專利名稱：濃度測(cè)量方法、濃度測(cè)量用具以及濃度測(cè)量裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由試料液(例如血液等生化試劑及其調(diào)整液)測(cè)量待測(cè)對(duì)象(如葡萄糖和膽固醇等)的濃度的技術(shù)。
背景技術(shù)：
在膽固醇的定量方法中，有一種利用酶反應(yīng)的方法。其中有代表性的方法是使用葡糖氧化酶(GOD)的方法。GOD是與作為輔酶的黃素腺二核苷酸(FAD)結(jié)合而成的糖蛋白質(zhì)，使用GOD時(shí)的葡萄糖的酶反應(yīng)按照下述化學(xué)式所示進(jìn)行(式中的FADH2表示FAD的還原型)Glucose+GOD/FAD→δ-Gluconolactone+GOD/FADH2在臨床醫(yī)學(xué)中測(cè)量血糖值時(shí)，也有通過測(cè)量隨葡萄糖濃度的變化而引起的吸光度的變化而對(duì)葡萄糖濃度進(jìn)行定量的方法，但一般采用電流滴定法對(duì)葡萄糖濃度進(jìn)行測(cè)量的方法。電流滴定法廣泛用作便攜式血糖值測(cè)量裝置的葡萄糖濃度測(cè)量方法。
使用電流滴定法的血糖值測(cè)量方法，以測(cè)量氧化電流的情況為例，如下所述。首先，第1步是構(gòu)筑可使血液、酶和氧化型電子傳遞體(介質(zhì))共存的反應(yīng)體系。由此，在上述酶反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，通過由該酶反應(yīng)生成的FADH2與介質(zhì)之間的氧化還原反應(yīng)生成還原型介質(zhì)。常用作介質(zhì)的有鐵氰化鉀，此時(shí)的反應(yīng)式如下述化學(xué)式所示。
其次，第2步是通過用1對(duì)電極給反應(yīng)體系施加電壓，將亞鐵氰化鉀氧化(釋放電子)，如下述化學(xué)式所述生成鐵氰化鉀。而來自亞鐵氰化鉀的電子供給到陽極。
再次，第3步是測(cè)量因施加電壓而產(chǎn)生的氧化電流值，同時(shí)根據(jù)該測(cè)量值計(jì)算葡萄糖濃度。
在使用便攜式血糖值測(cè)量裝置測(cè)量血糖時(shí)，使用在電極之間形成了含有酶和介質(zhì)的試劑層的葡萄糖傳感器，同時(shí)，向試劑層供血，由此在電極間構(gòu)成反應(yīng)體系。用這種葡萄糖傳感器，可通過將其安裝在便攜式血糖測(cè)量裝置上，給電極間施加電壓，同時(shí)測(cè)量氧化電流值，根據(jù)該氧化電流值確定血液中的葡萄糖濃度。
如上所述，所用酶通常為GOD，介質(zhì)通常使用鐵氰化鉀。但在GOD和鐵氰化鉀組合的反應(yīng)體系中，以電流滴定法為代表的電化學(xué)方法測(cè)量葡萄糖濃度的方法中存在下述問題。
其一是還原性物質(zhì)的影響。例如，設(shè)想測(cè)量血液中葡萄糖濃度時(shí)的情況，血液中還同時(shí)存在除葡萄糖以外的其它還原性物質(zhì)(例如抗壞血酸、谷胱甘肽、Fe(II)2+)。當(dāng)給反應(yīng)體系施加電壓時(shí)，如果除亞鐵氰化鉀以外，還同時(shí)存在其它還原物質(zhì)，則除了來自亞鐵氰化鉀的電子以外，隨著電壓的施加來自于還原性物質(zhì)的電子也被供至電極。結(jié)果，在測(cè)得電流值中也包括因還原性物質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的本底電流(干擾)。因此，測(cè)得的葡萄糖濃度會(huì)高于葡萄糖的實(shí)際濃度。隨著施加在電極之間的電壓值越大，被氧化的還原性物質(zhì)的種類和量就越多，該測(cè)量誤差也就表現(xiàn)得越顯著。所以，當(dāng)用鐵氰化鉀作為介質(zhì)時(shí)，必須先對(duì)實(shí)測(cè)值進(jìn)行修正，然后再?zèng)Q定最終濃度，從而不能以高精度實(shí)施血糖測(cè)量。還原性物質(zhì)的影響不僅限于血糖值測(cè)量時(shí)，在根據(jù)氧化電流值計(jì)算濃度時(shí)，對(duì)其它成分也同樣有影響。
其它問題還有，當(dāng)使用便攜式血糖測(cè)量裝置和葡萄糖傳感器測(cè)量葡萄糖濃度時(shí)，葡萄糖傳感器的保存穩(wěn)定性方面會(huì)出現(xiàn)問題。鐵氰化鉀易受光和水的影響而減弱，會(huì)因暴露在光和水中而由葡萄糖以外的環(huán)境中得到電子形成還原型的亞鐵氰化鉀。當(dāng)發(fā)生這種情況后，反應(yīng)體系內(nèi)就形成由酶反應(yīng)而形成的還原型亞鐵氰化鉀與因暴露而形成的還原型亞鐵氰化鉀共存的局面。結(jié)果，與上述還原性物質(zhì)時(shí)的情況一樣，施加電壓時(shí)的氧化電流也包括來自因暴露而形成的亞鐵氰化鉀的本底電流。所以，所測(cè)得的葡萄糖濃度會(huì)高于實(shí)際的葡萄糖濃度。為控制這種問題的發(fā)生，就需要避免葡萄糖傳感器的試劑層暴露，從而需要將葡萄糖傳感器封入由不透光性材料制成的包裝袋等內(nèi)。且為延長(zhǎng)葡萄糖傳感器的壽命，需要由氮?dú)庵脫Q處理等避免水分的影響，以在濕度降低的狀態(tài)下密封，因此不便于進(jìn)行葡萄糖傳感器的工業(yè)化批量生產(chǎn)，并會(huì)造成成本增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種能以較低成本降低本底電流的影響、并精確測(cè)量試料液中的待測(cè)對(duì)象的濃度的技術(shù)。
本發(fā)明第1方面所提供的待測(cè)對(duì)象的濃度測(cè)量方法的特征在于，構(gòu)筑含有待測(cè)對(duì)象、氧化還原酶以及電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系，利用電化學(xué)方法測(cè)量待測(cè)對(duì)象的濃度，上述電子傳遞物質(zhì)使用Ru化合物。
上述濃度測(cè)量方法優(yōu)選為包括在反應(yīng)體系內(nèi)生成Ru化合物的還原體的第1步驟；對(duì)反應(yīng)體系施加電壓，將還原體氧化，同時(shí)測(cè)量與此時(shí)由還原體釋放出的電子量相應(yīng)的響應(yīng)電流值的第2步驟；根據(jù)上述第2步驟中測(cè)得的響應(yīng)電流值，計(jì)算待測(cè)對(duì)象的濃度的第3步驟。
在本發(fā)明的濃度測(cè)量方法中，既可在反應(yīng)體系為不加電壓的狀態(tài)下的第1步驟后進(jìn)行反應(yīng)體系為施加電壓狀態(tài)下的第2步驟，也可從供給至少含有待測(cè)對(duì)象的試料液時(shí)繼續(xù)使反應(yīng)體系為施加電壓的狀態(tài)，同時(shí)進(jìn)行第1步驟和第2步驟。
第2步驟中加在第1電極和第2電極之間的電壓優(yōu)選為一定電壓。該電壓值優(yōu)選為在還原型Ru(II)配位體和氧化型Ru(III)配位體之間的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(vs.標(biāo)準(zhǔn)氫電極)以上、且小于亞鐵氰化離子與鐵氰化離子之間的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(vs.標(biāo)準(zhǔn)氫電極)。施加在第1電極和第2電極之間的一定電壓為例如100～500mV，更優(yōu)選為100～300mV。
