專(zhuān)利名稱(chēng)：檢驗(yàn)和治療鼻咽癌的物質(zhì)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于癌細(xì)胞中的差異基因表達(dá)治療癌癥的物質(zhì)和方法。尤其是，但不僅僅是，本發(fā)明提供了診斷和治療鼻咽癌的物質(zhì)和方法。
人鼻咽癌(NPC)出現(xiàn)于后鼻咽部的表面上皮，并且并發(fā)高頻率的頸部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。NPC在中國(guó)東南部、亞洲東南部、臺(tái)灣、非洲東部和阿拉斯加州的某些區(qū)域發(fā)生率高(Marks等，1998)。NPC的高峰發(fā)生率發(fā)生在生命的第四十至五十年。在新加坡，NPC是中國(guó)血統(tǒng)的男性中第五個(gè)最流行的癌癥，具有每100,000中14.3的年發(fā)生率(Chia等，2000)。在臨床上，最常用離子放射治療NPC(Lee等，1992；Marks等，1998)。
世界衛(wèi)生組織(WHO)已根據(jù)分化程度將NPC分為三類(lèi)(Marks等，1998)。I型是指鱗狀細(xì)胞癌，它們高度分化，具有特征性的上皮生長(zhǎng)方式和細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外角蛋白絲。無(wú)角質(zhì)化WHO II型癌保留上皮細(xì)胞性狀和生長(zhǎng)方式。另一方面，WHO III型未分化癌不產(chǎn)生角蛋白并且不產(chǎn)生獨(dú)特的生長(zhǎng)方式。WHO-I角質(zhì)化鱗狀細(xì)胞癌包括75％美國(guó)鼻咽癌病例并且在美國(guó)出生的、非西班牙白種人中發(fā)現(xiàn)最多。WHO-II無(wú)角質(zhì)化和WHO-III未分化鼻咽癌包括剩余25％的NPC并且更常見(jiàn)于亞洲人。在臨床上，報(bào)道了亞洲人具有最高比例的放射反應(yīng)性WHO-II無(wú)角質(zhì)化和WHO-III未分化鼻咽癌并且與具有更大數(shù)量低放射反應(yīng)性的角質(zhì)化鱗狀細(xì)胞鼻咽癌的非洲人-美洲人和西班牙人和非西班牙白種人相比能更好地存活。報(bào)道了無(wú)角質(zhì)化和未分化鼻咽癌的5年相對(duì)存活率是65％，和角質(zhì)化變種是37％(Marks等，1998)。
已經(jīng)證明EB病毒(EBV)與NPC密切相關(guān)(Mutirangura等，1998；Chen等，1998)。已報(bào)到WHOII和III型NPC與EBV感染相關(guān)。WHO-II和III型NPC患者中，他們針對(duì)EBV病毒殼體抗原(VCA)以及早期抗原傳播成分的IgG和IgA水平升高(Zong等，1992；Sigel等，1994)。相比之下，WHO I型分化很好的癌癥患者具有與對(duì)照人群類(lèi)似的EBV血清學(xué)特征且看來(lái)與EBV感染沒(méi)有特殊相關(guān)。此外，分子研究表明在所有三個(gè)WHO型NPC的惡性上皮腫瘤細(xì)胞中都可清楚證明EBV基因組。Northern印跡分析也證明了從NPC患者獲得的活檢組織中潛伏期和溶解周期中包括的EBV基因產(chǎn)物的表達(dá)(Busson等，1992)。然而，表明EBV是NPC病因物質(zhì)的直接證據(jù)很困難且尚未建立。
NPC的另一個(gè)重要特征是NPC腫瘤的病理組織學(xué)特征是非惡性淋巴細(xì)胞重度浸潤(rùn)。已經(jīng)表明顯著比例的這些腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞(TIL)是T細(xì)胞(Huang等，1999)。這些TIL產(chǎn)生的某些細(xì)胞因子可能有助于NPC發(fā)展過(guò)程中腫瘤的生長(zhǎng)(Huang等，1999 Tang等，2001)。
NPC癌發(fā)生可能反映了多種遺傳、飲食和病毒相關(guān)事件的累積，它改變了癌基因和腫瘤抑制基因的正常功能(Gray and Collins，2000；Williams，2000)。廣泛的分子分析包括核型和比較基因組雜交(CGH)研究(Chien等，2001；Fang等，2001)提示NPC因多步驟過(guò)程出現(xiàn)。等位基因分型和CGH的基因組寬泛研究檢測(cè)到NPC中染色體3p、9p、11q、12q、13q和14q上高頻率的基因異常。這個(gè)數(shù)據(jù)提示在RASSF1A基因定位的3p21.3的區(qū)域存在潛在NPC相關(guān)腫瘤抑制基因(Lo等，2001)。近來(lái)報(bào)道了NPC細(xì)胞中啟動(dòng)子過(guò)度甲基化與RASSF1A基因表達(dá)喪失的相關(guān)性(Lo等，2001)。發(fā)現(xiàn)飲食接觸在發(fā)生NPC特殊組織學(xué)亞組的整體改變風(fēng)險(xiǎn)中起作用。在含高水平N-亞硝基化合物的防腐肉的頻繁消費(fèi)者中無(wú)角質(zhì)化和未分化鼻咽癌腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加(Farrow等，1998)。在攝入維生素C的個(gè)體中分化鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)降低，不是其它組織學(xué)類(lèi)型(Farrow等，1998)。這個(gè)關(guān)系在不吸煙者和以前吸煙者比當(dāng)前吸煙者明顯增強(qiáng)(Farrow等，1998)。此外，發(fā)現(xiàn)無(wú)角質(zhì)化和未分化鼻咽癌的患者中針對(duì)早期抗原和病毒殼體抗原的EBV抗體的效價(jià)升高，而這些抗體的效價(jià)在對(duì)照和角質(zhì)化變種患者之間相當(dāng)(Neel，1985和1986)。然而，角質(zhì)化鱗狀細(xì)胞鼻咽癌和放射反應(yīng)性相對(duì)更高的無(wú)角質(zhì)化和未分化鼻咽癌之間的分子基礎(chǔ)尚未系統(tǒng)地研究。
為了試圖理解角質(zhì)化鱗狀細(xì)胞鼻咽癌與無(wú)角質(zhì)化和未分化鼻咽癌之間的分子差異，本發(fā)明人采用cDNA微陣列來(lái)鑒定人NPC癌形成中可能潛在包括的基因。發(fā)明人確定了在未分化和分化人NPC中差異表達(dá)的少量基因。特別是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在未分化CNE-2 NPC細(xì)胞中十五個(gè)基因差異性上調(diào)，而在分化很好的HK1細(xì)胞中六個(gè)基因特異性上調(diào)。
鑒定的未分化人NPC細(xì)胞系CNE-2中特異性上調(diào)的基因之一是人印記基因H19。有趣的是，H19不在分化很好的人HK1 NPC細(xì)胞中表達(dá)。Northern印跡和原位雜交分析也證實(shí)了H19在未分化CNE-2人NPC細(xì)胞系中強(qiáng)烈表達(dá)，但不在分化很好的HK1人NPC細(xì)胞系中表達(dá)。而且，發(fā)明人證明了H19啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化不足可誘導(dǎo)H19基因表達(dá)在分化很好的人HK1 NPC細(xì)胞中去調(diào)節(jié)。發(fā)明人相信啟動(dòng)子區(qū)域基因的甲基化過(guò)度因此可能是在人NPC細(xì)胞分化和印記基因轉(zhuǎn)錄沉默中起作用的重要后生事件。
因此，最基本，本發(fā)明提供了診斷和治療鼻咽癌(NPC)的物質(zhì)和方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選可以用于鼻咽癌治療或診斷的試劑或治療目標(biāo)的方法。
在不同類(lèi)型NPC中某些基因的差異表達(dá)知識(shí)首次提供了診斷NPC或NPC風(fēng)險(xiǎn)的工具。這種診斷可以不依賴(lài)組織學(xué)研究或可以用于補(bǔ)充組織學(xué)研究。
更加和非常重要的是，差異基因表達(dá)知識(shí)能夠診斷NPC類(lèi)型，因此確保得到適當(dāng)治療。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了確定患者NPC的存在或風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括步驟(a)獲得從懷疑具有NPC或具有NPC風(fēng)險(xiǎn)的患者得到的鼻咽細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物；
(b)所述表達(dá)產(chǎn)物接觸能夠結(jié)合對(duì)應(yīng)于表1中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員；和(c)基于來(lái)自所述鼻咽細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物與一種或多種結(jié)合成員的結(jié)合來(lái)確定所述患者NPC的存在或風(fēng)險(xiǎn)。
