專利名稱：利用使用甲化合物的氧化還原反應(yīng)的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用氧化還原反應(yīng)測定試樣中的待測物的方法。
背景技術(shù)：
此前，例如，利用氧化還原反應(yīng)測定試樣中的待測物的量的方法已廣泛被采用。例如，也適用于生化分析和臨床檢查等的糖化蛋白質(zhì)的測定。
例如，血液中的糖化蛋白質(zhì)，特別是紅細(xì)胞中的糖化血紅蛋白(HbAlc)，由于反映了生物中血糖值的過去的情況，因此被作為糖尿病的診斷和治療等的重要指標(biāo)。例如，紅細(xì)胞中的糖化蛋白質(zhì)可利用氧化還原反應(yīng)如以下所述進(jìn)行測定。
首先，配制使紅細(xì)胞溶血的試樣，用適當(dāng)?shù)牡鞍酌傅葘υ撊苎嚇舆M(jìn)行處理后，再用果糖基氨基酸氧化酶(以下稱作FAOD)處理，使過氧化氫生成。該過氧化氫量對應(yīng)于紅細(xì)胞中的糖化蛋白質(zhì)量。然后，在該反應(yīng)溶液中再添加過氧化物酶(以下稱作POD)和還原劑，上述POD作為催化劑引起上述過氧化氫和上述還原劑之間的氧化還原反應(yīng)。此時，作為上述還原劑，如果采用因氧化而顯色的還原劑，則可通過測定其顯色來測定上述過氧化氫量，結(jié)果可知紅細(xì)胞中的糖化蛋白質(zhì)量。
然而，在血液中通常存在抗壞血酸(AsA)、膽紅素等各種還原物質(zhì)，紅細(xì)胞中還存在谷胱甘肽(GSH)等各種還原物質(zhì)。由于這些還原物質(zhì)既可使上述過氧化氫還原，又阻礙上述氧化還原反應(yīng)，能把上述還原劑顯色后還原而使其褪色。因此，存在的問題是難以準(zhǔn)確測定紅細(xì)胞中的糖化蛋白質(zhì)量。
另外，由于各種試樣含有的還原物質(zhì)的濃度也不一定，所以還存在測定精度差的問題。
為了避免這些問題，例如有在上述試樣中添加各種氧化劑的方法。例如，特開昭56-151358號公報中公開了采用碘酸、過碘酸等鹵氧化物作為氧化劑的方法；特開昭57-13357號公報、特開昭57-161650號公報、特開昭59-193354號公報、特開昭62-169053號公報、特開平3-30697號公報中公開了采用鈷、鐵、鈰等金屬配合物作為氧化劑的方法。
然而，即使使用這些氧化劑的場合，也不能充分避免對上述測定的影響，特別是，待測物為紅細(xì)胞內(nèi)成分時，上述氧化劑效果差。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供利用氧化還原反應(yīng)測定試樣中的待測物的方法，該測定方法可得到可靠性優(yōu)良的測定值。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的測定方法是利用氧化還原反應(yīng)測定試樣中的待測物的方法，其特征在于，通過甲化合物排除上述試樣中的還原物質(zhì)的影響。再者，本發(fā)明中，甲化合物是指具有甲(H2NN＝CHN＝NH)骨架的甲的取代化合物。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用現(xiàn)有的方法時，雖然排除了上述GSH和AsA那樣的低分子量還原物質(zhì)的影響，但不能排除蛋白質(zhì)等那樣的高分子量還原物質(zhì)的影響。因此，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用上述甲化合物，與現(xiàn)有的氧化劑不同，不僅能排除與上述低分子量還原物質(zhì)等同樣的還原型物質(zhì)的影響，例如，也能排除血紅蛋白及血紅蛋白分解物(以下將兩者合稱為“血紅蛋白”)的影響，從而完成了本發(fā)明的測定方法。這樣，本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，通過還原型物質(zhì)甲化合物可以排除上述那樣的高分子量還原物質(zhì)的影響。按照本發(fā)明的測定方法，由于可以更可靠地求出待測物的量，所以，例如，在臨床醫(yī)療等的各種檢查中有用。再者，推測還原物質(zhì)甲化合物排除試樣中的還原物質(zhì)對測定系統(tǒng)的影響，是由于與現(xiàn)有的氧化劑不同的機(jī)理。另外，由于該甲化合物非常穩(wěn)定，因此氧化還原反應(yīng)也不受甲化合物的影響。
本發(fā)明的測定方法中，優(yōu)選在上述氧化還原反應(yīng)之前，在上述試樣中添加甲化合物以排除上述試樣中所含的還原物質(zhì)的影響，然后，使來自上述待測物的還原物質(zhì)或氧化物質(zhì)生成，利用上述氧化還原反應(yīng)測定其量，由該測定值確定上述待測物的量。
本發(fā)明的測定方法中，上述甲化合物例如可以用下述式(1)表示，甲骨架的至少1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子上可以具有取代基(R1、R2及R3)。下述式(1)中，作為R1、R2及R3，可以為氫或以下所示的取代基。