第1步驟的時(shí)間為0～10秒，而第3步驟中作為葡萄糖濃度計(jì)算基礎(chǔ)的計(jì)算用電流值優(yōu)選采用由第2步驟起算經(jīng)3秒以上的一定時(shí)間后測(cè)量的電流值。更優(yōu)選采用以第1步驟時(shí)間為0～3秒、由上述第2步驟開始3～5秒范圍內(nèi)的一定時(shí)間內(nèi)測(cè)得的電流值作為計(jì)算用電流值。
本發(fā)明的第2方面提供一種濃度測(cè)量用具，其特征在于，具有基板、形成于該基板上的至少存在的第1電極和第2電極、呈固體狀的試劑層，上述試劑層含有氧化還原酶和Ru化合物，且在供給含有待測(cè)對(duì)象的試料液時(shí)溶解，構(gòu)成液相反應(yīng)體系。
試劑層的構(gòu)成優(yōu)選為在供給了試料液后，液相反應(yīng)體系中的氧化還原酶和Ru化合物共存。
在本發(fā)明的第1和第2方面中，Ru化合物優(yōu)選為以氧化型Ru配位體的形式存在于反應(yīng)體系中。對(duì)Ru配位體除要求可作為介質(zhì)(電子傳遞體)發(fā)揮功能之外，對(duì)該配位體的種類則沒有特別限定，但氧化型配位體優(yōu)選使用以下述化學(xué)式表示的物質(zhì)。
n+化學(xué)式中的X可以舉出NH3、鹵離子、CN、吡啶、煙酰胺和H2O，其中優(yōu)選為NH3和鹵離子。化學(xué)式中的n+表示由X的種類所決定的氧化型Ru(III)配位體的價(jià)數(shù)。
當(dāng)Ru化合物為氧化型Ru(III)配位體時(shí)，所選擇的電子傳遞系統(tǒng)應(yīng)使得僅通過例如由氧化還原酶催化的待測(cè)對(duì)象的氧化反應(yīng)和氧化型Ru(III)配位體的還原反應(yīng)這兩個(gè)反應(yīng)生成還原型Ru(II)配位體。
反應(yīng)體系為例如均勻或近似均勻地將相對(duì)量較少的氧化還原酶和相對(duì)量較多的氧化型Ru(III)配位體分散的均勻或近似均勻的液相反應(yīng)體系。此時(shí)，反應(yīng)體系的各處近似均勻地生成還原型Ru(II)配位體。
作為待測(cè)對(duì)象，可以舉出葡萄糖、膽固醇、乳酸、抗壞血酸等。
氧化還原酶根據(jù)待測(cè)對(duì)象的種類而選擇，優(yōu)選為選自葡糖脫氫酶(GDH)(包括后述的αGDH以及CyGDH)、葡糖氧化酶(GOD)、膽固醇脫氫酶、膽固醇氧化酶、乳酸脫氫酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸脫氫酶、抗壞血酸氧化酶、醇脫氫酶、醇氧化酶、果糖脫氫酶、3-羥基丁酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、NADH氧化酶、尿酸氧化酶(尿酸酶)、尿素酶以及二羥基硫辛酰胺脫氫酶(心肌黃酶)中的至少一種。
在本發(fā)明中，GDH除以例如吡咯喹啉醌(PQQ)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)以及煙酰胺酰嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等作為輔酶之外，還可使用αGDH和CyGDH等。作為GDH，優(yōu)選使用以PQQ作為輔酶的物質(zhì)(PQQGDH)、αGDH或CyGDH。
αGDH作為具有葡萄糖脫氫活性的子單元，它包含在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子量約為60kDa的GDH活性蛋白質(zhì)。而CyGDH是包含以上述GDH活性蛋白質(zhì)和在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子量約為43kDa的電子傳遞蛋白質(zhì)(細(xì)胞色素C)為子單元的物質(zhì)。GDH還可使用具有除GDH活性蛋白質(zhì)和細(xì)胞色素C以外的其它子單元的物質(zhì)。
CyGDH可以通過對(duì)例如屬于洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepatia)的微生物在菌體外分泌的酶進(jìn)行精制，或者對(duì)該菌體的菌體內(nèi)酶進(jìn)行精制而得到。另外，αGDH可以通過例如對(duì)形成將取自屬于洋蔥伯克霍爾德氏菌的微生物的αGDH的形成進(jìn)行編碼的遺傳因子引入的轉(zhuǎn)化子、并由該轉(zhuǎn)化子分泌到外部的酶進(jìn)行精制，或者該轉(zhuǎn)化子的菌體內(nèi)酶進(jìn)行精制而得到。
屬于洋蔥伯克霍爾德氏菌的微生物，例如可以使用洋蔥伯克霍爾德氏菌KSI菌株。該KSI菌株以第FERM BP-7306的微生物保藏號(hào)于平成12年9月25日保藏在獨(dú)立專利法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。
本發(fā)明的第3方面提供一種濃度測(cè)量裝置，其特征在于，使用時(shí)安裝著具有試劑層、第1電極和第2電極、且上述試劑層含有氧化還原酶和Ru化合物的濃度測(cè)量用具，并具有在上述第1電極和第2電極之間施加電壓的電壓施加機(jī)構(gòu)；測(cè)量上述第1電極和第2電極之間加有電壓時(shí)的響應(yīng)電流的電流值測(cè)量機(jī)構(gòu)；以及根據(jù)上述響應(yīng)電流值計(jì)算待測(cè)對(duì)象的濃度的計(jì)算機(jī)構(gòu)。
濃度測(cè)量裝置優(yōu)選為還具有控制電壓施加機(jī)構(gòu)的施加電壓動(dòng)作或電流測(cè)量機(jī)構(gòu)的電流值測(cè)量動(dòng)作的控制機(jī)構(gòu)。
控制機(jī)構(gòu)用于將例如由電壓施加機(jī)構(gòu)所施加的電壓控制在選自100～500mV的范圍、更優(yōu)選為選自100～300mV的范圍內(nèi)的一定電壓。控制機(jī)構(gòu)也可將例如由電壓施加機(jī)構(gòu)所施加的電壓控制在選自在Ru化合物的氧化體和還原體之間的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(vs.標(biāo)準(zhǔn)氫電位)以上、小于亞鐵氰化離子和鐵氰化離子之間的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(vs.標(biāo)準(zhǔn)氫電位)的范圍內(nèi)的一定電壓。
