及試劑對于克隆和蛋白質(zhì)純化，基本上按照文獻(S.Kon等，(2000)J.Cell.Biochem.77487-498)中記載的方法實施。
如下獲得人OPN同種型a、b的cDNA。以從人腎癌細胞株NRC-12細胞中制備的RNA作為模板，合成cDNA，并以此為模板，使用下述OPN-5、OPN-3引物進行PCR，分別獲得編碼含有信號肽區(qū)的全長人OPN-a和OPN-b的cDNA。
接著，如上述文獻所記載，將上述克隆的OPN-a和OPN-b的cDNA插入pGEX4T載體(Amersham Pharmacia Biotech，Tokyo，Japan)，使其與GST(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，EC2.5.1.18)基因為相同可讀框，使用大腸桿菌JM109，以GST融合蛋白表達(以下，將如此得到的GST-OPN融合蛋白分別稱為“GST-OPN-a”和“GST-OPN-b”)。
OPN-55’-CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3’OPN-35’-CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3’編碼人OPN-c同種型的cDNA是以上述OPN-a的cDNA為模板，通過二步PCR制備。第一步是將OPN-5與下述OPNct-3引物、下述OPNct-5與OPN-3引物分別進行PCR，將兩個PCR產(chǎn)物混合，通過加熱后慢慢冷卻使其退火，加入酶使其延伸。接著作為第二步，通過將OPN-5與下述OPN-3引物進行PCR，來獲得編碼含有信號肽區(qū)的全長人OPN-c的cDNA。按照與同種型a、b相同的方法，使該同種型c的cDNA重組到pGEX4T載體，制備GST融合蛋白(以下稱為“GST-OPN-c”)OPNct-35’-ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC-3’OPNct-55’-TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3’編碼從OPN-a的凝血酶切割位點到氨基末端一側(cè)一半(M1-R168)的cDNA是以上述OPN-a的cDNA為模板，使用OPN-5和下述的OPNnh-3引物進行PCR而獲得。按照與同種型a、b相同的方法重組到pGEX4T載體中，制備GST蛋白(以下稱為“GST-Nhalf”)。
OPNnh-35’-GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3’從OPN-a的凝血酶切割位點到羧基一側(cè)的骨橋蛋白蛋白質(zhì)(hOPNC half)是以O(shè)PN-a的cDNA為模板，通過兩步PCR制備的。第一步是用OPN-5、下述OPNch-3引物、下述OPNch-5與OPN-3引物分別進行PCR。第二步通過用OPN-5與OPN-3引物進行PCR，來制備羧基一側(cè)的OPN蛋白質(zhì)。按照與同種型a、b相同的方法，重組到pGEX4T載體中，制備GST蛋白(以下稱為“GST-Chalf”)OPNch-35’-TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3’OPNch-55’-CACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3’各種重組GST-OPN融合蛋白可以按照常規(guī)方法由大腸桿菌中制備，根據(jù)上述文獻所述方法，使用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱進行純化。其中對于GST-Nhalf蛋白，使用預切割蛋白酶(PreScission；AmershamPharmacia Biotech)將連接部分切開，除去GST蛋白部分，得到只由OPN的氨基末端一側(cè)一半(I17-R168)構(gòu)成的蛋白(以下稱為“nOPN”)。
另一方面，進一步將編碼全長OPN-a(M1-N314)的cDNA插入pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen)，用其轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞(大日本制藥(株))(以下稱為“CHO/OPN-a細胞”)。如下所述對由該細胞得到的糖鏈結(jié)合型OPN-a(以下稱為“CHO/OPN-a”)進行純化。即，對CHO/OPN-a細胞的培養(yǎng)上清液通過使用DEAE-瓊脂糖凝膠CL-6B柱(AmershamPharmacia Biotech)進行離子交換層析、使用ULTROGEL AcA44柱(BioSepra SA)進行凝膠過濾層析，接著采用RESOURCE RPC柱(Amersham Pharmacia Biotech)的反向柱層析進行純化。
用于免疫致敏和結(jié)合研究的各種肽均購自Sigma Genosis Japan，或用肽合成儀(型號432 A、PerkinElmer Life Science)，按照Fmoc法(N-(9-芴基)甲氧羰基)化學合成，然后通過C18反向柱層析純化制得。
實施例2單克隆抗體的制備準備以下所示的人OPN的內(nèi)部序列所對應(yīng)的合成肽，用于免疫。
肽1；C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S (C+V153至S169)肽2；C I D S Q E L S K V S R E F H S H (C+I261至H276)其中，肽1具有分別識別αvβ3和α9β1整聯(lián)蛋白受體的RGD和SVVYGLR序列。
