專利名稱：繪制并消除t細胞表位的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了篩選蛋白質(zhì)分子上可引起免疫反應(yīng)的決定簇和表位的方法。具體而言，本發(fā)明涉及在治療性蛋白質(zhì)中鑒定T細胞表位。最后，本發(fā)明涉及這樣的組合方法，所述組合方法將使用表位繪制與由所述表位繪制法確定MHC II類配體并分別設(shè)計具有此類配體和表位的數(shù)量減少的序列類似物相一致。
背景技術(shù)：
有許多例子表明治療蛋白的效率受限于針對所述治療蛋白的干擾性免疫反應(yīng)。已有若干種小鼠單克隆抗體表現(xiàn)出治療多種人類疾病的前景，但在某些情況下由于誘導(dǎo)出相當(dāng)程度的人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答而未能成功應(yīng)用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對于單克隆抗體，已開發(fā)了多種技術(shù)以試圖減弱HAMA應(yīng)答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。這些重組DNA方法通常是減少最終的抗體構(gòu)建體中小鼠的遺傳信息，同時增加最終構(gòu)建體中人的遺傳信息。盡管如此，在許多情況下，所得的“人源化”抗體仍然引起患者的免疫應(yīng)答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗體不是唯一一類作為治療劑施用的可引起免疫應(yīng)答的多肽分子。即使是人源的并在人與人之間具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)仍可在人體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。明顯的實例包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的治療性應(yīng)用(Wadhwa，M.等人(1999)臨床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和干擾素α2的治療性應(yīng)用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl.J.Med.)3181409-1413)。在這些人蛋白具有免疫原性的情況下，可能發(fā)生了對這些蛋白的免疫耐受的破壞，否則對這些蛋白的免疫耐受將在這些受試者體內(nèi)運行。
當(dāng)人蛋白被作為替代治療，例如在蛋白的組成性缺乏如血友病A、血友病B、高歇氏病(Gauchers disease)和許多其他疾病的遺傳性疾病中，情況就不同了。在這些情況下，治療學(xué)替代蛋白可能一開始就作為外來分子而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且當(dāng)個體能夠產(chǎn)生針對該治療劑的免疫應(yīng)答時，該治療的功效將大打折扣。
不管該蛋白治療劑被宿主免疫系統(tǒng)視作外來分子還是本來存在的對該分子的耐受被克服了，對該蛋白的免疫反應(yīng)的機理是相同的。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要因素是在蛋白中存在可經(jīng)由MHC II類分子的呈遞作用激活T-細胞活性的肽(即所謂的T-細胞表位)。此類T-細胞表位通常定義為任何能夠與MHC II類分子結(jié)合的氨基酸殘基序列。隱含地，″T-細胞表位″是指當(dāng)其與MHC分子結(jié)合時可被T-細胞受體(TCR)識別的表位，并且至少原則上，這種表位可以通過與TCR相互作用而激活這些T-細胞以促進T-細胞應(yīng)答。
MHC II類分子為一組在T輔助細胞的選擇和活化中起中心作用的高度多態(tài)性蛋白質(zhì)。人類白細胞抗原群DR(HLA-DR)為該組蛋白質(zhì)的主要同種型，但是，同種型HLA-DQ和HLA-DP行使相類似的作用。人群中的每一個體具有二至四個DR等位基因，兩個DQ和兩個DP等位基因。已解析了許多DR分子的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)揭示了一個具有一些可結(jié)合肽的疏水殘基(口袋殘基)的疏水口袋的敞口肽結(jié)合溝[Brown等人，自然(Nature)(1993)36433；Stern等人(1994)自然(Nature)368215]。確定II類分子的不同同種異型的多態(tài)性促成了肽結(jié)合溝內(nèi)用于結(jié)合肽的不同表面的大量多樣性，并在群體水平上確保了在識別外源蛋白質(zhì)并引起對病原生物體的免疫應(yīng)答的能力方面有最大的靈活性。
針對治療性蛋白的免疫應(yīng)答通過MHC II類肽呈遞途徑進行。其間外來蛋白經(jīng)吞噬和加工后與DR、DQ或DP型MHC II類分子結(jié)合以進行呈遞。MHC II類分子由專門抗原呈遞細胞(APC)如巨噬細胞、樹突狀細胞等表達。通過MHC II類肽復(fù)合體與T細胞表面的關(guān)聯(lián)性T-細胞受體的相互作用，及與某些其他共受體，如CD4分子的交聯(lián)結(jié)合可誘導(dǎo)T-細胞進入激活狀態(tài)。上述激活作用可導(dǎo)致細胞因子釋放，進一步激活其他淋巴細胞如B細胞產(chǎn)生抗體或激活T殺傷細胞形成完整的細胞免疫應(yīng)答。
T細胞表位鑒定是消除表位的第一步，然而，本領(lǐng)域中少有將表位鑒定和表位去除整合為一個方案的清楚的例子。因此，WO98/52976和WO00/34317中公開了鑒定具有與人MHC II類DR同種異型亞群結(jié)合的潛在能力的多肽序列的計算機穿線方法(computational threadingapproaches)。這些教導(dǎo)中，利用目的蛋白中合理的氨基酸置換除去預(yù)測的T細胞表位。然而，在該方案和其他基于計算的表位鑒定方法[Godkin，A.J.等人(1998)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)161850-858；Stumiolo，T.等人(1999)自然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)17555-561]中，預(yù)測的能夠結(jié)合MHC II類分子的肽可能不會在所有情況下(尤其是在體內(nèi)由于加工途徑或其他現(xiàn)象)都起T細胞表位的作用。此外，對T細胞表位預(yù)測的計算方法通常不能預(yù)測DP或DQ限制性表位。
同樣，例如用明確定義的MHC同種異型的B細胞系作為MHC II類結(jié)合表面的來源以測量合成肽結(jié)合MHC II類分子的能力的體外方法可以應(yīng)用于MHC II類配體的鑒定[Marshall K.W.等人(1994)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1524946-4956；O′Sullivan等人(1990)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1451799-1808；Robadey C.等人(1997)免疫學(xué)雜志(J.Immunol)1593238-3246]。然而，這些技術(shù)不適于篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位，也不能確定結(jié)合肽能夠起T細胞表位的作用。
最近利用重組MHC分子與合成肽的可溶性復(fù)合體的技術(shù)已經(jīng)得到應(yīng)用[Kern，F(xiàn).等人(1998)自然醫(yī)藥(Nature Medicine)4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫學(xué)趨勢(TRENDS in Immunology)22583-588]。這些試劑和方法用于鑒定人或?qū)嶒瀯游锸茉囌叩耐庵苎獦又心芙Y(jié)合特定MHC-肽復(fù)合物的T細胞克隆的存在，但是這些試劑和方法不適于篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位。
T細胞活化的生物學(xué)測定提供了一個解讀受試肽/蛋白序列引起免疫應(yīng)答的能力的實用選擇。該類方法的例子包括Petra等人用對細菌蛋白葡萄球菌激酶的T細胞增殖進行測定，然后用合成肽刺激T細胞系的表位作圖[Petra，A.M.等人(2002)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)168155-161]。類似地，使用破傷風(fēng)毒素蛋白的合成肽進行T細胞增殖測定導(dǎo)致明確了該毒素免疫顯性的表位區(qū)[Reece J.C.等人(1993)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1516175-6184]。WO99/53038公開了一種方法，該方法利用分離的人免疫細胞亞型，促進它們的體外分化，在合成的目的肽存在時培養(yǎng)細胞，并測定培養(yǎng)的T細胞中任何誘導(dǎo)的增殖來確定受試蛋白的T細胞表位。同樣的技術(shù)也被Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)免疫治療雜志(J.Immunotherapy)23654-660]描述過，在這兩個例子中，該方法都用于檢測細菌枯草桿菌蛋白酶的T細胞表位。這種技術(shù)需要小心應(yīng)用細胞分離技術(shù)和補充多種細胞因子的細胞培養(yǎng)基以得到所需的免疫細胞亞型(樹突狀細胞、CD4+和/或CD8+T細胞)，并且無助于使用多種供體樣品的快通量篩選。
在這些方法的一種改變形式中，Hiemstra等[Hiemstra，H.S.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci USA 9410313-10318]描述了鑒定可刺激已知T細胞的肽表位的方法，此方法對于在(自身)抗原未知的情況下檢測其自身反應(yīng)性T細胞克隆是極有價值的。
有許多上述例子和其他涉及測定體外T細胞活化事件(通常通過測定誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)進行)的改變形式的生物學(xué)試驗。但是，這些方法無一提供了用于檢測人源蛋白質(zhì)中生物學(xué)相關(guān)表位的統(tǒng)一方案，也不易用于檢測大量MHC同種異型中重要的表位。本發(fā)明用于提供此種方案，并提供了用于對特定的原則上有治療價值但最初為免疫原性肽、多肽或蛋白質(zhì)進行鑒定和去除T細胞表位的基礎(chǔ)。