表達(dá)產(chǎn)物的存在或上調(diào)可以通過(guò)將從測(cè)試下細(xì)胞得到的表達(dá)產(chǎn)物的存在或水平與適當(dāng)對(duì)照細(xì)胞得到的進(jìn)行比較來(lái)確定。理想地，對(duì)照細(xì)胞將是“正常的”，即來(lái)自鼻咽的非癌上皮細(xì)胞。這些細(xì)胞也可以從檢測(cè)下的患者得到。也可以使用來(lái)自其它身體部分的正常上皮細(xì)胞。分析對(duì)照細(xì)胞的可供選擇方法是可以用作對(duì)照的表達(dá)產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)與測(cè)試下細(xì)胞的表達(dá)水平或模式進(jìn)行比較。這種標(biāo)準(zhǔn)可以通過(guò)分析樣品收集物確定正常細(xì)胞中一種或多種產(chǎn)物“標(biāo)準(zhǔn)”表達(dá)水平或模式來(lái)產(chǎn)生。這在下面更詳細(xì)討論。
如上提及，根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的方法不僅特別適合于將鼻咽樣品分類(lèi)為正?；驉盒?，而且適合于對(duì)特定類(lèi)型NPC進(jìn)行分類(lèi)。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)檢測(cè)表1中鑒定的至少一種基因的差異上調(diào)表達(dá)來(lái)確定NPC類(lèi)型的方法，如分化或未分化。
該表達(dá)產(chǎn)物可以是轉(zhuǎn)錄核酸序列或表達(dá)的多肽。該轉(zhuǎn)錄核酸序列可以是RNA、mRNA或mRNA產(chǎn)生的cDNA。
結(jié)合成員可以是在適合雜交條件下能夠特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄核酸的互補(bǔ)核酸序列。
當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物是表達(dá)蛋白的情況下，優(yōu)選結(jié)合成員是所述表達(dá)多肽特異性的抗體或包含抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分子。
為了檢測(cè)目的，可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)步驟標(biāo)記結(jié)合成員。
優(yōu)選，該結(jié)合成員固定在固相支持體上。接著表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)該固相支持體，由此使它們接觸結(jié)合成員。固相支持體可以是玻璃表面，如顯微鏡玻片；小珠(Lynx)；或光纖維。在小珠的情況下，每個(gè)結(jié)合成員可以固定到各個(gè)小珠并在溶液中接觸表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明人已經(jīng)成功使用了包含固定到固相支持體上的多種核酸序列的核酸微陣列。代表表達(dá)基因的核酸序列通過(guò)微陣列，它們能夠產(chǎn)生NPC和更進(jìn)一步NPC類(lèi)型的特征性表達(dá)形式。
本領(lǐng)域現(xiàn)存確定特定基因組的表達(dá)形式的各種方法并且它們可以應(yīng)用于本發(fā)明。例如，基于小珠(Lynx)的方法或分子條碼(Surromed)是已知技術(shù)。在這些情況下，每個(gè)結(jié)合成員與各自可讀和自由浮動(dòng)容易接觸表達(dá)產(chǎn)物的小珠或“條碼”連接。結(jié)合成員與表達(dá)產(chǎn)物(目標(biāo))的結(jié)合在溶液中完成，其后標(biāo)記的小珠或條碼通過(guò)裝置(如流式細(xì)胞儀)并閱讀。
確定表達(dá)形式的更多已知方法是Illumina開(kāi)發(fā)的器械，即光纖維。在這種情況下，每個(gè)結(jié)合成員與光纖維電纜一端的特殊“地址”連接。表達(dá)產(chǎn)物與結(jié)合成員的結(jié)合可以誘導(dǎo)熒光改變，它可以通過(guò)光纖維電纜另一端的裝置閱讀。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了確定個(gè)體NPC的存在或風(fēng)險(xiǎn)的核酸微陣列，包括帶有多種核酸序列的固相支持體，所述核酸序列能夠特異性結(jié)合表1中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物。樣品的分類(lèi)將得到個(gè)體NPC的診斷和/或NPC的分類(lèi)。
典型地，高密度核酸序列，通常是cDNA或寡核苷酸，固定到固相支持體的很小的分散區(qū)域或點(diǎn)上。該固相支持體通常是顯微鏡玻片或?yàn)V膜，被基質(zhì)(或芯片)包被。該核酸序列通常通過(guò)自動(dòng)機(jī)系統(tǒng)傳遞(或印記)到包被的固相支持體上并接著制動(dòng)或固定到支持體上。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，典型地使用熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記樣品得到的表達(dá)產(chǎn)物，接著接觸固定的核酸序列。雜交后，使用檢測(cè)器檢測(cè)熒光標(biāo)記，如高分辨率激光掃描儀。
用數(shù)字圖像軟件分析每個(gè)分散點(diǎn)發(fā)射的信號(hào)獲得表示基因表達(dá)模式(表達(dá)形式)的結(jié)合形式。接著實(shí)驗(yàn)樣品的基因表達(dá)模式可以與對(duì)照的(即來(lái)自正常組織樣品的表達(dá)形式)比較進(jìn)行差異分析。
如上提及，對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)可以是以前判斷是正?；驉盒约?xì)胞特征性的一種或多種表達(dá)形式。這些一種或多種表達(dá)形式可以可提取地保存于數(shù)據(jù)載體上作為部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。然而，也可以將對(duì)照導(dǎo)入試驗(yàn)步驟。換句話說(shuō)，測(cè)試樣品可以“摻加”一種或多種“合成腫瘤”或“合成正常”表達(dá)產(chǎn)物，它可以用作待與測(cè)試樣品中基因鑒定者的表達(dá)水平相比的對(duì)照。
多數(shù)微陣列利用兩種熒光團(tuán)，典型地，最常使用的熒光團(tuán)是Cy3(綠波激發(fā))和Cy5(紅波激發(fā))。微陣列圖像分析的目的是從每個(gè)表達(dá)產(chǎn)物提取雜交信號(hào)。以給定目標(biāo)的絕對(duì)強(qiáng)度(主要對(duì)于與單一樣品雜交的陣列)或具有不同熒光標(biāo)記，代表待與作為內(nèi)對(duì)照的一個(gè)探針進(jìn)行比較的兩種分開(kāi)處理的兩個(gè)表達(dá)產(chǎn)物的比率，(如樣品和對(duì)照)來(lái)測(cè)定信號(hào)。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的微陣列包含多種分散點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)含有一種或多種寡核苷酸并且每個(gè)點(diǎn)代表選自表1中的一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物的一個(gè)不同結(jié)合成員。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了產(chǎn)生NPC或特定類(lèi)型NPC特征性的表達(dá)形式的方法，所述方法包括(a)獲得從患者得到的NPC細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物(b)所述表達(dá)產(chǎn)物接觸能特異性結(jié)合表1中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物的多種結(jié)合成員；(c)確定所述表達(dá)產(chǎn)物與結(jié)合成員的結(jié)合，使得產(chǎn)生NPC細(xì)胞特征性的表達(dá)形式。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括NPC或NPC類(lèi)型特征性的表達(dá)數(shù)據(jù)的核酸(RNA或cDNA)表達(dá)形式數(shù)據(jù)庫(kù)，所述數(shù)據(jù)得自顯示NPC或NPC類(lèi)型特征性核酸分布的多種寡核苷酸微陣列的分析，用于診斷。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了診斷NPC或NPC類(lèi)型的診斷工具，包括寡核苷酸微陣列，所述微陣列具有帶有多種寡核苷酸序列的固相支持體，所述寡核苷酸各自包括能夠特異性結(jié)合表1中鑒定的多種基因的表達(dá)核酸的核酸序列。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了確定生物學(xué)樣品中NPC的存在或類(lèi)型的試劑盒，所述試劑盒包括個(gè)能夠特異性結(jié)合表1中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物的一種或多種結(jié)合成員，和檢測(cè)工具。優(yōu)選該生物學(xué)樣品是細(xì)胞提取物。