使這些肽與甲狀腺球蛋白結(jié)合，按照常規(guī)方法，用于小鼠的免疫。然后從經(jīng)過免疫的小鼠中分離脾細胞，使用聚乙二醇，與小鼠骨髓瘤細胞P3-X63-Ag8-653進行細胞融合。根據(jù)文獻(M.Kinebuchi等，(1991)J.Immunol.，146，3721-3728)所述方法，選擇與用于免疫的肽反應(yīng)的雜交瘤。
從用肽1和2免疫的小鼠中分別得到了命名為2K1和4C1的單克隆抗體。產(chǎn)生單克隆抗體2K1的雜交瘤于2001年6月20日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，保藏號為FERM BP-7883。另外，單克隆抗體53(mAb53)是用全長重組人OPN進行免疫而獲得的(D.S.Bautista等，(1994)J.Biol.Chem.，269，23280-23285)。
實施例3OPN及其凝血酶消化物與單克隆抗體的反應(yīng)性使用蛋白質(zhì)印跡法，測試實驗例2中得到的單克隆抗體2K1和4C1與OPN及其凝血酶消化物的結(jié)合力。表明2K1抗體與GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Nhalf反應(yīng)。另外表明4C1抗體與GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Chalf反應(yīng)。進一步表明這些單克隆抗體不但與由大腸桿菌生產(chǎn)的糖鏈非結(jié)合型重組OPN結(jié)合，也與糖鏈結(jié)合型CHO/OPN-a蛋白及其凝血酶消化物(以下稱為“凝血酶切割型OPN”)反應(yīng)。
實施例4單克隆抗體抑制細胞粘附于OPN通過以下方法研究單克隆抗體是否抑制細胞粘附于OPN。首先，在4℃下，用各種濃度的CHO/OPN-a預包被96孔板過夜，然后在37℃條件下，以0.5％BSA的PBS進行10分鐘的處理以便封閉非特異性粘附。使人成纖維細胞TIG-7或用整聯(lián)蛋白α9亞基cDNA轉(zhuǎn)化的SW480細胞(以下稱為“α9轉(zhuǎn)化SW480細胞”)懸浮于含有0.25％BSA的D-MEM中，在各種濃度的單克隆抗體或合成肽的存在或不存在下，將200μl細胞懸浮液(細胞濃度為5×104細胞/孔)注入預包被CHO/OPN-a或nOPN的96孔板中，在37℃下孵育1小時。
從板上除去培養(yǎng)基，用含有0.25％BSA的D-MEM將所有孔洗滌2次。固定粘附的細胞，用溶于20％甲醇中的0.5％結(jié)晶紫染色30分鐘。
用水將所有孔沖洗3次，使粘附的細胞溶于20％乙酸。將由各孔得到的所產(chǎn)生的上清液用免疫讀出儀(immunoreader)分析，測定590nm下的吸收，求出粘附于孔上的細胞的相對數(shù)量。全部測定均進行3次，進行至少3次獨立實驗。所示數(shù)值為至少3個獨立的實驗的平均值。
已知TIG-7很好地粘附于OPN，但如圖1A所示，該粘附明顯地受到GRGDSP肽(100μg/ml)的抑制，不受對照肽(OPN的C末端部分K296-N314)(100μg/ml)的抑制，因此為RGD依賴型。另外，如圖1B所示，表明200μg/ml的2K1抗體抑制細胞粘附于OPN。并且如圖1C所示，2K1的細胞粘附抑制效果與mAb53所顯示的效果相當，為濃度依賴型。2K1和mAb53并不抑制TIG-7細胞粘附于玻連蛋白(VN)和纖連蛋白(FN)。
圖2顯示單克隆抗體對nOPN和玻連蛋白與α9轉(zhuǎn)化SW480細胞的粘附的抑制的圖。如圖2A所示，1μg/ml玻連蛋白與α9轉(zhuǎn)化SW480細胞的粘附受到200μM GRGDSP肽(PGD)的抑制，因此為RGD依賴型。α9轉(zhuǎn)化SW480細胞對3μg/ml nOPN的粘附受到200μM GRGDSP肽(PGD)和抗α9β1單克隆抗體Y9A2(A.Wang等，(1996)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，15，664-672)的組合的抑制，因此為RGD依賴型和非依賴型的粘附。另外，圖2B顯示了2K1對α9轉(zhuǎn)化SW480細胞與nOPN和玻連蛋白的粘附的影響。α9轉(zhuǎn)化SW480細胞與玻連蛋白的粘附不受2K1的抑制，但與nOPN的粘附受到2K1的抑制。結(jié)果表明2K1具有RGD依賴性的粘附抑制功能。
實施例5單克隆抗體對OPN誘導單核細胞遷移的抑制通過ChemoTx101-8系統(tǒng)(Neuro Probe Inc.)進行使用U937細胞的細胞遷移實驗。使細胞在含有0.1％BSA的D-MEM中的濃度為2×106細胞/ml，加入到濾膜(孔徑8μm)的上層，下層加入OPN蛋白質(zhì)。
在37℃、5％CO2存在下，將ChemoTx板靜置4小時。靜置后，用甲醇固定濾膜，用蘇木精和曙紅(H-E)染色。以400倍放大倍數(shù)計數(shù)顯微鏡下遷移到濾膜的背面的細胞數(shù)。試驗進行3次，取平均值作為數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖3所示。
圖3a顯示相對于所示濃度的CHO/OPN-a、凝血酶切割型OPN和GST-Nhalf，U937細胞的細胞遷移。另外，圖3b為在50μg/ml的經(jīng)過抗原特異性純化的2K1、mAb53或?qū)φ招∈驣gG存在下或不存在下，使用10μg/ml的各OPN的抑制測定。
如圖3a和圖3b所示，CHO/OPN-a、凝血酶切割型OPN和GST-Nhalf濃度依賴性地誘導人單核細胞U937的遷移(A)。2K1抗體明顯抑制由CHO/OPN-a、凝血酶切割型OPN和GST-Nhalf誘導的單核細胞的遷移。而mAb53只抑制由全長OPN所誘導的單核細胞的遷移(B)。