R1N＝N-C(R2)＝N-NHR3…(1)作為上述甲化合物，例如優(yōu)選在甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子的至少兩處具有環(huán)結(jié)構(gòu)的取代基(環(huán)結(jié)構(gòu)取代基)，更加優(yōu)選在三處都具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基。
如上所述，當(dāng)上述甲化合物至少在兩處具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基時，優(yōu)選在1位的氮原子及5位的氮原子上具有上述取代基。另外，當(dāng)甲化合物在三處具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基時，優(yōu)選在1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子上具有上述取代基。
上述甲化合物優(yōu)選至少兩個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)。另外，作為環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)以外的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，例如有在環(huán)骨架中含有S或O，并且是共振結(jié)構(gòu)的取代基，例如，噻吩基、噻唑基等。
上述甲化合物優(yōu)選在甲骨架的至少1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子上具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，上述環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的至少兩個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)。
上述甲化合物優(yōu)選至少一個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基具有官能團(tuán)，更加優(yōu)選具有多個上述官能團(tuán)。
作為上述官能團(tuán)，優(yōu)選為吸電子性官能團(tuán)，例如有鹵素基、醚基、酯基、羧基、?；喯趸?、硝基、羥基、磺基等。其他，除上述官能團(tuán)以外，例如還可舉出，氫過氧基、氧基(oxy)、環(huán)氧基、環(huán)二氧基、氧代基(oxo)等含氧的特性基及巰基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代基、亞磺基、苯磺?；?benzene sulfonyl)、苯基磺?；?phenylsulfonyl)、對甲苯磺?；?p-toluenesulfonyl)、對甲苯基磺?；?p-tolylsulfonyl)、對甲苯磺?；?tosyl)、氨磺?；?、異硫氰酸酯基等含硫的特性基等。這些吸電子性官能團(tuán)中，優(yōu)選硝基、磺基、鹵素基、羧基、羥基、甲氧基、乙氧基。另外，除了上述吸電子性官能團(tuán)外，例如還有苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不飽和烴基等。再者，上述官能團(tuán)也可以通過離解而離子化。
上述甲化合物優(yōu)選在甲骨架的1位的氮原子及5位的氮原子上具有苯環(huán)(苯基)，上述兩苯環(huán)(苯基)中的至少一個具有選自鹵素基、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基及乙氧基的至少一個官能團(tuán)。再者，上述兩個苯環(huán)(苯基)具有上述官能團(tuán)也可以。上述苯環(huán)(苯基)中，在任一位置(鄰位、間位、對位)上有上述官能團(tuán)也可以。另外，對官能團(tuán)的數(shù)目沒有特別限制，可以具有相同的官能團(tuán)，也可以具有不同的官能團(tuán)。
甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子上具有環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的甲化合物，例如可以舉出以下化合物。
1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(4-硝基苯基)甲1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲1-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(4-硝基苯基)甲1-(4-碘苯基)-3-苯基-5-(4-硝基苯基)甲3-(4-氯苯基)-1，5-(二苯基)甲