本發(fā)明的濃度測(cè)量裝置優(yōu)選為還具有用于對(duì)檢測(cè)向濃度測(cè)量用具的試劑層供給試料液的檢測(cè)機(jī)構(gòu)的結(jié)構(gòu)?？刂茩C(jī)構(gòu)的構(gòu)成用于控制電壓施加機(jī)構(gòu)，使得例如由檢測(cè)機(jī)構(gòu)測(cè)得試料液供向試劑層的0～10秒的第1確定時(shí)間之內(nèi)，不在第1電極和第2電極之間施加電壓。此時(shí)，控制機(jī)構(gòu)控制電壓施加機(jī)構(gòu)，使得由經(jīng)過第1確定時(shí)間的時(shí)間點(diǎn)開始，利用電壓施加機(jī)構(gòu)在第1電極和第2電極之間施加一定電壓?？刂茩C(jī)構(gòu)還可采用下述結(jié)構(gòu)，在由在先的開始施加一定電壓起算并經(jīng)3秒以上的經(jīng)過第2確定時(shí)間的時(shí)間點(diǎn)，在電流值測(cè)量機(jī)構(gòu)中，由電流值測(cè)量機(jī)構(gòu)測(cè)量計(jì)算機(jī)構(gòu)中的計(jì)算濃度用響應(yīng)電流值。更優(yōu)選為，第1確定時(shí)間為0～3秒，第2確定時(shí)間為3～5秒。


圖1為本發(fā)明的葡萄糖濃度測(cè)量裝置一例的簡(jiǎn)要結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為用于圖1的葡萄糖濃度測(cè)量裝置中的葡萄糖傳感器一例的整體立體圖；圖3為圖2的葡萄糖傳感器的分解立體圖；圖4A為含有葡萄糖、PQQ-GDH和Ru配位體的反應(yīng)體系的電子傳遞系統(tǒng)示意圖，而圖4B為含有葡萄糖、GOD和Ru配位體的反應(yīng)體系的電子傳遞系統(tǒng)示意圖；圖5為測(cè)量葡萄糖濃度時(shí)施加在第1和第2電極之間的電壓值以及響應(yīng)電流值隨時(shí)間變化的示意圖；圖6為本發(fā)明的葡萄糖傳感器1與對(duì)照葡萄糖傳感器的CV波形圖；圖7為外加電壓值影響的示意圖；圖8為開始向使用Ru配位體的試劑層供給全血后一定時(shí)間形成開路后，向試劑層施加電壓時(shí)(閉合回路)的響應(yīng)電流隨時(shí)間變化的示意圖；圖9為開始向使用Fe配位體的試劑層供給全血后一定時(shí)間形成開路后，向試劑層施加電壓時(shí)(閉合回路)的響應(yīng)電流隨時(shí)間變化的示意圖；圖10為對(duì)不同葡萄糖濃度的多種全血在向試劑層開始供給全血起10秒后施加500mV的電壓時(shí)，在開始施加電壓5秒后的響應(yīng)電流值的示意圖；圖11為對(duì)不同葡萄糖濃度的多種全血在向試劑層開始供給全血起10秒后施加250mV的電壓時(shí)，在開始施加電壓5秒后的響應(yīng)電流值的示意圖；圖12為圖10和圖11所示圖中，對(duì)葡萄糖濃度為0的全血的響應(yīng)電流值(本底電流)分別以對(duì)Fe配位體和對(duì)Ru配位體表示的柱狀圖；圖13為根據(jù)向試劑層供給標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)的響應(yīng)電流值評(píng)價(jià)因水分引起的暴露影響的示意圖；圖14為根據(jù)向試劑層供給標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)的響應(yīng)電流值評(píng)價(jià)Ru配位體的分散能的示意圖；圖15為根據(jù)不同試劑層配方(氧化還原媒)的葡萄糖傳感器，葡萄糖濃度和響應(yīng)電流值的相關(guān)性的示意圖；圖16為在以GOD用作氧化還原酶的葡萄糖傳感器中，葡萄糖濃度和響應(yīng)電流值的相關(guān)性的示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面，參照附圖具體說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。在本實(shí)施方式中，以用于測(cè)量試料液中的葡萄糖濃度而構(gòu)成的葡萄糖濃度測(cè)量裝置和葡萄糖傳感器為例進(jìn)行說明。但本發(fā)明不僅限于測(cè)量葡萄糖濃度的情況，也可用于測(cè)量其它成分。
如圖1所示，葡萄糖濃度測(cè)量裝置1是使用葡萄糖傳感器2測(cè)量血液等的葡萄糖溶液中的葡萄糖濃度的裝置。該葡萄糖濃度測(cè)量裝置1具有施加電壓部3、電流值測(cè)量部4、檢測(cè)部5、控制部6、計(jì)算部7和顯示部8。
葡萄糖傳感器2如圖2和圖3所示，具有罩板20、隔板21和基板22，由此規(guī)定了流通路25。
罩板20上設(shè)有開孔23，隔板21與開孔23相通，且隔板21上設(shè)有前端24a開放的狹縫24。流通路25經(jīng)狹縫24的前端開放部24a以及開孔23與外部連通。前端開放部24a構(gòu)成試料液導(dǎo)入口25a，由該試料液導(dǎo)入口25a而供給的葡萄糖溶液利因毛細(xì)管現(xiàn)象而在流通路25內(nèi)朝向開孔23行進(jìn)。
基板22的上面22a設(shè)有第1電極26、第2電極27和試劑層28。
第1和第2電極26、27作為整體沿基板22的長(zhǎng)度方向延伸。第1和第2電極26、27的一端26A、27A具有沿基板22寬度方向延伸的作用部26a和反電極部27a。
基板22的上面22a由絕緣膜29覆蓋，并露出第1電極26的作用部26a、第2電極27的反電極部27a、第1和第2電極26、27的另一端26b、27b。第1和第2電極26、27的另一端部26b、27b構(gòu)成與下述葡萄糖濃度測(cè)量裝置1的第1和第2探頭3a、3b(參照?qǐng)D1)接觸的端子。
試劑層28例如為固體狀，跨接在作用部26a和反電極部27a之間。該試劑層28包含相對(duì)較多的介質(zhì)(電子傳遞體)和相對(duì)較少的氧化還原酶。試劑層28通過例如將近似均勻地分散有介質(zhì)和氧化還原酶的涂料涂布在其上，而在第1和第2電極26、27之間形成橋接，然后使其干燥后而形成的。這樣形成的試劑層28，為氧化還原酶近似均勻分散在介質(zhì)間的單一固體層，易于因供給葡萄糖溶液而溶解。
優(yōu)選將葡糖脫氫酶(GDH)或葡糖氧化酶(GOD)用作氧化還原酶。可使用以吡咯喹啉醌(PQQ)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺酰嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等作為輔酶的GDH，以及αGDH、CyGDH等作為GDH。在這些GDH中，優(yōu)選使用以PQQ作為輔酶的(PQQGDH)、αGDH和CyGDH。關(guān)于αGDH和CyGDH，如上所述。
介質(zhì)可使用Ru配位體等。對(duì)該Ru配位體的種類沒有特別限制，只要該Ru配位體能起到電子傳遞體的作用即可，其中氧化型配位體優(yōu)選使用以下述化學(xué)式表示的Ru配位體。
n+化學(xué)式中的X可以舉出NH3、鹵離子、CN、吡啶、煙酰胺或H2O，其中優(yōu)選為NH3和鹵離子?；瘜W(xué)式中的n+表示由X的種類所決定的氧化型Ru(III)配位體的價(jià)數(shù)。
