專利名稱：用于基質(zhì)輔助激光解吸/離子化的基質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于紫外線基質(zhì)-輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析的基質(zhì)，其由作為質(zhì)子受體的胺鹽和作為質(zhì)子供體的有機物質(zhì)組成，其中胺或有機物質(zhì)吸收紫外線；本發(fā)明還涉及這類基質(zhì)的應(yīng)用。
紫外線基質(zhì)-輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析通常簡寫為UV-MALDI-MS。
UV-MALDI-MS的分析原理基于從被分析物與紫外線吸收基質(zhì)物質(zhì)的共結(jié)晶內(nèi)分子(包括生物分子)的基質(zhì)-輔助激光解吸和離子化。此類紫外線吸收物質(zhì)也簡稱為MALDI基質(zhì)。
常見的MALDI基質(zhì)例如2，5-二羥基苯甲酸(DHB)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)和反-3，5-二甲氧基4-羥基肉桂酸(芥子酸)。
被分析物和基質(zhì)的共結(jié)晶例如通常受在金屬試樣夾上混合和干燥所述紫外線吸收基質(zhì)和被分析物的水合溶液的影響。所述共結(jié)晶物固相中產(chǎn)生的離子然后用質(zhì)譜分析儀檢測，其基于例如TOF、四極桿、離子捕集器、或FTICR原理、或這些技術(shù)的組合。
UV-MALDI-MS主要用于分子或生物分子的質(zhì)譜分析，例如碳水化合物、蛋白質(zhì)、縮氨酸、核苷酸、和類脂物包括其相應(yīng)的共軛物如糖蛋白、脂蛋白等。使用MALDI-MS分析對全細胞和微生物進行直接性能表征也是可行的。關(guān)于這一點可參見例如，Alomirah HF，Alli I，Konishi Y.的Applications of mass spectrometry to food proteins andpeptides，J.Chromatogr.A.2000 Sep 29；893(1)1-21.Review；和Kussmann M，Roepstorff P.Sample preparation techniques for peptidesand proteins analysed by MALDI-MS，Methods Mol.Biol.2000；146405-24；和Bonk T，Humney A.，MALDI-TOF MS analysis of Protein andDNA，Neuroscientist，2001，27(5)，465-72。
MALDI-MS方法有許多優(yōu)點。其中包括分析的高靈敏度(離析范圍為10-15至1018摩爾)、對不純物和各種緩沖物質(zhì)有高的容許誤差、簡單的樣品制備(“干燥液滴法”)、以及所述MALDI-MS分析原理可具有高的分析容量。
此外，可在MALDI靶子或MALDI試樣夾上使用酶，以便對用質(zhì)譜分析待研究和待檢測的物質(zhì)進行修飾。為此，可將酶的溶液、被分析物/培養(yǎng)基和中性原子、常規(guī)的MALDI基質(zhì)如ATT直接施加到MALDI靶子上。發(fā)生的酶促反應(yīng)然后通過反應(yīng)混合物的干燥和共結(jié)晶而終止。然后照常在實際的酶促反應(yīng)后用MALDI法對反應(yīng)產(chǎn)物進行分析?？商鎿Q地，酸性基質(zhì)如DHB可被加入到后來的反應(yīng)混合物中以結(jié)束酶促反應(yīng)。
但是，用固體基質(zhì)或固態(tài)被分析物制品進行MALDI-MS分析的顯著不足是，分析物從同一制品或同一樣品不同位置解吸的信號強度差別非常大。首先，該變化由于被分析物分子在干燥制品表面的分布不同；其次，導(dǎo)致這種結(jié)果的原因在于不同種類的物質(zhì)在被分析物/樣品和基質(zhì)的干燥共結(jié)晶物的晶格內(nèi)有不同的結(jié)合。目前，為了得到更均勻的結(jié)晶物已提出各種制備方法。例如包括薄層制備(Vorm O.，Roepstorf，P.，Mann M.，Anal.Chem.，64，1992，1879-1884)，作為晶核的基質(zhì)晶體薄層的制備，加入硝化纖維以及巖藻糖，以及將常規(guī)MALDI基質(zhì)例如DHB或CHCA溶解在甘油中(Sze ET，Chan TW，Wang G.Formulation of matrix solutions for use in matrix-assisted laserdesorption/ionisation of biomolecules.J.Am.Soc.Mass.Spectrom.1998Feb；9(2)166-74).但是，這些最優(yōu)化的方法往往僅能解決與MALDI-MS分析法相關(guān)的某些問題。