優(yōu)選，試劑盒中一種或多種結(jié)合成員(抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或核酸序列)固定到固相支持體上。優(yōu)選檢測(cè)工具是當(dāng)結(jié)合成員已經(jīng)與表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)記(放射性或染料，如熒光染料)。
優(yōu)選，一種或多種結(jié)合成員包括能夠特異性結(jié)合H19或CNKNIC表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員。這些基因都被用作未分化人NPC的方便標(biāo)記。當(dāng)H19不產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物將是mRNA。在CNKNIC的情況下，表達(dá)產(chǎn)物可以是mRNA或產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物。
如上提及，II型和III型未分化NPC對(duì)放療反應(yīng)更大，因此罹患這些類(lèi)型NPC的患者有更好的存活率。本發(fā)明人確定了與分化的I型NPC相反，在未分化NPC中上調(diào)的很多基因(見(jiàn)表1)。這些基因包括H19和CNKN1C。
本發(fā)明人進(jìn)一步確定了與未分化(II型或III型)細(xì)胞相反，在I型分化細(xì)胞中上調(diào)的很多基因(見(jiàn)表1)。
不僅該差異表達(dá)知識(shí)產(chǎn)生了極其有效的診斷方法，而且也提供了治療NPC，尤其是過(guò)去治療成功有限的I型的新方法。
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)分化細(xì)胞的H19基因的啟動(dòng)子區(qū)域被高度甲基化，而未分化細(xì)胞中相同區(qū)域沒(méi)有見(jiàn)到甲基化。發(fā)明人進(jìn)一步表明這個(gè)區(qū)域的去甲基化導(dǎo)致分化細(xì)胞中H19基因的表達(dá)。
這個(gè)令人興奮的發(fā)現(xiàn)提供了改變不同類(lèi)型NPC特征性的基因差異表達(dá)的方法并提供了對(duì)治療，如放療更易感的細(xì)胞。
因此，在本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了治療NPC或NPC風(fēng)險(xiǎn)的患者的方法，包括給予去甲基化劑，如5′氮雜-2′-脫氧胞苷，聯(lián)合癌癥治療，如化療或放療。
本發(fā)明也提供了去甲基化劑用于制備聯(lián)合化療或放療治療鼻咽癌藥物的用途。
優(yōu)選該去甲基化劑用于治療I型NPC。
本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)-分化和未分化形式NPC具有不同的基因表達(dá)，發(fā)展了篩選能夠治療NPC的物質(zhì)，和尤其是能夠選擇性治療不同類(lèi)型NPC的物質(zhì)的方法。
因此，在第五個(gè)方面，提供了篩選能夠治療患者的NPC的物質(zhì)的方法，所述方法包括(a)在細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)表1中鑒定的一種或多種基因，(b)所述細(xì)胞與測(cè)試物質(zhì)接觸；(c)確定與所述測(cè)試物質(zhì)對(duì)缺乏所述一種或多種基因過(guò)度表達(dá)的可比較細(xì)胞的作用相比，所述測(cè)試物質(zhì)對(duì)所述細(xì)胞的作用；和(d)鑒定所述測(cè)試物質(zhì)為能夠治療NPC的物質(zhì)。
該方法可以進(jìn)一步包括制備包含步驟(d)鑒定的物質(zhì)的藥物組合物的步驟。
通過(guò)將能夠表達(dá)所述基因特征性的表達(dá)產(chǎn)物的核酸插入所述細(xì)胞可以過(guò)度表達(dá)該一種或多種基因。
根據(jù)該篩選方法，可以?xún)?yōu)選選擇已知在分化NPC或未分化NPC中上調(diào)的基因。此外，根據(jù)測(cè)試下的物質(zhì)，可以?xún)?yōu)選選擇已知產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物如CNKNIC的那些基因。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，被表達(dá)的一種或多種基因包括CNKN1C。
該方法也可以包括用去甲基化劑聯(lián)合該測(cè)試物質(zhì)來(lái)處理過(guò)度表達(dá)表1中鑒定的一種或多種基因的細(xì)胞。
作為重組產(chǎn)生過(guò)度表達(dá)不同類(lèi)型NPC特征性的一種或多種基因的細(xì)胞可供選擇的方法，可以直接使用NPC細(xì)胞(I、II或III型)。盡管這將提供關(guān)于測(cè)試物質(zhì)作用的有價(jià)值信息，但是可能需要進(jìn)一步測(cè)試來(lái)鑒定該特殊基因目標(biāo)。
現(xiàn)在將通過(guò)實(shí)施例，參照附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的方面和實(shí)施方案。更多方面和實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將很明顯。本文中提及的所有文件并入這里作為參考。
在圖中

圖1未分化NPC(CNE-2)和很好分化的NPC(HK1)細(xì)胞之間的基因表達(dá)的對(duì)比微陣列分析，來(lái)自雙份實(shí)施的三個(gè)實(shí)驗(yàn)(1至3)。用Cy5(掃描時(shí)假紅色(pseudo-colored red))標(biāo)記得自CNE-2細(xì)胞或HK1細(xì)胞的cDNA，用Cy3(假綠色)標(biāo)記對(duì)照cDNA(混合來(lái)自10個(gè)細(xì)胞系)。使用Cluster程序計(jì)算Log2轉(zhuǎn)換的中值(median-centered)Cy5∶Cy3比率。這些比率是每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品中相對(duì)基因表達(dá)的測(cè)定結(jié)果，并且根據(jù)底部顯示的顏色棒(使用TreeView程序)以從紅經(jīng)過(guò)黑至綠的梯度色譜顯示。不幸的是，這不能呈現(xiàn)于本說(shuō)明書(shū)所附的黑白圖中。實(shí)際上，線圖已經(jīng)用于試圖呈現(xiàn)梯度色譜。紅 代表高于實(shí)驗(yàn)樣品特定基因的中值的Cy5∶Cy3比率。綠 或黑 分別代表低于或等于實(shí)驗(yàn)樣品基因的中值的Cy5∶Cy3比率。呈現(xiàn)了四個(gè)基因簇(A至D)，顯示(A)HK1比CNE-2細(xì)胞中表達(dá)水平高的基因，(B和C)CNE-2細(xì)胞比HK1中表達(dá)水平高的基因，和(D)內(nèi)部“看家”對(duì)照基因。
圖2從18個(gè)不同人腫瘤細(xì)胞系(Detroit 562，F(xiàn)adu，CNE-2，DAKIKI，Raji，WT-18，F(xiàn)HS-738Lu，MRC-5，A549，HeLa，HT-3，SW480，PA-1，HeCat，Bt-20，Hep-G2，A498和Hs67)純化的polyA+RNA的Northern印跡分析。5μg polyA+RNA在1％含甲醛的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并如“材料和方法”中所述探測(cè)H19和β-肌動(dòng)蛋白。
圖3由未分化NPC(CNE-2)、分化很好的NPC(HK1)和宮頸癌(HT-3)得到的細(xì)胞系的原位雜交，使用如“材料和方法”中所述的β-肌動(dòng)蛋白探針和H19有義和反義探針。以×400的放大率進(jìn)行照相。
圖4來(lái)自正常鼻咽(NP)和未分化鼻咽癌(NPC)的初級(jí)人組織的原位雜交。如“材料和方法”所述使用H19或β-肌動(dòng)蛋白特異性的DIG標(biāo)記探針。以×400的放大率進(jìn)行照相。