總之，本發(fā)明涉及下述內(nèi)容·在幼稚T細胞試驗中使用一組合成肽繪制治療蛋白質(zhì)的免疫原性區(qū)，特別是治療蛋白質(zhì)為人蛋白質(zhì)；·在回憶試驗中使用一組合成肽精細繪制治療蛋白質(zhì)的免疫原性區(qū)；·在幼稚T細胞試驗中使用一組完整蛋白質(zhì)的變體以選擇體外顯示最小免疫原性的變體；·在幼稚T細胞試驗中使用一組合成肽變體以選擇體外顯示最小免疫原性的肽序列；·使用T細胞刺激的生物學(xué)試驗以選擇在幼稚T細胞試驗中刺激指數(shù)小于2.0、優(yōu)選小于1.8的肽序列；·使用T細胞刺激的生物學(xué)試驗以選擇在幼稚T細胞試驗中刺激指數(shù)小于2.0、優(yōu)選小于1.8的蛋白質(zhì)變體；·一種策略，其中T細胞系由事先接受治療性蛋白質(zhì)的個體發(fā)育而得，并且使用這些細胞系繪制所述治療分子的免疫原性區(qū)；·如上所述的策略，其中還與由事先接受治療性蛋白質(zhì)的個體發(fā)育得到T細胞系平行地發(fā)育B細胞系，并且組合應(yīng)用這些細胞系繪制所述治療分子的免疫原性區(qū)；·與由事先接受治療性蛋白質(zhì)的同一個體發(fā)育得到T細胞系而平行地發(fā)育的B細胞系的用途，其在下一輪的T細胞刺激中用作自身APC的來源，或任選地用作合成肽結(jié)合試驗的結(jié)合表面；·使用分離自健康供體的PBMC，構(gòu)建受試蛋白質(zhì)的T細胞表位圖譜，并且篩選方法涉及的步驟包括i)抗原接觸，通過體外使用合成肽或完整蛋白質(zhì)免疫原培養(yǎng)，培養(yǎng)期間不超過7天；ii)添加IL-2，并且培養(yǎng)不超過3天；iii)將已接觸過抗原的T細胞加入至自體已接受輻射的PBMC并用抗原再攻擊，進一步培養(yǎng)4天；以及iv)測定T細胞活化，如用任一合適的方法測定增殖指數(shù)；·使用分離自其中針對受試蛋白質(zhì)或其衍生物已建立免疫反應(yīng)的患者的PBMC，構(gòu)建受試蛋白質(zhì)的T細胞表位圖譜，并且應(yīng)用的篩選方法涉及的步驟包括i)抗原接觸，通過體外使用合成肽或完整蛋白質(zhì)免疫原培養(yǎng)，培養(yǎng)期間不超過7天；ii)添加IL-2，并且培養(yǎng)不超過3天；iii)將已接觸過抗原的T細胞加入至自體已接受輻射的PBMC并用抗原再攻擊，進一步培養(yǎng)不超過4天；以及iv)測定T細胞活化，如用任一合適的方法測定增殖指數(shù)；·使用多克隆或單克隆細胞系構(gòu)建T細胞表位圖譜，其中所述多克隆或單克隆細胞系來自健康供體的PBMC樣本或來自對目標(biāo)蛋白質(zhì)已建立免疫反應(yīng)的患者的PBMC樣本。所述細胞系發(fā)育為免疫學(xué)上已接觸抗原的狀態(tài)是通過一輪或多輪的接觸抗原步驟進行，為在IL-2+/-植物血凝素(PHA)或其他絲裂原刺激劑存在下培養(yǎng)擴增的細胞數(shù)。所述已接觸抗原的細胞與單個的合成肽或包含多個合成肽的肽庫接觸，并使用任一合適的方法檢測刺激并增殖的細胞系。如果由合并的肽免疫原檢測到了刺激，則需要用單個的肽或較小的肽庫并且進一步接觸細胞進行下輪篩選以揭示刺激肽的身份；·使用幼稚T細胞活化試驗在蛋白質(zhì)序列中繪制T細胞表位位置的相關(guān)方法，以及模擬肽配體與一種或多種MHC同種異型結(jié)合的計算方案；·用于在蛋白質(zhì)序列中定位T細胞表位的方法，其包括以下步驟i)使用幼稚T細胞活化試驗和合起來包含目標(biāo)蛋白質(zhì)序列的合成肽來鑒定可活化T細胞的表位區(qū)；ii)使用模擬肽配體與一種或多種MHC同種異型結(jié)合的計算方案分析步驟(i)中鑒定的表位區(qū)，并由此在表位區(qū)中鑒定MHC II類配體；iii)使用模擬肽配體與一種或多種MHC同種異型結(jié)合的計算方案鑒定表位區(qū)中包含的MHC配體的如下序列類似物，所述序列類似物不再結(jié)合MHCII類或者以較低的親和性結(jié)合較少數(shù)量的MHC同種異型；iv)使用幼稚T細胞活化試驗和完全包含在目標(biāo)蛋白質(zhì)中鑒定的表位區(qū)的合成肽或合起來包含在目標(biāo)蛋白質(zhì)中鑒定的表位區(qū)的合成肽，并在幼稚T細胞活化試驗中與野生型(親本)序列平行地測試序列類似物；·根據(jù)上述方案的方法，其中步驟(ii)和(iii)使用WO 02/069232所教導(dǎo)的計算方法實施；
·根據(jù)上述方案的方法，其中幼稚T細胞活化試驗使用來自約20個或更多不相關(guān)供體的PBMC細胞進行；·根據(jù)上述方案的方法，其中當(dāng)在兩個或多個獨立供體樣本中觀察到刺激指數(shù)分值約2.0時，則發(fā)現(xiàn)了T細胞表位的位置；·根據(jù)上述方案的方法，其中當(dāng)在兩個或多個獨立供體樣本中觀察到刺激指數(shù)分值約2.0時則發(fā)現(xiàn)了T細胞表位的位置，且其中可使用計算體系在同一序列位置中確定一個或多個MHC II類配體；·根據(jù)上述方案的方法，其中計算體系是根據(jù)WO 02/069232所教導(dǎo)的方法；·對促進免疫反應(yīng)的能力降低的蛋白質(zhì)序列的鑒定可使用前述方案中免疫學(xué)上已接觸抗原的細胞和篩選方法實施，通過平行參照只包含野生型序列的肽庫或完整蛋白抗原測試多個變體肽或完整蛋白抗原。選擇相對于參照肽庫或野生型蛋白質(zhì)具有較小刺激指數(shù)的肽或蛋白質(zhì)變體用于進一步分析；·對促進免疫反應(yīng)的能力增強的蛋白質(zhì)序列或蛋白質(zhì)制品的鑒定可使用前述方案中免疫學(xué)上已接觸抗原的細胞和篩選方法實施，通過平行參照產(chǎn)生已知的體外免疫反應(yīng)的肽庫或完整蛋白抗原測試一個或多個肽或完整蛋白抗原。選擇相對于參照制品顯示出引起不同刺激指數(shù)特征的肽或蛋白質(zhì)制品用于進一步分析，或可從產(chǎn)生過程中去除；·在幼稚T細胞試驗中能夠引起刺激指數(shù)大于1.8、優(yōu)選大于2.0的肽序列，并且選自任一治療蛋白質(zhì)；·選自任一治療蛋白質(zhì)的在幼稚T細胞試驗中能夠引起刺激指數(shù)大于1.8、優(yōu)選大于2.0的肽序列，其中對肽進行最小程度的修飾并在幼稚T細胞試驗中進行測試，并且發(fā)現(xiàn)其刺激指數(shù)小于2.0；·肽序列，其與野生型蛋白序列具有100％氨基酸同一性，并且能夠在T細胞試驗中引起刺激指數(shù)為1.8或者更大、優(yōu)選大于2.0；·蛋白質(zhì)分子，其中已使用T細胞試驗繪制了免疫原性區(qū)，然后進行修飾使得在T細胞試驗中重新測試時，該經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)引起的刺激指數(shù)小于親本(未修飾的)分子，并且最優(yōu)選地小于2.0。
發(fā)明祥述根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方案，提供了這樣的方法，如果蛋白質(zhì)以其未經(jīng)修飾形式導(dǎo)入人類受試者，則由該方法可篩選所述蛋白質(zhì)抗原中在其序列內(nèi)存在的可引起T細胞活化免疫反應(yīng)的決定簇。該方法因此提供了在對人具有治療潛力的蛋白質(zhì)中鑒定T細胞表位的預(yù)測手段，其中所述蛋白質(zhì)為欲提供的用于治療獲得性疾病且可為人蛋白質(zhì)。
尤其希望提供目標(biāo)蛋白質(zhì)的如下表位圖譜，所述圖譜與大范圍可能的MHC同種異型相關(guān)。希望所述圖譜有足夠的代表性，使得可以設(shè)計或選擇對大多數(shù)可能施用該蛋白質(zhì)的患者引起T細胞免疫反應(yīng)的能力消失或至少減小的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。因此在本發(fā)明的實踐中，篩選方法所使用的來自原初供體PBMC的T細胞收集自具有足夠免疫多樣性的供體庫，以提供在人群中至少大于90％并且優(yōu)選地大于95％的MHC II類庫(HLA-DR)的樣本。在理想的情況下，代表等于大于99％是優(yōu)選的，雖然認識到對達到該理想狀況存在實際的限制。因此，如果欲對給定的合成肽檢測幼稚T細胞反應(yīng)，該肽實際上與來自多個分別供體的PBMC制品接觸。供體的數(shù)量或文中較優(yōu)選地描述為″供體庫″實際上不可能小于20個不相關(guān)個體(根據(jù)他們的MHC II類單倍型進行預(yù)選擇)。
術(shù)語″原初供體″在本發(fā)明上下文中是指獲自個體的T細胞以前沒有暴露于目標(biāo)蛋白質(zhì)或肽抗原，并且當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)抗原是人蛋白質(zhì)時，所述個體沒有接受任何治療性或外部來源性的該蛋白質(zhì)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方案，提供了研究免疫原性幼稚T細胞的T細胞表位繪制的方法。所述T細胞獲自多個不同健康供體的外周血樣本，對所述健康供體而言目標(biāo)蛋白質(zhì)可能為內(nèi)源分子，但所述健康供體并未接受外部來源如治療性施用的目標(biāo)蛋白質(zhì)。本試驗使用體外培養(yǎng)的PBMC，通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法并涉及將PBMC與目標(biāo)蛋白質(zhì)代表性的合成肽接觸，經(jīng)合適的孵育時間后，測定肽誘導(dǎo)的T細胞活化如細胞增殖。測定可以任何合適的方法進行，并且可使用3H-胸苷摻入法，由此易于通過儀器測定細胞內(nèi)3H的量。將PBMC樣本與合成肽接觸而產(chǎn)生的細胞增殖程度與未用肽處理的PBMC樣本相比較。也可參照一種或多種具有預(yù)期增殖作用的肽處理后的增殖反應(yīng)。關(guān)于此，認為尤其有利的是使用具有已知MHC限制性的肽，尤其是對DP或DQ同種型具有MHC限制性的肽表位。
為了有利于對給定的目標(biāo)蛋白質(zhì)組成表位圖譜，產(chǎn)生了一組代表蛋白質(zhì)序列的合成肽。在本發(fā)明方案下的典型分析涉及使用含15個氨基酸殘基的肽，這基于認識到含有不少于9個氨基酸殘基的肽原則上是合適的肽。也可使用明顯超過15個氨基酸殘基的肽，但是可能的二級結(jié)構(gòu)效應(yīng)或細胞內(nèi)加工的復(fù)雜性可影響肽誘導(dǎo)增殖反應(yīng)的能力。為了對給定蛋白質(zhì)的全長掃描，特別簡便的方案是對每15個氨基酸殘基制備合成肽，所述合成肽與下一個肽在序列上有12個氨基酸殘基的重疊，即每一連續(xù)肽依次漸增地添加3個氨基酸用于分析。這樣肽的任一特定相鄰對將繪制目標(biāo)蛋白質(zhì)中連續(xù)的18個氨基酸序列。對于包含n個氨基酸殘基的目標(biāo)蛋白質(zhì)，對于所述蛋白質(zhì)完整掃描所需的15聚體合成肽數(shù)量為1+(n-12)/3?？煽紤]其它方案并同樣有效。
使用如上概述并在文中的實施例中詳細示出的方案，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了可對來自不同健康供體個體的幼稚PBMC引起增殖反應(yīng)的蛋白質(zhì)序列區(qū)。所討論的蛋白質(zhì)序列為來自人完整蛋白質(zhì)的序列串，對于該序列串預(yù)期具有免疫耐受，但在體外仍可證明引起替代免疫反應(yīng)的能力。如果所討論的蛋白質(zhì)之一例如作為治療劑施用時，該能力也可延伸應(yīng)用至體內(nèi)。具體地這些蛋白質(zhì)為干擾素α2和干擾素β。這兩種蛋白質(zhì)均用于治療，并且已報道了它們對患者所引起的令人注目的免疫原性反應(yīng)[Russo，D.等(1996)，見上文；Stein，R.等(1988)，見上文；Myhr，K.M.等(2000)，Neurology 551569-1572；Bertolotto，A.等(2000)，Immunopharmacology 4895-100]。本發(fā)明因此提供了用于闡明正常人蛋白質(zhì)中表位區(qū)的概括性方案，并闡明了來自這些蛋白質(zhì)的肽引起健康供體的幼稚PBMC體外增殖反應(yīng)的能力。