參考例1OPN與關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)為了了解關(guān)節(jié)炎中OPN的作用，按照常規(guī)方法，人工制備OPN基因缺陷型小鼠(S.R.Rittling等，(1998)J.Bone and Mminer.Res.，13(7)，1101-1111)，與正常小鼠進行比較實驗。
分別對OPN基因缺陷型小鼠(OPN-/-)和正常小鼠(OPN+/+)使用市售的關(guān)節(jié)炎觸發(fā)用單克隆抗體混合劑(商品名關(guān)節(jié)炎用混合劑、Arthrogen-CIAmAb，Arthritogenic mAb cocktail、巖井化學藥品)，作為引發(fā)關(guān)節(jié)炎的藥物，按照產(chǎn)品說明書給藥，引發(fā)關(guān)節(jié)炎，觀察發(fā)病程度。使用給予生理鹽水的兩只小鼠作為對照。
關(guān)節(jié)炎發(fā)病程度通過下述的關(guān)節(jié)炎計分和給藥10天后腕部腫脹程度進行比較。結(jié)果如圖4和圖5所示。
圖4表明在給予關(guān)節(jié)炎用混合劑/脂多糖(以下稱為“LPS”)的正常小鼠中，自第4天起關(guān)節(jié)計分上升，至第10天達到最高(12以上)。而在OPN基因缺陷型小鼠中，自第5天起關(guān)節(jié)計分上升，但最高只是4以下。另外，在給予生理鹽水的組中，均未見關(guān)節(jié)炎計分的上升。
如圖5所示，OPN基因缺陷型小鼠的腕部的腫脹明顯比正常小鼠的程度弱，表明了OPN與關(guān)節(jié)炎有關(guān)。
實施例62K1抗體對人外周血白細胞遷移的抑制活性按照下述方法研究2K1抗體對細胞因子活化的人外周血白細胞遷移的抑制活性。對中性粒細胞遷移的抑制活性結(jié)果如表1所示，對單核細胞遷移的抑制活性結(jié)果如表2所示。
<實驗方法>
用Ficoll法從健康人外周血中分離單核細胞級分和中性粒細胞級分(P.M.Daftarian等，(1996)Journal of Immunology，157，12-20)。對于單核細胞，收集Ficoll與血清之間的中間層，在燒瓶中在37℃下培養(yǎng)1小時，使用貼壁細胞。向收集了單核細胞級分后剩余的紅細胞層中加入5倍量的3％葡聚糖-PBS，使紅細胞凝集，然后在4℃下，以150×g離心5分鐘。
凝集的紅細胞沉淀，中性粒細胞以懸浮狀態(tài)存在于上清中，因此通過將該級分在室溫下、以500×g離心20分鐘，得到中性粒細胞。將上述得到的單核細胞和中性粒細胞在TNF-α(20ng/mL)中培養(yǎng)過夜，將活化的細胞用于遷移實驗。
使用48孔微量趨化室(micro chemotaxis chamber)(Neuro Probe Inc.)進行遷移實驗。事先在37℃下，以各種濃度向凝血酶切割型OPN中添加2K1抗體，放置15分鐘，然后加入到下室中(人OPN的終濃度為10μg/mL)。從上面裝入聚碳酸酯濾膜(孔徑5μm)，再向上室中加入50μL的細胞懸浮液(2×106細胞/mL)。
在37℃、5％CO2存在下培養(yǎng)2小時，然后取出聚碳酸酯濾膜，除去濾膜上側(cè)表面的細胞，然后將浸潤于濾膜背面的細胞用Diff-Quick(Baxter)染色。以40倍放大倍數(shù)顯微鏡計數(shù)染色的細胞數(shù)。結(jié)果以6孔平均細胞數(shù)(細胞/mm3)±SD表示。
<實驗結(jié)果>
2K1抗體抑制了由TNF-α活化的人外周血中性粒細胞和單核細胞向凝血酶切割型OPN的遷移。
對中性粒細胞遷移的抑制

**P＜0.01(單因素ANOVA，Dunnett檢驗)對單核細胞遷移的抑制[表2]

**P＜0.01(單因素ANOVA，Dunnett檢驗)實施例7M5抗體的制備準備如下所示的小鼠OPN的內(nèi)部序列(C+V138至R153)所對應(yīng)的合成肽，用于免疫。
M5肽CVDVPNGRGDSLAYGLR將該肽與甲狀腺球蛋白結(jié)合，按照常規(guī)方法同其免疫兔。采集經(jīng)免疫兔的抗血清，使用使M5肽N末端的半胱氨酸與thiol Sepharosebeads(硫代瓊脂糖凝膠微珠)(Amersham Pharmacia Biotech)通過二硫鍵結(jié)合的柱制備M5抗體。
實施例8OPN及其凝血酶消化物與M5抗體的反應(yīng)性采用蛋白質(zhì)印跡法測試實施例7中得到的M5抗體對OPN及其凝血酶消化物的結(jié)合力。所用OPN為由CHO細胞生產(chǎn)的糖基化重組小鼠OPN。M5抗體與OPN及其凝血酶消化物發(fā)生反應(yīng)。
實施例9M5抗體抑制細胞粘附于OPN根據(jù)文獻(S.Kon等，(2002)J.Cell.Biochem.，84(2)，420-432)所述方法研究M5抗體是否抑制細胞粘附于OPN。OPN使用由預切割蛋白酶(Amersham Pharmacia Biotech)除去了GST部分的小鼠全長OPN(以下稱為“mOPN/de-GST”)。細胞使用小鼠NIH3T3細胞。
如圖6所示，NIH3T3細胞濃度依賴性地粘附于mOPN/de-GST。另外，如圖7所示，該粘附明顯地受到GRGDSP肽(100μg/mL)的抑制，因此是RGD依賴型。圖8表明200μg/mL的M5抗體抑制了細胞粘附于OPN。
實施例10M5抗體對來源于小鼠脾臟的單核細胞遷移的抑制活性根據(jù)下述方法研究M5抗體對細胞因子活化的、來源于小鼠脾臟的單核細胞遷移的抑制活性。結(jié)果如表3所示。
<實驗方法>