圖5來(lái)自(A)十六種成人組織(心、腦、胎盤(pán)、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸和白細(xì)胞)和(B)五種胎兒組織(心、腦、肺、肝、腎)的polyA+RNA在尼龍膜(MTN Blots，Clontech)上的Northern印跡分析。如“材料和方法”所述探測(cè)印跡的H19和β-肌動(dòng)蛋白。
圖6分別得自未分化和分化很好的鼻咽癌的人細(xì)胞系CNE-2和HK1的RNA的Northern印跡分析，使用H19、胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF-2)和β-肌動(dòng)蛋白的探針。
圖7使用亞硫酸氫鹽測(cè)序檢測(cè)H19啟動(dòng)子內(nèi)304bp區(qū)域的CpG甲基化的程度。分析未分化NPC細(xì)胞(CNE-2)、分化很好的NPC細(xì)胞(HK1)和用甲基化抑制劑-5′-氮雜-2′-脫氧胞苷(AzC)處理的HK1細(xì)胞的這個(gè)區(qū)域的十二個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化特征。每個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化的發(fā)生率以測(cè)序的克隆數(shù)量百分比來(lái)表示。CNE-2、HK1和AzC處理的HK1細(xì)胞得到的測(cè)序的克隆數(shù)量分別是19、63和27。
圖8Northern印跡分析檢測(cè)在存在或不存在5′-氮雜-2′-脫氧胞苷(AzC)下培養(yǎng)7天的分化很好的NPC(HK1)和未分化NPC(CNE-2)細(xì)胞中H19基因表達(dá)。如“材料和方法”所述探測(cè)印跡的H19和β-肌動(dòng)蛋白。
材料和方法細(xì)胞系和組織培養(yǎng)以前已經(jīng)描述了人NPC細(xì)胞系CNE-2和HK1(Sizhong等人，1983；Huang等，1983)。CNE-2細(xì)胞是由H.M.Wang博士(CancerInstitute，Sun Yat-sen University of Medical Sciences，廣州，中國(guó))得到的，而細(xì)胞系HK1是由D.P.Huang博士(中國(guó)香港大學(xué))得到的。CNE-2細(xì)胞得自未分化鼻咽癌(Sizhong等，1983)，而HK1得自分化很好的鱗狀鼻咽癌(Huang等，1983)。
除非另有指出，本研究中采用的多數(shù)腫瘤細(xì)胞系是從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的。這些人細(xì)胞系包括A498(腎癌)、A549(肺癌)、DAKIKI(EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞)、Fadu(咽癌)、HeLa(子宮頸腺癌)、HepG2(heptocellular癌)、MCF-7(乳腺癌)、HT-3(子宮頸癌)、K562(骨髓白血病)、Detroit-562(咽癌)，Raji(Burkitt淋巴瘤)，WT-18(EBV轉(zhuǎn)化的B-淋巴細(xì)胞)，F(xiàn)HS-738Lu(正常肺)，MRC-5(二倍體肺)。采用的另外細(xì)胞系包括SW480(結(jié)腸腺癌)、PA-1(卵巢畸胎瘤)、HeCat(上皮)、BT-20(乳癌)和Hs67(正常胸腺)。所有這些細(xì)胞系在補(bǔ)充了10％FCS(Hyclone，Logan，UT)，0.1mM非必需氨基酸、4mM L-谷氨酸和1mM丙酮酸鈉的RPMI培養(yǎng)基(Gibco BRL，Life Technologies，Grand Island，NY)中增殖。
組織樣品治療前從新加坡國(guó)立醫(yī)院(Singapore General Hospital)ENT科的知情同意患者得到人NPC腫瘤活檢組織。使用棉簽敷料器施用的4％可卡因溶液從局部麻醉下的患者獲得活檢組織。使用Hilyard鉗，在用光纖維鼻內(nèi)窺鏡直接觀察下鉗取共三鉗咬腫瘤組織。前兩個(gè)鉗咬送去組織學(xué)檢查，取獲得的第三個(gè)活檢組織進(jìn)行本研究。來(lái)自患者的腫瘤活檢組織立即速凍并保存在液氮中直到研究。在石蠟切片中證實(shí)組織病理學(xué)診斷。
cDNA微陣列本發(fā)明人選擇了1000個(gè)以上IMAGE人cDNA克隆(IncyteGenomics Inc.，Palo Alto，CA)，代表大約941個(gè)不同的單基因簇(即獨(dú)特基因)，進(jìn)行它們的點(diǎn)微陣列研究。這1000個(gè)克隆形成建立作為新加坡國(guó)立癌癥中心的cDNA微陣列分析核心設(shè)備的18000個(gè)克隆庫(kù)的一部分。這些克隆的全部列表將可以申請(qǐng)獲得。劃線培養(yǎng)這1000個(gè)克隆，各個(gè)克隆生長(zhǎng)過(guò)夜。這些當(dāng)中，使用基因特異性引物對(duì)，PCR擴(kuò)增鑒定并證實(shí)了713個(gè)克隆。用100μl PCR反應(yīng)中1∶1000的終稀釋度，從過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物中擴(kuò)增到每個(gè)插入物。濃縮PCR產(chǎn)物，重懸于20μl3×SSC中，接著利用它印記到聚L-賴(lài)氨酸(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)處理的玻璃顯微鏡玻片(Fisher)上，使用配備四個(gè)印記環(huán)針(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)的自動(dòng)機(jī)GMS 417微陣列儀(Genetic Microsystems Inc，Woburn，MA)?？醇一虬℅APDH，β-肌動(dòng)蛋白，β-2-微球蛋白，親環(huán)蛋白和泛素類(lèi)似地點(diǎn)印作為數(shù)據(jù)分析過(guò)程中雜交信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)對(duì)照。印記后，倒置玻片于沸水浴(試劑級(jí)水)中2-3秒使陣列再水合，快速干燥5秒在100℃熱block上4秒并使用Stratalinker(Strategene，La Jolla，CA)用550mJ紫外線照射交聯(lián)。接著玻片置于0.2％SDS中(10分鐘，磁力攪拌)，隨后在清潔水(2L)中洗滌5次之后轉(zhuǎn)移到沸騰熱水(10分鐘)中，印跡除去過(guò)量液體，在95％乙醇中干燥5分鐘并在80℃烘箱中空氣干燥5分鐘。
cDNA微陣列雜交使用附于3DNA表達(dá)陣列檢測(cè)試劑盒(Genisphere Inc.，Montvale，NJ)的合成雜交探針的方案，有修改。使用10μg從人NPC細(xì)胞提取的總RNA或從10μg對(duì)照RNA(10個(gè)細(xì)胞系混合的)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，寡(dT)引物分別加入3DNA Cy5“標(biāo)記”試劑(5′-CCTGTTGCTCTATTTCCCGTGCCGCTCCGGT-(dT)n-3′)或3DNA Cy3“標(biāo)記”試劑(5′GGCCGACTCACTGCGCGTCTTCTGTCCCGCC-(dT)n-3′)的捕獲序列。產(chǎn)生混合對(duì)照RNA的10個(gè)細(xì)胞系是A498、A549、DAKIKI、CNE-2、Fadu、HeLa、HepG2、MCF-7、HT-3和K562。使用20μl雜交體積在玻璃蓋片下和潮濕暗室(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)中，每個(gè)測(cè)試RNA樣品(CNE-2或HK1)以及對(duì)照RNA產(chǎn)生的cDNA與微陣列42℃競(jìng)爭(zhēng)性雜交過(guò)夜。
雜交后玻片洗滌包括一系列洗滌，從2×SSC/0.1％SDS(2次洗滌，每次5分鐘)開(kāi)始，隨后是0.2×SSC/0.1％SDS(2次洗滌，每次5分鐘)，最后用0.1×SSC(2次洗涂，每次5分鐘)。在cDNA已經(jīng)與微陣列雜交后，僅用Cy5或Cy3標(biāo)記的摻入熒光染料捕獲序列的cDNA并洗去過(guò)量未結(jié)合的cDNA。
陣列定量和聚類(lèi)(cluster)分析用GMS 418激光掃描儀(Genetic Microsystems Inc，Woburn，MA)掃描雜交陣列。使用不同的波道分開(kāi)獲得Cy5和Cy3的圖像，疊加并用Imagene軟件3.0版(BioDiscovery Inc，Los Angeles，CA)定量。一格環(huán)對(duì)準(zhǔn)整個(gè)陣列圖像上的每個(gè)點(diǎn)限定陣列上的點(diǎn)。從點(diǎn)內(nèi)平均強(qiáng)度減去背景信號(hào)得到每個(gè)點(diǎn)的凈信號(hào)。應(yīng)用調(diào)節(jié)因子使得整個(gè)陣列上點(diǎn)的平均Cy5∶Cy3比率為1.0，使從Cy5和Cy3波道獲得的信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。接著計(jì)算Cy5∶Cy3比率的Log2轉(zhuǎn)換和中值集中。使用完全鏈接聚類(lèi)(linkage clustering)(Gene Cluster progrand，http://rana.lbl.gov/；Eisen等，1998)實(shí)施分級(jí)聚類(lèi)算法。TreeView程序(Eisen等，1998)用于使聚類(lèi)數(shù)據(jù)可視化，通過(guò)使用從亮紅、經(jīng)過(guò)黑色、至亮綠的梯度色譜顯示基因表達(dá)強(qiáng)度。不幸的是，這不能在本說(shuō)明書(shū)所附的黑白圖中顯示。然而，通過(guò)不同標(biāo)記的盒子已經(jīng)表示了強(qiáng)度。見(jiàn)例如圖1。
