專利名稱：用于對原代肝細胞進行灌注和鋪板的方法以及其培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本申請涉及能改善原代肝細胞的長期功能的方法。
背景技術：
肝細胞組成了肝臟的主體，并且負責肝臟在代謝和解毒方面的中心作用。因此，培養(yǎng)的肝細胞，在研究化學實體在肝臟中的藥理學和毒理學方面是重要的。正常的成年人肝細胞的原代培養(yǎng)物提供了用于研究哺乳動物，優(yōu)選人類的肝臟生理學的很多方面的體外模型，例如，包括血漿蛋白的分泌，藥物和異生素的氧化代謝，以及前致癌劑的激活。另外，所述培養(yǎng)物提供了由于倫理學原因在動物中不可能的條件下研究諸如細胞因子，生長因子和嗜肝病毒的生理病理學刺激對肝臟特殊功能的影響的獨特方式。
業(yè)已提出了將培養(yǎng)的肝細胞用于構建體外的肝臟輔助裝置(LAD)，這種裝置被推薦用作患有急性或爆發(fā)性肝功能衰竭的患者的治療裝置。LAD可以起著臨時支持裝置的作用，它被設計成能提供肝臟功能，直到肝臟移植或患者自身的肝臟再生。LAD整合了包括分離的肝細胞的生物反應器，預計該反應器能夠對肝功能衰竭患者的循環(huán)血漿中的物質進行解毒。
不過，將分離的肝細胞用于上述多種用途中的任意一種的挑戰(zhàn)之一是上述很多分化的功能是瞬時的，在培養(yǎng)物中僅持續(xù)幾小時至幾天。例如，采用傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)技術生長的原代肝細胞，通常只能存活3-7天時間，并且有2-4天時間表現(xiàn)出分化的功能。Nishibe，Y，和Hirata，M.在培養(yǎng)的猴肝細胞中誘導細胞色素P-450同工酶。Int JBiochem Cell Bio.273279-285.1995。Jauregui，HO，Ng，SF，Gann，K L和Waxman，D J.在成年大鼠肝細胞原代培養(yǎng)物中P-450 PB-4(IIB1)和P-450c(IA1)和相關的單加氧酶活性的異生素誘導。Xeno，21(9)1091-106.1991.Niak，S，Trenlder，D，Santangini，H，Pan，J和Jauregui，H O.用于人工肝臟支持的豬肝細胞的分離和培養(yǎng)。CellTrans 5107-115，1996。這限制了它們的用途。
采用現(xiàn)有細胞培養(yǎng)技術生長的肝細胞培養(yǎng)物喪失了特殊結構，包括穿孔，膽小管，并且喪失了雙核形成。另外，培養(yǎng)的肝細胞具有在完整肝臟中看不到的特征和結構它們擴散，并且變長，并且延長了應力纖維。在鋪板之后不久，肝細胞減少了某些轉錄因子的表達，這些轉錄因子負責誘導肝臟特異性基因的轉錄。其例子包括HNF-4，HNF-3，C-EBPα和C-EBPβ。
完全分化的肝細胞的另一個特征是白蛋白的分泌。但是，在原代肝細胞培養(yǎng)物中，到第3天，白蛋白分泌顯著減少，并且，到第5天，通過ELISA方法幾乎檢測不到。
在目前使用的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的肝細胞，喪失了在鋪板之后馬上代謝異生素的能力。到培養(yǎng)的第3天，細胞色素P450基因表達大大減弱了。除了所述藥物代謝酶的表達之外，誘導所述藥物代謝酶表達的能力在培養(yǎng)過程中同樣隨時間大大減弱。
用于分離原代肝細胞的標準方法，是使用兩個步驟的膠原灌注方法。不過，在該方法中，有可檢測的活性氧和活性氮類(ROS/RNS)的產(chǎn)生。ROS/RNS對于分離的肝細胞來說具有病理學意義，并且體現(xiàn)為增強了的脂過氧化作用，蛋白修飾和DNA損傷的形式。
活性氧類和活性氮類能夠在細胞中發(fā)揮重要作用。例如，對各種炎性刺激，肺內皮細胞，肺泡，和氣道上皮細胞，以及活化的肺泡巨噬細胞作出反應，產(chǎn)生一氧化氮(NO)和超氧化物陰離子自由基(O2-)。NO能調節(jié)肺血管和氣道張力，并且在針對各種細菌的肺宿主防御方面發(fā)揮重要作用。不過，NO可能是細胞毒性的，這是通過抑制諸如線粒體順烏頭酸酶和核糖核苷酸還原酶的關鍵酶，通過硫醇基團的S-nitrosolation，或通過與它們的鐵硫中心結合。另外，NO以接近擴散極限的速度與O2反應，以便形成強氧化劑過亞硝酸鹽(ONOO-)，它能夠對諸如表面蛋白A的各種肺蛋白上的關鍵的氨基酸進行硝化和氧化，并且抑制它們的功能。
一氧化氮是由身體內的多種類型的細胞產(chǎn)生的，用于細胞間交通(腦，心血管系統(tǒng))或作為免疫或炎性反應系統(tǒng)的一部分(巨噬細胞，內皮細胞)。NO的化學性質在氧合生物學系統(tǒng)中是非常復雜的，這種復雜性表現(xiàn)在化學物南的數(shù)量以及平行的和連續(xù)的反應的數(shù)量方面。
在同樣存在氧氣的條件下，可能因為N2O3造成DNA損傷。在這種情況下，迅速形成了過亞硝酸鹽，然后，在質子化之后，發(fā)生均裂，分裂成羥基和NO2。