在第一個實施方案中使用幼稚T細胞試驗確定T細胞圖譜的一個尤其有用方法在實施例1和2中提供，由此揭示了干擾素β(IFNβ)和干擾素α2(IFNα2)的免疫原性區(qū)。用于鑒定在體內(nèi)為弱免疫原性的蛋白質(zhì)中T細胞表位的尤其優(yōu)選的方法在實施例3中描述。
在第二個實施方案中，本發(fā)明提供了對T細胞表位圖譜的說明，此圖譜可指導(dǎo)設(shè)計經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，由此所述分子的表位區(qū)被適當(dāng)修飾，以至于它們不再能引起本發(fā)明方案的增殖反應(yīng)，并且目的蛋白質(zhì)因此對人產(chǎn)生較小的免疫原性。
根據(jù)該第二個實施方案，對蛋白質(zhì)的合適修飾可包括特定殘基的氨基酸替代或殘基的組合。為了除去T細胞表位，優(yōu)選在所預(yù)測的肽序列中合適的位點進行氨基酸替代以實現(xiàn)T細胞表位活性的減小或者消除。實踐中，合適的位點優(yōu)選等同于在MHC II類結(jié)合溝所提供的口袋之一中結(jié)合的氨基酸殘基。最優(yōu)選的是在所述肽的稱作P1或P1錨的位置改變在裂縫的第一口袋內(nèi)的結(jié)合。公認地，肽的P1錨殘基和MHC II類結(jié)合溝的第一口袋之間的結(jié)合相互作用的質(zhì)量是整個肽的總結(jié)合親和性的主要決定因素。在所述肽的這一位置的適當(dāng)替代是替代為不易容納到所述口袋中的殘基，例如替代為更親水的殘基。所述肽中處于如下位置的氨基酸殘基也被認為是落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述位置為與MHC結(jié)合裂縫的其他口袋區(qū)域結(jié)合的位置。
可以理解，由給定的潛在T-細胞表位內(nèi)的單一氨基酸替代導(dǎo)致該表位去除的路線是最優(yōu)選的。也可以在單一表位內(nèi)進行組合替代，例如，這可能對于單獨定義的表位間彼此重疊的情況特別適宜。此外，在給定的表位內(nèi)的單氨基酸替代或在一個表位內(nèi)的組合氨基酸替代也可以在非對應(yīng)于MHC II類結(jié)合溝的″口袋殘基″的位置，而是在所述肽序列內(nèi)的任意位點上進行。替代可參照同源結(jié)構(gòu)或由本領(lǐng)域已知的硅片上(insilico)技術(shù)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)方法進行，也可以根據(jù)本發(fā)明分子的已知結(jié)構(gòu)特征進行。例如可考慮恢復(fù)變體分子結(jié)構(gòu)或生物學(xué)活性的改變。此類補償性改變也包括對多肽中特定氨基酸殘基的刪除或添加。
從蛋白質(zhì)分子中去除表位的一個尤其有用的方法涉及使用文中示出的幼稚T細胞活化試驗方案與硅片上技術(shù)的結(jié)合，其中所述硅片上技術(shù)根據(jù)在WO 02/069232(此處引用作為參考)中描述的方案而開發(fā)。
該軟件在肽MHC II類結(jié)合的相互作用水平上模擬抗原呈遞過程，以提供對任一特定肽序列的結(jié)合分值。對人群中存在的許多主要MHC II類同種異型測定此分值。由于該方案可測試任意肽序列，可在肽與MHC II類結(jié)合溝相互作用的能力方面預(yù)測氨基酸替換、添加或刪除的結(jié)果。由此可設(shè)計含有與MHC II類相互作用并作為免疫原性T細胞表位發(fā)揮作用的肽的數(shù)量減少的新序列組合物。如果使用任一供體樣本進行生物學(xué)測試可評估與最多4種DR同種異型的結(jié)合，那么硅片上的方法可使用大于40種同種異型同時測試相同的肽序列。實踐中，該方法可指導(dǎo)新序列變體的設(shè)計，其中所述新序列變體在與多種MHC同種異型相互作用的能力方面有所降低。
通過舉例說明應(yīng)用表位鑒定和去除的結(jié)合方法，本申請?zhí)峁┝松婕霸O(shè)計人干擾素α(IFNα)的程序所得結(jié)果。全長人IFNα序列產(chǎn)生了一組51個15聚體肽(在實施例2的表2中列出)。T細胞試驗可確定該分子內(nèi)的三個免疫原性區(qū)(稱為R1，R2和R3)，且根據(jù)WO02/069232方案的軟件系統(tǒng)可在每一表位R1-R3中鑒定預(yù)測的MHC II類配體。而且，該系統(tǒng)可進一步鑒定在表位中導(dǎo)致所述肽序列和在該系統(tǒng)中代表的基本上所有MHC II類同種異型之間結(jié)合親和性明顯喪失的氨基酸替代。構(gòu)建了一組合成肽，所述合成肽包含野生型表位區(qū)和其中MHC II類的結(jié)合通過氨基酸替代而去除的變體序列。所述肽用于幼稚T細胞活化試驗，并對每一肽和供體PBMC樣本的組合測定刺激指數(shù)。在所有情況下，如果供體樣本對野生型肽產(chǎn)生反應(yīng)，則變體肽不活化T細胞(圖3)。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是使用經(jīng)改進的T細胞活化試驗，其中對T細胞反應(yīng)的測定是在加入受試蛋白質(zhì)或肽后的不同時間進行。該新型測試方法尤其用于檢測完整蛋白質(zhì)或弱免疫原性多肽的T細胞反應(yīng)。所述新型試驗方法抵消了T細胞試驗混合物中組分的復(fù)雜性，其中所述混合物包含白細胞和不同分子(包括細胞因子)的混合。對任一受試蛋白質(zhì)或肽，在所述試驗中T細胞反應(yīng)的動力學(xué)取決于多個因素，包括在T細胞試驗混合物中T細胞的狀態(tài)(例如，T細胞是幼稚T細胞還是記憶T細胞)、細胞因子在多個時間點時的濃度、以及由于一些因素(如特定的肽-MHC II類復(fù)合體濃度)產(chǎn)生明顯T細胞增殖的速率。對于任一給定蛋白質(zhì)或肽，在所述試驗體系中T細胞增殖的峰位于加入蛋白質(zhì)或肽至所述試驗混合物的第7天前或后，這樣在第7天時(標(biāo)準(zhǔn)試驗時間點)T細胞增殖不明顯。通過在一個時程期間例如在第4、5、6、7、8和9天測試T細胞增殖，則可檢測T細胞反應(yīng)，而不必在第7天檢測。T細胞試驗時程在實施例3中顯示。對于完整蛋白質(zhì)，T細胞試驗時程提供了對T細胞免疫原性的靈敏分析，并因此提供了對蛋白質(zhì)進行靈敏的免疫原性篩選。此外，如在實施例3中所述，該試驗法也可用于檢測氨基酸替代對免疫原性的效果。
將使用硅片上工具確定MHC II類配體并設(shè)計缺乏MHC II類配體的序列類似物與使用基于生物學(xué)的T細胞活化試驗進行表位繪制和再檢測相一致的組合方法是尤其有效的方法，并且是本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案。根據(jù)該最優(yōu)選實施方案的概括性方法包括以下步驟i)使用幼稚T細胞活化試驗和合成肽確定可活化T細胞的表位區(qū)，其中所述的合成肽合起來包含蛋白質(zhì)的目標(biāo)序列；ii)使用模擬肽配體與一種或多種MHC同種異型結(jié)合而分析在步驟(i)中確定的表位區(qū)并因此確定表位區(qū)中MHC II類配體的計算方案；iii)使用模擬肽配體與一種或多種MHC同種異型結(jié)合而確定在表位區(qū)中所包含的MHC配體的序列類似物的計算方案，其中所述序列類似物不再結(jié)合MHC II類或以降低的親和力結(jié)合至較少數(shù)目的MHC同種異型；iv)使用幼稚T細胞活化試驗和合成肽，其中所述的合成肽包含全部或合起來包含在目標(biāo)蛋白質(zhì)中確定的表位區(qū)，并在幼稚T細胞活化試驗中與野生型(親本)序列相平行地測試所述序列類似物；已知在WO 02/069232中所述的軟件方案也可用于以高度確切定義對任一人蛋白質(zhì)如干擾素而言所有包含可容許MHC類配體的肽的數(shù)據(jù)集合。對于如需要蛋白水解酶加工免疫原性肽和導(dǎo)致其體內(nèi)呈遞的其他生理步驟，下面這一點是清楚的，即整個肽庫的相對小的子集具有最終的生物學(xué)相關(guān)。在此類情況下，本發(fā)明人建立的體外人T細胞活化試驗可用于確定此類生物學(xué)相關(guān)肽。因此，對合成肽進行了測試，測試其引起體外培養(yǎng)的人T細胞產(chǎn)生增殖反應(yīng)的能力。如果此類方法使用健康供體的幼稚人T細胞進行，本發(fā)明人已建立了在操作此試驗時，刺激指數(shù)等于或大于2.0為一個有用的測定誘導(dǎo)增殖的參數(shù)。該刺激指數(shù)(SI)一般如下獲得所測定的針對受試肽的增殖分值(如使用3H-胸苷摻入時每分鐘放射性的計數(shù))除以未與受試肽接觸的細胞增殖分值。不引起反應(yīng)的肽產(chǎn)生的SI＝1.0，而在實踐中SI值在0.8-1.2的范圍內(nèi)是常見的。為了確保所記錄分值的可信性，可將許多技術(shù)方法結(jié)合入此類試驗的操作中。一般所有的測定均至少一式三份進行，并計算平均分值。如果所計算的SI＝＞2.0，則可對一式三份中分別的分值檢查存在偏離數(shù)據(jù)的證據(jù)。類似地，在每一試驗板中可包括對照肽，其中所述對照肽預(yù)期對大多數(shù)PBMC供體樣本為反應(yīng)性的。流感血細胞凝集素307-319(序列PKYVKQNTLKLAT)和衣原體HSP60肽(序列KVVDQIKKISKPVQH)是尤其合適的對照肽，但也可使用許多其他的例子。所述試驗應(yīng)優(yōu)選地也使用強的完整蛋白質(zhì)抗原如匙孔血藍蛋白，所有的PBMC樣本對該抗原預(yù)期會顯示SI明顯大于2.0。
根據(jù)本發(fā)明的方案，實踐中需要測試基本上具有相同肽序列的多種形式，以建立這樣的修飾(單個氨基酸替代或一些其他變化或變化的組合)，所述修飾導(dǎo)致所述肽誘導(dǎo)T細胞活化效應(yīng)的能力喪失或至少該能力較小。該需求通過使用許多不同的實踐方法而滿足，所述實踐方法之一涉及最初篩選大量的變體并實施選擇方案確定其中相對于其親本(如野生型)肽序列而言誘導(dǎo)增殖的能力降低或缺乏誘導(dǎo)增殖能力的變體肽。此方法可完全使用幼稚PBMC樣本進行，并同時(即平行地)進行表位繪制。應(yīng)理解的是該方法不限于篩選合成肽，該方法也可開發(fā)用來篩選例如可能包含多種變體的完整蛋白質(zhì)分子，其中所述的多種變體作為變體“文庫”產(chǎn)生，從變體″文庫″中選擇目標(biāo)成員。此類文庫例如可通過本領(lǐng)域公知的重組方法產(chǎn)生，或可包含用合成方式例如應(yīng)用組合化學(xué)的原理產(chǎn)生的文庫。在任一情況下，本文中選自文庫成員的目標(biāo)特性為不能誘導(dǎo)PBMC制備物的增殖反應(yīng)。
備選地，可用來自完全不同供體庫的樣本的幼稚PBMC篩選變體肽，即當(dāng)希望很少或不誘導(dǎo)增殖時，可使用經(jīng)修飾肽重復(fù)進行表位繪制。
進一步且尤其有利的方案涉及到在免疫回憶試驗中測試經(jīng)修飾肽誘導(dǎo)增殖效應(yīng)的能力。這例如可如下實施使用來自在最初的幼稚PBMC試驗期間鑒定的已知反應(yīng)性供體的PBMC，并使用合成肽(如在一個庫中)或完整蛋白質(zhì)刺激，然后在存在細胞因子如IL-2時孵育合適的時間。孵育后，使用合成的(經(jīng)修飾)肽或經(jīng)修飾的完整目標(biāo)蛋白質(zhì)再次刺激所述培養(yǎng)物，并且使用合適的方法測定增殖效應(yīng)。本發(fā)明人將這種試驗法歸于″回憶″試驗，之所以這樣稱呼是因為參與增殖反應(yīng)的T細胞群體是在再次刺激期間活化。