Northern印跡分析使用TRIzol試劑(Gibco BRL，Life Technologies，Grand Island，NY)分離總細(xì)胞RNA。使用來(lái)自Invitrogen的Fast-Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)選擇Poly(A)+RNA。對(duì)于Northern印跡分析，Poly(A)+RNA(5μg)加樣于含0.7％甲醛和5mM碘化乙酰胺的1％瓊脂糖凝膠的每一道，進(jìn)行電泳。通過(guò)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移將RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜(Amersham，Piscataway，NJ)并用32P標(biāo)記的H19 DNA(得自Shirley Tilghman教授的全長(zhǎng)cDNA克隆，普雷斯頓大學(xué)，NJ)探測(cè)。使用高引發(fā)DNA標(biāo)記試劑盒(BoehringerMannheim GmbH，Mannheim，Germany)根據(jù)制造商方案，通過(guò)隨機(jī)六核苷酸引發(fā)來(lái)標(biāo)記探針。人和人胎兒多種組織Northern印跡采用的濾膜購(gòu)自Clontech實(shí)驗(yàn)室(Clontech Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)。使用BioRadFX PhosphorImager(BioRad，Richmond，CA)定量雜交信號(hào)。
原位雜交在恒冷切片機(jī)中將冰凍活檢組織NPC組織切成10μm。細(xì)胞系(CNE-2，HK1和HT-3)在玻片(Falcon CultureSlide，Becton Dickinsonand Co.，NJ)上安裝的室中生長(zhǎng)至一半融合。用非放射活性有義和反義H19探針實(shí)施雜交，該探針根據(jù)制造商的規(guī)程，摻入地高辛配基(DIG)標(biāo)記的dUTP(DIG RNA標(biāo)記試劑盒，Hoffmann-La Roche，Basel，瑞士)被標(biāo)記。用過(guò)氧化物酶綴合的抗DIG抗體檢測(cè)雜交的地高辛配基標(biāo)記的探針，隨后與5-溴基-4-氯-3-吲哚磷酸鹽和硝基藍(lán)四唑鹽(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，德國(guó))進(jìn)行酶催化的顏色反應(yīng)。用蘇木精(BDH Laboratory Supplies，Dorset，英國(guó))計(jì)數(shù)器染色切片。用Olympus BX51顯微鏡(Olympus Optical Co.Ltd.，Tokyo，日本)觀察玻片。
用5’-氮雜-2’-脫氧胞苷處理七個(gè)細(xì)胞系(CNE-2，HK1，HeLa，Hep-G2，HT-3，NIHOVCAR-3和SW480)在RPMI(含10％胎牛血清)中12.5μM 5’-氮雜-2’-脫氧胞苷(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)存在或缺乏下分別培養(yǎng)7天。使用TRIzol試劑(Gibco BRL，Life Technologies，Grand Island，NY)，根據(jù)制造商的規(guī)程，提取這些細(xì)胞系的總RNA。20μg總RNA用于Northern印跡分析。
H19啟動(dòng)子區(qū)域的亞硫酸氫鹽測(cè)序用RsaI在37℃消化基因組DNA(2μg)16小時(shí)并添加新鮮制備的NaOH至終濃度0.3M，在42℃變性30分鐘。通過(guò)添加尿素/亞硫酸氫鹽溶液和氫醌分別至終濃度5.36M，3.44M和0.5mM，對(duì)變性DNA實(shí)施亞硫酸氫鹽反應(yīng)。反應(yīng)包括20個(gè)循環(huán)的55℃(15分鐘)，隨后95℃變性(30秒)。PCR擴(kuò)增亞硫酸氫鹽處理的DNA(5μl)，以20μl反應(yīng)，含0.5單位AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT)和使用引物(10μM)，將擴(kuò)增H19啟動(dòng)子中306bp區(qū)域5′-AGATAGTGGTTTGGGAGGGAGAGGTTTTGGAT-3′和5′-ATCCCACCCCCTCCCTCACCCTACT CCTCA-3′。反應(yīng)經(jīng)歷94℃(3分鐘)，接著35個(gè)循環(huán)(94℃30秒，58℃1分鐘，72℃30秒)，以72℃(6分鐘)結(jié)束。接著如(Tremblay等人，1997)所述克隆并測(cè)序亞硫酸氫鹽處理的DNA。使用CEQ 2000毛細(xì)管測(cè)序儀(Beckman Coulter Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)實(shí)施DNA測(cè)序。
結(jié)果未分化人NPC細(xì)胞系CNE-2和分化很好的人HK1 NPC腫瘤細(xì)胞顯示獨(dú)特的基因表達(dá)形式為了鑒定人NPC特異性基因，發(fā)明人啟動(dòng)新加坡國(guó)立癌癥中心程序，采用包含18000個(gè)cDNA克隆的文庫(kù)篩選人鼻咽癌臨床活檢組織將臨床信息內(nèi)容與這些表達(dá)形式聯(lián)系起來(lái)。基于他們的初步數(shù)據(jù)，他們選擇了大約1000個(gè)基因進(jìn)行他們的本研究。
使用從未分化人NPC細(xì)胞系CNE-2和分化很好的NPC細(xì)胞系HK1提取的RNA建立基因表達(dá)形式并雜交到點(diǎn)印微陣列。CNE-2和HK1細(xì)胞顯示了不同的基因表達(dá)形式(圖1，表1)。發(fā)現(xiàn)與CNE-2細(xì)胞相比，研究的大約1000個(gè)基因中有六個(gè)基因在HK1細(xì)胞中一致上調(diào)(表1)。這些包括編碼金屬硫蛋白-I、人黑素瘤相關(guān)抗原蛋白B3和單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP-3)的基因(圖1A，表1)。相比之下，發(fā)現(xiàn)十五個(gè)基因在未分化CNE-2細(xì)胞RNA中比在分化很好的HK1細(xì)胞RNA中一致更高度表達(dá)(表1)。這些基因中有些包括H19印記基因、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1C(CDKN1C或p57KTP2)基因，編碼蛋白-酪氨酸激酶Flt4、Tat相互作用蛋白和細(xì)胞周期蛋白D3的基因(圖1B和C，表1)。
H19基因在未分化人NPC細(xì)胞中高度表達(dá)最有趣的是印記H19基因在未分化CNE-2 NPC細(xì)胞中特異性上調(diào)。為了檢測(cè)H19表達(dá)是否對(duì)人NPC細(xì)胞是獨(dú)特的，發(fā)明人實(shí)施Northern印跡分析比較十八種不同來(lái)源的不同人腫瘤細(xì)胞系的H19表達(dá)。這些包括來(lái)自人Burkitt淋巴瘤、咽癌、子宮頸癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢畸胎瘤、肝細(xì)胞癌、腎癌、乳腺癌、EBV轉(zhuǎn)化的正常B淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮和胸腺的腫瘤細(xì)胞系(圖2)。僅可在CNE-2細(xì)胞檢測(cè)到與H19探針的陽(yáng)性雜交(圖2)。這些情況下檢測(cè)的其它十七個(gè)細(xì)胞系沒(méi)有可檢測(cè)的H19基因表達(dá)。
H19在人中的特異性表達(dá)原位雜交研究也證實(shí)了未分化CNE-2 NPC細(xì)胞系(圖3)。盡管在檢測(cè)的CNE-2、HK1和HT-3(子宮頸癌)細(xì)胞中可以檢測(cè)到β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，僅可在CNE-2細(xì)胞中特異性檢測(cè)到H19表達(dá)(圖3)。隨后結(jié)合非放射活性的地高辛配基標(biāo)記的反義H19 RNA探針后的灰-棕色染色鑒定表達(dá)H19 mRNA的細(xì)胞(圖3)。