用載玻片將C57BL/6小鼠的脾細胞搗碎成為單細胞，在37℃下在燒瓶中培養(yǎng)1小時，使用貼壁細胞作為單核細胞。將該單核細胞在人TNF-α(20ng/mL)中培養(yǎng)過夜，將活化的細胞用于遷移實驗。遷移實驗按照與上述實施例6中人的情況同樣的方法進行。
<實驗結(jié)果>
M5抗體抑制由TNF-α活化的來源于小鼠脾臟的單核細胞向由牛凝血酶(Sigma)將小鼠全長OPN(Genzyme)切割而得到的凝血酶切割型小鼠OPN的遷移。


**P＜0.05(單因素ANOVA，Dunnett檢驗)實施例11M5抗體對骨破壞的抑制作用根據(jù)下述方法研究M5抗體對小鼠顱蓋器官培養(yǎng)系統(tǒng)中骨破壞的抑制作用，結(jié)果如表4所示。
<實驗方法>
取下出生1天的新生小鼠的顱骨，取其一半調(diào)整為合適大小，放入24孔板的各個孔中。向其中加入添加了終濃度為10nM的人甲狀旁腺激素(PTH)(1-34)的D-MEM培養(yǎng)液(添加10％牛血清)，引發(fā)骨破壞。添加M5抗體，使終濃度為200μg/mL。在37℃下培養(yǎng)1小時后，用CaliumETest WAKO(和光純藥)定量測定由骨中釋放到培養(yǎng)液中的鈣量。
<實驗結(jié)果>
未添加PTH的試樣顯示出7.02mg/mL的鈣值，添加PTH，鈣值為9.11mg/mL，可見促進了鈣從骨中向外釋放。以200μg/mL的濃度添加M5抗體，則可證實骨吸收受到約70％的抑制。


**P＜0.01(單因素ANOVA，Dunnett檢驗)實施例12M5抗體在小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型中的效果根據(jù)下述方法研究M5抗體在小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型中的效果。關(guān)節(jié)炎計分的結(jié)果如表5所示，足部浮腫的結(jié)果如表6所示，體重變化的結(jié)果如表7所示，攝食量變化的結(jié)果如表8所示。
<實驗方法>
使用識別膠原中4個特異性表位的關(guān)節(jié)炎觸發(fā)抗體混合劑(商品名關(guān)節(jié)炎用混合劑Arthrogen-CIAmAb，Arthritogenic mAb cocktail，巖井化學藥品)誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。將該關(guān)節(jié)炎混合劑對小鼠靜脈給藥，3天后，通過腹膜內(nèi)給予LPS(100μg)誘發(fā)。自給予LPS后的第3天起觀察關(guān)節(jié)炎，第6天達到最高分。
在給予LPS之前和給予后第3天，以40μg、150μg或400μg的劑量靜脈給予M5抗體。其對照組為給予兔IgG組(給藥量400μg)。另外，在給予LPS之前和給予后第3天，以200μg/小鼠的劑量靜脈給予抗小鼠TNF-α抗體。其對照組為給予大鼠IgG組(給藥量200μg)。另外，自給予LPS日起，按照每天一次的頻率經(jīng)口給予MTX(給藥量3.2mg/kg)。此時使用的MTX是溶解于5ml的0.5％甲基纖維素溶液的MTX。作為其對照組，給予5ml 0.5％甲基纖維素溶液。
每組5只，進行關(guān)節(jié)炎計分、足部浮腫、體重變化、攝食量4個項目的評價。
<實驗結(jié)果>
如表5至表8所示，M5抗體對小鼠關(guān)節(jié)炎模型(治療效果)顯示了改善關(guān)節(jié)炎計分、延遲發(fā)病和改善足部浮腫等的明確的抑制作用。對于關(guān)節(jié)炎發(fā)病的抑制是劑量依賴性，抑制程度超過給予抗小鼠TNF-α抗體(給藥量200μg/小鼠)所產(chǎn)生的效果。與此相反，MTX幾乎未顯示藥效。
在該模型的正常組中，進一步觀察到在給予LPS后3天內(nèi)，體重顯著減輕約3g，雖然之后減輕的比率稍有緩和，但持續(xù)到第3-6天。而給予M5抗體組(150μg、400μg)以及給予抗小鼠TNF-α抗體組中表示出明顯對體重減輕的改善。另外，關(guān)于攝食量，至給予LPS后第3天，對任何藥劑均觀察到體重急劇減輕，但在第3-6天中，觀察到給予M5抗體組和給予抗小鼠TNF-α抗體組有改善。對關(guān)節(jié)計分的效果如表5所示、抑制足部浮腫的效果如表6所示、體重變化以及攝食量變化分別見表7和表8。


**P＜0.01，*P＜0.05(非參數(shù)Mann-Whitney檢驗)

*P＜0.05(非參數(shù)Mann-Whitney檢驗)


**P＜0.01，*P＜0.05(單因素ANOVA，Dunnett檢驗)








實施例13OPN相關(guān)片段肽的獲得可以從Auspep Inc.(Parkiville，Australia)購入HPLC色譜純化的OPN相關(guān)片段肽。其氨基酸序列如下述(1)-(3)所示。
hOPN5C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S(C+V153至S169) (1)hOPN3K S K K F R R P D I Q Y P D A T D E C(K170至E187+C) (2)hOPN1I P V K Q A D S G S S E E K Q C(I17至Q31+C)(3)
實施例14免疫用抗原的制備根據(jù)EMCS(N-(6-馬來酰亞胺基己酰氧基)-琥珀酰亞胺)法，如下制備OPN相關(guān)片段肽與甲狀腺球蛋白的結(jié)合物。制備結(jié)合物時，甲狀腺球蛋白與OPN相關(guān)片段肽及EMCS的摩爾比分別為1∶300∶400。
