專利名稱：免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)芯片，特別是一種以抗體文庫為基礎(chǔ)的用于多種蛋白分析的并可進(jìn)而用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的芯片、該芯片制備方法及其檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)芯片是繼基因芯片之后又一重大生物技術(shù)?；蛐酒鳛槌晒Φ睦?，已廣泛應(yīng)用于生物基礎(chǔ)研究及臨床醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。然而基因芯片只能檢測到人體各種遺傳信息在DNA/RNA水平的變化，而無法檢測出在蛋白質(zhì)水平上的變化。隨著人類基因組計劃測序工作的完成，即將進(jìn)入后基因組時代，下一步要對更加復(fù)雜的蛋白質(zhì)功能進(jìn)行研究，迫切需要蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。
蛋白質(zhì)芯片的初步模型是基于與基因芯片相似的基本原理，即在某一固相載體上按預(yù)先設(shè)計的微陣列方式固定大量蛋白質(zhì)。如果所固定的蛋白質(zhì)為抗體則稱免疫微陣列芯片?？乖贵w的結(jié)合，即免疫反應(yīng)，是特異性的，這樣將抗原(或抗體)加上各種標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)基于芯片的免疫檢測。
任何一種蛋白質(zhì)都可以作為一種抗原，都可通過免疫應(yīng)答產(chǎn)生自己的特異性抗體。所以無論是已經(jīng)存在的臨床生物樣品還是新的蛋白質(zhì)表達(dá)樣品都可以通過免疫芯片實(shí)現(xiàn)其檢測目的。
現(xiàn)有技術(shù)中的蛋白質(zhì)芯片，如中國專利申請01105795.5及01113323.6，是將蛋白質(zhì)樣品點(diǎn)陣于經(jīng)化學(xué)處理過的載玻片上，蛋白質(zhì)通過化學(xué)鍵連接于載玻片上而被固定并進(jìn)一步用于蛋白質(zhì)檢測或特定抗原或抗體的免疫分析。該類蛋白質(zhì)芯片以蛋白質(zhì)點(diǎn)陣為基礎(chǔ)，僅通過一次系列同步反應(yīng)就可得到多種指標(biāo)的反應(yīng)結(jié)果，大大提高了檢測速度和效率，適用于任意人份、任意指標(biāo)的同時檢測。但這種技術(shù)存在的嚴(yán)重問題有1.抗原或抗體與信號物質(zhì)的連接將有可能嚴(yán)重影響原有的生物活性(很多種蛋白質(zhì)不適于信號標(biāo)記甚至無法標(biāo)記)；2.在夾心免疫分析中所采用的捕獲抗體均采用整分子，這在很多情況下，如捕獲抗體與檢測抗體同源時會增加系統(tǒng)非特異性，降低信噪比，并在檢測生物樣品時增加了非特異性干擾機(jī)會，造成檢測結(jié)果的假陰性或假陽性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以上發(fā)展需求及蛋白質(zhì)芯片所存在的缺陷，提出了一種基于抗體文庫的免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，該技術(shù)包括蛋白質(zhì)芯片的設(shè)計、制備及其檢測技術(shù)。從而使該蛋白質(zhì)芯片真正成為高通量、高效率的生物分析系統(tǒng)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片，是利用平板印刷術(shù)按照預(yù)先設(shè)計的方案將取自抗體文庫的抗體或抗體片斷印刷到帶有醛基的芯片基片上，使抗體或抗體片斷上的游離氨基與基片上的醛基形成酰胺鍵共價連接，從而將抗體或其抗體片斷固定在活化的芯片基片；所述抗體作為捕獲探針以點(diǎn)陣的形式在芯片上橫向延伸，接受待測樣品的所有種類的探針點(diǎn)陣則沿縱向延伸。
本發(fā)明蛋白質(zhì)芯片的制備方法如下(1)從特定蛋白組的抗體文庫中選取抗體；(2)用酶切的方法制備抗體片斷；(3)將抗體或抗體片斷用平板印刷術(shù)按照預(yù)先設(shè)計的方案印刷到經(jīng)活化的芯片基片上，使抗體或抗體片斷上的游離氨基與基片上的醛基形成酰胺鍵共價連接；(4)洗滌；(5)封閉芯片基片上剩余的活性基團(tuán)；(6)干燥。
上述芯片基片活化的方法為常規(guī)的玻片硅烷化方法。用于免疫微陣列平板印刷的方法為使用制作DNA芯片的通用點(diǎn)樣儀進(jìn)行接觸式制樣或噴樣。
應(yīng)用上述制得的蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的檢測方法可以為免疫微陣列芯片夾心分析方法，即通過使用配對單克隆抗體實(shí)現(xiàn)對靶蛋白的夾心分析，其檢測步驟如下(1)將需要檢測的樣品加入到免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片上。