回憶試驗尤其用于對體內(nèi)顯示弱免疫原性的蛋白質(zhì)或肽抗原確定T細胞表位，并且當(dāng)特定氨基酸序列中的T細胞表位最初是通過其他方法如計算技術(shù)或生物學(xué)試驗確定的時，所述回憶試驗可提供所述表位存在的確切證據(jù)。在操作此類回憶試驗時，從健康供體或?qū)μ囟ㄖ委熞呀⒚庖叻磻?yīng)的患者分離PBMC。有必要凍存多份自體PBMC，這樣它們可在接下來的步驟中用作抗原呈遞細胞(APC)。該試驗的開始步驟是抗原接觸步驟。典型且優(yōu)選的方法需要向24孔板的每一孔中加入2-4×106個PBMC。向細胞中加入完整蛋白質(zhì)或肽抗原或肽庫，典型的濃度分別為1-10μg/ml和1-10μM(肽在肽庫中的總濃度可為1μM)。最后的培養(yǎng)體積為2ml。將細胞孵育7天，在第7天加入10U/ml IL-2，并將細胞再孵育3天，接下來將細胞用于抗原的再攻擊。
抗原的再攻擊需要自體PBMC作為APC。將APC與完整蛋白質(zhì)或合成肽抗原(例如濃度為1-10μg/ml)在37℃孵育1小時。APC的增殖能力最優(yōu)選地用γ輻射破壞，例如在圓底96孔板(1×105個PBMC/孔)中使用4000拉德γ輻射。將1-10×104個已接觸抗原的T細胞加至每一含有APC的孔中。建立未處理的對照反應(yīng)是重要的，所述對照反應(yīng)包含在不存在再攻擊抗原時將已接觸抗原的T細胞與經(jīng)γ輻射的APC培養(yǎng)。孵育這些細胞4天，然后進行脈沖增殖評估，例如3H-胸苷摻入試驗。應(yīng)理解的是此方法同樣可用富集的細胞群或純化的細胞群進行。
在第三個實施方案中，提供了這樣的方法，可由此方法篩選蛋白質(zhì)抗原序列中存在的可在個體中引起T細胞免疫反應(yīng)的決定簇，對所述個體而言，該待施用的目標(biāo)蛋白質(zhì)用于治療遺傳(組成型)疾病，但實際上，由于個體中的遺傳缺陷，所述蛋白質(zhì)已成為外來蛋白。從這種意義上說，該蛋白很可能代表體內(nèi)的強抗原，并且本發(fā)明人已經(jīng)建立了現(xiàn)在可從這些個體的PBMC體外建立多克隆或單克隆T細胞系，并且這些細胞系可以用作蛋白中T細胞表位作圖的有效細胞系。這基本上可以前面所述的回憶試驗相同的方式完成，不同之處在于將T細胞進行幾輪抗原體外刺激后立即在IL-2存在下增殖而完成。為了建立多克隆T細胞系，2-3輪抗原刺激通常足夠產(chǎn)生大量抗原特異性細胞。這些細胞被用于篩選大量的合成肽(例如以肽庫的形式)，并且它們可以低溫保藏以備用。在包括將抗原和PBMC共同孵育7天后的最初一輪完成后，隨后在最優(yōu)選的作為抗原呈遞細胞的自體經(jīng)照射PBMC存在下，進行抗原的再次攻擊。這些輪的抗原選擇進行3-4天，并且引入包括用IL-2刺激的增殖階段，可以每3天加入IL-2，總的時間約9天。最后的再次攻擊用已經(jīng)“靜息”的T細胞(即沒有被IL-2刺激已經(jīng)約4天了)進行。如前所述使用最優(yōu)選的自體抗原呈遞細胞，用抗原(例如合成肽或完整蛋白)刺激這些細胞約4天，隨后測量增殖應(yīng)答(如果有的話)。
所以，第三個實施方案的方法包括產(chǎn)生來自患有目標(biāo)疾病個體的PBMC樣品的T細胞系或者寡克隆培養(yǎng)物、用合成肽或者完整蛋白制品體外刺激所述細胞系或培養(yǎng)物、體外測定單獨的合成肽或蛋白的增殖效果(如果存在)、產(chǎn)生單個合成肽或完整蛋白的修飾變體、重新檢驗所述修飾肽或蛋白的促進T細胞系或培養(yǎng)物產(chǎn)生顯著增殖性應(yīng)答的后續(xù)能力。
尤其有用的是建立個體的寡克隆培養(yǎng)物的T細胞系，在這些個體中已經(jīng)開始了先前的治療性替代治療并且該替代治療已經(jīng)導(dǎo)致對該治療性蛋白的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。關(guān)于此主題的一個明顯例子是接受血友病A治療的個體，其對治療性的因子VIII具有明顯可測定的抑制性抗體滴度。在本發(fā)明的方案中，尤其希望利用來自這類所謂的“抑制劑病人(inhibitor patient)”的PBMC樣品，因為預(yù)期有許多這些個體的T細胞庫所定義的因子VIII蛋白的表位圖將代表能夠進行體內(nèi)呈遞的大多數(shù)優(yōu)勢肽表位。在這種意義上說，來自在先前顯示出免疫應(yīng)答的病人的PBMC構(gòu)成了體內(nèi)接觸治療性蛋白的產(chǎn)物，并且在本發(fā)明的方案中尤其有用。文中的實施例4詳細描述了對人FVIII進行表位繪制的方法，其中使用了來自健康人供體的幼稚T細胞和來自血友病A患者的PBMC。
如果使用來自以前接受免疫原性外源蛋白的個體的PBMC細胞系一般而言構(gòu)成了回憶試驗法，所述回憶試驗還提供了實際的益處，在于對任一特定的刺激肽或蛋白質(zhì)具有較大地提高增殖反應(yīng)幅度的能力。所述回憶試驗減小了進行增殖測定時會遇到的技術(shù)挑戰(zhàn)，并且在此情況下，如果對目標(biāo)蛋白質(zhì)確定了多個表位，該回憶試驗可能能定義免疫優(yōu)勢表位的可能等級。雖然如文中所示的對于特別大的蛋白質(zhì)如因子VIII情況確實如此，但預(yù)計小的人蛋白質(zhì)分子(如小于200個氨基酸殘基)可具有多個或復(fù)合的(即重疊的)T細胞表位。
在本發(fā)明的第四個實施方案中，提供了將前述的試驗法應(yīng)用于篩選成批的治療性生物蛋白質(zhì)的方案。該篩選方法的目的在于證實所述受試生物蛋白質(zhì)的免疫原性譜與例如下列尤其有用的情形的一致性，所述情形為所述生物蛋白質(zhì)的產(chǎn)生方法被一些參數(shù)改變且雖然所測定的所述蛋白質(zhì)的物理特性可能在被接受的范圍內(nèi)，也考慮到所述蛋白質(zhì)的潛在免疫原性特性可能已經(jīng)改變。因此為了預(yù)測對目標(biāo)分子的任一新制備物產(chǎn)生的免疫原性反應(yīng)，文中所示的方法可尤其有效地提供此類篩選方法。
因此根據(jù)第四個實施方案，作為對目標(biāo)蛋白質(zhì)進行表位繪制方法的一部分而獲得的T細胞系(寡克隆或單克隆)或任選地或此外一組幼稚PBMC制備物可用于測試受試蛋白質(zhì)的體外免疫原性，其中針對所述幼稚PBMC制備物已建立了一群已知的反應(yīng)性制備物，并且將針對受試蛋白質(zhì)的反應(yīng)分值與所述蛋白質(zhì)的參照物或″金標(biāo)準(zhǔn)″制備物比較。在此方面，如果使用T細胞系，尤其優(yōu)選地使用來自以前顯示對參照蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者的T細胞系。此類T細胞系預(yù)期在體外對抗原刺激產(chǎn)生高的刺激指數(shù)分值，并可能代表所述蛋白質(zhì)中最生物相關(guān)的和免疫優(yōu)勢表位。根據(jù)第四個實施方案，這些細胞系提供了用于表位喪失/改變的指示。相反，根據(jù)第四個實施方案，包含已知的一組對目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)性同種異型的多組幼稚PBMC提供了從頭表位產(chǎn)生的指標(biāo)，并且在預(yù)測不需要的臨床免疫原性反應(yīng)中同樣有用，其中所述表位存在于受試產(chǎn)物蛋白質(zhì)中。
術(shù)語“T細胞表位”根據(jù)本發(fā)明的理解是指這樣的氨基酸序列，其可以結(jié)合MHC II類分子、可刺激T細胞和/或也可在與MHC II類的復(fù)合體中結(jié)合(不必可測得地活化)T細胞。
此處及所附權(quán)利要求書中引用的術(shù)語″肽″為包括兩個或多個氨基酸的化合物。氨基酸通過肽鍵(定義在下文中)連接。有20種不同的天然存在氨基酸參與肽的生物產(chǎn)生，它們可以以任何數(shù)目及任意順序連接形成肽鏈或環(huán)。用于肽生物產(chǎn)生中的天然存在氨基酸均具有L-構(gòu)型。可使用L-氨基酸、D-氨基酸、或兩種不同構(gòu)型的氨基酸的各種組合通過常規(guī)的合成法制備合成肽。某些肽僅包含為數(shù)不多的氨基酸單元。短肽，如具有少于10個氨基酸單元的短肽，有時稱為“寡肽”。其它肽包含大量的氨基酸殘基，例如高達100個或更多個殘基，被稱為“多肽”。按照慣例，認為“多肽”可為包含三個或多個氨基酸的任何肽鏈，而“寡肽”通常為特定類型的“短”多肽。因此，如此處所用，談及“多肽”時也包括寡肽。而且任何談及的“肽”都包括多肽、寡肽和蛋白質(zhì)。氨基酸的每一種不同排列都將形成不同的多肽或蛋白質(zhì)?？尚纬傻亩嚯臄?shù)及因此形成的不同蛋白質(zhì)的數(shù)目實際上是不受限的。
本發(fā)明現(xiàn)在通過下列實施例闡述。所述實施例和以上部分談及了下列圖

圖1顯示了IFNβ中的免疫原性區(qū)，并詳細描述了這些區(qū)域中可刺激人幼稚T細胞的肽序列。
圖2提供了顯示可促進人幼稚T細胞體外增殖的IFNβ肽的列表。對于供體中的兩個供體，反應(yīng)記錄為來自區(qū)域R1或R2的多個重疊肽。對表位區(qū)R1或R2中繪制的單個合成肽產(chǎn)生的反應(yīng)分值來自6個供體。
圖3提供了來自時程T細胞活化試驗的示例性數(shù)據(jù)。對來自IFNαR1、R2和R3表位區(qū)的合成肽和含有氨基酸替代的肽序列類似物，圖中繪制了平行測試的刺激指數(shù)(SI)與時間(天)之間的關(guān)系。
實施例1MHC、肽和T細胞受體(TCR)的相互作用提供了T細胞識別的抗原特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。T細胞增殖測定檢驗肽與MHC的結(jié)合和TCR對MHC/肽復(fù)合體的識別。本實施例的體外T細胞增殖測定包括刺激含有抗原呈遞細胞(APC)和T細胞的外周血單核細胞(PBMC)。用合成肽抗原進行體外刺激，在某些實驗中使用完整蛋白抗原。用3H-胸苷(3H-Thy)測量刺激的T細胞增殖并對洗滌的固定細胞進行閃爍計數(shù)估計摻入的3H-Thy的存在。
從國家血液部門(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到保存時間小于12小時的人血血沉棕黃層。從Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-谷氨酰胺、50μg/ml鏈霉素、10μg/ml慶大霉素和0.1％人血清白蛋白的用于培養(yǎng)初級人淋巴細胞的無血清AIMV培養(yǎng)基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Pepscan(荷蘭)和BabrahamTechnix(Cambridge，UK)。
對血沉棕黃層輕微離心從血漿和血小板中分離出紅血球和白血球。除去并扔掉頂層部分(含有血漿和血小板)。在磷酸鹽緩沖液(PBS)中1∶1稀釋紅血球和白血球并鋪在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根據(jù)生產(chǎn)商推薦的條件進行離心并從血清+PBS/菲可帕克界面收獲PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC并通過離心收集。除去并扔掉上清液，將PBMC沉淀重新懸浮在50ml PBS中。通過離心再次沉淀細胞并拋棄PBS上清液。用50ml AIM V培養(yǎng)基重新懸浮細胞并在此時計數(shù)并用錐蟲藍染料排除估計存活率。再次離心收集細胞并拋棄上清液。細胞重新懸浮以低溫保藏，密度為3×107/ml。保藏培養(yǎng)基為90％(v/v)熱失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。將細胞轉(zhuǎn)移到受調(diào)節(jié)的冰凍容器(Sigma)并且在轉(zhuǎn)移到液氮以長期保存前將其置于-70℃過夜。當(dāng)需要使用時，在37℃水浴中快速解凍然后轉(zhuǎn)移到10ml預(yù)熱的AIMV培養(yǎng)基。