分別將4mg實施例13的各OPN相關(guān)片段肽溶解于約1ml的蒸餾水中。將溶解于1ml 0.01M磷酸緩沖液(pH7.0)的5mg甲狀腺球蛋白、用二甲基甲酰胺溶解的80μg/μl EMCS分別按照上述摩爾比混合，制備甲狀腺球蛋白-EMCS復合物溶液。將該復合物溶液分為3份，按照上述摩爾比分別向其中加入各種上述OPN相關(guān)片段肽溶液，制備由EMCS交聯(lián)的OPN相關(guān)片段肽與甲狀腺球蛋白的結(jié)合物溶液。
該結(jié)合物溶液用PBS透析，調(diào)節(jié)至結(jié)合物濃度為10μg/μl。將這樣得到的OPN相關(guān)片段肽與甲狀腺球蛋白的結(jié)合物作為免疫用抗原使用。
實施例15篩選用抗原的制備作為篩選用OPN蛋白，GST與人OPN同種型的融合蛋白GST-OPN-a、GST-OPN-b和GST-OPN-c、由凝血酶切割位點至氨基一側(cè)的OPN片段(GST-Nhalf)、以及至羧基一側(cè)的OPN片段(GST-Chalf)分別按照實施例1所述的方法制備，用于抗血清與OPN的反應(yīng)性。
實施例16免疫致敏使用實施例14中得到的OPN相關(guān)片段肽與甲狀腺球蛋白的結(jié)合物作為免疫用抗原，對兔進行免疫。通過間隔1周或2周給予100μl(100μg)結(jié)合物溶液來進行免疫。作為抗原，只在初次免疫時與弗氏完全佐劑混合，從第二次起則與弗氏不完全佐劑混合。免疫8次后，進行采血，分離血清，將其作為抗血清。
實施例17抗血清與OPN的反應(yīng)性將實施例13中制備的OPN相關(guān)片段肽用0.1M碳酸緩沖液(pH9.5)稀釋，使?jié)舛葹?0μg/ml，以50μl/孔固定于96孔板中。用PBS洗滌，用0.1％BSA/PBS/0.05％NaN3溶液封閉，然后將實施例16中得到的抗血清的100倍稀釋液依次稀釋2倍，向孔中加入50μl，在37℃下反應(yīng)30分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后，用0.05％吐溫20-PBS洗滌4次，向各孔中加入各50μlHRP標記抗兔IgG(IBL Co.，Ltd.)，在37℃下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，向各孔中加入各100μl含有0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD)和0.03％過氧化氫水溶液的0.05M檸檬酸緩沖液(pH4.5)，在室溫下以避光放置15分鐘，讓其顯色。顯色后，向各孔中加入100μl 1N硫酸，使反應(yīng)終止，測定492nm的吸光度。
另一方面，使用實施例15中制備的OPN蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)印跡法研究抗血清的反應(yīng)性。結(jié)果，針對OPN相關(guān)片段肽hOPN1和hOPN5的抗血清，與GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Nhalf反應(yīng)，但不與GST-Chalf反應(yīng)。針對OPN相關(guān)片段肽hOPN3的抗血清，與GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Chalf反應(yīng)，但不與GST-Nhalf反應(yīng)。
實施例18制備抗OPN相關(guān)片段肽抗體與HRP的結(jié)合物如下制備針對OPN相關(guān)片段肽hOPN3和hOPN1的抗體與HRP的結(jié)合物。用胃蛋白酶消化20mg各種抗OPN相關(guān)片段肽抗體，通過凝膠過濾純化抗OPN相關(guān)片段肽抗體的F(ab′)2片段，使用2-巰基乙醇將F(ab′)2片段還原為Fab′片段。在37℃下，將HRP與EMCS反應(yīng)60分鐘，通過凝膠過濾制備HRP-EMCS結(jié)合物，進一步將該結(jié)合物與抗OPN相關(guān)片段肽抗體Fab′片段在4℃下反應(yīng)過夜，通過凝膠過濾制備由EMCS交聯(lián)的抗OPN相關(guān)片段肽抗體與HRP的結(jié)合物。
實施例19夾心ELISA系統(tǒng)的構(gòu)建用夾心ELISA用平板與標記抗體的組合制備1-3、5-1兩種系統(tǒng)。其中，1-3系統(tǒng)如下制備。將10μg/ml抗OPN相關(guān)片段肽hOPN1抗體加入96孔ELISA用平板，每孔100μl。在4℃反應(yīng)過夜后，用10％BSA/PBS/NaN3溶液進行封閉，以此狀態(tài)作為夾心ELISA用平板。以實施例18制備的抗OPN相關(guān)片段肽hOPN3抗體與HRP的結(jié)合抗體作為標記抗體。以這樣使用抗hOPN1抗體的固相平板和使用抗hOPN3抗體的標記抗體的組合作為1-3系統(tǒng)。
同樣，以使用抗hOPN5抗體的固相平板和使用抗hOPN1抗體的標記抗體的組合構(gòu)建5-1系統(tǒng)。
實施例20以夾心ELISA系統(tǒng)進行受試者骨橋蛋白的測定如下進行OPN蛋白質(zhì)的測定。向1-3系統(tǒng)和5-1系統(tǒng)的夾心ELISA用平板中加入100μl含有采集于受試者的血漿和關(guān)節(jié)腔液試樣的溶液，在37℃下反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，用0.05％吐溫20-PBS洗滌4次，分別向各系統(tǒng)中加入100μl特異性標記抗體，在4℃下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，用0.05％吐溫20-PBS洗滌6次，加入100μl TMB溶液(四甲基聯(lián)苯胺)，在室溫下避光放置30分鐘。用1N硫酸使反應(yīng)終止，測定450nm的吸光度。