(2)待樣品中的靶蛋白與芯片抗體或其片斷實(shí)現(xiàn)免疫反應(yīng)并至反應(yīng)平衡，其中反應(yīng)溫度4～25℃；相對濕度70～85％(3)洗滌；(4)加入可與芯片捕獲抗體配對的單克隆或多克隆檢測抗體，構(gòu)成可直接攜帶信號的第一信號物質(zhì)，使兩個配對抗體與靶蛋白形成二重夾心復(fù)合物；(5)洗滌；(6)加入第二信號物質(zhì)(7)洗滌；(8)干燥后進(jìn)行成像檢測。
在上述芯片免疫檢測的末端還可引入親合素-生物素系統(tǒng)，即通過應(yīng)用第二信號物質(zhì)與生物素的連接物和熒光素標(biāo)記的親合素實(shí)現(xiàn)檢測信號的放大。該親合素-生物素系統(tǒng)的引入方法是(1)在已形成二重夾心復(fù)合物的蛋白質(zhì)芯片上加入生物素連接第二信號物質(zhì)，在反應(yīng)溫度4～25℃；相對濕度70～85％)的環(huán)境下，反應(yīng)后形成三重復(fù)合物。
(2)洗滌；(3)加入熒光素或其他發(fā)光物質(zhì)連接的親合素，并使之與芯片復(fù)合物連接形成四重復(fù)合物；(4)洗滌；(5)進(jìn)行熒光或發(fā)光信號檢測。
上述第二信號物質(zhì)可以是抗種屬免疫球蛋白G(IgG)抗體或Protein A等；成像檢測的方法是共聚焦掃描顯像法或電荷耦合檢測器(CCD)成像法。
上述免疫微陣列芯片中，每個微點(diǎn)的尺度在100～200μm，每平方厘米芯片基片面積內(nèi)可以制備2500點(diǎn)以上的免疫微陣列；所以利用本檢測體系可望在2×3cm的芯片范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)含有上萬種組分的蛋白組的分析檢測。因而實(shí)現(xiàn)了高通量檢測。
本發(fā)明利用抗體作為蛋白質(zhì)芯片的靶蛋白捕獲探針，對蛋白質(zhì)芯片的捕獲探針進(jìn)行統(tǒng)籌選擇和整體優(yōu)化，包括必要的分子改造，對于信號系統(tǒng)，則引入非直接標(biāo)記的檢測探針，同時應(yīng)用通用信號物質(zhì)，使整個芯片只用一種信號標(biāo)記物進(jìn)行蛋白組分析，可在實(shí)現(xiàn)微陣列“高通量”檢測的同時，也能滿足蛋白檢測的特異性要求。利用抗體片斷作為捕獲探針可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)芯片在后續(xù)反應(yīng)中的特異性，改善信噪比，并有利于引入通用標(biāo)記物和分子放大系統(tǒng)。引入親合素-生物素系統(tǒng)的信號放大體系的芯片檢測系統(tǒng)可將檢測靈敏度提高至超微量測定的水平。


圖1為基于抗體文庫的免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明特異性鑒定實(shí)驗(yàn)成像結(jié)果；圖3為本發(fā)明蛋白質(zhì)芯片用于腫瘤蛋白夾心分析檢測的成像結(jié)果；圖4為本發(fā)明蛋白質(zhì)芯片用于腫瘤蛋白引入親合素-生物素系統(tǒng)檢測的成像結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述如圖1所示，為本發(fā)明基于抗體文庫的免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計示意圖。其中芯片上所有微陣列抗體捕獲探針均取自抗體文庫，并可進(jìn)一步以抗體酶解所得到的活性片斷作為捕獲探針。其設(shè)計方案為雙向延伸型作為捕獲探針的抗體或其片斷在芯片上沿橫向逐列增加，直至達(dá)到芯片基片容許的容量；待測樣品的數(shù)量可以沿縱向逐行增加，直至達(dá)到芯片基片允許的容量。
圖中M為微陣列定位探針；A-G及其后各列為探針種類；1-6各行為各種被測靶蛋白(與探針捕獲匹配)的濃度梯度檢測帶；N行為靶蛋白檢測陰性質(zhì)控帶；P行為靶蛋白檢測陽性質(zhì)控帶；S1-S4及其以后各行為樣品檢測帶。每組探針(4個相同微點(diǎn))通過捕獲靶蛋白，最終給出一個平均的檢測信息數(shù)據(jù)。
如圖2所示，為本發(fā)明特異性鑒定實(shí)驗(yàn)成像結(jié)果。圖中M列為抗體片斷微陣列方位標(biāo)記；A列為AFP抗體片斷；B列為CEA抗體片斷；C列為β-HCG抗體片斷；D列為CA125抗體片斷；E列為CA19-9抗體片斷；F列為CA15-3抗體片斷。每四個微點(diǎn)得到一個平均光密度數(shù)據(jù)；S1、S2和S3為三種腫瘤蛋白混合溶液樣品S1(AFP、CEA、CA19-9)；S2(CEA、β-HCG、CA125)；S3(CEA、CA125、CA15-3)。