在96孔平底板(PBMC密度為2×105PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下將PBMC孵育7天后用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脈沖。對于本研究，產(chǎn)生并使用以3個氨基酸遞增的重疊并覆蓋IFNβ全序列的合成肽(15聚體)。肽標(biāo)識編號(ID#)和序列在表1中給出。
表1IFNβ肽
每種肽都單獨地針對從20個未接觸抗原供體中分離的PBMC進行篩選。在每個供體測定中使用先前已經(jīng)顯示具有免疫原性的兩種對照肽和一種強的非記憶抗原KLH。在本研究中使用的對照抗原為流感血細胞凝集素307-319(序列PKYVKQNTLKLAT)；衣原體HSP60肽(序列KVVDQIKKISKPVQH)和匙孔血藍蛋白。
將肽溶解于DMSO中使其終濃度為10mM，然后將這些貯存液在AIM V培養(yǎng)基中稀釋到原來的1/500(終濃度20μM)。向平底96孔板中加入肽使其終濃度為2和20μM(體積為100μl)。通過錐蟲藍染料排除估計解凍的PBMC的存活率。然后將細胞重新懸浮(密度為2×106個細胞/ml)，向每個含有肽的孔中移入100μl(2×105個PBMC/孔)。在每個肽濃度下測定一式三份的孔培養(yǎng)物。在5％CO2、37℃的潮濕空氣中孵育平板7天。用1μCi3H-Thy/孔的脈沖細胞18-21小時后收獲到過濾墊上。用Wallac微量培養(yǎng)板β頂層平板計數(shù)器(Perkin Elmer)或類似儀器測定CPM值。結(jié)果表達為刺激指數(shù)，其中刺激指數(shù)(SI)為用受試肽的增殖值(如放射性的每分鐘計數(shù))除以未接觸受試肽的細胞所測定的值進行確定。
使用T細胞增殖試驗對IFNβ序列中的T細胞表位進行繪制，結(jié)果確定了2個免疫原性區(qū)，為R1和R2，每一免疫原性區(qū)通過4種重疊肽的反應(yīng)確定(圖1)。
實施例2使用實施例1的方法對獲得人蛋白干擾素α2(IFNα)的表位圖譜。在所用方法中，除了合成肽為如表2(下文)所示和與PBMC制備物的孵育濃度為10μM不同外，其他方面為如實施例1的方法。
在IFNα序列中對T細胞表位的繪制，結(jié)果確定了3個免疫原性區(qū)，為R1、R2和R3。它們是分別對如圖2所示的7個、4個和5個重疊肽產(chǎn)生T細胞增殖而確定的。認為區(qū)域3包含潛在的免疫優(yōu)勢T細胞表位，因為在對IFN α起反應(yīng)的供體中，有三分之二記錄到對該區(qū)域起增殖反應(yīng)。
表2IFNα肽
實施例3進行時程T細胞活化試驗的方法進行時程T細胞活化試驗的一般性方法包括以下步驟1.每一供體融化1管PBMC。
2.將細胞重懸為2-4×106個細胞/ml(在AIM V中)。
3.分別將1ml轉(zhuǎn)移至24孔板中的3個孔(給出的終濃度為2-4×106個細胞/孔)，因為通常用于測試抗原的2個不同濃度并與無抗原處理對照比較(如10-50μg/ml蛋白質(zhì)或1-5μM肽)。
4.制備抗原母液，對蛋白質(zhì)通常為100μg/ml，對肽通常為2-10μM。將1ml抗原加至每一孔中，產(chǎn)生終濃度為10-50μg/ml蛋白質(zhì)或1-5μM肽。
5.孵育5天。
6.通過吸打?qū)⒓毎麥睾椭貞矣?ml培養(yǎng)物中，并且對每一培養(yǎng)條件取出100μl細胞并置于96孔板(圓底)的一個孔中，對每一培養(yǎng)條件重復(fù)該過程3次(在每個時間點，對每一培養(yǎng)條件總共取出了300μl)。
7.對96孔板的每一細胞孔加入在100μl AIM V中的1μCi/孔3H[Thy]。
8.過夜孵育并收獲細胞。
9.重復(fù)第6、7和8天(根據(jù)需要可包括第9天)的步驟6-8。
10.對每一抗原進行SI確定并繪制SI對時間的點陣圖。
圖3示出了對跨過干擾素α2免疫原性區(qū)域(參見實施例2)的長肽進行免疫原性時程試驗的代表性結(jié)果。該新的時程方法尤其用于分析完整蛋白以篩選T細胞免疫原性(SI＞1.8)并分析在該蛋白質(zhì)內(nèi)進行的氨基酸修飾對免疫原性的影響。
實施例4建立T細胞系和克隆的方法外周血單核細胞(PBMC)分離自血友病患者，并在液氮中低溫貯存。血液樣本的提供獲得患者的知情同意并取得了Addenbrooke′s HealthCare Trust當(dāng)局道義上的批準(zhǔn)。
在大體積培養(yǎng)物中先用FVIII刺激抗原特異性T細胞，然后用幾輪IL-2誘導(dǎo)的擴增而建立T細胞系。最初于24孔板中將在2ml含有4μg/mlFVIII(RefactoTM)的AIM V培養(yǎng)基中的2×106個PBMC進行孵育(在37℃的濕潤環(huán)境，含5％CO2)。孵育7天后，加入100U/ml IL-2并繼續(xù)培養(yǎng)3天。在10天的抗原/IL-2刺激結(jié)束后收集并計數(shù)T淋巴母細胞。為了保有抗原特異性，將T淋巴母細胞進行第二輪的抗原刺激，使用經(jīng)γ射線照射的自體PBMC作為抗原呈遞細胞。通過將24孔板中的1×106個自體PBMC/孔與4μg/ml FVIII在0.75ml AIM V(含5％熱滅活的人AB血清)孵育1小時，然后進行4000拉德的γ-照射實施。將在0.25ml AIM V中的4×105個細胞/ml自體T淋巴母細胞加至經(jīng)γ-照射的抗原呈遞細胞(已用FVIII預(yù)孵育過)，并培養(yǎng)3天。T淋巴母細胞用100U/ml IL-2刺激3天而擴增；然后每3天向培養(yǎng)物提供新鮮的IL-2(終濃度為100U/ml)，共進行9天。為了確保所有擴增的T淋巴母細胞為抗原特異的，進行了第3輪抗原刺激，其中收集T淋巴母細胞并以4×105個細胞/ml重懸于AIM V培養(yǎng)基中。如所述的那樣，事先將24孔板中的1×106個經(jīng)γ-照射的自體PBMC與4μg/mlFVIII在0.75ml AIM V(含5％熱滅活的人AB血清)孵育1小時從而產(chǎn)生抗原呈遞細胞，將在0.25ml AIM V中的4×105個細胞/ml自體T淋巴母細胞加至經(jīng)γ-照射的抗原呈遞細胞并孵育3天。在T淋巴母細胞收獲并用于篩選肽庫前3天進行最后的10U/ml IL-2擴增。
自大體積培養(yǎng)物克隆用FVIII抗原第3次刺激后，收獲并重懸T淋巴母細胞，系列稀釋至細胞密度為4×102-1×104個細胞/ml(2×最終培養(yǎng)物密度)。融化自體PBMC并在聚丙烯管中重懸至2×106個細胞/ml(2×最終培養(yǎng)物密度)。然后將PBMC暴露于4000拉德γ-射線照射，并用作抗原呈遞細胞，通過有限稀釋選擇抗原反應(yīng)性T細胞克隆。經(jīng)γ-射線照射的抗原呈遞細胞(終細胞密度為1×106個細胞/ml)與T淋巴母細胞(終細胞密度為2×102-5×103個細胞/ml)、1-10μg/ml FVIII抗原和100U/ml IL-2混合。通過在Terasaki板的每一孔中加入APC、T淋巴母細胞、FVIII和IL-2的20μl混合物建立T細胞克隆。用Terasaki板中2-50個T淋巴母細胞/孔進行有限稀釋克隆。
選擇和維持T細胞克隆T淋巴母細胞與FVIII抗原、IL-2和經(jīng)γ-照射的自體抗原呈遞細胞孵育約14天。在鑒定了含有確切顯示細胞生長的孔后，將T淋巴母細胞圓底96孔板的含有1×105個經(jīng)γ-照射的同種異體PBMC、100U/ml IL-2和1μg/ml植物血凝素(PHA)、終體積為200μl AIM V(含有1％熱滅活的人AB血清)的單獨孔中。當(dāng)細胞匯片時將T細胞克隆分開，并最終轉(zhuǎn)移至24孔板的含有1×106個經(jīng)γ-照射的同種異體PBMC(飼養(yǎng)細胞)、100U/ml IL-2和1μg/ml植物血凝素(PHA)、終體積為2ml AIM V(含有1％熱滅活的人AB血清)的單獨孔中。T細胞克隆的常規(guī)維持涉及每2-3周(根據(jù)細胞生長確定)用新鮮的PHA和同種異體飼養(yǎng)細胞刺激和一周兩次用100U/ml IL-2刺激。只有證實為FVIII特異的T細胞克隆擴增，并將所述T細胞克隆用于篩選FVIII肽。
自體B細胞的EBV轉(zhuǎn)化通過將3ml經(jīng)過濾(0.45μl)B95.8上清加入4×106個PBMC并于37℃孵育1小時，使PBMC制備物中的B細胞永生化，以產(chǎn)生B淋巴母細胞樣細胞系(BLCL)。沉淀PBMC并重懸于含有5％熱滅活胎牛血清(FCS)和1μg/ml環(huán)孢菌素A的2ml RPMI中。孵育7天后，將1ml的培養(yǎng)基替換為含有5％FCS和2μg/ml環(huán)孢菌素A的新鮮RPMI(給出的終濃度為1μg/ml環(huán)孢菌素A)。在第14天和第21天重復(fù)該替換方案，之后根據(jù)需要使用含有5％FCS的RPMI將細胞分開，并在組織培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)。
用T細胞系/克隆篩選FVIII肽合成長度為15個殘基并且通過以12個氨基酸與前一個肽重疊而遞增的肽(Pepscan，Netherlands)。肽最初以10mM溶解于100％二甲基亞砜(DMSO)中貯存。產(chǎn)生肽庫用于同時篩選針對FVIII特異的T細胞系的大量肽。將肽庫組織為每一庫包含有下一個庫的重疊肽，通過這種途徑，2個重疊肽的T細胞表位導(dǎo)致誘導(dǎo)2個分別庫的增殖。每一庫一般由8個肽組成，對每一肽測試1或5μM。
通過將1×105個PBMC或BLCL重懸于50μl AIM V培養(yǎng)基并接下來加至圓底96孔板的每一孔中，從而自體PBMC(對于T細胞系)或EBV轉(zhuǎn)化的BLCL(對于T細胞克隆)被用作抗原呈遞細胞。每一肽庫以兩種濃度(1或5μM)加入孔中，一式三份。將抗原呈遞細胞與肽庫在37℃孵育1小時，然后暴露于4000拉德γ-射線照射。當(dāng)BLCL(而不是經(jīng)γ-照射的自體PBMC)用作T細胞克隆的抗原呈遞細胞時，將BLCL用1μg/ml絲裂霉素C 37℃預(yù)處理1小時，然后用AIM V洗4次。然后將抗原特異性T細胞系或T細胞克隆以5×104個細胞/孔加入并孵育3天。在第3天，每一孔用1μCi[3H]-胸苷脈沖最少8小時。將板收獲至濾墊上后，用Wallac微孔板β計數(shù)儀測定cpm/孔。
用來自健康供體的PBMC進行幼稚T細胞表位繪制來自40個HLA-DR健康供體的血液用于分離PBMC，所得PBMC用于篩選2種濃度(1和5μM)的單獨FVIII肽。由于來自每一供體的PBMC數(shù)不足以篩選所有的FVIII肽，將供體分成2組，其中第1組的20個供體用于篩選分子中前一半的肽，而第2組供體用于篩選剩余的肽。根據(jù)所表達的MHC II類同種異型選擇供體，以在世界人口中覆蓋大量的同種異型。使用合適的方法檢測MHC同種異型。
使用市售試劑體系(Dynal，Wirral，UK)試驗所有PBMC樣本的組織型別。試驗根據(jù)供應(yīng)商推薦的方法和標(biāo)準(zhǔn)的補充試劑以及瓊脂糖電泳體系進行。
PBMC含有生理量的幼稚T細胞和抗原呈遞細胞。這些細胞的使用密度為2×105個細胞/孔(96孔平底板)，用于對一式三份的在200μl培養(yǎng)物中的1和5μM肽進行篩選。細胞與肽在37℃孵育6天，然后每一孔用1μCi[3H]-胸苷脈沖最少8小時。將板收獲至濾墊上并用Wallac微孔板β計數(shù)儀測定cpm/孔。