由上述方法測定的風濕病患者關(guān)節(jié)腔液(13例)的OPN值如表9所示，變形性關(guān)節(jié)病患者的關(guān)節(jié)腔液(12例)的OPN值如表10所示。另外，風濕病患者血漿(16例)的OPN值如表11所示，變形性關(guān)節(jié)病患者血漿(7例)的OPN值如表12所示，正常人血漿(6例)的OPN值如表13所示。
這些結(jié)果表明在血漿中OPN值的比較中，在1-3系統(tǒng)中風濕性關(guān)節(jié)炎患者、變形性關(guān)節(jié)病患者與健康人之間并未見顯著性差異。但在5-1系統(tǒng)中風濕性關(guān)節(jié)炎患者、變形性關(guān)節(jié)病患者與健康人比較，其測定值顯著偏高，風濕性關(guān)節(jié)炎患者為最高。這顯示5-1系統(tǒng)反映出的總OPN量在關(guān)節(jié)炎類總體診斷中的有效性。
另一方面，風濕性關(guān)節(jié)炎患者及變形性關(guān)節(jié)病患者的關(guān)節(jié)腔液的OPN值較血漿中的OPN值高，強烈顯示局部產(chǎn)生了OPN。
另外，在風濕性關(guān)節(jié)炎患者與變形性關(guān)節(jié)病之間關(guān)節(jié)腔液中OPN值的比較中，使用1-3和5-1的兩個系統(tǒng)，風濕性關(guān)節(jié)炎患者的OPN值均較變形性關(guān)節(jié)癥患者顯著偏高。
作為新的指標，進一步研究了1-3系統(tǒng)/5-1系統(tǒng)的OPN值比。該指標可以比較凝血酶切割型OPN的比例。風濕性關(guān)節(jié)炎患者的血漿和關(guān)節(jié)腔液的OPN值為1以下，變形性關(guān)節(jié)病患者為2以上，可見顯著性差異。因此，利用1-3系統(tǒng)/5-1系統(tǒng)的OPN值，可用作可區(qū)分風濕病患者與變形性關(guān)節(jié)病患者的早期檢查方法。






序列表<110>株式會社免疫生物研究所(Immuno-Biological Laboratories Co.，Ltd.)藤澤藥品工業(yè)株式會社(Fujisawa Pharmaceutical Co.，Ltd.)<120>抗骨橋蛋白抗體及其應(yīng)用<130>PF-020002-WO<140>
<141>
<150>JP 2001-290700<151>2001-09-25<150>JP 2001-107578<151>2001-04-05<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(1)hOPN5<400>1Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg Ser
<210>2<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(2)hOPN3<400>2Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg ProAsp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr1 5 10 15Asp Glu Cys<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(3)hOPN1<400>3Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Cys1 5 10 15<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPN-5<400>4cgggatccac taccatgaga attgcagtga tttgc 35<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPN-3<400>5ccgctcgagt taattgacct cagaagatgc actatc 36<210>6<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNct-3<400>6acacagcatt cttttccaca gaacttccag aatcagc37<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNct-5
<400>7tgaggaaaag aatgctgtgt cctctgaaga aaacc 35<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNnh-3<400>8gcctcgagtt acctcagtcc ataaaccaca ct 32<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNch-3<400>9tcttagattt ggcacaggtg atgcctagga g 31<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNch-5
<400>10cacctgtgcc aaatctaaga agtttcgcag a 31<210>11<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽1<400>11Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg Ser<210>12<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽2<400>12Cys Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu Phe His Ser1 5 10 15His<210>13