由有機酸胺鹽組成的離子液體已被提出作為用于MALDI-MS的基質(zhì)，參見D.W.Armstrong et al.，Anal.Chem.2001，73，3679-3686。這涉及各種肉桂酸衍生物的胺鹽或從氨基喹啉和CHCA得到的胺鹽(Kolli VSK，Orlando R，Rapid Commun.Mass Spectrom.1996，10923-926)。
本發(fā)明的目的是提供用于UV-MALDI-MS的改進的基質(zhì)，通過所述UV-MALDI-MS法可獲得沒有誤差且可再現(xiàn)的分析值，其中特別地可將單純的質(zhì)譜分析與從酶促反應(yīng)/改性得到的附加結(jié)果結(jié)合起來，并能進行檢測。
本發(fā)明的該目的可通過使用權(quán)利要求1～4中教導(dǎo)的基質(zhì)來實現(xiàn)，也可通過使用根據(jù)所述權(quán)利要求中教導(dǎo)的離子型液態(tài)基質(zhì)來實現(xiàn)。
本發(fā)明的對象包括新型基質(zhì)，即離子型液態(tài)基質(zhì)，從而基質(zhì)在室溫下為液態(tài)。這些基質(zhì)由作為質(zhì)子受體的胺鹽和作為質(zhì)子給體的有機物質(zhì)制備而成，其中或胺鹽或有機物質(zhì)可吸收紫外線。所述胺為3-氨基喹啉；吡啶；伯胺，其上的氮原子可連接苯基、或直鏈或支鏈的飽和C1-C11烷基，且這些基團可用羥基取代；仲胺或叔胺，其上的N原子可連接兩個或三個可相同或不同可為直鏈或支鏈且可用羥基取代的飽和C1-C8烷基，和苯基；咪唑；C和/或N烷基化的咪唑衍生物。
所述C1-C8烷基可具有1、2、3、4、5、6、7或8個碳原子，伯胺中的C1-C11烷基可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個碳原子。
因此本發(fā)明的所用胺包括·伯胺，其上的氮原子可連接可用羥基取代的甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基、異丁基、正戊基、異戊基、正己基、異己基、正-庚基、異庚基、正-辛基、異辛基、正-壬基、異壬基、正-癸基、異癸基、正-十一烷基、或異十一烷基，和苯基。
·仲胺或叔胺，其上的氮原子可連接兩個或三個基團，這些基團可相同或不同且選自可被OH取代的甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基、異丁基、正戊基、異戊基、正己基、異己基、正-庚基、異庚基、正-辛基和異辛基，和苯基。
·3-氨基喹啉、吡啶、咪唑、和C和/或氮烷基化的咪唑衍生物，其中烷基基團可相同或不同，特別地具有1、2、3、4、5、或6個碳原子。
上述引用的異基基團包括所有可能的異構(gòu)體。
上述有機物是2，5-二羥基苯甲酸及其異構(gòu)體(特別是2，6-二羥基苯甲酸)、2-羥基-5-甲氧基苯甲酸及其異構(gòu)體、吡啶羧酸、3-羥基吡啶羧酸、煙酸、5-氯-2-巰基苯并噻唑、6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶、三氟甲烷磺酸酯、2′，4′，6′-三羥基苯乙酮一水合物、2′，6′-二羥基-苯乙酮、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、地蒽酚、反-3-吲哚丙烯酸、脎、阿魏酸、2，5-二羥基苯乙酮、1-硝基咔唑、7-氨基-4-甲基香豆素、2-(對-羥基苯氮雜)-苯甲酸、8-氨基芘-2，3，4-三磺酸、2[2E-3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙-2-亞基]丙二腈(DCTB)、4-甲氧基-3-羥基肉桂酸和3，4-二羥基肉桂酸。以及上述各種有機物的異構(gòu)體、其他有機物的異構(gòu)體、特別是位置異構(gòu)物均可被使用，只要它們能夠與胺形成離子型液體，下面將更詳細地解釋。因此，本申請要求保護在室溫下為離子型液體的基質(zhì)。該離子型液體由前述作為質(zhì)子受體的胺和前述作為質(zhì)子給體的有機物質(zhì)發(fā)生酸堿反應(yīng)而得到的。