1，3-二苯基-5-(對二苯基)甲3-(對二苯基)-1，5-(二苯基)甲1，3-二苯基-5-(4-苯乙烯基苯基)甲1，3-二苯基-5-(間甲苯基)甲1，3-二苯基-5-(對甲苯基)甲另外，上述甲化合物并不限于上述那些化合物，除此之外，也可以使用在甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子中的兩處具有環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基、另一處具有其他環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物。作為這樣的化合物，例如可以舉出以下化合物。
3-(2-噻吩基)-1，5-(二苯基)甲1-苯并噻唑基-3-[4-(2-磺乙基氨基甲?；?苯基]-5-(4-羧基-2-甲氧基苯基)甲1，3-二苯基-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)甲另外，也可以使用甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子中的兩處具有環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基、另一處具有非環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的甲化合物，例如可以舉出以下化合物。
3-氰基-1，5-(二苯基)甲3-羧基-1，5-(二苯基)甲3-甲基-1，5-(二苯基)甲3-乙基-1，5-(二苯基)甲其他，例如也可以使用5，5’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯)-4，4’-二基]-雙[1-(4-硝基苯基)-3-苯基甲]、1-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-3，5-二苯基甲等。
上述甲化合物中，如上所述，優(yōu)選具有三個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，更加優(yōu)選具有三個環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)的取代基，且含有較多吸電子性官能團(tuán)的化合物，特別優(yōu)選1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲。再者，這樣的甲化合物，例如可以是鹽，也可以是離子化的狀態(tài)等。
在本發(fā)明的測定方法中，上述甲化合物的添加量沒有特別限制，可根據(jù)試樣的種類及上述試樣中的還原物質(zhì)的量來適當(dāng)確定。具體地說，例如，優(yōu)選每1μl試樣添加上述甲化合物使達(dá)到0.001～100μmol的范圍，更加優(yōu)選0.005～10μmol的范圍，特別優(yōu)選0.01～1μmol的范圍。
本發(fā)明的測定方法中，當(dāng)上述試樣為全血時，優(yōu)選每1μl全血添加上述甲化合物使達(dá)到0.001～10μmol的范圍，更加優(yōu)選0.005～5μmol的范圍，特別優(yōu)選0.01～1μmol的范圍。具體地說，當(dāng)上述甲化合物為1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲時，優(yōu)選每1μl全血添加上述甲化合物使達(dá)到0.001～0.4μmol的范圍，更加優(yōu)選0.005～0.1μmol的范圍，特別優(yōu)選0.01～0.07μmol的范圍。
本發(fā)明的測定方法中，例如，優(yōu)選上述氧化還原反應(yīng)通過氧化酶還原來自上述待測物的氧化物質(zhì)，并且是使因氧化而顯色的底物(顯色底物)氧化的顯色反應(yīng)，上述氧化物質(zhì)的量的測定是通過上述顯色反應(yīng)的顯色程度的測定。另外，上述顯色程度的測定優(yōu)選是上述底物的檢測波長處的吸光度測定。
這樣，使用氧化酶使來自上述待測物的氧化物質(zhì)與上述顯色底物發(fā)生顯色反應(yīng)，對上述底物因氧化的顯色程度進(jìn)行吸光度測定時，優(yōu)選上述顯色底物的檢測波長與甲化合物的吸收波長為不同的波長。
作為上述顯色底物沒有特別限制，為了能夠高靈敏度地檢測，優(yōu)選例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲基氨基)二苯基胺鈉(例如，商品名DA-64和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))。另外，上述氧化酶優(yōu)選為過氧化物酶(POD)。
本發(fā)明的測定方法中，優(yōu)選來自上述待測物的氧化物質(zhì)為過氧化氫，通過測定上述過氧化氫的量來確定待測物的量。例如，用上述氧化酶POD還原過氧化氫，并且使上述顯色底物發(fā)生氧化，通過測定上述底物的顯色程度來測定上述過氧化氫的量。
本發(fā)明的測定方法中，上述試樣的種類沒有特別限制，除了全血、血漿、血清、血細(xì)胞等以外，例如對尿、髓液等生物試樣，以及果汁等飲料、醬油、調(diào)味汁等食品類等試樣也可適用。