從成像結(jié)果可以得出，在被檢測樣品中，若含有某種腫瘤蛋白，則其即被抗體或抗體片斷捕獲而最終給出陽性結(jié)果，反之給出陰性結(jié)果，從而反映出由不同捕獲探針?biāo)M成的免疫微陣列具有高度特異性，即選擇性結(jié)合，無交叉反應(yīng)。
實(shí)施例1-抗體作為捕獲探針，以免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片夾心分析檢測體系進(jìn)行腫瘤蛋白組檢測，該芯片制備方法及其檢測腫瘤蛋白組的步驟如下(1)從腫瘤蛋白組抗體文庫中，選取6種蛋白標(biāo)志物-甲胎蛋白、癌胚抗原、人絨毛膜促性腺激素、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原19-9(CA19-9)和糖類抗原15-3(CA15-3)-的單克隆抗體作為靶蛋白捕獲探針；(2)將該三種抗體分別溶于固化緩沖液中，用接觸式點(diǎn)樣儀在醛基化的芯片基片上將其制作成免疫微陣列，固化反應(yīng)持續(xù)時間為4-16小時，4℃，75％相對濕度；(3)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(4)將芯片浸入封閉液中30-60分鐘，室溫，封閉所有剩余的醛基基團(tuán)及具有非特異性吸附性能的芯片表面部位；(5)在芯片上加入含有甲胎蛋白、癌胚抗原、人絨毛膜促性腺激素、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原19-9(CA19-9)和糖類抗原15-3(CA15-3)等腫瘤蛋白標(biāo)志物的反應(yīng)液，75％相對濕度下，室溫反應(yīng)3小時，；(6)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(7)加入上述腫瘤蛋白的兔源多克隆抗體混合反應(yīng)液，75％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(8)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；
(9)加入異硫氫酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體溶液，75％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(10)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(11)干燥后進(jìn)行CCD成像檢測。
檢測成像結(jié)果如圖3所示，其中1.M行和M列為抗體微陣列方位標(biāo)記；N行為腫瘤蛋白陰性質(zhì)控；P行為腫瘤蛋白陽性質(zhì)控。
2.A列為AFP抗體；B列為CEA抗體；C列為β-HCG抗體；D列為CA125抗體；E列為CA19-9抗體；F列為CA15-3抗體。每四個微點(diǎn)得到一個平均光密度數(shù)據(jù)。
3.行1中被檢測腫瘤蛋白濃度-AFP20μg/L，CEA20μg/L，β-HCG20μg/L，CA12540KU/L，CA19-940KU/L，CA15-340KU/L；行2中被檢測腫瘤蛋白濃度-AFP40μg/L，CEA40μg/L，β-HCG40μg/L，CA12580KU/L，CA19-980KU/L，CA15-380KU/L；行3中被檢測腫瘤蛋白濃度--AFP80μg/L，CEA80μg/L，β-HCG80μg/L，CA125160KU/L，CA19-9160KU/L，CA15-3160KU/L；行4中被檢測腫瘤蛋白濃度-AFP160μg/L，CEA160μg/L，β-HCG160μg/L，CA125320KU/L，CA19-9320KU/L，CA15-3320KU/L；行5中被檢測腫瘤蛋白濃度-AFP320μg/L，CEA320μg/L，β-HCG320μg/L，CA125640KU/L，CA19-9640KU/L，CA15-3640KU/L；行6中被檢測腫瘤蛋白濃度-AFP640μg/L，CEA640μg/L，β-HCG640μtg/L，CA1251280KU/L，CA19-91280KU/L，CA15-31280KU/L。
4.從成像結(jié)果可以得出，6種腫瘤蛋白可被同時檢測，且每種不同濃度的腫瘤蛋白最終給出不同的光密度值(光密度隨濃度梯度變化而成梯度變化)。
實(shí)施例2-抗體作為捕獲探針，并引入親合素-生物素系統(tǒng)的免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片檢測體系進(jìn)行腫瘤蛋白組檢測，該芯片制備方法及其檢測腫瘤蛋白組的步驟如下其中步驟(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)同實(shí)施例1；