表3顯示了使用來自血友病患者的T細胞系和來自健康個體的幼稚T細胞制備物產(chǎn)生的人B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII表位圖譜。如果將T淋巴母細胞和來自T細胞的幼稚PBMC用于鑒定含有T細胞表位的肽庫，那么接下來對這些肽庫進行解碼，以確定含有T細胞表位的單獨肽。
表3
序列編號是根據(jù)B結(jié)構(gòu)域缺失的序列進行的實施例5計算方案有多種因素對決定蛋白或多肽的總體結(jié)構(gòu)起重要作用。首先是肽鍵，即將氨基酸連接在一起形成鏈的鍵，它是一種共價鍵。這種鍵是平面結(jié)構(gòu)的，實質(zhì)上是一種取代的酰胺?！磅０贰敝负?CONH-基團的一組有機化合物中的任何一個化合物。
連接相鄰氨基酸的Cα的平面肽鍵如下所示
由于O＝C和C-N原子位于一個相對剛性的平面中，所以不會發(fā)生沿這些軸的自由旋轉(zhuǎn)。因此，圖中虛線所示的平面有時被稱作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主鏈中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氫(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相對的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不發(fā)生旋轉(zhuǎn)，所以多肽鏈包含一系列連接Cα原子的平面肽鍵。
第二個對決定多肽或蛋白的整體結(jié)構(gòu)或構(gòu)象起重要作用的因素是每一酰胺平面繞共有Cα鍵的轉(zhuǎn)角。此后術(shù)語″轉(zhuǎn)角″和″扭轉(zhuǎn)角″是等同的術(shù)語。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(這通常是一種正確的假設(shè)，盡管在一些構(gòu)象中這些原子會輕微的偏移平面)，這些轉(zhuǎn)角確定了N和R多肽主鏈構(gòu)象，即相鄰殘基之間的結(jié)構(gòu)。這兩個轉(zhuǎn)角稱為φ和Ψ。因此，一套φi和Ψi角(其中，腳標(biāo)i代表多肽鏈中的特定殘基)有效地規(guī)定了多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)。在文獻中定義了用于確定φ和Ψ角的慣例，即在給定的多肽中酰胺平面形成0度角的參考點，以及哪個角是φ角，哪個角是Ψ角的定義。參見Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23283-437(1968)，285-94頁，這些頁中的內(nèi)容在此引入作為參考。
本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何蛋白，并部分基于下述發(fā)現(xiàn)，即人MHCII類分子結(jié)合溝的主要口袋1錨定位點對特定氨基酸側(cè)鏈具有設(shè)計好的特異性。這一口袋的特異性由MHC II類分子β鏈第86位的氨基酸的身份來確定。這一位點位于口袋1的底部并決定可容納于這一口袋中的氨基酸側(cè)鏈的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，1524946-4956(1994)。如果這一殘基是甘氨酸，則所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容納于所述的口袋中，優(yōu)選芳香族側(cè)鏈。如果這一口袋殘基是纈氨酸，則該氨基酸的側(cè)鏈伸到口袋中并限制了可容納的肽側(cè)鏈的大小，所以只有疏水性脂肪族側(cè)鏈可容納進去。因此在氨基酸殘基序列中，無論哪里發(fā)現(xiàn)了帶有疏水性脂肪族或芳香族側(cè)鏈的氨基酸，即有存在MHC II類限制性T-細胞表位的可能性。但是，如果所述的側(cè)鏈?zhǔn)鞘杷灾咀鍌?cè)鏈，其與T-細胞表位相關(guān)的可能性約是芳香族側(cè)鏈的兩倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球種群中)。
將本發(fā)明具體化的計算機方法描繪出肽區(qū)域包含T-細胞表位的可能性，該方法如下(1)掃描預(yù)定長度肽片段的一級序列，并鑒定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族側(cè)鏈。(2)對疏水性脂肪族側(cè)鏈賦予比芳香族側(cè)鏈高的值；優(yōu)選約兩倍于賦予芳香族側(cè)鏈的值，例如，給疏水性脂肪族側(cè)鏈賦值為2，給芳香族側(cè)鏈賦值為1。(3)將所述肽中的預(yù)定統(tǒng)一長度的每一重疊氨基酸殘基片段(窗口)中確定存在的值總和起來，再將某一特定片段(窗口)的總值賦予該片段(窗口)中間位置的某個單個氨基酸殘基，優(yōu)選賦予大約處于抽樣片段(窗口)中間點的氨基酸。將這一過程對每一抽樣的重疊氨基酸殘基片段(窗口)重復(fù)進行。因此，所述肽的每一氨基酸殘基均被賦予了一個值，該值與T-細胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相關(guān)。(4)用按照上述步驟3中的描述計算、賦予的值對被評估的整個氨基酸殘基序列的氨基酸坐標(biāo)作圖。(5)序列中具有預(yù)定值(例如該值為1)的所有部分均被認為可能包含T細胞表位，并且在需要時可進行修飾。在這一方面本發(fā)明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-細胞表位的肽區(qū)域。在這些區(qū)域中對所述的肽進行修飾有可能改變MHC II類的結(jié)合特性。
依照本發(fā)明的另一方面，可利用考慮了肽與MHC II等位基因模型之間的相互作用的更復(fù)雜計算方法來更精確地預(yù)測T-細胞表位。根據(jù)這一方面，對肽中存在的T細胞表位的計算預(yù)測考慮到基于所有已知MHCII類分子的結(jié)構(gòu)構(gòu)建至少42個MHC II類等位基因模型；使用這些模型計算鑒定T細胞表位的方法；對每一模型構(gòu)建肽主鏈文庫以允許在相關(guān)肽主鏈α碳(Cα)位置具有已知的變異性；在肽和MHC II類分子間相互作用關(guān)鍵的位置處，對與每一模型對接(dock)的每一主鏈，相對于20種氨基酸選項中每一種構(gòu)建氨基酸側(cè)鏈構(gòu)象文庫；以及將這些主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象文庫與評分函數(shù)結(jié)合用于選擇與特定MHC II類分子對接的特定肽的最佳主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象并得出該相互作用的結(jié)合分值。
MHC II類分子模型可從Brookhaven蛋白數(shù)據(jù)庫(″PDB″)中的許多類似的結(jié)構(gòu)出發(fā)通過同源建模推導(dǎo)得出。它們可通過使用引入了模擬退火算法的半自動同源建模軟件(Modeller，Sali A.& Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234779-815)并結(jié)合用于能量最小化的CHARMm力場(購自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)來制備。也可以應(yīng)用其他的建模方法。
本發(fā)明的方法與下述的其他計算方法有著顯著的不同，這些方法在于利用從實驗中得來的關(guān)于一小組MHC II類分子結(jié)合溝中每一位點的每一種氨基酸選項的結(jié)合數(shù)據(jù)文庫(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)157-162)(1995)；或利用類似的實驗結(jié)合數(shù)據(jù)以定義所述的溝中特定結(jié)合口袋類型的結(jié)合特性(同樣利用相對小的MHC II類分子亞組)然后將這一口袋文庫中的口袋類型進行‘混合和匹配’以人工構(gòu)建更“實際的”MHC II類分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)555-561(1999)。這兩種現(xiàn)有方法的主要缺陷在于實驗的復(fù)雜性和需要合成大量的肽變體造成僅有少量的MHC II類分子可通過實驗掃描。因此第一種已知的方法僅能預(yù)測少量的MHC II類分子。第二種已知的方法還假設(shè)在不同II類等位基因的背景下在一個分子中襯有類似氨基酸的口袋將具有相同的結(jié)合特性，故其另外的缺陷在于，僅僅可“實際地”地構(gòu)建出那些包含口袋文庫中所包含的口袋的MHC II類分子。利用本發(fā)明的建模方法可推導(dǎo)出任意數(shù)量和類型的MHC II類分子的結(jié)構(gòu)，因此可特異性地選擇等位基因以代表全球種群的特征。此外，掃描的MHC II類分子的數(shù)量可通過構(gòu)建更多的模型而增加而無需通過復(fù)雜的實驗獲得額外的數(shù)據(jù)。
利用主鏈文庫使得被掃描的各種肽在與特定的MHC II類分子結(jié)合時其Cα原子位置處可進行變化。這也與上述現(xiàn)有技術(shù)中的計算機方法不同，在那些方法中依賴于利用簡化的肽主鏈來掃描結(jié)合在特定口袋中的氨基酸。這些簡化的主鏈不可能代表在“真正的”肽中存在的主鏈構(gòu)象，從而導(dǎo)致對肽結(jié)合的預(yù)測不準(zhǔn)確。本發(fā)明的主鏈文庫是通過疊加蛋白數(shù)據(jù)庫中所有與MHC II類分子結(jié)合的肽的主鏈，并考慮到位于結(jié)合溝內(nèi)的11個氨基酸的每個氨基酸的Cα原子之間的均方根(RMS)差而構(gòu)建的。盡管該文庫可來自少量合適的可獲得的小鼠和人的結(jié)構(gòu)(當(dāng)前為13種)，但為了允許存在甚至更大變異的可能性，將每一C″-α位點的RMS數(shù)提高50％。然后確定每一氨基酸的平均Cα位置，圍繞這一點劃一個球，其半徑等于在該位置的RMS差加50％。該球體代表所有可允許的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸殘基的Cα，等同于結(jié)合溝中11個殘基的位置2)起運作，將所述的球三維網(wǎng)格化，網(wǎng)格內(nèi)的每個頂點作為該氨基酸的Cα的可能位置。將后續(xù)的酰胺平面(相應(yīng)于與后續(xù)氨基酸的肽鍵)移動到這些Cα的每一個上面，將φ和Ψ角以設(shè)定的間隔逐步地轉(zhuǎn)動以便于安置后續(xù)的Cα。如果后續(xù)的Cα落入對這一Cα而言‘可被允許的位置球’中，則此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外則所得的二肽不能被接受。對每一后續(xù)Cα位置均重復(fù)這一過程，使肽從所述的口袋1Cα‘種子’開始生長，直到全部9個后續(xù)的Cα的位置均根據(jù)之前Cα的所有可能排列確定下來。然后對口袋1前的單個Cα重復(fù)上述步驟1次以上以構(gòu)建定位于結(jié)合溝內(nèi)的主鏈Cα位置文庫。