由于還原型(II)不穩(wěn)定，所以Ru配位體通常以氧化型(III)的形式存在。所以，即使在葡萄糖傳感器2的試劑層28中摻雜有Ru配位體的狀態(tài)下暴露在光和水中，也不容易實(shí)現(xiàn)還原。而Ru配位體具有不易結(jié)晶、可適當(dāng)保持微粉末狀態(tài)的特性。另外，Ru配位體和PQQGDH的組合具有電子傳遞速度快的優(yōu)點(diǎn)。
圖1所示電壓施加部3用于在第1電極26的端子26b和第2電極27的端子27b之間施加一定電壓。電壓施加部3通過將葡萄糖傳感器2安裝在設(shè)于葡萄糖濃度測(cè)量裝置1的裝配部(未圖示)上，經(jīng)第1和第2探頭3a、3b而與葡萄糖傳感器2的端子26b、27b導(dǎo)通。電壓施加部3可使用例如干電池或蓄電池等直流電源。
電流值測(cè)量部4用于測(cè)量在第1和第2電極之間施加電壓時(shí)相應(yīng)于由試劑層28的還原型Ru(II)配位體釋放出的電子量的響應(yīng)電流值。
檢測(cè)部5用于在將葡萄糖傳感器2安裝到葡萄糖濃度測(cè)量裝置1上后，向試劑層28供給葡萄糖溶液，檢測(cè)可否測(cè)量葡萄糖溶液濃度。
控制部6用于控制電壓施加部3，以選擇第1和第2電極之間是(閉合回路)還是不是(開路)施加有電壓的狀態(tài)?？刂撇?還控制電流值測(cè)量部4的測(cè)量電流值的時(shí)機(jī)。
計(jì)算部7用于根據(jù)由電流值測(cè)量部4測(cè)得的響應(yīng)電流值計(jì)算葡萄糖溶液中的葡萄糖濃度。
另外，檢測(cè)部5、控制部6和計(jì)算部7可分別由例如CPU和ROM、RAM等存儲(chǔ)器構(gòu)成，檢測(cè)部5、控制部6和計(jì)算部7還均可按照一個(gè)CPU連接多個(gè)存儲(chǔ)器的結(jié)構(gòu)形成。另外，計(jì)算部7的計(jì)算結(jié)果由顯示部8顯示。顯示部8可由LCD等構(gòu)成。
然后，參照?qǐng)D1～3，以及圖4和圖5說明葡萄糖溶液中的葡萄糖濃度測(cè)量的操作順序。
如圖1所示，首先，在葡萄糖濃度測(cè)量裝置1中設(shè)置葡萄糖傳感器2。由此使葡萄糖傳感器2的第1和第2電極26、27的端子26b、27b與葡萄糖測(cè)量裝置1的第1和第2探頭3a、3b相接。如上所述，在該狀態(tài)下，第1和第2電極26、27可與電壓施加部3導(dǎo)通。在實(shí)際測(cè)量中，在向葡萄糖傳感器2供給葡萄糖溶液以前，利用控制部6的控制，由電壓施加部3在第1和第2電極26、27之間施加一定電壓。
施加在第1電極和第2電極之間的一定電壓設(shè)定在例如100～500mV的范圍內(nèi)。一定電壓設(shè)定為在還原型Ru(II)配位體和氧化型Ru(III)配位體之間的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(vs.標(biāo)準(zhǔn)氫電位)以上、小于亞鐵氰化離子和鐵氰化離子之間的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(vs.標(biāo)準(zhǔn)氫電位)。Ru配位體的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位因配位體種類的不同而有所不同，大約為+100mV，而鐵氰化離子的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位為+360mV。所以，由電壓施加部3施加在第1電極和第2電極26、27之間的定電壓可在例如100～350mV的范圍內(nèi)選擇。如上所述，作為Ru配位體，氧化型最適合使用表示為[Ru(NH3)6]3+(還原型為[Ru(NH3)6]2+)的配位體。此時(shí)，定電壓優(yōu)選為100～350mV，更優(yōu)選為100～300mV。
然后，經(jīng)葡萄糖傳感器2的試料液導(dǎo)入口25a供給血液等的葡萄糖溶液。由于毛細(xì)管現(xiàn)象，葡萄糖溶液在葡萄糖傳感器2的流通路25內(nèi)行進(jìn)。在該過程中，葡萄糖溶液使試劑層28溶解。
如上所述，由于Ru配位體可以適度維持難結(jié)晶的微粉末狀態(tài)，所以在微粉末狀態(tài)下試劑層28中含有Ru配位體時(shí)，供給葡萄糖溶液時(shí)試劑層28整體易于且可立即溶解。由于試劑層28的結(jié)構(gòu)是Ru配位體分散在氧化還原酶中，所以試劑層28的各處均勻地發(fā)生酶反應(yīng)，可在短時(shí)間內(nèi)可靠地測(cè)量葡萄糖濃度。
另外，當(dāng)向試劑層28供給葡萄糖溶液時(shí)，利用氧化還原酶將葡萄糖氧化成葡糖酸內(nèi)酯，同時(shí)使介質(zhì)成為還原型。由于介質(zhì)在試劑層28中被近似均勻地分散，所以在試劑層28的各處近似均勻地、且不用施加電壓即可自發(fā)生成還原型介質(zhì)。另外，葡糖酸內(nèi)酯不通過酶即形成葡糖酸。
在此，圖4(a)表示使用[Ru(III)(NH3)6]3+作為介質(zhì)、同時(shí)使用PQQGDH作為氧化還原酶時(shí)的電子傳遞系統(tǒng)，圖4(b)表示使用[Ru(III)(NH3)6]3+作為介質(zhì)、同時(shí)使用GOD作為氧化還原酶時(shí)的電子傳遞系統(tǒng)。
在圖4(a)和(b)所示例中，在經(jīng)兩個(gè)端子26b、27b在第1和第2電極26、27之間施加一定電壓的狀態(tài)下，存在于試劑層28中的還原型Ru(II)配位體向第1電極26的作用部26a側(cè)移動(dòng)，在該作用部26a釋放電子而成為氧化型Ru(III)配位體。所以，在由電壓施加部3在第1和第2電極26、27之間施加一定電壓的狀態(tài)下，由還原型Ru(II)配位體給予的電子量經(jīng)第1電極26和第1探頭3a在電流測(cè)量部4上作為響應(yīng)電流被測(cè)得。該響應(yīng)電流值是與來自通過施加電壓而在試劑層28移動(dòng)的還原型Ru(II)的電子量相關(guān)，它被稱為擴(kuò)散電流。
另外，電流值測(cè)量部4上測(cè)得的響應(yīng)電流值由檢測(cè)部5監(jiān)控，如圖5所示，響應(yīng)電流值超過閾值I1(例如2～3μA)時(shí)的t0點(diǎn)，檢測(cè)部5測(cè)得向試劑層28供給葡萄糖溶液而使試劑層28溶解的情況。
當(dāng)檢測(cè)部5檢測(cè)到供給葡萄糖溶液時(shí)，控制部6控制電壓施加部3，而停止向第1和第2電極26、27之間施加電壓。在停止施加電壓的狀態(tài)下，還原型Ru(II)配位體不被氧化，所以通過由氧化還原酶引發(fā)的葡萄糖的氧化反應(yīng)以及介質(zhì)的還原反應(yīng)而蓄積還原型Ru(II)配位體。在經(jīng)過一定時(shí)間(例如t1-t0＝0～10秒，更優(yōu)選為0～3秒)的t1點(diǎn)，根據(jù)控制部6的控制，由電壓施加部3再次向第1和第2電極26、27之間施加一定電壓V。另外，也可在檢測(cè)部5檢測(cè)到供給了葡萄糖溶液后還繼續(xù)施加電壓，使生成的還原型Ru(II)依次向作用部26a移動(dòng)測(cè)量擴(kuò)散電流。