所述胺優(yōu)選為苯胺、乙醇胺、乙胺、正丁胺、N，N-二乙胺、N，N-二乙苯胺、N，N-二乙基甲胺、N，N-二甲胺、三乙胺、三-正丙胺、三正丁胺、3-氨基喹啉和吡啶。
優(yōu)選的新型基質(zhì)是2，5-二羥基苯甲酸-丁胺和2-羥基-5-甲氧基苯甲酸-丁胺。
新型基質(zhì)可通過作為質(zhì)子受體的上述胺與作為質(zhì)子給體的前述有機物按摩爾比為0.5∶1-1∶0.5、優(yōu)選等量摩爾比進行反應(yīng)得到，例如將此兩反應(yīng)物接觸。若只有一種反應(yīng)物是液態(tài)，那么固體反應(yīng)物可以被加到液體反應(yīng)物中，反之亦然。若為兩種反應(yīng)物均為液態(tài)，那么可一同加入。但是優(yōu)選使兩種反應(yīng)物在溶劑中相互接觸，該溶劑可在反應(yīng)后除去，優(yōu)選通過將溶劑餾出、特別地在真空下除去。若在該反應(yīng)中或在除去溶劑后得到液態(tài)反應(yīng)產(chǎn)物，那么這些物質(zhì)便為本發(fā)明的離子型液體或基質(zhì)。
那么這可通過簡單的實驗直接證明在室溫下是否可通過上述胺作為質(zhì)子受體和有機物作為質(zhì)子給體進行反應(yīng)制備離子型液體。若能，那么便是本發(fā)明的基質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目的是新型基質(zhì)以及由作為質(zhì)子受體的胺鹽和肉桂酸或肉桂酸衍生物組成的離子型液體形式的已知基質(zhì)的應(yīng)用，所述胺的氮原子可連接一個、兩個或三個可被OH取代的甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基[或]異丁基，和/或苯基；吡啶或3-氨基-喹啉，基質(zhì)作為與(生物)高分子進行反應(yīng)，和檢測這些反應(yīng)，以及通過紫外線基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析法來分析反應(yīng)產(chǎn)物的介質(zhì)。
描述這些已知液態(tài)基質(zhì)的文獻在上述已經(jīng)提及，即D.W.Armstrong等在Anal.Chem.2001，73，3679-3686中所述。
在本申請的上下文中，新型基質(zhì)和已知基質(zhì)均為本發(fā)明的基質(zhì)。
由于本發(fā)明的基質(zhì)是液體，那么在該基質(zhì)中的分析物可均勻分布。因此不會產(chǎn)生上述固態(tài)基質(zhì)中存在的問題。例如在制品中的不同點不會發(fā)生不同分析物的分聚。因此，使用液態(tài)基質(zhì)的UV-MALDI-MS法也可進行定量分析，這迄今為止只在幾個例外的情況才可行，例如通過使用痕量示蹤內(nèi)標法。
使用離子型液體的另外一個優(yōu)點在于基質(zhì)/分析物的混合物不需要被干燥。從而節(jié)省了樣品制備的時間。
但是，為了降低離子型基質(zhì)的粘性，使其更加易于處理如被吸液處理，也可將本發(fā)明的基質(zhì)或本發(fā)明的離子型液體與溶劑一起使用，例如乙醇、異丙醇以及長鏈醇和乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和四氫呋喃。另外，通過使用所述溶劑，被分析物在基質(zhì)中的溶解性被改善。
本發(fā)明的基質(zhì)可毫無疑問地用在現(xiàn)有的UV-MALDI質(zhì)譜儀中，其例如可安裝有N2激光器。
另外，使用液體基質(zhì)也可進行分子廣譜分析。這包括工業(yè)聚合物和生物聚合物如碳水化合物，例如寡糖類、蛋白質(zhì)、縮氨酸、類脂物、核酸、次級代謝產(chǎn)物、藥物及其共軛物，如糖共軛物(glococonjugates)和酯共軛物(lipoconjugates)以及二次培養(yǎng)代謝產(chǎn)物(例如類黃酮，包括大分子單寧(procyanidines)等)。