生成的主鏈數(shù)目取決于幾種因素‘可被允許的位置球’的大?。粚诖?位點處′最初的球′網(wǎng)格化的細度；用于定位后續(xù)Cα的φ和Ψ角逐步旋轉(zhuǎn)的細度。利用這一程序可以構(gòu)建大的主鏈文庫。主鏈文庫越大越可能發(fā)現(xiàn)對MHC II類分子結(jié)合溝內(nèi)的特定肽而言的最適主鏈。鑒于和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸可能存在沖突，所以不是所有的主鏈均適合于與所有MHC II類分子模型‘對接’(docking)，故對每個等位基因建立亞文庫以包含適合被該等位基因容納的主鏈。利用所述的主鏈文庫并結(jié)合MHC II類分子模型可以構(gòu)建出由與每一容許主鏈對接的每一MHC II類分子結(jié)合溝的每一位點中的每一氨基酸的容許側(cè)鏈構(gòu)象所組成的詳盡數(shù)據(jù)庫?？梢岳煤唵蔚牧Ⅲw重疊函數(shù)構(gòu)建這一數(shù)據(jù)組，其中，主鏈與MHC II類分子對接，氨基酸側(cè)鏈在所需位置被嫁接到主鏈上。將側(cè)鏈上可旋轉(zhuǎn)的鍵以設(shè)定的間隔逐步旋轉(zhuǎn)，記錄下依賴于該鍵的原子的最終定位。將所述原子與結(jié)合溝側(cè)鏈原子間的相互作用記錄下來，根據(jù)下述的標(biāo)準(zhǔn)確定是否接受這些位置如此定位的所有原子的重疊總量不能超過預(yù)定值。因此，構(gòu)象搜索的嚴(yán)謹度是在鍵的逐步旋轉(zhuǎn)中所用的間隔及對總重疊的預(yù)定限度的函數(shù)。如果已知特定的口袋是剛性的，則后一值可較小，但若已知口袋側(cè)鏈的位置相對靈活則嚴(yán)謹度可放松。這樣便可以模擬結(jié)合溝口袋內(nèi)靈活性的變化。針對與每一MHC II類分子對接后每一主鏈的所有位點上的所有氨基酸重復(fù)這種構(gòu)象搜索以建立詳盡的側(cè)鏈構(gòu)象數(shù)據(jù)庫。
用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)表達式評價MHC II類分子模型與肽配體構(gòu)象的結(jié)合能量，所述的肽配體構(gòu)象需通過掃描上述的主鏈/側(cè)鏈構(gòu)象大數(shù)據(jù)庫根據(jù)經(jīng)驗獲得。這樣，通過對每一長度在9-20個氨基酸范圍內(nèi)變化(盡管對于每一次掃描長度是一定的)的可能肽進行下述計算，可以掃描蛋白以搜索潛在的T-細胞表位選擇MHC II類分子及適合于該分子的肽主鏈，將相應(yīng)于所需肽序列的側(cè)鏈移植到其上。對于氨基酸的每一容許構(gòu)象(由上述數(shù)據(jù)庫獲得)，收集與主鏈上特定位點的特定側(cè)鏈相關(guān)的原子身份和原子間距數(shù)據(jù)。沿主鏈對每一側(cè)鏈重復(fù)此過程，利用評分函數(shù)推導(dǎo)肽得分。保留該主鏈的最佳得分，對所選模型的每一容許主鏈重復(fù)該過程。比較所有容許主鏈的得分，最高的得分被認為是該MHC II類模型中所需肽的得分。對每一模型用從掃描的蛋白得到的所有可能肽重復(fù)上述過程，列出肽相對于模型的得分。
在本發(fā)明中，用于結(jié)合親和力計算的每種配體都是選自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配體為來自已知序列的肽、多肽或蛋白的長度為約9到20個氨基酸的選定氨基酸鏈。此后術(shù)語“氨基酸”和“殘基”視為等同的術(shù)語。將移植到選自上述主鏈文庫的主鏈上的待檢測肽中的連續(xù)氨基酸形式的配體，通過肽主鏈上C″-α原子坐標(biāo)定位到來自MHC II類分子模型庫的MHC II類分子的結(jié)合裂縫中，并從容許構(gòu)象的數(shù)據(jù)庫中選擇每一側(cè)鏈的容許構(gòu)象。相關(guān)的原子身份和原子間距也可以從這一數(shù)據(jù)庫獲得并用于計算肽結(jié)合分數(shù)。將對MHC II類結(jié)合口袋具有高親和力的配體作為侯選者標(biāo)記出來用于定點誘變。在標(biāo)記的配體中(也由此在目的蛋白中)進行氨基酸替代，然后用評分函數(shù)重新測定以確定使結(jié)合親和力降低到預(yù)定的閾值以下的變化。這些變化即可引入到目的蛋白中以去除T-細胞表位。
肽配體與MHC II類分子結(jié)合溝的結(jié)合涉及非共價鍵相互作用，其包括但不限于氫鍵、靜電相互作用、疏水(親脂)相互作用和范德華相互作用。它們被包括在下面將詳細描述的肽評分函數(shù)中。應(yīng)當(dāng)理解，氫鍵是非共價鍵，其可在極性或帶電的基團之間形成，由被兩個其他原子共享的氫原子構(gòu)成。氫供體中的氫帶正電荷，而氫受體帶有部分負電荷。為肽/蛋白相互作用的目的，氫鍵供體可以是連接氫的氮，或連接在氧或氮上的氫。氫鍵受體原子可以是沒有連接氫的氧、沒有連接氫并具有一或兩個連接的氮或僅有一個連接的硫。某些原子，如連接了氫的氧或亞胺氮(如C＝NH)，既可以是氫受體也可以是氫供體。氫鍵的能量在3-7Kcal/mol，大大強于范德化鍵，但弱于共價鍵。氫鍵具有高度的方向性，且當(dāng)供體原子、氫原子和受體原子共線時最強。靜電鍵是在帶有相反電荷的離子對間形成的，根據(jù)庫侖定律這種相互作用的強度與原子間距離的平方成反比。離子對間的最佳距離是約2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、組氨酸或賴氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之間形成靜電鍵。該鍵的強度依賴于電離基團的pKa和介質(zhì)的介電常數(shù)，盡管其與氫鍵的強度類似。
親脂相互作用是蛋白和肽配體之間發(fā)生的有利疏水-疏水相互作用。這種相互作用通常出現(xiàn)在埋于結(jié)合溝口袋中的肽的疏水性氨基酸側(cè)鏈間，以使它們不暴露在溶劑中。將疏水殘基暴露于溶劑中是非常不利的，因為周圍的溶劑分子將被迫在彼此間形成氫鍵而形成籠狀結(jié)構(gòu)。所致的熵值降低是非常不利的。親脂性原子可以是既非極性又不是氫受體的硫和非極性的碳原子。
范德華鍵是相距3-4的原子間的非特異性的力。它比氫鍵和靜電鍵弱、特異性低。原子周圍的電荷分布隨時間變化，并且在任何瞬間電荷分布均是不對稱的。這種瞬間的電荷不對稱性誘導(dǎo)臨近原子中的類似不對稱性。在范德華接觸距離中所導(dǎo)致的原子之間的吸引力達到最大，而在約1到2處迅速消失。相反，當(dāng)原子間隔的距離小于此接觸距離時，由于原子外部的電子云重疊使不斷增強的斥力成為主導(dǎo)。盡管與靜電和氫鍵相比，此吸引力相對較弱(約0.6Kcal/mol)，但所述斥力對于決定肽配體是否能與蛋白成功結(jié)合可能非常重要。
在一個實施方案中，利用Bhm評分函數(shù)(SCORE1方法)評估結(jié)合常數(shù)(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)243-256(1994)，該文獻在此全文引入作為參考)。在另一個實施方案中，用評分函數(shù)(SCORE2方法)評估結(jié)合親和力作為配體含有T-細胞表位的指示物(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)309-323(1998)，該文獻在此全文引入作為參考)。但是上述文獻中描述的Bhm評分函數(shù)是用于評估下述情況中配體對蛋白的結(jié)合親和力的，即已知所述的配體可成功地與所述蛋白結(jié)合，且蛋白/配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)已解析，這一結(jié)構(gòu)已列于蛋白數(shù)據(jù)庫(″PDB″)中。因此，利用已知的陽性結(jié)合數(shù)據(jù)對評分函數(shù)作了發(fā)展。為了區(qū)分陽性和陰性的結(jié)合體，需向方程中加入排斥項。此外，可通過以成對的方式計算親脂相互作用，而非利用上述Bhm函數(shù)中基于面積的能量項來進行更理想的結(jié)合能量評估。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，用經(jīng)修飾的Bhm評分函數(shù)評估結(jié)合能。在經(jīng)修飾的Bhm評分函數(shù)中，在評估蛋白和配體之間的結(jié)合能(ΔGbind)時考慮了下述參數(shù)由于配體的平移和轉(zhuǎn)動熵的整體損失造成的結(jié)合能減低(ΔG0)；理想氫鍵的貢獻(ΔGhb)，其中至少一個配對物是中性的；無擾離子相互作用的貢獻(ΔGionic)；親脂配體原子和親脂受體原子之間的親脂相互作用(ΔGlipo)；由于配體中內(nèi)在自由度的凍結(jié)，即繞每一C-C鍵的旋轉(zhuǎn)自由度降低而造成的結(jié)合能損失(ΔGrot)；蛋白和配體之間相互作用的能量(EVdW)?？紤]到這些項給出等式1(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)其中N是對于特定項符合的相互作用的數(shù)目，在一個實施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常數(shù)，其值分別為5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb項依照等式2計算Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcsf(ΔR，Δα)是罰函數(shù)，其解決氫鍵自理想情況的巨大偏離，其依照等式3計算f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)其中如果ΔR＜＝TOL 則f1(ΔR)＝1，或者如果ΔR＜＝0.4+TOL 則f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者如果ΔR＞0.4+TOL 則f1(ΔR)＝0并且如果Δα＜30° 則f2(Δα)＝1，或者如果Δα＜＝80° 則f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者如果Δα＞80° 則f2(Δα)＝0
TOL是氫鍵鍵長中所能允許的偏差＝0.25ΔR是H-O/N氫鍵鍵長與理想值＝1.9的偏差Δα是氫鍵鍵角∠N/O-H..O/N與180°理想值的偏差f(Nneighb)區(qū)分蛋白表面的凹凸部分，并因此賦予口袋中的極性相互作用比蛋白表面的極性相互作用更高的權(quán)重。這一函數(shù)根據(jù)下述等式4計算f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5Nneighb為蛋白中與任意給定蛋白原子之間的距離小于5的非氫原子的數(shù)量。
Nneighb，0是常數(shù)＝25fpcs是考慮到每氫鍵的極性接觸表面面積的函數(shù)，由此可以區(qū)分強和弱的氫鍵，其值由下述的標(biāo)準(zhǔn)確定當(dāng)Apolar/NHB＜102時 fpcs＝β或當(dāng)Apolar/NHB＞102時 fpcs＝1Apolar是極性蛋白-配體接觸面的大小NHB是氫鍵的數(shù)目β是常數(shù)＝1.2由于假定了相同的幾何相關(guān)性，在實施經(jīng)修飾的Bhm評分函數(shù)時，離子相互作用的貢獻ΔGionic用與上述有關(guān)氫鍵的類似方式計算。
Nlipo項按下述的等式5計算Nlipo＝∑lLf(rlL)根據(jù)下述標(biāo)準(zhǔn)，對于所有親脂配體原子l和所有親脂蛋白原子L，計算f(rlL)當(dāng)rlL＜＝R1時 f(rlL)＝1當(dāng)R2＜rlL＞R1時f(rlL)＝(rlL-R1)/(R2-R1)當(dāng)rlL＞＝R2時 f(rlL)＝0其中R1＝rlvdw+rLvdw+0.5
R2＝R1+3.0rlvdw是原子l的范德華半徑rLvdw是原子L的范德華半徑Nrot項是氨基酸側(cè)鏈中可旋轉(zhuǎn)的鍵的數(shù)目，其被視為無環(huán)的sp3-sp3及sp3-sp2鍵的數(shù)目。末端-CH3或-NH3的旋轉(zhuǎn)未考慮進去。