本發(fā)明的測定方法中，作為待測物，例如可舉出全血中成分、紅細(xì)胞內(nèi)成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髓液成分等，優(yōu)選紅細(xì)胞內(nèi)成分。作為上述紅細(xì)胞內(nèi)成分，例如可以舉出糖化血紅蛋白、糖化白蛋白等糖化蛋白質(zhì)、糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、尿酸、膽固醇、肌酸酐、肌氨酸、甘油等，更加優(yōu)選糖化蛋白質(zhì)。例如，測定上述紅細(xì)胞成分的場合，可以把全血直接溶血后作為試樣，也可以從全血中分離出紅細(xì)胞，把上述紅細(xì)胞溶血后作為試樣。
本發(fā)明的測定方法中，當(dāng)上述待測物為糖化蛋白質(zhì)的場合，優(yōu)選通過使果糖基氨基酸氧化酶作用于上述待測物，使來自上述待測物的氧化物質(zhì)生成過氧化氫。另外，使上述糖化肽、糖化氨基酸等糖化胺與FAOD反應(yīng)，也同樣是優(yōu)選的。再者，根據(jù)需要，優(yōu)選在上述FAOD處理前對上述糖化蛋白質(zhì)及糖化肽進(jìn)行蛋白酶處理。
作為上述FAOD，優(yōu)選是催化下式(2)表示的反應(yīng)的FAOD。
…(2)上述式(2)中，R1表示羥基或來自糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。當(dāng)反應(yīng)前的糖為醛糖時，上述糖殘基(R1)為醛糖殘基，而當(dāng)反應(yīng)前的糖為酮糖時，R1則為酮糖殘基。例如，當(dāng)反應(yīng)前的糖為葡萄糖時，通過阿馬多利重排，使反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)變成果糖結(jié)構(gòu)，這時，糖殘基(R1)變成葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n為0～6的整數(shù)。
上述式(2)中，R2沒有特別限制，然而，例如，在糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白質(zhì)的情況、α-氨基被糖化的情況與其他氨基被糖化的情況不同。
上述式(2)中，在α-氨基被糖化的情況下，R2為下式(3)表示的氨基酸殘基或肽殘基。
-CHR3-CO-R4…(3)上述式(3)中，R3表示氨基酸側(cè)鏈基。另外，R4表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下式(4)表示。下式(4)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述相同，表示氨基酸側(cè)鏈基。
-(NH-CR3H-CO)n-OH…(4)另外，上述式(2)中，當(dāng)α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸側(cè)鏈基被糖化)的情況下，R2可以由下式(5)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7…(5)上述式(5)中，R5表示氨基酸側(cè)鏈基中被糖化的氨基以外的部分。例如，被糖化的氨基酸為賴氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-CH2-例如，被糖化的氨基酸為精氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-另外，上述式(5)中，R6表示氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下式(6)表示。再者，下式(6)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述相同，表示氨基酸側(cè)鏈基。
-(CO-CHR3-NH)n-H …(6)另外，上述式(5)中，R7表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下式(7)表示。再者，下式(7)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述相同，表示氨基酸側(cè)鏈基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH…(7)另外，試樣中的上述還原物質(zhì)優(yōu)選為蛋白質(zhì)。上述蛋白質(zhì)的分子量例如為3000以上，優(yōu)選為3000～3000000的范圍，更加優(yōu)選為10000～300000的范圍，特別優(yōu)選為30000～100000的范圍。作為這樣的還原物質(zhì)，例如可以舉出血紅蛋白、珠蛋白、球蛋白、白蛋白等，優(yōu)選血紅蛋白。
具體實施例方式
下面，關(guān)于本發(fā)明的測定方法，以測定血細(xì)胞中的糖化蛋白質(zhì)為例加以說明。