此時(shí)，如圖4(a)、(b)之例所示，還原型Ru(III)配位體放出電子e-而成為氧化型Ru(II)配位體。當(dāng)葡萄糖溶液中除還原型Ru(III)配位體之外、還同時(shí)存在其它還原型物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)也釋放出與施加電壓值相應(yīng)的成分種類或相應(yīng)數(shù)量的電子而成為氧化型。
還原型Ru(III)配位體及其它還原型物質(zhì)所釋放出的電子被供向第1電極26的作用部26a，它們經(jīng)第1探頭3a而由電流測(cè)量部4測(cè)得作為響應(yīng)電流。所以，實(shí)際測(cè)得的響應(yīng)電流值包括來自于在施加電壓時(shí)成為還原型的共存物質(zhì)的電子而形成的部分。形成還原型的共存物質(zhì)放出電子而成為氧化型的概率(比例)取決于施加在第1和第2電極26、27之間的電壓大小，施加電壓愈大，則釋放出電子的共存物質(zhì)的種類和各共存物質(zhì)釋放出的電子的總量愈多。另外，還原型Ru(III)配位體不僅包括與氧化還原酶之間的氧化還原反應(yīng)而給出電子的物質(zhì)，還包括由于暴露在水和光中而成為還原型Ru(III)的部分。所以，可以認(rèn)為實(shí)際測(cè)得的響應(yīng)電流值包括來自于由共存物質(zhì)而引起的本底電流和酶反應(yīng)以外的電子的還原型Ru(III)所引起的本底電流。
為此，在本實(shí)施方式中，在第1和第2電極26、27之間的一定電壓V，如圖5所示，與檢測(cè)部5檢測(cè)到葡萄糖溶液被供給到試劑層28為止所加的一定電壓V的值相同。即，再施加的一定電壓V小于鐵氰化離子的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位，為100～350mV，更優(yōu)選為100～300mV。在本實(shí)施方式中，第1和第2電極26、27之間(試劑層28)施加電壓值小于使用鐵氰化離子(鉀)作為介質(zhì)時(shí)。所以，就葡萄糖溶液來說，可以抑制包括使用血液等情況的抗壞血酸和谷胱甘肽等還原型物質(zhì)因施加電壓而被氧化(釋放出電子)的情況。由此，可以減小因還原性共存物質(zhì)的影響而引起的本底電流。結(jié)果，即使不實(shí)行考慮還原性共存物質(zhì)的影響而對(duì)實(shí)測(cè)值的修正，也可以高精度計(jì)算濃度。
另外，由于Ru配位體中氧化型(II)明顯比還原型(III)穩(wěn)定，所以即使在光照射和存在水分的情況下也難于分解，其大部分到由酶反應(yīng)而得到電子為止均以氧化型(II)的狀態(tài)存在。所以由來自酶反應(yīng)以外的電子而成為還原型的Ru(III)配位體的比例明顯減小，因此也可減小本底電流。所以，在保存葡萄糖傳感器2時(shí)幾乎不必考慮水分的影響，所以不需利用氮?dú)庵脫Q處理等而降低水分的處理。結(jié)果，在工業(yè)化大批量生產(chǎn)葡萄糖傳感器2時(shí)，就因?yàn)槠渲圃烊菀锥欣诮档统杀尽?br> 另外，在本實(shí)施方式中，根據(jù)由試劑層28整體生成的還原型Ru(II)配位體的擴(kuò)散電流作為響應(yīng)電流而測(cè)量。即，如圖4(a)和(b)所示，兩個(gè)氧化還原反應(yīng)雙方都發(fā)生在試劑層28的各處，所以，供給葡萄糖溶液后，葡萄糖反應(yīng)立即結(jié)束。因此，當(dāng)葡萄糖濃度為600mg/dL左右時(shí)，經(jīng)過測(cè)量響應(yīng)電流值的時(shí)刻——例如開始供給葡萄糖后的5秒——時(shí)，與葡萄糖濃度相應(yīng)量的氧化型Ru(III)配位體形成還原型Ru(II)。所以，即使葡萄糖濃度為100mg/dL的水平，響應(yīng)電流值為μA級(jí)時(shí)，相對(duì)較大，所以不易受電磁波等干擾的影響。所以不須增大以確保電極面積就可以高精度測(cè)量葡萄糖濃度。另外，例如，當(dāng)將介質(zhì)和酶固定在電極上，僅電極表面上發(fā)生酶催化反應(yīng)，使介質(zhì)和電極之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，測(cè)定此時(shí)的電子轉(zhuǎn)移量(催化電流)時(shí)，難于以高精度進(jìn)行測(cè)量。即，在與葡萄糖和電極之間的電子轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個(gè)反應(yīng)中，只要一個(gè)反應(yīng)比其它反應(yīng)慢，則該反應(yīng)就會(huì)限制反應(yīng)速度，即使供給一定濃度以上的葡萄糖，響應(yīng)電流值也不會(huì)在一定值以上。所以，在葡萄糖濃度比較大的范圍內(nèi)的響應(yīng)電流值逐漸接近一定值，難于測(cè)量高濃度。對(duì)此，在測(cè)量擴(kuò)散電流時(shí)，由于是在葡萄糖反應(yīng)事實(shí)上結(jié)束時(shí)測(cè)量響應(yīng)電流值，所以即使在高濃度區(qū)域，也可以精確測(cè)量葡萄糖濃度。
另外，在計(jì)算部7，在再次向第1和第2電極26、27之間施加電壓起經(jīng)過一定時(shí)間(例如t2-t1＝3秒以上，更優(yōu)選為3～5秒)t2點(diǎn)，根據(jù)在電流測(cè)量部4上測(cè)得的響應(yīng)電流I2，進(jìn)行葡萄糖溶液中的葡萄糖濃度的計(jì)算。葡萄糖濃度的計(jì)算是在將響應(yīng)電流值換算為電壓值后，將該電壓值與通過預(yù)先作好的表示電壓值和葡萄糖濃度之間的關(guān)系的計(jì)量曲線相對(duì)照而進(jìn)行計(jì)算。計(jì)量曲線與被量化而進(jìn)行計(jì)算的程序一起載入ROM，利用CPU和ROM而運(yùn)行載入該ROM的程序，從而進(jìn)行葡萄糖濃度的計(jì)算。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例1～8證實(shí)利用酶反應(yīng)測(cè)量葡萄糖濃度時(shí)，使用Ru配位體作為介質(zhì)時(shí)，可用低電壓在短時(shí)間內(nèi)測(cè)量葡萄糖濃度；且受葡萄糖溶液中所含還原物質(zhì)的影響小；對(duì)光和水的暴露耐性高；以及試劑層溶解性高。
(葡萄糖傳感器的形成)在實(shí)施例1～8中，在基板上使用如圖2和圖3所示的形成有第1電極、第2電極、試劑層和流通路的葡萄糖傳感器。由炭糊利用絲網(wǎng)印刷在基板上形成第1和第2電極。
在實(shí)施例1～6中，將兩個(gè)葡萄糖傳感器進(jìn)行了比較。一個(gè)是本發(fā)明的葡萄糖傳感器1，另一個(gè)是對(duì)照葡萄糖傳感器1。如下表1所示，該葡萄糖傳感器的試劑層的配方不同。該試劑層是將包括介質(zhì)、氧化還原酶和磷酸鉀緩沖液的試劑1μL在基板上點(diǎn)觸后干燥而形成。
表1 在實(shí)施例7中，如下表2所示，使用與實(shí)施例1～6的氧化還原酶種類不同的兩個(gè)本發(fā)明的葡萄糖傳感器2、3。試劑層以外的構(gòu)成與實(shí)施例1～6的葡萄糖傳感器相同。另外，αGDH和CyGDH如上所述。
表2