另外，本發(fā)明的基質(zhì)也可用來研究包括動力學(xué)在內(nèi)的反應(yīng)的進程和過程，而在任何一點都沒有必要停止反應(yīng)。例如其可用在被酶催化的反應(yīng)中，尤其是糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶或裂解酶催化的反應(yīng)。因此尤其可研究使用蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶)分解縮氨酸/蛋白質(zhì)、使用糖苷酶(如巖藻糖苷酶、唾液酸酶、牛乳糖、己糖胺酶、果膠酶、裂解酶)分解碳水化合物和甘油共軛物，以及類脂物(三酸甘油酯、磷脂、糖脂)和核酸(脫氧核糖核酸、核糖核酸)的分解。另外，隨后可通過轉(zhuǎn)移酶例如轉(zhuǎn)糖苷酶在MALDI基質(zhì)中進行合成反應(yīng)。
高濃度的被分析物可不稀釋而直接制備和測量。另外，也可同步檢測具有較低解吸依賴性差異的不同分析物。
這也可應(yīng)用于不同物質(zhì)種類的被分析物，其可具有不同的物理和化學(xué)性質(zhì)。
使用液態(tài)基質(zhì)也可分析不穩(wěn)定的被分析物。不受該解釋限制，假設(shè)由于被分析物進入液體的氣相不是晶格，那么液態(tài)基質(zhì)的解吸將更加溫和。
由于本發(fā)明基質(zhì)的pH值接近于非鍵合絡(luò)合物和酸不穩(wěn)定分子的生理值，因此也可測量這類被分析物。
另外，液態(tài)基質(zhì)也可將分析與制備色譜技術(shù)聯(lián)合使用，如HPLC、GPC和HPAEC與MALDI-MS聯(lián)合。因此，例如在大氣壓MALDI模式下，基質(zhì)和柱洗脫液可在原料中或在此之前混和。在離線MALDI分析中，適當(dāng)?shù)淖詣尤訖C可將柱中洗脫液和液態(tài)基質(zhì)平行地施加到靶子上，從而可通過使用高效色譜分離的“表達”不斷確保分析改進。
與聯(lián)合LC相同，紫外線基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜還可與電泳技術(shù)(如FFE、PAGE或CE技術(shù))聯(lián)合使用，任選借助于自動取樣機、或結(jié)合/聯(lián)合(微)制備/分離技術(shù)，特別是μTAS、GYROS和Lab-on-Chip技術(shù)。
本發(fā)明的另一個目的是方法權(quán)利要求所教導(dǎo)的方法。
本發(fā)明可根據(jù)實施例中的優(yōu)選實施方式得到更詳細的說明。原理上講，本發(fā)明的基質(zhì)可通過加入等摩爾比的作為質(zhì)子受體的胺和作為質(zhì)子給體的有機物來制備，其中胺或有機物質(zhì)吸收UV光線。反應(yīng)在室溫下進行。可獲得離子型液體或液態(tài)鹽，其在高真空下通常是穩(wěn)定的，且可用作UV-MALDI基質(zhì)。
實施例12，5-二羥基苯甲酸-丁胺(DHB-Bu)的制備將308.4毫克的2，5-二羥基苯甲酸(DHB)溶解在10毫升乙醇中。然后加入198.4μl的丁胺(Bu)。
在約40℃和約43毫巴的條件下將溶劑蒸餾出，直到體積不再減少(約30分鐘)。得到DHB-Bu的最終體積約為200μl。
實施例25-甲氧基水楊酸-丁胺(MSA-Bu)的制備將336.4毫克的5-甲氧基水楊酸(MSA；也稱為2-羥基-5-甲氧基苯甲酸)溶于10毫升乙醇。向其中加入198.4μl丁胺(Bu)。按照實施例1的條件進行實驗?？傻玫郊s200μl的MSA-丁胺(MSA-Bu)。
混合丁胺-DHB和丁胺-MSA(10∶1)(體積/體積)，可得到丁胺-DHBS。
實施例3α-氰基-4-羥基肉桂酸-丁胺(CHCA-Bu)的制備將378.4毫克的α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)溶于10毫升甲醇。然后加入198.4μl丁胺(Bu)。按照實施例1的方式進行操作?？傻玫?00μl的α-氰基-4-羥基肉桂酸-丁胺(CHCA-Bu)。
實施例4芥子酸-三乙胺的制備將378.4毫克芥子酸(反-3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸)溶解在10毫升乙醇中。然后加入278.4μl的三乙胺。按照實施例1進行實驗?？傻玫?00μl的芥子酸-三乙胺。
實施例56-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶-丁胺(ATT-Bu)的制備將286.4毫克的6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)溶于10毫升乙醇。然后加入198.4μl的丁胺(Bu)。
