結(jié)合到rsv g蛋白的人類抗體的制作方法
【專利說明】結(jié)合到RSVG蛋白的人類抗體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)。本發(fā)明尤其設(shè)及特異性結(jié)合到呼吸道合胞體病毒巧SV)的附著 糖蛋白（G蛋白）并且中和RSV的抗體和抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還設(shè)及使用抗RSV抗體的 診斷、預(yù)防W及治療方法。 陽00引發(fā)明背景
[0003] 人類呼吸道合胞體病毒巧SV)是副粘病毒科（Paramyxoviridae)的一種負(fù)義單鏈 RNA病毒，該科還包括常見呼吸道病毒，如導(dǎo)致麻疹和腮腺炎的呼吸道病毒。存在兩種原始 RSV亞型：亞型A和亞型B。RSV在上呼吸道中復(fù)制并且然后蔓延到下氣道，導(dǎo)致細(xì)支氣管 炎或肺炎。該病毒引起炎癥、氣道水腫、粘液產(chǎn)生增加W及呼吸上皮破裂。
[0004] 估計(jì)全世界有6400萬例呼吸道疾病和160, 000例死亡可歸因于RSV誘發(fā)的疾病。 嚴(yán)重RSV感染最通常出現(xiàn)在兒童和嬰兒中、尤其早產(chǎn)兒中。潛在健康問題（如慢性肺病或 先天性屯、臟?。┛赡軙?huì)顯著增加重病的風(fēng)險(xiǎn)。RSV感染還可能會(huì)在年老者、患有慢性肺病的 個(gè)體W及免疫功能不全的成人（如骨髓移植接受者）中引起重病。 陽0化]已經(jīng)研究若干用W預(yù)防和治療RSV感染的方法。從供體分離的靜脈注射免疫球蛋 白巧SV-IGIV;Resp沿am⑧）和單克隆抗體帕利珠單抗（SYNA創(chuàng)滬'）已經(jīng)得到批準(zhǔn)用 于在高風(fēng)險(xiǎn)早產(chǎn)兒中進(jìn)行RSV預(yù)防。然而，用于RSV的疫苗或可商購(gòu)治療仍不可獲得。僅 利己韋林（一種RNA抑制劑）得到批準(zhǔn)用于治療RSV感染。為了有效用于治療RSV感染， 高劑量、重復(fù)給藥和/或大量的抗體產(chǎn)品（如帕利珠單抗）因低有效性而是所需的。
[0006] RSV具有兩種主要表面糖蛋白，F(xiàn)和G。F蛋白介導(dǎo)融合，使得病毒進(jìn)入到細(xì)胞 的細(xì)胞質(zhì)中并且促進(jìn)體外合胞體的形成。F蛋白序列在RSV株之中是充分（約90% ) 保守的（約翰遜（Johnson)和柯林斯（Collins),《普通病毒學(xué)雜志》（JGenVirol), (1988)69:2623-2628)。唯一市售的單克隆抗體帕利珠單抗針對(duì)RSV的F蛋白。
[0007] RSV的G蛋白是一種嚴(yán)重糖基化并且充當(dāng)附著蛋白的表面蛋白。與F蛋白對(duì)比，G 蛋白在病毒株中除中央保守域（CCD)外相當(dāng)可變，該中央保守域包含RSVA2株的G蛋白的 氨基酸殘基153-184或其他病毒株中的相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。中央保守域和相鄰區(qū)（殘基 145-193)W剛性和重0-糖基化粘蛋白樣區(qū)為邊界。中央保守域的N末端那一半含有一個(gè) 在多于700種病毒株之中保守的小區(qū)。C末端那一半含有4個(gè)W1-4、2-3布局連接的保守 半脫氨酸并且折疊為一個(gè)脫氨酸套索。
[0008] 盡管使用針對(duì)G蛋白的抗體進(jìn)行的被動(dòng)免疫一般由于在病毒株中缺乏序列保 守性而被視為不切實(shí)際的，但中和結(jié)合到RSVG蛋白的單克隆抗體是已知的。安德森 L.J. (Anderson,L.J.)等人（《病毒學(xué)雜志》（J.Virol.) (1988)62:4232-4238)描述了F和 G鼠類單克隆抗體混合物的中和能力，運(yùn)些抗體之一結(jié)合到RSVG蛋白（即131-2G)。運(yùn)種 抗體的抗原位點(diǎn)后來由薩倫德（Sullender)定義（《病毒學(xué)》(Virol.) (1995)209:70-79)。 發(fā)現(xiàn)運(yùn)種抗體結(jié)合代表RSV的主要病毒株的RSV組A和B。另外，WO2009/055711披露了 與RSVA2的G蛋白內(nèi)的保守基元具有免疫反應(yīng)性并且針對(duì)RSVA和B亞型具有中和活性 的抗體，如3D3和3G12。運(yùn)些抗體已經(jīng)顯示識(shí)別中央保守域中的線性表位，但尚未在優(yōu)選動(dòng) 物模型（即棉花大鼠）中進(jìn)行測(cè)試用于評(píng)估RSV抗體和疫苗。