<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述M5肽<400>13Cys Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>14Ser Val Val Tyr Gly Arg Leu1 5<210>15<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>15
Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser1 5 10<210>16<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>16Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg1 5 10 15Ser<210>17<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>17Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg Ser1 5 10<210>18<211>17<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>18Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg1 5 10 15Ser
權(quán)利要求
1.抗骨橋蛋白抗體，所述抗骨橋蛋白抗體抑制識別RGD序列的整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合，并且抑制識別SVVYGLR序列或其相當?shù)男蛄械恼?lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合。
2.抗骨橋蛋白抗體，所述抗骨橋蛋白抗體抑制識別RGD序列的整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合，并且抑制α9β1整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合。
3.抗骨橋蛋白抗體，所述抗骨橋蛋白抗體抑制識別RGD序列的整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合，并且抑制α4整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合。
4.抗骨橋蛋白抗體，所述抗骨橋蛋白抗體抑制識別RGD序列的整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合，并且抑制α9β1整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合、以及α4整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段的結(jié)合。
5.抗骨橋蛋白抗體，其中權(quán)利要求1-4的片段為骨橋蛋白N末端片段。
6.權(quán)利要求1-5的任一項的抗骨橋蛋白抗體，其中所述抗體是以含有部分氨基酸序列RGDSVVYGLR的肽作為抗原而得到的。
7.權(quán)利要求1-6的任一項的抗骨橋蛋白抗體，其中所述抗體是以含有部分氨基酸序列RGDSVVYGLRS的肽作為抗原而得到的。
8.權(quán)利要求1-7的任一項的抗骨橋蛋白抗體，其中所述抗體是以肽VDTYDGRGDSVVYGLRS作為抗原而得到的。
9.權(quán)利要求1-5的任一項的抗骨橋蛋白抗體，其中所述抗體是以含有部分氨基酸序列RGDSLAYGLR的肽作為抗原而得到的。
10.權(quán)利要求1-5的任一項的抗骨橋蛋白抗體，其中所述抗體是以肽CVDVPNGRGDSLAYGLR作為抗原而得到的。
11.權(quán)利要求1-10的任一項的抗骨橋蛋白抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
12.權(quán)利要求1-8的任一項的抗骨橋蛋白抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
13.權(quán)利要求1-8的任一項的抗骨橋蛋白抗體，其中所述抗體是人類抗體。
14.自身免疫病治療藥，所述治療藥含有權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體作為有效成分。
15.風濕病治療藥，所述治療藥含有權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體作為有效成分。
16.風濕性關(guān)節(jié)炎治療藥，所述治療藥含有權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體作為有效成分。
17.變形性關(guān)節(jié)病治療藥，所述治療藥含有權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體作為有效成分。
18.自身免疫病的治療方法，其特征在于將權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體給予自身免疫病患者。