(9)加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體溶液，75％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(10)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(11)加入異硫氫酸熒光素標(biāo)記的親合素溶液，75％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(12)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(13)干燥后進(jìn)行CCD成像檢測。
應(yīng)用該方法的抗體片斷微陣列用于腫瘤蛋白檢測的成像結(jié)果如圖4所示，其中1.M行和M列為抗體微陣列方位標(biāo)記；N行為腫瘤蛋白陰性質(zhì)控；P行為腫瘤蛋白陽性質(zhì)控。
2.A列為AFP抗體片斷；B列為CEA抗體片斷；C列為β-HCG抗體片斷；D列為CA125抗體片斷；E列為CA19-9抗體片斷；F列為CA15-3抗體片斷。每四個微點(diǎn)得到一個平均光密度數(shù)據(jù)。
3.行1中被檢測腫瘤蛋白濃度——AFP20μg/L，CEA20μg/L，β-HCG20μg/L，CA12540KU/L，CA19-940KU/L，CA15-340KU/L；行2中被檢測腫瘤蛋白濃度—AFP40μg/L，CEA40μg/L，β-HCG40μg/L，CA12580KU/L，CA19-980KU/L，CA15-380KU/L；行3中被檢測腫瘤蛋白濃度——AFP80μg/L，CEA80μg/L，β-HCG80μg/L，CA125160KU/L，CA19-9160KU/L，CA15-3160KU/L；行4中被檢測腫瘤蛋白濃度——AFP160μg/L，CEA160μg/L，β-HCG160μg/L，CA125320KU/L，CA19-9320KU/L，CA15-3320KU/L；行5中被檢測腫瘤蛋白濃度——AFP320μg/L，CEA320μg/L，β-HCG320μg/L，CA125640KU/L，CA19-9640KU/L，CA15-3640KU/L；行6中被檢測腫瘤蛋白濃度——AFP640μg/L，CEA640μg/L，β-HCG640μg/L，CA1251280KU/L，CA19-91280KU/L，CA15-31280KU/L。
4.從成像結(jié)果可以得出，6種腫瘤蛋白可被同時檢測，且每種不同濃度的腫瘤蛋白最終給出不同的光密度值，即光密度隨濃度梯度變化而成梯度變化；檢測信號更強(qiáng)，能給出更優(yōu)的信號數(shù)據(jù)。
實(shí)施例3-抗體片斷作為捕獲探針，不引入親合素-生物素系統(tǒng)的免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片檢測體系進(jìn)行腫瘤蛋白組檢測，該芯片制備方法及其檢測腫瘤蛋白組的步驟如下(1)從腫瘤蛋白組抗體文庫中，選取6種標(biāo)志物-甲胎蛋白、癌胚抗原、人絨毛膜促性腺激素、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原19-9(CA19-9)和糖類抗原15-3(CA15-3)-的單克隆抗體，用胃蛋白酶按照已報道的方法進(jìn)行酶切并分離純化得到抗體片斷F(ab')2，作為捕獲探針；(2)將該三種F(ab’)2抗體片斷分別溶于固化緩沖液中，用接觸式點(diǎn)樣儀在醛基化的芯片基片上將其制作成免疫微陣列，固化反應(yīng)持續(xù)時間為4-16小時，4℃，75％相對濕度；(3)洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(4)將芯片浸入封閉液中30-60分鐘，室溫，封閉所有剩余的醛基基團(tuán)及具有非特異性吸附性能的芯片表面部位；(5)在芯片上加入含有甲胎蛋白、癌胚抗原、人絨毛膜促性腺激素、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原19-9(CA19-9)和糖類抗原15-3(CA15-3)等腫瘤蛋白標(biāo)志物的反應(yīng)液，75％相對濕度下，室溫反應(yīng)3小時；(6)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(7)加入含有與捕獲探針配對的作為第一信號物質(zhì)的單克隆抗體混合反應(yīng)液，70％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(8)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(9)加入異硫氫酸熒光素標(biāo)記的Fc區(qū)特異的羊抗鼠IgG抗體溶液，70％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(10)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(11)干燥后進(jìn)行CCD成像檢測。