為了尋找未分化CNE-2細(xì)胞中H19表達(dá)的相關(guān)性，實(shí)施原位雜交研究未分化人初級(jí)NPC組織中H19的表達(dá)。原位雜交研究揭示H19也在未分化人NPC活檢組織中強(qiáng)烈表達(dá)(圖4)，并且不在非惡性但取自與鼻咽區(qū)域類(lèi)似條件的慢性炎癥組織活檢組織的上皮中表達(dá)(圖4)。原位雜交研究了共七種未分化人初級(jí)NPC活檢組織和三個(gè)非NPC活檢組織并且圖4顯示了代表性結(jié)果。
此外，通過(guò)Northern印跡分析也確定了H19在人胎盤(pán)組織中表達(dá)(圖5A)。在來(lái)自檢測(cè)的多數(shù)成年組織中RNA中不能檢測(cè)到H19。這些包括心、腦、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸和白血病的組織(圖5A)。在胎兒肝臟的RNA，而不是胎兒心臟、胎兒腦、胎兒肺或胎兒腎組織中也可以檢測(cè)到H19表達(dá)(圖5B)。
H19是父本印記基因并且位于染色體11p15.5上母本印記IGF-2基因非常接近的位置(Feinberg，1999)。為了確定這兩個(gè)基因在未分化CNE-2細(xì)胞和分化很好的HK1細(xì)胞中的表達(dá)之間的關(guān)系，實(shí)施Northern印跡分析。與僅在CNE-2細(xì)胞中表達(dá)的H19相比，IGF-2在CNE-2和HK1細(xì)胞中均表達(dá)(圖6)。
分化很好的HK1 NPC細(xì)胞的啟動(dòng)子區(qū)域中CpG二核苷酸甲基化過(guò)度當(dāng)檢測(cè)H19的DNA序列時(shí)，一個(gè)值得注意的特征是H19基因啟動(dòng)子區(qū)域很多CpG二核苷酸的存在(圖7)。已經(jīng)證明CpG二核苷酸甲基化不足和過(guò)度在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中是重要的后生事件。為了研究甲基化是否在未分化和分化很好的NPC細(xì)胞中H19基因的調(diào)節(jié)中起作用，發(fā)明人比較了CNE-2和HK1細(xì)胞中H19基因的啟動(dòng)子甲基化狀況。從CNE-2細(xì)胞和HK1細(xì)胞中純化基因組DNA，PCR擴(kuò)增H19啟動(dòng)子區(qū)域和亞硫酸氫鹽測(cè)序后估計(jì)H19啟動(dòng)子的甲基化狀況。亞硫酸氫鈉特異性誘導(dǎo)胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶殘基的水解脫氨基作用。因此，預(yù)期當(dāng)亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序PCR擴(kuò)增的DNA時(shí)，最終測(cè)序反應(yīng)中檢測(cè)的胞嘧啶將代表在天然DNA樣品中甲基化的那些胞嘧啶殘基。相比之下，在最初DNA樣品中沒(méi)有甲基化的所有胞嘧啶殘基在亞硫酸氫鹽處理后隨后將轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?。研究了跨越H19啟動(dòng)子區(qū)域304bp的共十二個(gè)CpG二核苷酸(圖7)。在從H19強(qiáng)烈表達(dá)的CNE-2細(xì)胞純化的DNA中，這些CpG二核苷酸中多數(shù)沒(méi)有甲基化(圖7)。相比之下，在從H19不表達(dá)的HK1細(xì)胞純化的基因組DNA中，這些CpG二核苷酸中多數(shù)被甲基化(圖7)。在位置-209，-189，-180，-117和-102的CpG二核苷酸看來(lái)是甲基化“熱點(diǎn)”并且計(jì)數(shù)大于70％測(cè)序的克隆(圖7)。
H19啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的CpG二核苷酸甲基化不足與分化很好的HK1 NPC細(xì)胞中H19基因表達(dá)的恢復(fù)有關(guān)為了確定甲基化不足是否可以誘導(dǎo)H19表達(dá)，發(fā)明人用去甲基化劑5′-氮雜-2′-脫氧胞苷處理HK1細(xì)胞。當(dāng)用H19探針的Northern印跡雜交分析從去甲基化劑5′-氮雜-2′-脫氧胞苷處理后的HK1細(xì)胞中提取的RNA時(shí)，在處理的HK1細(xì)胞的RNA中可檢測(cè)到多種的H19轉(zhuǎn)錄物(圖8)。
為了進(jìn)一步尋找HK1細(xì)胞中啟動(dòng)子甲基化不足與H19基因表達(dá)的相關(guān)性，從去甲基化劑5′-氮雜-2′-脫氧胞苷處理的HK1細(xì)胞純化基因組DNA并如上所述利用它進(jìn)行亞硫酸氫鹽測(cè)序。與從野生型HK1細(xì)胞純化的DNA中多數(shù)甲基化的CpG二核苷酸相比，從5′-氮雜-2′-脫氧胞苷處理的HK1細(xì)胞純化的DNA的H19啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的CpG二核苷酸甲基化大大減少(圖7)。這些發(fā)現(xiàn)提示H19啟動(dòng)子區(qū)域甲基化不足與人NPC細(xì)胞中H19基因表達(dá)相關(guān)。
討論根據(jù)其分化和角化程度，人NPC分為I、II和III型(Marks等，1998)。I型是高度分化和對(duì)放射反應(yīng)相對(duì)較小的鱗狀細(xì)胞NPC癌。另一方面，III型未分化NPC癌對(duì)放射反應(yīng)較大(Neel 1985；Marks等，1998)。最多部分理解了人NPC的腫瘤增進(jìn)和進(jìn)展的分子機(jī)制并且沒(méi)有研究NPC細(xì)胞的分化狀態(tài)和癌形成之間的關(guān)系?；蚋淖円呀?jīng)暗含作為有助于向NPC發(fā)展的很多機(jī)制之一。各自基因產(chǎn)物的隨后變化將反映這些基因改變中的多數(shù)。在新加坡，已經(jīng)提出90％以上的臨床檢測(cè)的NPC病例分化很差。在本研究中，發(fā)明人因此采用cDNA微陣列來(lái)鑒定在分化很好和未分化NPC癌細(xì)胞中表達(dá)有差異的基因。這些基因無(wú)疑將對(duì)闡明人NPC癌形成很重要。從它們的cDNA微陣列分析來(lái)看，證明十五個(gè)基因在未分化CNE-2 NPC細(xì)胞中被差異上調(diào)，而在分化很好的HK1細(xì)胞中六個(gè)基因被特異性上調(diào)(圖1和表1)。
在分化很好的HK1細(xì)胞中一致上調(diào)的基因之一是金屬硫蛋白I(圖1和表1)。金屬硫蛋白I編碼在細(xì)胞生長(zhǎng)、修復(fù)和分化中起作用并且已經(jīng)暗示作為腫瘤分化或細(xì)胞增殖的潛在標(biāo)志的金屬結(jié)合蛋白(Hengstler等，2001)。此外，金屬硫蛋白I也起著抵抗由氧化性或外部應(yīng)力誘導(dǎo)的DNA損害和調(diào)亡的保護(hù)性作用，并且假定有助于腫瘤細(xì)胞抵抗放射(Jayasurya等，2000)。在HK1細(xì)胞中也差異上調(diào)的其它基因包括編碼單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)、CPR2、CDK抑制劑2A和IGFBP-3(圖1和表1)的基因。
MCP-3，與趨化因子受體CCR1、CCR2和CCR3相互作用的C-C趨化因子，是單核細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的化學(xué)趨化因子(Fioretti等，1998)。已經(jīng)提示NPC腫瘤損害中見(jiàn)到的特征性白細(xì)胞浸潤(rùn)可能是由浸潤(rùn)細(xì)胞分泌的C-C趨化因子誘導(dǎo)的(Tang等，2001)。然而，HK1 NPC細(xì)胞中MCP-3表達(dá)上調(diào)提示NPC腫瘤細(xì)胞自己也可能對(duì)白細(xì)胞募集到腫瘤部位有活躍貢獻(xiàn)。
發(fā)現(xiàn)與分化很好的HK1 NPC細(xì)胞相比，在未分化CNE-2細(xì)胞中十五個(gè)基因一致以較高水平差異表達(dá)(圖1和表1)。這些基因之一編碼與血管生成性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(VEGF-C)相互作用的蛋白-酪氨酸激酶Flt4-一種受體型酪氨酸激酶(Lee等，1996)。有趣的是，未分化NPC細(xì)胞中Flt4的增強(qiáng)表達(dá)很好地與Flt4在未分化畸胎瘤細(xì)胞但不在分化畸胎瘤細(xì)胞中表達(dá)的觀察結(jié)果一致(Pajusola等，1992)。在CNE-2細(xì)胞中上調(diào)的另一個(gè)基因是編碼30kDa Tat相互作用蛋白(TIP30)的基因。TIP30等同于作為轉(zhuǎn)移抑制劑的CC3并通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷調(diào)亡而抑制人小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移(Shtivelman 1997)。這是通過(guò)誘導(dǎo)多種調(diào)亡相關(guān)基因，如Bad和Siva，和轉(zhuǎn)移抑制劑，TIP30/CC3對(duì)NM23-H2介導(dǎo)的(Xiao等，2000)。