在約40℃和約43毫巴的條件下將溶劑餾出，直到體積不再減少(約30分鐘)。得到的ATT-Bu的最終體積為約200μl。
實施例62’，4’，6’-三羥基乙酰苯酮一水合物-丁胺(THAP-丁胺)的制備將372.4毫克的2’，4’，6’-三羥基乙酰苯酮一水合物(THAP)溶于10毫升乙醇。然后加入198.4μl的丁胺(Bu)在約40℃和約43毫巴的條件下將溶劑餾出，直到體積不再減少(約30分鐘)。得到的ATT-Bu的最終體積為約200μl。
為了降低得到的離子型基質(zhì)的粘度，可在各種情況下用溶劑進行稀釋，例如用純醇以1/1的體積比進行稀釋，從而便于取樣。
實施例7基質(zhì)被分析物樣品可通過如下常規(guī)步驟來制備1.在MALDI(不銹鋼靶子)上將1μl的液態(tài)離子型基質(zhì)A(未稀釋或以1∶1(體積比)在乙醇或溶劑B中)與1μl的被分析物在適當(dāng)溶劑中D混合。
2.可選擇地，用步驟1進行樣品制備，但該步驟也可在被分析物的預(yù)脫鹽之后進行，其中的預(yù)脫鹽通過在冠醚或離子交換劑按1∶1(體積)的稀釋液中進行培養(yǎng)而實現(xiàn)。
3.帶有預(yù)混合樣品的所述MALDI樣板被直接轉(zhuǎn)移到MALDI高真空中。然后進行MALDI-MS分析。
對于基質(zhì)A，此處描述的所有離子型液體均適用，特別是如下物質(zhì)丁胺-CHCA、丁胺-DHB、丁胺-MSA、丁胺-DHBS、和三乙胺-芥子酸。
對于溶劑B，可使用下列物質(zhì)丙酮、乙腈、甲醇(MetOH)、乙醇(EtOH)、丁醇、異丙醇、氯仿和水。
分析物C可為下列物質(zhì)1.工業(yè)聚合物(例如PEG、聚丙烯酰胺、聚乙烯)；2.碳水化合物(如均聚物和雜聚物組分的單糖、二糖、三糖、低聚糖和多聚糖)；3.蛋白質(zhì)和縮氨酸；4.類脂物；5.上述被分析物的共軛物；6.單、雙、三、寡和多核苷酸；7.二次培養(yǎng)代謝產(chǎn)物(苯酚類物質(zhì)、類黃酮等)；8.在高真空下不能揮發(fā)的原子(例如堿金屬和堿土金屬(比如Na、K、Ca、Mg)，金屬(比如Fe、Zn、Sn、Cu、Cr等)可用下列物質(zhì)作為溶劑D10-80％的甲醇、乙醇、水、丙酮、乙腈、異丙醇、丁醇、氯仿、二甲基亞砜(DMSO)、DMF、甘油、和四氫呋喃的水溶液或酸化溶液。
這些溶液可用如0.1-5％的三氟乙酸(TFA)、乙酸或蟻酸來酸化。
實施例82，6-二羥基苯甲酸-丁胺(2，6-DHB-Bu)的制備
將308.4毫克的2，6-二羥基苯甲酸(DHB)溶解在10毫升乙醇中。然后加入198.4μl丁胺(Bu)。
在約40℃和約43毫巴的條件下將溶劑餾出，直到體積不再減少(約30分鐘)。得到的2，6-DHB-Bu的最終體積約為200μl。
實施例92，5-二羥基苯甲酸-1-己基-3-甲基咪唑(DHB-HMIM)的制備將308.4毫克的2，5-二羥基苯甲酸(DHB)溶解在10毫升乙醇中。然后加入371.4毫克的1-己基-3-甲基咪唑(HMIM)。
在約40℃和約43毫巴的條件下將溶劑餾出，直到體積不再減少(約30分鐘)。得到的DHB-HMIM的最終體積為約200μl。
實施例103-氨基喹啉三氟甲烷磺酸酯(AC-triflate)的制備將288.4毫克的3-氨基喹啉(AC)溶于10毫升乙醇。然后加入298.2毫克的三氟甲烷磺酸酯。
在約40℃和約43毫巴的條件下將溶劑餾出，直到體積不再減少(約30分鐘)。得到的3-氨基喹啉三氟甲烷磺酸酯的最終體積為約200μl。
在該基質(zhì)中，3-氨基喹啉和胺或質(zhì)子受體是能夠吸收紫外線的化合物，但是在其他實施例中胺不能吸收紫外線，而作為質(zhì)子給體的有機物吸收紫外線。
實施例11在上述基質(zhì)中可進行(生物)聚合體的反應(yīng)，特別是進行酶促反應(yīng)。其中，所述基質(zhì)也作為介質(zhì)或“反應(yīng)容器”。反應(yīng)過程可隨后直接連續(xù)地進行質(zhì)譜分析。
對于相應(yīng)產(chǎn)品的制備，可使用如下方法(常規(guī)方法)在MALDI樣品板上，將0.5μl的液態(tài)基質(zhì)A(未稀釋、或在乙醇或另一種適當(dāng)溶劑中以1∶1(v/v)稀釋)與0.5μl適當(dāng)溶劑/緩沖液C中的酶B(約1μg/μl)、及0.5μl適當(dāng)溶劑/緩沖液中的培養(yǎng)基D均勻混合。然后MALDI樣板連同在離子型液態(tài)MALDI基質(zhì)中的預(yù)混酶反應(yīng)混合物直接轉(zhuǎn)移到MALDI高真空中。