檢測結(jié)果表明6種腫瘤蛋白可被同時檢測，且每種不同濃度的腫瘤蛋白最終給出不同的光密度值，即光密度隨濃度梯度變化而成梯度變化；結(jié)果呈現(xiàn)出更好的信噪比。
實(shí)施例4-抗體片斷作為捕獲探針，并引入親合素-生物素系統(tǒng)的免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片檢測體系進(jìn)行腫瘤蛋白組檢測，該芯片制備方法及其檢測腫瘤蛋白組的步驟如下步驟(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)同實(shí)施例3；(9)加入生物素標(biāo)記的Fc區(qū)特異的羊抗鼠IgG抗體溶液，75％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(10)洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(11)加入異硫氫酸熒光素標(biāo)記的親合素溶液，75％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(12)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(13)干燥后進(jìn)行CCD成像檢測。
從成像結(jié)果可以得出，6種腫瘤蛋白可被同時檢測，且每種不同濃度的腫瘤蛋白最終給出不同的光密度值，即光密度隨濃度梯度變化而成梯度變化；結(jié)果呈現(xiàn)出更好的信噪比；檢測信號更強(qiáng)，能給出更優(yōu)的信號數(shù)據(jù)。
實(shí)施例5-抗體片斷作為捕獲探針，以Protein A為第二信號物質(zhì)，并引入親合素-生物素系統(tǒng)的免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片檢測體系進(jìn)行腫瘤蛋白組檢測，該芯片制備方法及其檢測腫瘤蛋白組的步驟如下步驟(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)同實(shí)施例3；(14)加入生物素標(biāo)記的Protein A溶液，85％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(15)洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(16)加入異硫氫酸熒光素標(biāo)記的親合素溶液，85％相對濕度下，室溫反應(yīng)1小時；(17)用洗滌液洗滌芯片3次，每次1分鐘；(18)干燥后進(jìn)行CCD成像檢測。
從成像結(jié)果可以得出，6種腫瘤蛋白可被同時檢測，且每種不同濃度的腫瘤蛋白最終給出不同的光密度值，即光密度隨濃度梯度變化而成梯度變化；結(jié)果呈現(xiàn)出良好的信噪比；檢測信號強(qiáng)，能給出優(yōu)良的信號數(shù)據(jù)。
上述捕獲探針固化液配方0.5M碳酸緩沖液及其替代物，pH 9.1，0.15MNaCl，40％丙三醇，0.1％NaN3。
芯片洗滌液配方0.05M磷酸緩沖液及其他替代物，pH 7.4，0.15M NaCl，0.2％Tween，0.1％NaN3。
芯片封閉液配方0.5M碳酸緩沖液及其他替代物，pH 9.1，0.15M NaCl，2％BSA，0.1％NaN3。
芯片反應(yīng)液配方0.05M磷酸緩沖液及其他替代物，pH 7.4，0.15M NaCl，0.5％BSA，0.1％NaN3。
本實(shí)施例中所述對六種腫瘤蛋白的檢測方法可以擴(kuò)展用于檢測抑制所有腫瘤標(biāo)志蛋白，至少20種以上，并進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對龐大的腫瘤蛋白組的鑒定。
上述實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果均達(dá)到了設(shè)計結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了高靈敏、高特異和高通量的微型化免疫檢測，將該檢測系統(tǒng)與自動化儀器連用，可應(yīng)用于臨床檢測和實(shí)驗(yàn)室研究。同步檢測多個疾病標(biāo)志物，將有利于臨床醫(yī)生對疾病進(jìn)行全面分析；通過比較健康和疾病細(xì)胞的蛋白組圖譜，研究人員將能更好的理解和分析細(xì)胞信號傳遞及新陳代謝途徑，為醫(yī)藥學(xué)和診療學(xué)提供更多判斷依據(jù)。
權(quán)利要求
1.免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片，其特征在于該芯片是利用平板印刷術(shù)按照預(yù)先設(shè)計的方案將取自抗體文庫的抗體或進(jìn)而制備的抗體片斷印刷到帶有醛基的芯片基片上，使抗體或抗體片斷上的游離氨基與基片上的醛基形成酰胺鍵共價連接，從而將抗體或其抗體片斷固定在活化的芯片基片；所述抗體作為捕獲探針以點(diǎn)陣的形式在芯片上橫向延伸，接受待測樣品的所有種類的探針點(diǎn)陣則沿縱向延伸。