有趣的是，證明了H19基因和編碼CDKN1C的基因在未分化CNE-2NPC細(xì)胞中差異上調(diào)(圖1和表1)。H19和CDKN1C基因都位于染色體11p15(Feinberg，1999)并且報(bào)道了都是印記基因?；蚪M印記是引起母本和親本基因差異表達(dá)的親本來(lái)源特異性染色體修飾(Tilghman 1999)。盡管已經(jīng)報(bào)道的印記基因量相對(duì)較少，但是它們?cè)诎l(fā)育和癌形成中起重要作用(Joyce and Schofield，1998)。已經(jīng)假定CDKN1C和H19基因是腫瘤抑制基因(Hatada and Mukai，1995)。也證明了CDKN1C是很多G1細(xì)胞周期/Cdk復(fù)合物的強(qiáng)力抑制劑和細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)劑(Matsuoka等，1995；Hatada等，1996 & 1995)。
H19是功能未知的父本印記基因。它位于染色體11p15.5上非常接近于母本印記IGF-2基因(Feinberg 1999)。對(duì)于正常人組織，在檢測(cè)的胎盤(pán)和胎兒肝組織中檢測(cè)到H19的表達(dá)，但不在其它成人和胎兒組織中表達(dá)(圖5)。這與小鼠中的研究非常一致，其中H19基因在小鼠胚胎的內(nèi)胚層和中胚層組織中高度表達(dá)，但是出生后戲劇性地下調(diào)(Brunkow and Tilghman，1991)。
目前，H19基因在癌形成中的作用不清楚。然而，H19基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的過(guò)度表達(dá)引起妊娠期后期的出生前致死，強(qiáng)烈提示但不能證明H19在發(fā)育和分化過(guò)程中的重要作用(Brunkow和Tilghman，1991；Pfeifer等，1996)。與這些觀察一致，已經(jīng)報(bào)道了H19基因在損傷后大鼠血管平滑肌細(xì)胞中重新表達(dá)(Kim等，1994)。也有多種跡象表明基因組印記可能在人疾病中很重要(Paulsen等，2001)。已經(jīng)報(bào)道了一些Beckwith-Wiedemann綜合征患者在11p15上顯示出單親二體性(Bliek等，2001)。幾個(gè)研究進(jìn)一步證明了在胚胎性腫瘤如Vilms’腫瘤(Moulton et al，1994；Taniguchi et al，1995)和在腫瘤抑制基因位點(diǎn)經(jīng)歷雜合性損失的胚胎性橫紋肌肉瘤(Casola等，1997；Zhan等，1994)中父本等位基因的優(yōu)選保留。這些觀察支持兩個(gè)等位基因的不等同性并提示在腫瘤形成中基因印記的可能作用(Zhang等，1993)。也表明在這個(gè)位點(diǎn)保留了雜合性的多數(shù)Wilm’s腫瘤中正常印記是松弛的，和基因表達(dá)是雙等位性(Moulton等，1994；Taniguchi等，1995)。已經(jīng)證明了人H19基因的腫瘤抑制潛力。H19基因轉(zhuǎn)染兩個(gè)胚胎性腫瘤細(xì)胞系消除了軟瓊脂中一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的致瘤性和在裸鼠中它們的腫瘤性(Hao等，1993)。
當(dāng)檢測(cè)并比較分化很好和未分化人NPC細(xì)胞中H19的基因表達(dá)模式時(shí)，證明了H19基因表達(dá)可能僅在未分化CNE-2人NPC細(xì)胞中特異性出現(xiàn)(圖2，4和6)。這也證明了對(duì)于人NPC活檢組織，H19在未分化NPC細(xì)胞中表達(dá)和不在正常鼻咽(NP)組織的上皮中表達(dá)(圖4)。有趣地觀察到顯示不同程度分化的兩種NPC細(xì)胞系的H19基因表達(dá)不同。更重要的是，我們證明了在5’-氮雜-2’-脫氧胞苷存在下培養(yǎng)分化很好的HK1細(xì)胞，H19的表達(dá)表達(dá)可能倒轉(zhuǎn)(圖8)。此外，H19表達(dá)與H19基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG二核苷酸的甲基化不足有關(guān)(圖7)。通過(guò)亞硫酸氫鹽DNA測(cè)序清楚證明了這個(gè)觀察結(jié)果并且與DNA甲基化可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的概念相一致(Li等，1993；Feil和Khosla，1999；Sleutels等，2000)。
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表1.cDNA微陣列分析總結(jié)。
在分化很好和未分化NPC細(xì)胞中差異表達(dá)的基因的鑒定。
權(quán)利要求
1.一種確定個(gè)體中鼻咽癌(NPC)的存在或風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括步驟(a)獲得從懷疑具有NPC或具有NPC風(fēng)險(xiǎn)的人體得到的鼻咽細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物；(b)將所述表達(dá)產(chǎn)物接觸一種或多種能夠結(jié)合表1中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員；和(c)基于來(lái)自所述鼻咽細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物與一種或多種結(jié)合成員的結(jié)合來(lái)確定所述患者中NPC的存在或風(fēng)險(xiǎn)。
2.一種確定個(gè)體中鼻咽癌(NPC)類(lèi)型的方法，包括步驟(a)獲得從懷疑具有NPC或具有NPC風(fēng)險(xiǎn)的患者得到的鼻咽細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物；(b)將所述表達(dá)產(chǎn)物接觸一種或多種能夠結(jié)合表1中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員；和(c)基于來(lái)自所述鼻咽細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物與一種或多種結(jié)合成員的結(jié)合來(lái)確定所述患者中NPC的類(lèi)型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中表達(dá)產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄的核酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中轉(zhuǎn)錄的核酸序列是RNA、mRNA或mRNA產(chǎn)生的cDNA。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合成員是能夠特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄的核酸序列的核酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中表達(dá)產(chǎn)物是表達(dá)的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中結(jié)合成員是能夠特異性結(jié)合所述表達(dá)多肽的抗體，或包含抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的物質(zhì)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中為了檢測(cè)目的，結(jié)合成員被標(biāo)記。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種結(jié)合成員固定到固相支持體上。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，包括將表達(dá)產(chǎn)物固定到固相支持體上。
11.一種產(chǎn)生NPC，或特定類(lèi)型NPC特征性的表達(dá)形式的方法，所述方法包括步驟(a)獲得從個(gè)體得到的NPC細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物；(b)將所述表達(dá)產(chǎn)物接觸能夠特異性結(jié)合表I中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物的多種結(jié)合成員；(c)確定所述表達(dá)產(chǎn)物與結(jié)合成員的結(jié)合，使得產(chǎn)生NPC細(xì)胞特征性的表達(dá)形式。