[0009] 鑒于特別是在幼兒和年老者中由RSV引起的呼吸道疾病的嚴(yán)重程度，持續(xù)需要用 W預(yù)防和治療RSV感染的有效手段。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明提供了特異性結(jié)合到RSVG蛋白并且能夠中和RSV的分離的抗體和其抗原 結(jié)合片段。運(yùn)些抗體和抗原結(jié)合片段優(yōu)選地能夠特異性結(jié)合到并且中和亞型A和B的RSV。 優(yōu)選地，運(yùn)些抗體是人類抗體。運(yùn)些抗體結(jié)合到該RSVG蛋白的中央保守未糖基化區(qū)（也 稱為中央保守域，CCD)中的表位。
[0012] 運(yùn)些抗體和抗原結(jié)合片段對(duì)于該G蛋白具有高親和力并且具有有力的中和能力。 運(yùn)些本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段單獨(dú)和與其他診斷、預(yù)防和/或治療劑組合可用作診 斷、預(yù)防和/或治療劑。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了組合物，運(yùn)些組合物包含一種或多種本發(fā)明的抗體和/或其 抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還提供了使用運(yùn)些抗RSV抗體的診斷、預(yù)防W及治療方法。預(yù)防和 治療方法包括將運(yùn)些抗RSV抗體和/或其抗原結(jié)合片段給予人類受試者用于預(yù)防或治療一 種RSV感染和RSV介導(dǎo)的疾病或病狀和/或改善一種RSV感染的一種或多種癥狀。多種不 同抗RSV抗體和/或其抗原結(jié)合片段和/或與其他抗RSV抗體的組合可W用于組合療法。 還提供了包含運(yùn)些抗RSV抗體和/或其抗原結(jié)合片段與其他預(yù)防或治療劑組合的組合物。 本發(fā)明還提供了編碼運(yùn)些抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸分子。
[0014] 運(yùn)些本發(fā)明的抗體是獨(dú)特的，在于至少在一種體外中和分析中，針對(duì)RSVA和B型 運(yùn)些抗體比任何已知抗RSVG抗體、特別是比已知抗RSVG單克隆抗體3D3更有力。
[0015] 運(yùn)些本發(fā)明的抗體結(jié)合到該RSVG蛋白上的獨(dú)特表位。
[0016] 在某些實(shí)施例中，運(yùn)些抗體包含一個(gè)在其氨基酸序列中包含一種CXXXXC基元的 重鏈CDR3。
[0017] 在某些實(shí)施例中，運(yùn)些抗體和其抗原結(jié)合片段是獨(dú)特的，在于它們與抗RSVF抗體 疊加和/或協(xié)同地起作用。
【附圖說明】
[0018] 凰I示出了針對(duì)RSVGa和RSV抓蛋白的結(jié)合特征曲線。在化ISA分析中測(cè)試 IgG結(jié)合到重組RSVGa和Gb蛋白的胞外域的能力。開口圈（虛線）表示結(jié)合到Ga巧SVA/ 長(zhǎng)）并且閉口圈（實(shí)線）表示結(jié)合到Gb巧SVB/B1)。
[0019] 圖2示出了針對(duì)RSV-A和RSV-B株的中和特征曲線。在中和分析中測(cè)試IgG中和 RSV-A和RSV-B株的能力。開口圈（虛線）表示中和RSV-A巧SVA/A2)并且閉口圈（實(shí)線） 表示中和RSV-B巧SVB/18537)。
[0020] Ml示出了RSVG特異性單克隆抗體與RSVG膚的結(jié)合巧LISA)?？缭街醒氡Ｊ?域的短和長(zhǎng)RSVG膚（表15)在一種化ISA中用于結(jié)合實(shí)驗(yàn)，其中RSVG特異性mAb的濃 度不同：CB003. 1 (閉口黑色圈，實(shí)線）、CB010. 7 (開口黑色圈，虛線），或無單克隆抗體（閉 口淺灰色圈）。
[0021] 圖4 :通過化DScan講行的最小表仿定仿。RSVG蛋白特異性抗體與中央?yún)^(qū)巧SV-G A型和B型的殘基145-201)的所有完全重疊5聚體（mer)、8聚體、10聚體、14聚體、18聚 體、25聚體W及32聚體膚的結(jié)合活性。與一種膚的結(jié)合活性W與化pScanELISA信號(hào)成比 例的垂直線形式示出。