對于基質(zhì)A，可使用實施例7中提及的那些。
對于酶B，可使用下列種類的酶水解酶、異構(gòu)酶、裂解酶、轉(zhuǎn)移酶、氧化還原酶和連接酶。
對于溶劑/緩沖液C，可使用下列物質(zhì)水、碳酸鹽緩沖液、乙酸銨緩沖液、三羥基甲基氨基甲烷緩沖液、或其他適當(dāng)且與MS-相容的緩沖體系或溶劑。
在最終的基質(zhì)-酶-酶作用物溶液中所述酶/酶作用物的比例為1∶1～1∶300(重量比)或更高。
使用例子·從人乳進行三糖的脫唾液酸酶作用(Desialisation)在MALDI樣品板上，將在25mM、PH為5.0的乙酸胺緩沖溶液中從牛腎臟提取的唾液酸酶(濃度為1μg/μl(約0.1mU/μl))0.5μl與水中濃度為1μg/μl的sialyllactose 0.5μl、及0.5μl的DHB-Bu(以體積比為1∶1在乙醇中)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·從人乳中進行五糖的脫巖藻糖苷酶作用(defucosylation)在MALDI樣品板上，將在25mM、PH為5.0的乙酸胺緩沖溶液中從牛腎臟提取的濃度為1μg/μl(約2mU/μl)的α-巖藻糖苷酶0.5μl和水中濃度為1μg/μl的LNFP 0.5μl、以及0.5μlDHB-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·糖蛋白的脫糖基化在MALDI樣品板上，將在20mM、PH為7.5的三羥基甲基氨基甲烷緩沖溶液中從病原腦膜炎膿毒性黃桿菌提取的濃度為1μg/μl(約0.5U/μl)的PNGase F 0.5μl和水中濃度為1μg/μl的RNAseB 0.5μl、以及1μl CHCA-Bu或DHB-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·人酪蛋白的酶催化水解在MALDI樣品板上，將用TPCK從牛胰腺中提取濃度為0.01-1μg/μl(約0.074-7.4U/μl)的胰島素0.5μl與在12.5mM、PH為7.6的咪唑緩沖溶液中濃度為1μg/μl的β-干酪素0.5μl、以及1μl CHCA-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·用于分析縮氨酸序列的羧肽酶消化作用在MALDI樣品板上，將從釀酒酵母中提取的濃度為0.2μg/μl(約20U/μl)的羧肽酶0.5μl與在60mM、PH為5的檸檬酸氫二氨鹽緩沖溶液中濃度為0.1-11μg/μl的縮氨酸0.5μl、以及1μl CHCA-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·用于分析縮氨酸序列的氨基肽酶消化作用在MALDI樣品板上，將從氣單胞菌屬Protolytica提取的濃度為0.2μg/μl(約20mU/μl)的氨基肽酶0.5μl與在三(羥甲基)甲基甘氨酸、PH為8的ZnCl2溶液中濃度為0.1-11μg/μl的縮氨酸0.5μl、以及1μl CHCA-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·磷糖蛋白的脫磷作用在MALDI樣品板上，將從馬鈴薯中提取的濃度為0.01-1μg/μl(約0.02-2U/μl)的磷酸(酯)酶0.5μl與在25ml、PH為5的乙酸氨緩沖溶液中濃度為1μg/μl的β-干酪素0.5μl、以及1μl CHCA-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·磷脂的脫磷作用在MALDI樣品板上，將從蜂蜜中提取的濃度為0.01μg/μl(約10mU/μl)磷酯酶0.5μl與在MetOH/CHCl3(2∶1)中濃度為1μg/μl的卵磷脂雙十七烷酰、以及1μl DHB-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·醣脂類/神經(jīng)節(jié)苷脂的脫糖基化作用在MALDI樣品板上，混和下列物質(zhì)在20mM、PH為7.0的三羥基甲基氨基甲烷緩沖液中從Marobdella decora中提取的濃度為1μg/μl(約10mU/μl)的神經(jīng)酰胺麥芽糖糊精酶0.5μl，在水中的牛神經(jīng)節(jié)苷脂GM1(濃度1μg/μl)0.5μl，以及1μl CHCA-Bu或DHB-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