首先，將全血直接溶血，或用離心分離等常用方法從全血分離出血細(xì)胞成分，將其溶血，配制溶血試樣。該溶血方法沒有特別限制，例如，可以使用采用表面活性劑的方法、采用超聲波的方法、利用滲透壓差的方法等。其中，從操作的簡便性等的理由看，上述采用表面活性劑的方法是優(yōu)選的。
作為上述表面活性劑，例如，可以使用聚氧乙烯對叔辛基苯基醚(Triton類表面活性劑等)、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯(Tween類表面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij類表面活性劑等)非離子型表面活性劑，具體例如有TritonX-100、Tween-20、Brij35等。上述采用表面活性劑的處理條件，通常，當(dāng)處理溶液中的血細(xì)胞濃度為1～10體積％時，添加上述表面活性劑使得在上述處理溶液中的濃度達(dá)0.01～5重量％，室溫下，攪拌數(shù)秒(約5秒)～10分鐘。
然后，在上述溶血試樣中添加上述甲化合物，進(jìn)行試樣的前處理。
例如，當(dāng)前處理溶液中的血細(xì)胞濃度為1～10體積％時，優(yōu)選添加上述甲化合物以使?jié)舛冗_(dá)0.02～2000mmol/L的范圍，更加優(yōu)選0.1～1000mmol/L的范圍，特別優(yōu)選0.4～200mmol/L的范圍。具體地說，當(dāng)上述甲化合物為1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲時，優(yōu)選添加上述甲化合物以使?jié)舛冗_(dá)0.02～80mmol/L的范圍，更加優(yōu)選0.1～20mmol/L的范圍，特別優(yōu)選0.2～15mmol/L的范圍。
上述前處理通常在緩沖液中進(jìn)行。上述緩沖液，例如可以使用CHES緩沖液、CAPSO緩沖液、CAPS緩沖液、磷酸緩沖液、Tris緩沖液、EPPS緩沖液、HEPES緩沖液等。其pH例如為6～13的范圍，優(yōu)選為8～12的范圍，更加優(yōu)選為9～11的范圍。另外，上述前處理溶液中的上述緩沖液的最終濃度例如為1～400mmol/L的范圍，優(yōu)選為10～200mmol/L的范圍。
該前處理的條件沒有特別限制，通常，溫度為10～37℃的范圍，處理時間為10秒～60分鐘的范圍。
上述甲化合物可以直接使用，但從操作的簡便性和處理效率等考慮，優(yōu)選溶解在溶劑中作為甲化合物溶液使用。上述溶液的濃度可以根據(jù)甲化合物的種類(例如分子量等)等適當(dāng)確定，例如為0.01～120mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.1～50mmol/L的范圍，更加優(yōu)選為0.2～20mmol/L的范圍。作為上述溶劑，例如可以使用蒸餾水、生理鹽水、緩沖液等，作為上述緩沖液，例如可以使用與上述相同的緩沖液。再者，上述甲化合物可以使用一種，也可以兩種以上并用。
下面，對該前處理完成后的溶血試樣進(jìn)行蛋白酶處理。這是為了使后面的處理中使用的FAOD易于與待測物作用。
上述蛋白酶的種類沒有特別限制，例如，可以使用蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、氨肽酶等。上述蛋白酶處理通常在緩沖液中進(jìn)行，其處理條件根據(jù)使用的蛋白酶的種類、作為待測物的糖化蛋白質(zhì)的種類及其濃度等適當(dāng)確定。
具體地說，例如，使用蛋白酶K作為上述蛋白酶來處理上述前處理完成的溶血試樣時，通常，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為10～30000mg/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.05～15體積％，反應(yīng)溫度為15～37℃，反應(yīng)時間為1分鐘～24小時，pH為6～12的范圍。另外，上述緩沖液的種類也沒有特別限制，例如可以使用Tris-鹽酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液等。
接著，將通過上述蛋白酶處理得到的分解物用上述FAOD進(jìn)行處理。通過該FAOD處理來催化上述式(2)表示的反應(yīng)。
該FAOD處理優(yōu)選在與上述蛋白酶處理相同的緩沖液中進(jìn)行。其處理條件根據(jù)使用的FAOD的種類、作為待測物的糖化蛋白質(zhì)的種類及其濃度等適當(dāng)確定。
具體地說，例如，反應(yīng)液中的FAOD濃度為50～50000U/L，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.01～1體積％，反應(yīng)溫度為15～37℃，反應(yīng)時間為1～60分鐘，pH為6～9的范圍。另外，上述緩沖液的種類也沒有特別限制，可以使用與上述蛋白酶處理相同的緩沖液。
接著，使用POD及上述顯色底物，通過氧化還原反應(yīng)測定在用上述FAOD處理時生成的過氧化氫。