2.如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于(1)從特定蛋白組的抗體文庫中選取抗體；(2)用酶切的方法制備抗體片斷；(3)將抗體或抗體片斷用平板印刷術(shù)按照預(yù)先設(shè)計的方案印刷到經(jīng)活化帶有醛基的芯片基片上，使抗體或抗體片斷上的游離氨基與基片上的醛基形成酰胺鍵共價連接；(4)洗滌；(5)封閉芯片基片上剩余的活性基團(tuán)；(6)干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述芯片基片活化的方法為玻片硅烷化方法，免疫微陣列平板印刷是采用通用點(diǎn)樣儀進(jìn)行接觸式制樣或噴樣。
4.應(yīng)用如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的檢測方法，其特征在于通過使用配對單克隆抗體對靶蛋白進(jìn)行夾心分析，其步驟為(1)將特定檢測樣品加入到免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片上；(2)待樣品中的靶蛋白與芯片抗體或其片斷在反應(yīng)溫度為4～25℃，相對濕度為70～85％的條件下進(jìn)行免疫反應(yīng)并至反應(yīng)平衡；(3)洗滌；(4)加入作為第一信號物質(zhì)的可與芯片捕獲抗體配對的檢測抗體，使兩個配對抗體與靶蛋白形成二重夾心復(fù)合物；(5)洗滌；(6)加入與熒光素或其他發(fā)光物質(zhì)連接的第二信號物質(zhì)，并使其與所形成的二重夾心復(fù)合物實(shí)現(xiàn)連接形成三重復(fù)合物；(7)洗滌；(8)干燥后進(jìn)行成像檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于所述第二信號物質(zhì)為抗種屬免疫球蛋白G抗體或Protein A。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于所述成像檢測的方法是共聚焦掃描顯像法或電荷耦合檢測器成像法。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于在上述芯片免疫檢測的末端引入親合素-生物素系統(tǒng)，通過應(yīng)用第二信號物質(zhì)與生物素的連接物和熒光素標(biāo)記的親合素實(shí)現(xiàn)檢測信號的放大，該親合素-生物素系統(tǒng)的引入方法是(1)在已形成二重夾心復(fù)合物的蛋白質(zhì)芯片上加入生物素連接的第二信號物質(zhì)在反應(yīng)溫度4～25℃；相對濕度70～85％的條件下反應(yīng)，形成三重復(fù)合物；(2)洗滌；(3)加入熒光素或其他發(fā)光物質(zhì)連接的親合素，并使之與芯片三重復(fù)合物連接形成四重復(fù)合物；(4)洗滌；(5)進(jìn)行熒光或發(fā)光信號檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述第二信號物質(zhì)為抗種屬免疫球蛋白G抗體或Protein A。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于前述成像檢測的方法是共聚焦掃描顯像法或電荷耦合檢測器成像法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以抗體文庫為基礎(chǔ)的用于多種蛋白質(zhì)分析的并可進(jìn)而用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片、該芯片制備方法及其檢測技術(shù)。該芯片是利用平板印刷術(shù)按照預(yù)先設(shè)計的方案將取自抗體文庫的抗體或進(jìn)而制備的抗體片斷印刷到帶有醛基的芯片基片上，將抗體或其抗體片斷用平板印刷術(shù)固定在活化的芯片基片上。該芯片在檢測時，應(yīng)用通用信號物質(zhì)，使整個芯片只用一種信號標(biāo)記物進(jìn)行蛋白組分析，可在實(shí)現(xiàn)微陣列“高通量”檢測的同時，也能滿足蛋白檢測的特異性要求；另外引入親合素－生物素系統(tǒng)的信號放大體系檢測系統(tǒng)可將檢測靈敏度提高至超微量測定的水平。利用抗體片斷作為捕獲探針可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)芯片在后續(xù)反應(yīng)中的特異性，改善信噪比。
文檔編號G01N33/53GK1584592SQ0315053
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月22日
發(fā)明者宋世平, 李賓, 王惠瓊, 胡鈞, 唐國忠, 李民乾 申請人:中國科學(xué)院上海原子核研究所