·寡核苷酸的序列化在MALDI樣品板上，將在20mM、PH為8.0的三羥基甲基氨基甲烷緩沖溶液中從Crotalus Adamanteus毒素中提取的濃度約1mU/μl的神經(jīng)磷酸二酯酶I 0.5μl、與在水中濃度為1μg/μl的寡核苷酸0.5μl、以及1μl CHCA-Bu(在乙醇中體積比為1∶1)混合，并直接轉(zhuǎn)移到MALDI-MS高真空中。
在例如0、5、10、20、30、60和120分鐘后記錄MALDI-MS光譜。必要時，可將MS分析延長到混合物樣品制備幾天之后。
在上所述的方式中，例如培養(yǎng)基或反應(yīng)產(chǎn)物的簡單過濾也是可行的。因此僅在一種樣品板上使用一種酶便可孵化數(shù)百種不同的培養(yǎng)基。因此僅有最小量的酶和培養(yǎng)基(0.5μl在例如濃度1μl/μl時)是必需的。用質(zhì)譜分析法例如可在真空中進行動力學(xué)研究。利用現(xiàn)有的自動測量方法，該應(yīng)用在自動化和費用節(jié)省方面具有非常大的潛力。
例如其應(yīng)用在利用唾液酸酶在DHB-Bu中進行sialyllactose的脫唾液酶作用(disialisation)，以及在DHB-Bu中使用PNGaseF進行糖肽類抗生素/糖蛋白的脫糖基化。
此外，上述基質(zhì)可于LC-MALDI-MS聯(lián)合使用，或用在電泳-MALDI-MS(PAGE，CE，F(xiàn)FE)中。也可與(微)制備/分離法的聯(lián)合使用，尤其是與μTAS、GYROS和Lab-on-Chip法的聯(lián)合使用。
權(quán)利要求
1.一種用于紫外線基質(zhì)-輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析法的基質(zhì)，其由反應(yīng)作為質(zhì)子受體的胺鹽和反應(yīng)作為質(zhì)子供體的有機物質(zhì)制備而成，其中所述的胺或有機物質(zhì)吸收紫外線，其特征在于所述基質(zhì)在室溫下為離子性液體，所述胺選自3-氨基喹啉；吡啶；其上的氮原子可連接苯基、或直鏈或支鏈的且可被OH基團取代的飽和C1-C11烷基的伯胺；仲胺和叔胺，其上的氮原子可連接兩個或三個可相同或不同、可為直鏈或支鏈且可被OH基團取代的飽和C1-C8烷基，和苯基；咪唑和C和/或N烷基化咪唑衍生物；和有機物選自以下物質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸及其異構(gòu)體、2-羥基-5-甲氧基苯甲酸及其異構(gòu)體、吡啶甲酸、3-羥基吡啶甲酸、煙酸、5-氯-2-巰基苯并噻唑、6-氮雜-2-硫代-胸腺嘧啶、2′，4′，6′-三羥基苯乙酮一水合物、2′，6′-二羥基-苯乙酮、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、1，8，9-蒽三酚、反-3-吲哚丙烯酸、脎、阿魏酸、2，5-二羥基苯乙酮、1-硝基咔唑、7-氨基-4-甲基香豆素、2-(對-羥基苯氮雜)-苯甲酸、8-氨基芘-2，3，4-三磺酸、2[2E-3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙-2-亞烯基]丙二腈(DCTB)、4-甲氧基-3-羥基肉桂酸、三氟甲烷磺酸酯和3，4-二羥基肉桂酸。
2.如權(quán)利要求1的基質(zhì)，其特征在于胺為苯胺、乙醇胺、乙胺、正丁胺、N，N-二乙胺、N，N-二乙苯胺、N，N-二乙基甲胺、N，N-二甲胺、三乙胺、三-正丙胺、三正丁胺、3-氨基喹啉和吡啶。
3.如權(quán)利要求1或2的基質(zhì)，其特征在于所述基質(zhì)為2，5-二羥基苯甲酸-丁胺和2-羥基-5-甲氧基苯甲酸-丁胺。
4.如前述任一項權(quán)利要求的基質(zhì)，其特征在于用溶劑對其進行處理。
5.前述任一項權(quán)利要求的離子型液態(tài)基質(zhì)在紫外線基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析中的應(yīng)用，特別是在定性或定量紫外線基質(zhì)-輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析中的應(yīng)用。