作為上述顯色底物，例如有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉(以下也稱為DA-64)、鄰苯二胺(OPD)、Trinder試劑與4-氨基安替比林(4AA)組合的底物等。作為上述Trinder試劑，例如有苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等，可以使用N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽二水合物(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺鈉鹽一水合物(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉鹽(DAOS)等。另外，除上述氨基安替比林以外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。這些顯色底物中，如上所述，特別優(yōu)選N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉(DA-64)。
上述氧化還原反應(yīng)通常在緩沖液中進(jìn)行，其條件根據(jù)上述生成的過氧化氫的濃度等適當(dāng)確定。通常，反應(yīng)液中的POD濃度為10～100000IU/L，顯色濃度為0.005～30mmol/L，反應(yīng)溫度為15～37℃，反應(yīng)時間為0.1～30分鐘，pH為5～9。另外，上述緩沖液沒有特別限制，例如，可以使用與上述蛋白酶處理及FAOD處理等相同的緩沖液等。
上述氧化還原反應(yīng)中，例如，使用上述顯色底物時，通過用分光光度計測定上述反應(yīng)液的顯色程度(吸光度)，可以測定過氧化氫的量。而且，例如，用該過氧化氫濃度與校正曲線等，可以求出試樣中的糖化蛋白質(zhì)量。
再者，已知上述甲化合物多為色素化合物，在特定的波長處顯示吸收，如上所述進(jìn)行吸光度測定時，例如，如果采用與使用的顯色底物顯色的吸收波長不同的吸收波長的甲化合物，也不會因甲化合物產(chǎn)生測定誤差。
以下列舉甲化合物的具體例及其λmax、顯色底物的具體例及其λmax。由各λmax的值，例如對于顯色底物(1)，可以組合(2)、(3)或(5)的甲化合物；對于顯色底物(2)，可以組合(1)～(5)之任一甲化合物；對于顯色底物(3)，可以組合(1)～(5)之任一甲化合物；對于顯色底物(4)，可以組合(2)、(3)或(5)的甲化合物。再者，這些只是一例，其組合并沒有特別限定。
(甲化合物及其λmax)(1)5，5’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯)-4，4’-二基]-雙[1-(4-硝基苯基)-3-苯基甲] λmax＝530(nm)(2)1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(4-硝基苯基)甲λmax＝438(nm)(3)1-(4-碘苯基)-3-苯基-5-(4-硝基苯基)甲λmax＝490(nm)(4)1-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-3，5-二苯基甲λmax＝565(nm)
(5)1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲λmax＝433(nm)(顯色底物及其λmax)(1)TOOS與4AA的組合 λmax＝555(nm)(2)MAOS與4AA的組合 λmax＝630(nm)(3)DA-64 λmax＝723(nm)(4)DAOS與4AA的組合 λmax＝593(nm)再者，上述過氧化氫的量，除了采用上述POD等酶的方法外，例如，也可以通過電學(xué)方法測定。
在該測定方法中，采用甲化合物的前處理工序，如上所述，只要是在氧化還原反應(yīng)實際發(fā)生之前即可，并沒有特別限制，然而，在上述FAOD處理后，由于產(chǎn)生過氧化氫，所以，優(yōu)選在上述FAOD處理前進(jìn)行。另外，如上所述，各處理工序可分別進(jìn)行，例如，也可以如下所示組合同時進(jìn)行。
1溶血處理+前處理2溶血處理+前處理+蛋白酶處理3蛋白酶處理+FAOD處理4FAOD處理+POD氧化還原處理5蛋白酶處理+FAOD處理+POD氧化還原處理另外，上述FAOD、POD以及顯色底物的添加順序也沒有特別限制。
這樣，通過使試樣與甲化合物接觸，不僅可避免GSH、AsA、二硫蘇糖醇、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等低分子量還原物質(zhì)的影響，而且，例如，也可避免蛋白質(zhì)及上述分子量范圍內(nèi)的還原物質(zhì)的影響。
另外，在本發(fā)明的測定方法的采用上述甲化合物的前處理工序中，例如，除作為還原物質(zhì)的上述甲化合物以外，也可再與各種氧化劑并用。作為上述氧化劑，例如可以使用碘乙酸鈉、亞碘酸、過碘酸等鹵素氧化物、EDTA-Fe、抗壞血酸氧化酶、膽紅素氧化酶等。這種氧化劑的添加量，例如，為每1μl試樣0.001～0.1mg的范圍。