12.一種產(chǎn)生NPC，或特定類(lèi)型NPC特征性的表達(dá)形式的方法，所述方法包括步驟(a)獲得NPC細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物或正常鼻咽細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物；(b)將所述NPC細(xì)胞或所述正常細(xì)胞的所述表達(dá)產(chǎn)物分別接觸能夠特異性結(jié)合表I中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物的多種結(jié)合成員；(c)比較NPC細(xì)胞和正常細(xì)胞的表達(dá)形式；和(d)確定NPC細(xì)胞特征性的表達(dá)形式。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的方法，其中表達(dá)產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄的核酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中轉(zhuǎn)錄的核酸序列是RNA、mRNA或mRNA產(chǎn)生的cDNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合成員是能夠特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄的核酸序列的核酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的方法，其中表達(dá)產(chǎn)物是表達(dá)多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中結(jié)合成員是能夠特異性結(jié)合所述表達(dá)多肽的抗體，或包含抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的物質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至17任一項(xiàng)的方法，其中為了檢測(cè)目的，結(jié)合成員被標(biāo)記。
19.根據(jù)權(quán)利要求11至18任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種結(jié)合成員固定到固相支持體上。
20.根據(jù)權(quán)利要求11至18任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將表達(dá)產(chǎn)物固定到固相支持體上。
21.一種診斷試劑，包括固相支持體，其上固定了能夠特異性結(jié)合表1中鑒定的一種或多種基因的表達(dá)產(chǎn)物的一種或多種結(jié)合成員。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的診斷試劑，其中一種或多種結(jié)合成員包括能夠特異性結(jié)合H19或CNKNIC的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合成員。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的診斷試劑，其中表達(dá)產(chǎn)物是mRNA或產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物。
24.一種確定生物學(xué)樣品中NPC的存在或類(lèi)型的試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)權(quán)利要求21至23任一項(xiàng)的診斷試劑和檢測(cè)工具。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其中生物學(xué)樣品是細(xì)胞提取物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或權(quán)利要求25的試劑盒，其中檢測(cè)工具是當(dāng)結(jié)合成員已經(jīng)與表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)記。
27.去甲基化劑在制備治療NPC或NPC風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的藥物中的應(yīng)用，所述治療與另一種癌癥療法聯(lián)合。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中另一種癌癥療法是化療或放療。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中去甲基化劑是5’-氮雜-2’-脫氧胞苷。
30.根據(jù)權(quán)利要求27至29任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中NPC是I型。
31.一種治療NPC或NPC風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的方法，包括給所述個(gè)體施用去甲基化試劑聯(lián)合另一種癌癥療法。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中另一種癌癥療法是化療或放療。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或權(quán)利要求32的方法，其中去甲基化試劑是5’-氮雜-2’-脫氧胞苷。
34.根據(jù)權(quán)利要求31或33任一項(xiàng)的方法，其中NPC是I型。
35.一種篩選能夠治療個(gè)體的NPC的物質(zhì)的方法，所述方法包括(a)在細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)表I中鑒定的一種或多種基因；(b)將所述細(xì)胞接觸測(cè)試物質(zhì)；(c)確定與所述測(cè)試物質(zhì)對(duì)缺乏所述一種或多種基因過(guò)度表達(dá)的可比較細(xì)胞的作用相比，所述測(cè)試物質(zhì)對(duì)所述細(xì)胞的作用；和(d)鑒定所述測(cè)試物質(zhì)為能夠治療NPC的物質(zhì)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中通過(guò)將能夠表達(dá)所述基因特征性的表達(dá)產(chǎn)物的核酸插入所述細(xì)胞而過(guò)度表達(dá)所述一種或多種基因。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或權(quán)利要求36的方法，其中在分化NPC中，所述一種或多種基因被上調(diào)。
38.根據(jù)權(quán)利要求35或權(quán)利要求36的方法，其中在未分化NPC中，所述一種或多種基因被上調(diào)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中一種或多種基因包括H19和CDKNIC。
40.根據(jù)權(quán)利要求35至39任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用去甲基化劑處理過(guò)度表達(dá)表I中鑒定的一種或多種基因的細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中過(guò)度表達(dá)表I中鑒定的一種或多種基因的細(xì)胞是NPC細(xì)胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求35至41任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括制備包含步驟(d)所鑒定的物質(zhì)的藥物組合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明有關(guān)基于細(xì)胞中差異基因表達(dá)的鼻咽癌(NPC)的檢測(cè)和治療。特別是，本發(fā)明提供了NPC中差異表達(dá)的基因的細(xì)節(jié)，用來(lái)檢測(cè)該疾病及其臨床類(lèi)型的存在或風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明也提供了與化療或放療聯(lián)合治療NPC的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1643377SQ03806030
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月23日
發(fā)明者吳俊賢, 唐靜萍, 許錦文, 吳福慶 申請(qǐng)人:吳俊賢;許錦文, 唐精萍, 吳福慶