6.前述權(quán)利要求1-4中任一項的離子型液態(tài)基質(zhì)的應(yīng)用，以及在室溫下為離子型液體的液態(tài)基質(zhì)的應(yīng)用，其中基質(zhì)由反應(yīng)作為質(zhì)子受體的胺鹽，和肉桂酸或肉桂酸的衍生物組成，所述的胺是其上的氮原子可連接一個、兩個或三個以下基團取代的胺甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基或異丁基，這些基團又可被羥基取代，和/或苯基，3-氨基喹啉或吡啶，其作為與(生物)聚合物反應(yīng)、檢測這些反應(yīng)、以及通過紫外線基質(zhì)-輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析法對制備的物質(zhì)進行分析的介質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)可被酶催化，尤其是被糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶或裂解酶催化的反應(yīng)，且(生物)聚合物為縮氨酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、類脂物、核酸、次級代謝產(chǎn)物和其藥物或共軛物。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項的應(yīng)用，其特征在于紫外線基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜可與分析或制備液相色譜結(jié)合，特別是HPLC、GPC和HPAEC；電泳技術(shù)，特別是CE、CEC、PAGE、和FFE；或(微)制備/分離技術(shù)，特別是μTAS、GYROS和Lab-on-Chip聯(lián)合使用。
9.一種與(生物)聚合物進行反應(yīng)、檢測這些反應(yīng)以及分析其中形成的反應(yīng)產(chǎn)物的方法，其中特別地這些反應(yīng)可用酶催化，優(yōu)選糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶或裂解酶催化，其特征在于這些反應(yīng)在前述任一項權(quán)利要求1-4中的離子型液體基質(zhì)中進行、或在由反應(yīng)作為質(zhì)子受體的胺鹽和肉桂酸或肉桂酸衍生物組成的離子型液態(tài)基質(zhì)中進行，所述的胺是其N原子上可連接一個、二個或三個以下基團的胺甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基或異丁基，該基團又可被OH和/或苯基取代；3-氨基喹啉或吡啶，該反應(yīng)可通過紫外線基質(zhì)-輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析法進行檢測。
10.如權(quán)利要求9的方法，其特征在于紫外線基質(zhì)-輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分可與分析或制備液體色譜結(jié)合，特別是HPLC、GPC和HPAEC；電泳技術(shù)，特別是CE、CEC、PAGE、和FFE；或(微)制備/分離技術(shù)，特別是μTAS、GYROS和Lab-on-Chip聯(lián)合使用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于紫外線基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析的基質(zhì)，其由反應(yīng)作為質(zhì)子受體的胺鹽和反應(yīng)作為質(zhì)子給體的有機物質(zhì)組成，其中胺或有機物質(zhì)吸收紫外線。這些基質(zhì)的特征在于所述基質(zhì)在室溫下為離子型液體，所述胺選自3－氨基喹啉；吡啶；伯胺，其上的氮原子可連接苯基殘基、或直鏈或支鏈可被OH基團取代的飽和C
文檔編號G01N33/68GK1675554SQ03819761
公開日2005年9月28日 申請日期2003年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月19日
發(fā)明者貝恩德·施塔爾, 京特·伯姆, 馬爾科·曼科 申請人:N·V·努特里西阿