本發(fā)明的測定方法中，只要待測物能利用氧化還原反應(yīng)即可，沒有特別限制，除上述糖化蛋白質(zhì)以外，例如，如上所述，可以舉出糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、膽固醇、尿酸、肌酸酐、肌氨酸、甘油等。
例如，在通過使過氧化氫生成來測定上述各待測物的量時，例如，使葡萄糖氧化酶作用于上述葡萄糖、膽固醇氧化酶作用于上述膽固醇、尿酸酶作用于上述尿酸、肌氨酸氧化酶作用于上述肌酸酐、肌氨酸氧化酶作用于上述肌氨酸、甘油氧化酶作用于上述甘油，以使過氧化氫生成。這種過氧化氫量的測定方法可與上述同樣地進(jìn)行。另外，糖化肽、糖化氨基酸，例如，可與上述糖化蛋白質(zhì)的測定同樣地測定。
另外，如果在用上述甲化合物處理試樣中的還原物質(zhì)后，使來自待測物的還原物質(zhì)生成，用氧化還原反應(yīng)測定所生成的量，由該測定值確定上述待測物的量時，例如可以如下所示進(jìn)行測定。
例如，當(dāng)上述待測物為葡萄糖時，例如，在NAD和NADP等的存在下，使用葡萄糖脫氫酶使NADH和NADPH等還原物質(zhì)生成。而且，使用例如硫辛酰胺脫氫酶和因還原而顯色的底物，通過氧化還原反應(yīng)測定來自上述待測物的還原物質(zhì)NADH和NADPH。從而，如上所述，例如可以使用來自該待測物的還原物質(zhì)的濃度和校正曲線等求出試樣中的待測物的量。另外，例如，待測物為膽固醇時，可以使用膽固醇脫氫酶；待測物為肌氨酸時，可以使用肌氨酸脫氫酶。
作為上述因還原而顯色的底物，沒有特別限制，例如，可以使用2，6-二氯酚靛酚等。再者，為了得到更可靠的測定值，例如，優(yōu)選在測定來自上述待測物的還原物質(zhì)之前，預(yù)先測定吸光度。
這樣，如果用上述甲化合物處理試樣，例如，可以避免上述蛋白質(zhì)等高分子量還原物質(zhì)的影響。因此，分子量為1萬以上的還原物質(zhì)，以及蛋白質(zhì)還原物質(zhì)影響的場合，并不只限定于上述全血試樣，對上述各種試樣也適用。使用全血試樣以外的試樣的場合，除上述試樣不同外，可以使用同樣的試劑，同樣地進(jìn)行測定。
實施例下面通過實施例和比較例加以說明。
(實施例1、比較例1)該實施例是用甲化合物對試樣進(jìn)行前處理以排除上述試樣中的還原物質(zhì)的影響的實例。以下所示為使用的試劑及方法。
(Hb試樣)使用HbAlc濃度為6.7％的精制Hb凍干品。
(甲化合物)甲化合物使用下式表示的1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲(商品名WSF3，同仁化學(xué)公司生產(chǎn))。
(果糖基纈氨酸溶液)果糖基纈氨酸(以下稱作FV)按照特開平2-69644號公報制備。將上述FV溶解在精制水中，配制10mM的FV溶液。
(溶血試劑)在含有40mM CHES及15mM MOPS的緩沖液(pH＝9.4)中混合表面活性劑(商品名Nikkol，Nikko Chemical公司生產(chǎn))使達(dá)7.5％，配制溶血試劑。
(前處理試劑)WSF3 0、0.25、1.7mMNaN30.043g/LCaCl22.5mMNaCl 50mMMES-MES·Na(pH＝5.5) 1mM(顯色試劑)FAOD 17.5KU/LPOD67KU/L商品名DA-64(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn)) 70μMTris-HCl(pH＝7.0) 300mM(方法)在上述Hb試樣10mg中添加10mM FV溶液0.123mL及上述溶血試劑1.877mL，配制測定樣品。在該測定樣品8.4μL中添加含有上述規(guī)定濃度的WSF3的前處理試劑75.6μL，于37℃下處理5分鐘。之后，再添加顯色試劑18.9μL，于37(℃下進(jìn)行3分鐘顯色反應(yīng)(全量102.9μL)。然后，測定該顯色反應(yīng)后的反應(yīng)溶液在726nm處的吸光度。再者，由于WSF3的吸收波長為430nm附近，所以對DA-64的檢測沒有影響。
作為對照，除了使用不添加10mg上述Hb試樣而將10mM FV溶液0.123mL及上述溶血試劑1.877mL混合成的物質(zhì)以外，與上述同樣地進(jìn)行測定。作為比較例1，除了使用不添加上述WSF3而配制的前處理試劑以外，與上述實施例1同樣地進(jìn)行測定。
然后，將這些測定值代入下式，求出以對照的吸光度作為100％時的相對值(％)。前處理試劑中的WSF3濃度為1.7mM時的結(jié)果如下表1所示。
相對值(％)＝[(X1-X0)/(Y1-Y0)]×100
X1顯色反應(yīng)8分鐘后的吸光度X0顯色反應(yīng)開始時的吸光度Y1對照的顯色反應(yīng)8分鐘后的吸光度Y0對照的顯色反應(yīng)開始時的吸光度(表1)WSF3濃度相對值(mM) (％)實施例1.7 32比較例0 1對照 1.7 100這樣，關(guān)于含有對利用氧化還原反應(yīng)的測定有影響的還原物質(zhì)Hb的測定試樣，通過用甲化合物處理，可以排除上述測定試樣中的還原物質(zhì)的影響，提高測定的可靠性。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性如上所述，本發(fā)明的測定方法是通過在試樣中添加上述甲化合物來排除試樣中的還原物質(zhì)的影響，所以可以進(jìn)行可靠性優(yōu)良的測定。因此，本發(fā)明的測定方法，例如，可適用于臨床醫(yī)療的各種分析，特別是在糖尿病診斷中重要，對紅細(xì)胞中的糖化血紅蛋白等糖化蛋白質(zhì)的測定有用。