[0022] 圖5 :通討P巧Scan進(jìn)行的CB003. 1和CB010. 7表位的完全取代分析。單克隆 抗體CB003. 1和CB010. 7對(duì)應(yīng)地在100和30ng/mL下與一種膚的結(jié)合活性W與化pscan ELISA信號(hào)成比例的垂直線形式示出。具有20條線的每一組對(duì)應(yīng)于針對(duì)初始14聚體膚 (FHFEVFNFVPCSIC)中的每個(gè)氨基酸位置設(shè)定的完全置換。在每一組的20條線內(nèi)，取代是基 于單字母氨基酸代碼按字母順序的（ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY)并且初始14聚體膚的反應(yīng)性 W灰色條形式示出。
[0023]圖6:RSVG蛋白中央?yún)^(qū)的丙氨酸掃描（P巧Scan)。對(duì)應(yīng)于A型（左圖）和B型（右 圖）的RSV-G中央域的殘基161-192的膚的所有位置處的丙氨酸取代。A型的位置180處 的丙氨酸被甘氨酸取代。初始膚的反應(yīng)性W灰色條形式示出。
[0024] Ml示出了單克隆抗體與RSV G蛋白中央?yún)^(qū)的天然存在的變體的結(jié)合。mAb CB003. 1和CB010. 7與對(duì)應(yīng)于可用的A型（上圖）和B型（下圖）變體的不同膚的結(jié)合。 野生型膚的反應(yīng)性W灰色條形式示出。 陽0巧]圖8示出了抗RSVGmAb在激發(fā)后第4天在棉花大鼠RSV-A/長(zhǎng)模型中關(guān)于肺和 鼻甲病毒負(fù)荷的預(yù)防功效。 陽0%] 圖9示出了抗RSVGmAb在激發(fā)后第4天在棉花大鼠RSV-A/長(zhǎng)模型中關(guān)于肺和 鼻甲病毒負(fù)荷的治療功效。
[0027]圖10示出了在激發(fā)后第6天抗RSVGmAb在棉花大鼠RSV-A/長(zhǎng)模型中關(guān)于組織 病理學(xué)分?jǐn)?shù)的治療功效。 陽0測(cè)發(fā)明說明
[0029] 定女
[0030]W下給出如本發(fā)明中所用的術(shù)語的定義。
[00川如在此所用，術(shù)語"包括（included)"或"包括著（including)"被視為后面有措 辭"無限制"。
[0032] 如在此所用，術(shù)語"抗體"是指免疫球蛋白分子，包括單克隆抗體，如嵌合、人類化 或人類單克隆抗體。術(shù)語"抗體"包括本領(lǐng)域中已知的所有免疫球蛋白類別和子類。取決 于其重鏈的恒定域的氨基酸序列，抗體可W被分成五種主要完整抗體類別：IgA、I曲、I姐、 IgGW及IgM，并且運(yùn)些類別中的數(shù)種可W進(jìn)一步被分成子類（同種型），例如IgAl、IgA2、 IgGl、IgG2、IgG3W及IgG4。
[0033] 術(shù)語抗原結(jié)合片段是指一種免疫球蛋白的包含抗原結(jié)合和/或可變域的片段，運(yùn) 些片段與完整免疫球蛋白為特異性結(jié)合到免疫球蛋白（即RSVG蛋白）的結(jié)合伴侶而競(jìng) 爭(zhēng)。無關(guān)于結(jié)構(gòu)，抗原結(jié)合片段與由完整免疫球蛋白識(shí)別的相同抗原結(jié)合。抗原結(jié)合片段 尤其包括F油、F(油'）、F(油'）2、Fv、dAb、Ft互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)片段、單鏈抗體（scFv)、 二價(jià)單鏈抗體、（單）域抗體、雙功能抗體、=功能抗體、四功能抗體、至少含有一種免疫球 蛋白的足W致使特異性抗原結(jié)合到（多）膚的一個(gè)片段的（多）膚等。一種抗原結(jié)合片 段可W包含包括抗體的氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、 100、125、150、175、200或250個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的一種氨基酸序列的一種膚或多膚?？乖?結(jié)合片段可W合成地或通過使完整免疫球蛋白酶促或化學(xué)裂解而產(chǎn)生，或它們可W通過重 組DM技術(shù)而基因工程化。產(chǎn)生方法在本領(lǐng)域中是熟知的并且在例如《抗體：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》 (Antibodies:AL油oratoryManual)，E.