19.風濕病的治療方法，其特征在于將權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體給予風濕病患者。
20.風濕性關(guān)節(jié)炎的治療方法，其特征在于將權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體給予風濕性關(guān)節(jié)炎患者。
21.變形性關(guān)節(jié)病的治療方法，其特征在于將權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體給予變形性關(guān)節(jié)病患者。
22.自身免疫病治療藥的篩選方法，其特征在于評價受試化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合和/或SVVYGLR序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合的抑制程度。
23.風濕病治療藥的篩選方法，其特征在于評價受試化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合和/或SVVYGLR序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合的抑制程度。
24.風濕性關(guān)節(jié)炎治療藥的篩選方法，其特征在于評價受試化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合和/或SVVYGLR序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合的抑制程度。
25.變形性關(guān)節(jié)病治療藥的篩選方法，其特征在于評價受試化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合和/或SVVYGLR序列與整聯(lián)蛋白的結(jié)合的抑制程度。
26.抗骨橋蛋白同種型抗體，所述抗體是通過使骨橋蛋白同種型所對應(yīng)的片段肽與生物高分子化合物結(jié)合，用該結(jié)合物免疫動物，由該動物收集抗體而獲得。
27.權(quán)利要求26的抗骨橋蛋白同種型抗體，其中所述骨橋蛋白同種型所對應(yīng)的片段肽是以下式(1)、(2)或(3)所示的肽，C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S(1)K S K K F R R P D I Q Y P D A T D E C (2)I P V K Q A D S G S S E E K Q C(3)
28.診斷方法及檢測用的試劑盒，所述方法和試劑盒通過檢測骨橋蛋白的N末端片段來鑒別風濕性關(guān)節(jié)炎和變形性關(guān)節(jié)病的炎癥異常。
29.使用關(guān)節(jié)腔液或血漿用于權(quán)利要求28的炎癥異常鑒別的方法及檢測試劑盒。
30.用于檢測炎癥異常的試劑盒，所述試劑盒包含利用權(quán)利要求27的3種抗骨橋蛋白同種型抗體中2種抗體的組合的第一免疫檢測試劑和利用不同的2種抗體組合的第二免疫檢測試劑的組合。
31.權(quán)利要求29的炎癥異常檢測試劑盒，其中所述第一免疫檢測試劑所使用的2種抗體分別為抗以下式(3)和(2)I P V K Q A D S G S S E E K Q C (3)K S K K F R R P D I Q Y P D A T D E C (2)所示肽的抗體；所述第二免疫檢測試劑所使用的2種抗體分別為抗以下式(1)和(3)C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S (1)I P V K Q A D S G S S E E K Q C (3)所示肽的抗體。
32.權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體在制備自身免疫病治療藥中的應(yīng)用。
33.權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體在制備風濕病治療藥中的應(yīng)用。
34.權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體在制備風濕性關(guān)節(jié)炎治療藥中的應(yīng)用。
35.權(quán)利要求1-13的任一項的抗骨橋蛋白抗體在制備變形性關(guān)節(jié)病治療藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了抑制識別RGD序列的整聯(lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段結(jié)合，并且抑制識別SVVYGLR序列或其相當?shù)男蛄械恼?lián)蛋白與骨橋蛋白或其片段結(jié)合的抗骨橋蛋白抗體。該抗體可用作自身免疫病治療藥、風濕病治療藥以及風濕性關(guān)節(jié)炎的治療藥，并提供治療自身免疫病、風濕病及風濕性關(guān)節(jié)炎的方法。另外該骨橋蛋白抗體也可用于風濕病的診斷劑和診斷方法。
文檔編號G01N33/68GK1513000SQ0281108
公開日2004年7月14日 申請日期2002年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月5日
發(fā)明者上出利光, 今重之, 佐伯行彥, 橫崎恭之, 野田政樹, 山本宣哉, 之, 哉, 彥, 樹 申請人:株式會社免疫生物研究所, 藤澤藥品工業(yè)株式會社