最終，項Evdw依照如下等式6計算Evdw＝ε1ε2((r1vdw+r2vdw)12/r12-(r1vdw+r2vdw)6/r6)，其中ε1和ε2是取決于原子身份的常數(shù)r1vdw+r2vdw是范德華原子半徑r是原子對間的距離。
關(guān)于式6，在一個實施方案中，ε1和ε2常數(shù)被賦予如下原子值，分別為C0.245，N0.283，O0.316，S0.316(即分別對于碳、氮、氧和硫原子)。對于式5和6，給予范德華半徑如下原子值，分別為C1.85，N1.75，O1.60，S2.00。
應(yīng)當(dāng)理解上述等式中所有預(yù)定的值和給定的常數(shù)都是在現(xiàn)有的對蛋白配體相互作用的理解局限內(nèi)具體相對于此處所用的計算類型確定的。因此，隨著這種評分函數(shù)的進一步精練，這些值和常數(shù)也會因此而改變，任何能在蛋白和配體結(jié)合能的評估方面給出所需結(jié)果的適宜數(shù)值均可使用，而且，其也落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
如上所述，所述的評分函數(shù)應(yīng)用于由上述側(cè)鏈構(gòu)象、原子身份和原子間距數(shù)據(jù)庫中提取的數(shù)據(jù)。為本說明書的目的，該數(shù)據(jù)庫中包含的MHC II類分子數(shù)是42個模型加上4個已解析的結(jié)構(gòu)。從上述描述中可清楚地了解到，本發(fā)明的計算構(gòu)建方法的模塊性質(zhì)意味著，可簡單地添加新的模型，并利用肽主鏈文庫和側(cè)鏈構(gòu)象搜索功能進行掃描以創(chuàng)建其它的可通過上述的肽評分函數(shù)處理的數(shù)據(jù)集。這使得被掃描的MHC II類分子庫可以很容易地增加，或者如果可以獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，則可以替換結(jié)構(gòu)和相關(guān)數(shù)據(jù)以創(chuàng)建現(xiàn)有等位基因的更精確的模型。
本發(fā)明的預(yù)測方法可以相對于包含大量已通過實驗確定了其對不同MHC II類分子的親和力的肽的數(shù)據(jù)集進行校準(zhǔn)。將計算值與實驗數(shù)據(jù)相比較，可確定一截斷值，已知該值之上所有經(jīng)實驗確定的T-細胞表位都得以正確的預(yù)測。
應(yīng)當(dāng)理解，盡管上述評分函數(shù)與現(xiàn)有的一些復(fù)雜方法相比相對簡單，但計算進行得非常迅速。還應(yīng)當(dāng)理解的是，其目的并不在于計算出對接到所選擇的MHC II類蛋白結(jié)合溝內(nèi)的每種肽的真正結(jié)合能本身。根本的目的在于獲得相對的結(jié)合能數(shù)據(jù)以助于根據(jù)所選蛋白的一級結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)預(yù)測T-細胞表位的定位。相對高的結(jié)合能或結(jié)合能高于選定的閾值意味著在配體中存在T-細胞表位。然后可以將所述配體進行至少一輪氨基酸替代，并再次計算結(jié)合能。由于計算可迅速進行，對肽序列的這些操作可在現(xiàn)有成本劃算的計算機硬件上于程序用戶界面中互動進行。由此不需要對計算機硬件進行大量投資。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，也可使用其他軟件達到相同的目的。特別是可以使用能將配體對接入蛋白結(jié)合位點的更復(fù)雜的軟件，并與能量最小化相結(jié)合。對接軟件的例子包括DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3300-308(1995))。分子建模和操作軟件的例子包括AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用這些計算方法將嚴(yán)重限制本發(fā)明方法的信息吞吐量，這是由于進行必要的計算所需的處理時間導(dǎo)致的。但是可行的方式為，將這些方法作為‘二級篩選’以獲得關(guān)于通過本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)為‘陽性結(jié)合體’的肽的更精確的肽結(jié)合能計算值。用于復(fù)雜的分子機械或分子動力學(xué)計算的處理時間的限制性是由進行所述計算的軟件設(shè)計和目前計算機硬件技術(shù)的限制共同確定的。可以預(yù)期在將來，隨著編寫更高效的代碼和計算機處理器速度的不斷提高，在更易控制的時間框架內(nèi)進行上述計算是可行的。有關(guān)用于大分子的能量函數(shù)的其他信息和有關(guān)在折疊蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生的多種相互作用的考慮可參考下述文獻Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4187-217(1983)，有關(guān)蛋白-配體一般相互作用的信息參見Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)31-47(1988)，這些文獻均全文引入作為參考。其他有用的背景資料也可參見Fasman，G.D.編，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN0-306 4313-9。
權(quán)利要求
1.使用外周血單核細胞(PBMCs)對受試蛋白質(zhì)或其片段構(gòu)建T細胞表位圖譜的方法，其包括下列步驟(i)使用完整受試蛋白質(zhì)或合成肽進行體外抗原接觸，其中所述合成肽為代表性的并產(chǎn)生自所述受試蛋白質(zhì)或其片段的氨基酸序列，通過將合成肽與來自PBMC的T細胞孵育并培養(yǎng)；(ii)用細胞因子處理并培養(yǎng)已接觸抗原的T細胞；(iii)將已接觸抗原的T細胞加至自體的經(jīng)照射PBMCs，并進行與所述合成肽抗原的新一輪接觸和培養(yǎng)，以及(iv)通過事先選擇的時程法在T細胞增殖試驗中測定T細胞反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中包含T細胞的PBMCs分離自之前沒暴露于所述受試蛋白質(zhì)、其片段或肽抗原的多個不同健康個體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中PBMCs來自代表多于90％MHC II類庫的具有足夠免疫學(xué)多樣性的供體個體庫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中包含T細胞的PBMCs分離自其體內(nèi)已對受試蛋白質(zhì)或其片段建立了免疫反應(yīng)的患者個體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的方法，其中個體為人，且受試蛋白質(zhì)為人蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的方法，其中對受試蛋白質(zhì)的全長進行掃描，以獲得來自所選區(qū)域的具有一致預(yù)定大小并由至少3個氨基酸殘基構(gòu)成的重疊合成肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述重疊的合成肽包含9-15個氨基酸殘基。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述合成肽包含15個氨基酸殘基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項所述的方法，其中細胞因子為IL-2。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項所述的方法，其中時程法根據(jù)實施例3中所述實施。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項所述的方法，其中受試蛋白質(zhì)為治療性蛋白質(zhì)。
12.T細胞活化試驗，其包括權(quán)利要求1-11的任一方法。
13.權(quán)利要求12的T細胞活化試驗的用途，用于檢測弱免疫原性蛋白質(zhì)、多肽或肽。
14.用于制備來自親本分子的具有相同生物學(xué)活性的免疫原性經(jīng)修飾生物受試蛋白質(zhì)的方法，其中經(jīng)修飾的分子具有的氨基酸序列不同于所述親本分子的氨基酸序列，且當(dāng)其暴露于給定物種的免疫系統(tǒng)時顯示免疫原性低于親本分子；所述方法包括以下步驟(i)確定親本蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列；(ii)鑒定一個或多個潛在的T-細胞表位；(iii)通過在最初確定的T細胞表位序列中改變至少一個氨基酸殘基而設(shè)計新的序列變體，所述變體通過某種方式修飾，以實質(zhì)上降低或去除T細胞表位序列的活性或數(shù)量和/或能與來自所述生物分子的肽結(jié)合的MHC同種異型數(shù)量，它們分別通過所述肽與MHC分子的結(jié)合來確定，或通過肽-MHC復(fù)合物與T-細胞的結(jié)合來確定；(iv)通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建所述序列變體，并檢測所述變體以便鑒定一個或多個具有所需特性的變體；和(v)任選地重復(fù)步驟(ii)-(iv)，其特征在于根據(jù)步驟(ii)對T細胞表位序列的鑒定包括根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項所述的方法。
15.權(quán)利要求14的方法，其中鑒定步驟(ii)還包括通過計算方法計算MHC II類分子與每一所述樣本合成肽片段的結(jié)合分值，其中所述結(jié)合分值是通過將存在于所述樣本氨基酸殘基片段中的每一疏水氨基酸殘基側(cè)鏈所賦予的值相加，并選擇至少一個所述合成肽片段用于修飾。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所選擇的合成肽具有的免疫原性刺激指數(shù)(SI)大于2.0，其中SI通過用對所選擇肽測定的T細胞增殖分值除以對未與所述肽結(jié)合的細胞測定的分值。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任意一項所述的方法，其中經(jīng)修飾的受試蛋白質(zhì)具有的免疫原性刺激指數(shù)(SI)小于1.8。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于確定蛋白質(zhì)分子上可引起免疫反應(yīng)的決定簇和表位的篩選方法。具體而言，本發(fā)明涉及在治療性蛋白質(zhì)中鑒定T細胞表位。最后，本發(fā)明涉及這樣的組合方法，所述組合方法將使用表位繪制與由所述表位繪制法確定MHC II類配體并分別設(shè)計具有此類配體和表位的數(shù)量減少的序列類似物相一致。
文檔編號G01N33/68GK1659437SQ03813451
公開日2005年8月24日 申請日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月11日
發(fā)明者M·貝克, F·J·卡爾, G·卡特 申請人:默克專利有限公司