哈洛化Harlow)和D萊恩值,Lane)編（1988)， 冷泉港實(shí)驗(yàn)室（ColdSpring化rborL油oratory),冷泉港（ColdSpring化rbor)，紐約 (NewYork)中進(jìn)行描述，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合在此。一種抗體或其抗原結(jié)合片段可W具有 一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如果存在多于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，那么運(yùn)些結(jié)合位點(diǎn)可W與彼此相同或 它們可W是不同的。
[0034] 如在此所用，術(shù)語"克隆抗體"是指具有單一特異性的抗體分子。一種單克隆抗體 對(duì)于一種具體表位呈現(xiàn)一種單一結(jié)合特異性和親和力。因此，術(shù)語"人類單克隆抗體"是指 一種呈現(xiàn)一種單一結(jié)合特異性的抗體，該抗體具有衍生自或基于人類生殖系免疫球蛋白序 列或衍生自完全合成序列的可變和恒定區(qū)。制備單克隆抗體的方法與結(jié)合特異性不相關(guān)。
[0035] 如在此所用，術(shù)語"功能變體"是指一種抗體，該抗體包含與一種參考抗體的核巧 酸和/或氨基酸序列相比通過一個(gè)或多個(gè)核巧酸和/或氨基酸而改變的一種核巧酸和/或 氨基酸序列并且能夠與參考抗體為特異性結(jié)合到結(jié)合伴侶（即RSV)而競(jìng)爭(zhēng)。換句話說，參 考抗體的氨基酸和/或核巧酸序列中的修飾不顯著影響或改變由該核巧酸序列編碼或含 有該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征，即該抗體仍能夠特異性識(shí)別并且結(jié)合其標(biāo)祀。功能變 體可W具有保守序列修飾，包括核巧酸和氨基酸取代、添加W及缺失。運(yùn)些修飾可W通過本 領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（如定點(diǎn)誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變）引入，并且可W包含天然W 及非天然核巧酸和氨基酸。
[0036] 如在此關(guān)于本發(fā)明的抗體所用，術(shù)語"中和"是指能夠通過中和或抑制其生物效應(yīng) 和/或降低RSV的感染滴度而防止或抑制一種細(xì)胞受病毒感染的抗體，無關(guān)于實(shí)現(xiàn)中和的 機(jī)制。中和可W例如通過抑制病毒與細(xì)胞表面的附著或粘著或通過抑制病毒與細(xì)胞膜在病 毒與標(biāo)祀細(xì)胞附著之后的融合等來實(shí)現(xiàn)。
[0037] 如在此關(guān)于一種抗體與其結(jié)合伴侶（例如一種抗原）的相互作用所用，術(shù)語"特異 性結(jié)合"意指相互作用取決于該結(jié)合伴侶上一種具體結(jié)構(gòu)（例如一種抗原決定子或表位） 的存在。換句話說，即使當(dāng)該結(jié)合伴侶存在于其他分子或生物體的混合物中時(shí)，該抗體也優(yōu) 先結(jié)合或識(shí)別該結(jié)合伴侶。結(jié)合可W由共價(jià)或非共價(jià)相互作用或兩者的組合介導(dǎo)。又換句 話說，術(shù)語"特異性結(jié)合"意指該抗體與一種抗原決定子或表位具有特異性免疫反應(yīng)性并且 與其他抗原決定子或表位不具有免疫反應(yīng)性。（免疫）特異性結(jié)合到一種抗原的一種抗體 可W按較低親和力結(jié)合到其他膚或多膚，如通過例如放射免疫分析巧IA)、酶聯(lián)免疫吸附分 析巧LISA)、BIAC0RE或本領(lǐng)域中已知的其他分析測(cè)定。特異性結(jié)合到一種抗原的抗體或其 片段可W與攜帶相同表位的相關(guān)抗原具有交叉反應(yīng)性。優(yōu)選地，特異性結(jié)合到一種抗原的 抗體或其片段與其他抗原不交叉反應(yīng)。
[0038] 發(fā)巧詳細(xì)說巧
[0039] 在一個(gè)第一方面，本發(fā)明提供了能夠特異性結(jié)合到呼吸道合胞體病毒巧SV)的G 蛋白并且能夠中和RSV的抗體和抗原結(jié)合片段。運(yùn)些抗體優(yōu)選地能夠特異性結(jié)合到并且中 和亞型