在實(shí)施例8中，如下表3所示，使用GOD作為氧化還原酶的本發(fā)明的葡萄糖傳感器4和對(duì)照葡萄糖傳感器2。試劑層以外的構(gòu)成與實(shí)施例1～6的葡萄糖傳感器相同。
表3 實(shí)施例1在本實(shí)施例中，通過研究CV波形評(píng)測(cè)葡萄糖傳感器的電極響應(yīng)特性。研究CV波形時(shí)，是在葡萄糖傳感器的試劑層上點(diǎn)觸了葡萄糖溶液后，以50mV/sec的掃描速度，按照0mV→+800mV→0mV→-800mV→0mV→+800mV的方式施加電壓，進(jìn)行掃描，并測(cè)量掃描時(shí)的響應(yīng)電流。葡萄糖溶液使用濃度為200mg/dL的標(biāo)準(zhǔn)液(將葡萄糖溶解在生理鹽水(0.9wt％NaCl)中調(diào)制而成)。點(diǎn)觸在試劑層的葡萄糖溶液量為1μL。CV波形如圖6所示。
由圖6的CV波形可知當(dāng)施加電壓第2次達(dá)到0mV→+800mV的范圍內(nèi)，本發(fā)明的以[Ru(III)(NH3)6]Cl3為介質(zhì)的葡萄糖傳感器1上施加電壓約為100mV時(shí)響應(yīng)電流值最大，而使用K3[Fe(III)(CN)6]的葡萄糖傳感器1上施加電壓為300mV弱時(shí)響應(yīng)電流值最大。圖6的CV波形的意義是當(dāng)以[Ru(III)(NH3)6]Cl3為介質(zhì)時(shí)，施加電壓設(shè)為100mV以上時(shí)，可將幾乎所有還原型氧化為氧化型，同樣，在使用K3[Fe(III)(CN)6]時(shí)，施加電壓需設(shè)在300mV以上。各介質(zhì)的響應(yīng)電流值為最大值時(shí)的施加電壓值與各介質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位大致一致。
所以，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位小的Ru配位體為介質(zhì)時(shí)，不降低施加電壓也能精確測(cè)量葡萄糖濃度，此時(shí)，就可在減小因還原性共存物質(zhì)所引起的本底電流的同時(shí)以高精度進(jìn)行測(cè)量。
實(shí)施例2在本實(shí)施例中，研究能否在低電壓(200mV)下精確測(cè)量葡萄糖濃度。在對(duì)其進(jìn)行研究時(shí)，分別對(duì)本發(fā)明的葡萄糖傳感器1和對(duì)照葡萄糖傳感器使用葡萄糖濃度為0mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、600mg/dL的4種標(biāo)準(zhǔn)液，分別測(cè)量施加電壓為500mV和200mV時(shí)的響應(yīng)電流值。持續(xù)第1電極和第2電極之間加有電壓的狀態(tài)，在試劑層點(diǎn)觸1μL的標(biāo)準(zhǔn)液后，經(jīng)5秒后測(cè)量響應(yīng)電流值。其結(jié)果如圖7所示。
由圖7可知，當(dāng)施加電壓為500mV時(shí)，本發(fā)明的葡萄糖傳感器1圖中點(diǎn)集線性程度高，即使葡萄糖濃度很高(400mg/dL以上)時(shí)也能精確測(cè)量葡萄糖濃度。反之，對(duì)照葡萄糖傳感器1在葡萄糖濃度高時(shí)(400mL/dL以上)有些許偏離線性關(guān)系，但作為整體仍呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。
另外，當(dāng)施加電壓為200mV時(shí)，當(dāng)葡萄糖濃度高時(shí)(400mg/dL以上)，本發(fā)明的葡萄糖傳感器1的圖中點(diǎn)集有些許偏離線性關(guān)系，但圖中點(diǎn)集線性程度仍很高。本發(fā)明的葡萄糖傳感器1在200mV時(shí)偏離線性的程度小于對(duì)照葡萄糖傳感器1在500mV時(shí)偏離線性的程度。
因此，在使用Ru配位體作為介質(zhì)時(shí)，可以確定，即使在施加電壓為200mV的低電壓下，至少在葡萄糖濃度為0～600mg/dL的范圍內(nèi)可精確進(jìn)行葡萄糖濃度的測(cè)量。所以，當(dāng)使用Ru配位體為介質(zhì)時(shí)，可以低電壓驅(qū)動(dòng)濃度測(cè)量裝置，減少功率消耗，降低運(yùn)營(yíng)成本。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，對(duì)精確測(cè)量葡萄糖濃度時(shí)所需時(shí)間進(jìn)行了研究。在進(jìn)行該研究時(shí)，在向試劑層點(diǎn)觸了1μL的葡萄糖濃度為400mg/dL的全血后，經(jīng)0秒、1秒、2秒和10秒后，開始在第1和第2電極之間施加500mV的電壓，測(cè)量繼續(xù)施加電壓的情況下測(cè)得的響應(yīng)電流隨時(shí)間的變化。其結(jié)果示于圖8和圖9中。
由圖8可知，在本發(fā)明的葡萄糖傳感器1中，不論施加電壓前的時(shí)間(未加電壓狀態(tài)的時(shí)間)的長(zhǎng)短，從開始施加電壓3秒后，各測(cè)量值呈一致。所以，在本發(fā)明的葡萄糖傳感器中，當(dāng)施加電壓時(shí)間在3秒以上時(shí)，可得到穩(wěn)定的測(cè)量結(jié)果，參照?qǐng)D9可知，它比使用Fe配位體為介質(zhì)時(shí)的施加時(shí)間短。另外，由于即使延長(zhǎng)未加電壓狀態(tài)的時(shí)間也沒有實(shí)際益處，所以，考慮圖8的結(jié)果后，在本發(fā)明中，葡萄糖傳感器1不加電壓狀態(tài)時(shí)間確保為10秒以下已足夠，從供給葡萄糖溶液到測(cè)量用于計(jì)算葡萄糖濃度的響應(yīng)電流為止的時(shí)間確保為10～15秒即已足夠。所以，由圖8和圖9所示結(jié)果可知，使用Ru配位體為介質(zhì)時(shí)，與使用Fe配位體為介質(zhì)時(shí)相比，可以縮短時(shí)間。
實(shí)施例4在本實(shí)施例中，對(duì)還原性共存物質(zhì)的影響(本底電流的影響)進(jìn)行了研究。分別對(duì)本發(fā)明的葡萄糖傳感器1和對(duì)照葡萄糖傳感器1使用葡萄糖濃度為0mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、600mg/dL的4種全血(葡萄糖濃度以外成分調(diào)整為人血中的平均濃度)分別測(cè)量施加電壓為500mV和250mV時(shí)的響應(yīng)電流值。在對(duì)試劑層點(diǎn)觸1μL的全血后10秒內(nèi)為未加電壓狀態(tài)，然后在開始對(duì)第1電極和第2電極之間施加電壓起5秒后測(cè)量響應(yīng)電流值。其結(jié)果如圖10和圖11所示。
由圖10和圖11可知，對(duì)照葡萄糖傳感器1與本發(fā)明的葡萄糖傳感器1相比，整體響應(yīng)電流值高。據(jù)認(rèn)為，這是因?yàn)閷?duì)照葡萄糖傳感器1與本發(fā)明的葡萄糖傳感器1相比，受血液中的還原性共存物質(zhì)的影響大，由本底電流導(dǎo)致的響應(yīng)電流值大。