權(quán)利要求
1.利用氧化還原反應(yīng)測定試樣中的待測物的方法，其特征在于，在試樣中添加甲化合物以排除上述試樣中所含的還原物質(zhì)的影響。
2.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中在上述氧化還原反應(yīng)之前，在試樣中添加甲化合物以排除上述試樣中所含的還原物質(zhì)的影響，然后，使來自上述待測物的還原物質(zhì)或氧化物質(zhì)生成，通過上述氧化還原反應(yīng)測定其量，從該測定值確定上述待測物的量。
3.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中甲化合物在甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子中至少兩處具有環(huán)結(jié)構(gòu)的取代基。
4.權(quán)利要求3所述的測定方法，其中甲化合物至少在甲骨架的1位的氮原子及5位的氮原子上具有環(huán)結(jié)構(gòu)的取代基。
5.權(quán)利要求4所述的測定方法，其中甲化合物在甲骨架的1位的氮原子及5位的氮原子上具有苯環(huán)(苯基)取代基。
6.權(quán)利要求5所述的測定方法，其中在甲骨架的1位的氮原子及5位的氮原子上具有苯環(huán)(苯基)取代基，上述兩苯環(huán)(苯基)中的至少一個具有選自鹵素基、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基及乙氧基的至少一個官能團(tuán)。
7.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中甲化合物為1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲。
8.權(quán)利要求2所述的測定方法，其中上述氧化還原反應(yīng)通過氧化酶還原來自上述待測物的氧化物質(zhì)，并且是使因氧化而顯色的底物氧化的顯色反應(yīng)，上述氧化物質(zhì)的量的測定是利用上述顯色反應(yīng)的顯色程度的測定。
9.權(quán)利要求8所述的測定方法，其中上述顯色程度的測定是上述底物的檢測波長處的吸光度測定。
10.權(quán)利要求9所述的測定方法，其中因氧化而顯色的底物的檢測波長與甲化合物的吸收波長為不同的波長。
11.權(quán)利要求2所述的測定方法，其中來自上述待測物的氧化物質(zhì)為過氧化氫。
12.權(quán)利要求8所述的測定方法，其中上述氧化酶為過氧化物酶。
13.權(quán)利要求2所述的測定方法，其中待測物為選自糖化蛋白質(zhì)、糖化肽及糖化氨基酸的至少一種，通過使果糖基氨基酸氧化酶作用于上述待測物，使來自上述待測物的氧化物質(zhì)過氧化氫生成。
14.權(quán)利要求13所述的測定方法，其中在使上述果糖基氨基酸氧化酶作用于上述待測物之前，在上述試樣中添加甲化合物。
15.權(quán)利要求13所述的測定方法，其中在使果糖基氨基酸氧化酶作用于待測物之前，使蛋白酶作用于上述待測物。
16.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中待測物為選自糖化蛋白質(zhì)、糖化肽及糖化氨基酸的至少一種。
17.權(quán)利要求16所述的測定方法，其中糖化蛋白質(zhì)為糖化血紅蛋白。
18.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中上述試樣中所含的還原物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中上述試樣為紅細(xì)胞的溶血試樣。
20.權(quán)利要求17所述的測定方法，其中對于血細(xì)胞1～10體積％，相對于上述試樣的甲的添加比例為0.02～2000mmol/L的范圍。
全文摘要
本發(fā)明提供利用氧化還原反應(yīng)測定試樣中的待測物的方法，可得到可靠性優(yōu)良的測定值。在上述氧化還原反應(yīng)之前，在試樣中添加甲化合物以排除上述試樣中所含的還原物質(zhì)的影響，然后，使來自上述待測物的還原物質(zhì)或氧化物質(zhì)生成，通過氧化還原反應(yīng)測定其量，從該測定值確定上述待測物的量。作為上述甲化合物，例如可以使用1－(4－碘苯基)－3－(2，4－二磺苯基)－5－(2，4－二硝基苯基)甲。
文檔編號G01N33/52GK1659441SQ03812998
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日
發(fā)明者米原聰, 石丸香 申請人:愛科來株式會社