在此值得注意的是，對(duì)照葡萄糖傳感器1即使葡萄糖濃度為0mg/dL時(shí)，測(cè)得的響應(yīng)電流仍為正值。這一點(diǎn)據(jù)認(rèn)為也是由于還原性物質(zhì)導(dǎo)致的本底電流的影響使得對(duì)照葡萄糖傳感器1的響應(yīng)電流值增大。
在此，對(duì)于葡萄糖濃度為0mg/dL時(shí)的響應(yīng)電流值，如圖12的柱狀圖所示。由該圖可知，對(duì)于對(duì)照葡萄糖傳感器1，即使葡萄糖濃度為0mg/dL也可測(cè)得較大的響應(yīng)電流值，其受到還原性共存物質(zhì)的很大影響。反之，對(duì)于本發(fā)明的葡萄糖傳感器1，在葡萄糖濃度為0mg/dL時(shí)，測(cè)得響應(yīng)電流值很小，明顯降低了受還原性共存物質(zhì)影響的程度。所以，當(dāng)使用Ru配位體作為介質(zhì)時(shí)，就可在不需考慮還原性共存物質(zhì)的影響并進(jìn)行修正的情況下，以高精度進(jìn)行濃度計(jì)算。
實(shí)施例5在本實(shí)施例中，對(duì)暴露耐性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)該暴露耐性時(shí)，是將同時(shí)制成的本發(fā)明的葡萄糖傳感器1和對(duì)照葡萄糖傳感器1置于維持著相對(duì)濕度為50％、溫度為25℃的條件的恒溫恒濕室內(nèi)，使用葡萄糖濃度為0mg/dL的標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)量響應(yīng)電流值。在向試劑層點(diǎn)觸了標(biāo)準(zhǔn)液起10秒后，開始在電極間施加500mV的電壓，同時(shí)，在開始加電壓5秒后測(cè)量響應(yīng)電流值。在恒溫溫室內(nèi)的放置時(shí)間為1日和4日，另外，以相同的條件測(cè)量即將置于恒溫恒濕室內(nèi)之前(初期)的和封閉在加有6g分子篩(Molecular Sieves)(除濕劑)的干燥器(內(nèi)容積0.2L、初始設(shè)定相對(duì)濕度50％、溫度25℃)內(nèi)的狀態(tài)下置于維持著相對(duì)濕度50％、溫度25℃的條件的恒溫恒濕室內(nèi)4日后的(密閉4日)傳感器的響應(yīng)電流值。其結(jié)果如圖13所示。
由圖13可知，在整個(gè)環(huán)境設(shè)定中，本發(fā)明的葡萄糖傳感器1與對(duì)照葡萄糖傳感器1相比，響應(yīng)電流明顯減小，該值在整個(gè)環(huán)境設(shè)定中為相同程度。所以，可以想見，在使用Ru配位體為介質(zhì)時(shí)，即使在暴露環(huán)境下，試劑層變質(zhì)(還原)也很少，保存穩(wěn)定性佳，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)也不易變質(zhì)。所以，當(dāng)使用Ru配位體為介質(zhì)時(shí)，不必為保存葡萄糖傳感器而特別考慮暴露在水分中的影響。所以，在工業(yè)化批量生產(chǎn)葡萄糖傳感器，再對(duì)其包裝時(shí)，不需在包裝內(nèi)施行氮?dú)庵脫Q處理，所以便于制造并可降低成本。
實(shí)施例6在本實(shí)施例中，研究試劑層的溶解性。在研究試劑層的溶解性時(shí)，分別對(duì)本發(fā)明的葡萄糖傳感器1和對(duì)照葡萄糖傳感器1使用葡萄糖濃度為0mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、600mg/dL的4種標(biāo)準(zhǔn)液，在施加電壓為500mV的情況下測(cè)量響應(yīng)電流值。在向試劑層點(diǎn)觸1μL標(biāo)準(zhǔn)液起10秒內(nèi)為未加電壓狀態(tài)，然后在第1電極和第2電極之間加電壓起的5秒后測(cè)量響應(yīng)電流值。其結(jié)果如圖14所示。在圖14中，同時(shí)表示了相對(duì)于Fe配位體的100重量份添加有1重量份的用作分散劑的無機(jī)凝膠時(shí)的對(duì)照葡萄糖傳感器1的結(jié)果。
由圖14可知，即使在葡萄糖濃度大時(shí)，本發(fā)明的葡萄糖傳感器1線性程度也很高。這意味著無論葡萄糖濃度如何，在從供給標(biāo)準(zhǔn)液起15秒以內(nèi)，試劑層可很好溶解。
所以，當(dāng)使用Ru配位體為介質(zhì)時(shí)，試劑層的溶解性好，試劑層整體可形成均勻的反應(yīng)體系，結(jié)果，即使對(duì)于葡萄糖濃度相對(duì)較高的葡萄糖溶液，不需使用分散劑等與之相應(yīng)，即可在短時(shí)間內(nèi)以高精度測(cè)量濃度。
實(shí)施例7在本實(shí)施例中，對(duì)具有按上述表2所示配方形成的試劑層的本發(fā)明葡萄糖傳感器2和本發(fā)明葡萄糖傳感器3，測(cè)量濃度不同的4種(0mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、600mg/dL)全血的響應(yīng)電流值。其結(jié)果如圖15所示。在圖15中，對(duì)于與實(shí)施例1～6的構(gòu)成相同的本發(fā)明的葡萄糖傳感器1，同時(shí)表示由同樣條件測(cè)得的響應(yīng)電流值的結(jié)果。
由圖15可知，即使對(duì)于使用CyGDH或αGDH作為氧化還原酶的本發(fā)明葡萄糖傳感器2和本發(fā)明的葡萄糖傳感器3，通過施加200mV的低電壓，且在開始加電壓起的5秒的短時(shí)間內(nèi)，也可以從相對(duì)較低濃度到較高濃度范圍內(nèi)精確進(jìn)行濃度測(cè)量。另外，由圖15可知，對(duì)于該葡萄糖傳感器，本底電流小。所以，當(dāng)使用Ru配位體為介質(zhì)時(shí)，對(duì)于各種GDH，可以得到實(shí)施例1～實(shí)施例6中所述效果。
實(shí)施例8在本實(shí)施例中，對(duì)于使用GOD作為氧化還原酶的同時(shí)，使用Ru配位體為介質(zhì)的本發(fā)明的葡萄糖傳感器4和使用GOD為氧化還原酶、同時(shí)使用鐵氰化鉀為介質(zhì)的對(duì)照葡萄糖傳感器2，與實(shí)施例7一樣，測(cè)量其響應(yīng)電流值。其結(jié)果如圖16所示。
由圖16可知，即使在將GOD和Ru配位體組合時(shí)，與實(shí)施例1～實(shí)施例6中所用的本發(fā)明葡萄糖傳感器1一樣，即使在葡萄糖濃度較高時(shí)，線性程度也很好，本底電流小。所以，即使在將GOD和Ru配位體組合時(shí)，也可得到實(shí)施例1～實(shí)施例6中所示的效果。
如上所述，在本發(fā)明中，在較短測(cè)量時(shí)間內(nèi)，從對(duì)象物濃度較低的試料液到對(duì)象物濃度較高的試料液，既可降低還原性共存物質(zhì)的影響，又可充分確保試劑層的溶解性，從而可精確測(cè)量試料液中的待測(cè)對(duì)象的濃度。
權(quán)利要求
1.一種待測(cè)對(duì)象的濃度測(cè)量方法，其特征在于，通過構(gòu)筑含有待測(cè)對(duì)象、氧化還原酶和電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系，利用電化學(xué)方法測(cè)量待測(cè)對(duì)象的濃度，所述電子傳遞物質(zhì)使用Ru化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的待測(cè)對(duì)象的濃度測(cè)量方法，其特征在于，包括在所述反應(yīng)體系內(nèi)生成Ru化合物的還原體的第1步驟；對(duì)所述反應(yīng)體系施加電壓，將所述還原體氧化，同時(shí)測(cè)量與此時(shí)由所述還原體放出的電子量相應(yīng)的響應(yīng)電流值的第2步驟；根據(jù)所述第2步驟中測(cè)得的響應(yīng)電流值，計(jì)算待測(cè)對(duì)象濃度的第3步驟。
3.如權(quán)利要求2所述的待測(cè)對(duì)象的濃度測(cè)量方法，其特征在于，所述Ru化合物為氧化型Ru(III)配位體，所述還原體為還原型Ru(II)配位體。
4.如權(quán)利要求3所述的待測(cè)對(duì)象的濃度測(cè)量方法，其特征在于，所述氧化型Ru(III)配位體如下述化學(xué)式所示[Ru(NH3)5X]n+所述化學(xué)式中的X為NH3或鹵離子，所述化學(xué)式中的n+則表示由X的種類所決定的氧化型Ru(III)配位體的價(jià)數(shù)。
5.如權(quán)利要求3所述的待測(cè)對(duì)象的濃度測(cè)量方法，其特征在于，在第1步驟中，僅通過由所述氧化還原酶催化的待測(cè)對(duì)象的氧化反應(yīng)和氧化型Ru(III)配位體的還原反應(yīng)這兩個(gè)反應(yīng)生成所述還原型Ru(II)配位體。
6.如權(quán)利要求3所述的待測(cè)對(duì)象的濃度測(cè)量方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系為近似均勻地將相對(duì)量較少的氧化還原酶和相對(duì)量較多的氧化型Ru(III)配位體分散的的均勻或近似均勻的液相反應(yīng)體系。
7.如權(quán)利要求1所述的待測(cè)對(duì)象的濃度測(cè)量方法，其特征在于，所述待測(cè)對(duì)象為葡萄糖。
8.一種濃度測(cè)量用具，其特征在于，具有基板、形成于所述基板上的至少存在的第1電極和第2電極、呈固體狀的試劑層，所述試劑層含有氧化還原酶和Ru化合物，且在供給含有待測(cè)對(duì)象的試料液時(shí)溶解，構(gòu)成液相反應(yīng)體系。
9.如權(quán)利要求8所述的濃度測(cè)量用具，其特征在于，所述試劑層在供給了試料液后，所述液相反應(yīng)體系中有氧化還原酶和Ru化合物共存。
10.如權(quán)利要求8所述的濃度測(cè)量用具，其特征在于，所述試劑層含有所述Ru化合物作為氧化體，且在向所述試劑層供給試料液時(shí)，僅通過由所述氧化還原酶催化的所述待測(cè)對(duì)象的氧化反應(yīng)和所述Ru化合物的還原反應(yīng)這兩個(gè)反應(yīng)，由所述氧化體生成還原體。
11.如權(quán)利要求10所述的濃度測(cè)量用具，其特征在于，所述試劑層的結(jié)構(gòu)使得所述液相反應(yīng)體系的各處大致均勻地生成所述還原體。
12.如權(quán)利要求8中所述的濃度測(cè)量用具，其特征在于，所述Ru化合物如下述化學(xué)式所示，[Ru(NH3)5X]n+所述化學(xué)式中的X為NH3或鹵離子，所述化學(xué)式中的n+則表示由X的種類所決定的氧化型Ru(III)配位體的價(jià)數(shù)。
13.如權(quán)利要求8所述的濃度測(cè)量用具，其特征在于，所述待測(cè)對(duì)象為葡萄糖。
14.如權(quán)利要求13所述的濃度測(cè)量用具，其特征在于，所述氧化還原酶為選自PQQGDH、αGDH和CyGDH中的至少其中之一。
15.一種濃度測(cè)量裝置，其特征在于，使用時(shí)安裝著具有試劑層、第1電極和第2電極、且所述試劑層含有氧化還原酶和Ru化合物的濃度測(cè)量用具，并具有在所述第1電極和所述第2電極之間施加電壓的電壓施加機(jī)構(gòu)；測(cè)量所述第1電極和所述第2電極之間施加電壓時(shí)的響應(yīng)電流值的電流值測(cè)量機(jī)構(gòu)；和根據(jù)所述響應(yīng)電流值計(jì)算待測(cè)對(duì)象濃度的計(jì)算機(jī)構(gòu)。
16.如權(quán)利要求15所述的濃度測(cè)量裝置，其特征在于，還具有控制電壓施加機(jī)構(gòu)的施加電壓動(dòng)作的控制機(jī)構(gòu)，所述控制機(jī)構(gòu)用于將由所述電壓施加機(jī)構(gòu)所施加的電壓控制在選自100～500mV的范圍內(nèi)的一定電壓。
17.如權(quán)利要求15所述的濃度測(cè)量裝置，其特征在于，還具有用于控制電壓施加機(jī)構(gòu)的施加電壓動(dòng)作的控制機(jī)構(gòu)，所述控制機(jī)構(gòu)將由所述電壓施加機(jī)構(gòu)所施加的電壓控制在選自在所述Ru化合物的氧化體和還原體之間的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(vs.標(biāo)準(zhǔn)氫電位)以上、小于亞鐵氰化離子和鐵氰化離子之間的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(vs.標(biāo)準(zhǔn)氫電位)的范圍內(nèi)的一定電壓。
18.如權(quán)利要求15所述的濃度測(cè)量裝置，其特征在于，還具有用于控制所述電流測(cè)量部的電流值測(cè)量動(dòng)作的控制機(jī)構(gòu)，所述控制機(jī)構(gòu)用于在向所述試劑層供給試料液后的3～5秒后的范圍內(nèi)的任一時(shí)刻，用所述電流測(cè)量機(jī)構(gòu)測(cè)量所述計(jì)算機(jī)構(gòu)中計(jì)算時(shí)所需的響應(yīng)電流值。
全文摘要
本發(fā)明涉及構(gòu)筑含有待測(cè)對(duì)象、氧化還原酶和電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系，利用電化學(xué)方法測(cè)量待測(cè)對(duì)象濃度的技術(shù)。它使用Ru化合物作為電子傳遞物質(zhì)。本發(fā)明還提供具有基板、形成于該基板上的至少存在的第1和第2電極、以及呈固體狀的試劑層的濃度測(cè)量用具。試劑層含有氧化還原酶和Ru化合物，且在供給試料液時(shí)會(huì)溶解，從而構(gòu)成液相反應(yīng)體系。
文檔編號(hào)G01N27/30GK1571925SQ0281795
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者永川健兒, 山岡秀亮 申請(qǐng)人:愛科來株式會(huì)社