肝細胞可以是用于對接觸致癌物質的影響進行定量的有價值的系統(tǒng)。某些環(huán)境化學物質對人類健康造成了威脅。對這些成脅進行精確的評估，需要基于人類接觸的定量數(shù)據(jù)。這樣的數(shù)據(jù)目前是根據(jù)對空氣，水，或食物中的化學物質的測定估算的。通常沒有嘗試過在人類血液，尿液或組織中進行直接測定，因為有關化合物通常是短壽命的，并且以低水平存在。可以將肝細胞用于對具有毒理學價值的化學物質進行定量，包括監(jiān)測它們與人類蛋白的反應產(chǎn)物，包括致癌物質，誘變劑，和其他活性化學物質。還可將肝細胞用于對人類危險作更精確的評估，并且對相關聯(lián)系作更精確的流行病學研究，例如，接觸致癌物質和人類癌癥之間的聯(lián)系。
能夠長時間存活或保持功能的肝細胞培養(yǎng)物對肝臟生物學家，毒理學家，和藥物學研究者來說是有用的。因為培養(yǎng)的肝細胞具有短的半衰期，很多現(xiàn)象不能夠進行適當?shù)难芯?。不過，包括人類在內的動物會在它們的環(huán)境中遇到多種有毒物質。對所述有毒物質進行最初的和最有效的防御的是肝臟，它能代謝我們所攝入的所有試劑的80％以上。
起著清除有毒物質功能的細胞色素P450酶的誘導，是一種候選化合物是否能夠在藥物發(fā)現(xiàn)過程中繼續(xù)發(fā)展的一個重要因素。更精確地預測P450誘導，是藥物生產(chǎn)方案進行的一個步驟。在肝臟毒理學領域，在毒性的接觸和表現(xiàn)之間存在明顯的滯后，例如，黃曲霉毒素是由霉菌產(chǎn)生的有毒代謝物，可能需要很多天時間使它們在人體上表現(xiàn)出其作用，為了研究這種長時間的作用，能夠長時間代謝異生素的肝細胞將是有用的。對確定它們的候選化合物的毒性感興趣的公司不得不測試它們的肝臟毒性。使用分離的肝細胞僅提供了短期問題的指標。例如，如果毒性是在接觸3天以上出現(xiàn)的話，現(xiàn)有的肝細胞培養(yǎng)物就不能檢測所述毒性。
需要一種用于在培養(yǎng)物中長時間保持肝細胞的改進方法，以便用于藥物學檢測。針對用于治療肝臟的任何藥物最好都使用這種改進的肝細胞細胞培養(yǎng)模型進行測試。與它的短壽命的對應體相比，在長壽命的肝細胞模型中能夠更好地模擬它的效能和有效性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了能夠長時間培養(yǎng)原代肝細胞，并且能保持它的功能和/或存活力三天以上的方法。該方法包括在存在抗氧化劑和第二種試劑的條件下對所述肝細胞進行鋪板，其中，所述第二種試劑是(1)產(chǎn)生活性氧和活性氮類的酶的功能性抑制劑，或(2)直接抑制所述活性氧和活性氮類，或(3)增加細胞內谷胱甘肽。
在優(yōu)選實施方案中，所述抗氧化劑是生育酚琥珀酸酯或羥基自由基清除劑。所述羥基自由基清除劑優(yōu)選是甘露醇。
在另一種優(yōu)選實施方案中，所述第二種試劑是谷胱甘肽前體或一氧化氮抑制劑。所述谷胱甘肽前體優(yōu)選是2-氧-噻唑烷。所述一氧化氮抑制劑優(yōu)選是NG-甲基精氨酸。
一種特別優(yōu)選的組合是2-氧-噻唑烷和生育酚琥珀酸酯。
另一種特別優(yōu)選的組合是NG-甲基精氨酸和甘露醇。
另一種特別優(yōu)選實施方案提供了融合分子，該分子融合了所述抗氧化劑特性和能產(chǎn)生活性氧和活性氮類的酶的功能性抑制劑。
在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法是在分離和培養(yǎng)完整肝臟期間使用的。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法被用于分離和培養(yǎng)原代肝細胞。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法被用于分離和培養(yǎng)肝臟切片培養(yǎng)物。
本發(fā)明還提供了在藥物開發(fā)期間使用具有改善了的長期功能的肝細胞篩選化合物的長期毒性的方法。所述長期功能超過三天時間，更優(yōu)選超過五天時間，更優(yōu)選至少一周時間，更優(yōu)選至少兩周時間，更優(yōu)選至少一個月。
本發(fā)明還提供了使用具有改善了的長期功能的肝細胞篩選用于治療肝臟的候選藥物的方法。
本發(fā)明還提供了將具有改善了的長期功能的肝細胞用于生物人工肝臟裝置的方法。
本發(fā)明還提供了使用具有改善了的長期功能的肝細胞生產(chǎn)蛋白的方法，所述蛋白包括在肝細胞中內源表達的蛋白，如TNF-α和肝細胞生長因子(HGF)。
本發(fā)明還提供了將具有改善了的長期功能的肝細胞用于開發(fā)乙型肝炎和丙型肝炎細胞培養(yǎng)物模型的方法。
本發(fā)明還提供了將具有改善了的長期功能的肝細胞用于肝細胞的冷凍貯藏的方法。
附圖簡述

圖1表示CYP lA1誘導機制。
圖2是表示對各種治療的氧化還原作用的控制機制的表格。
圖3是表示與未處理過的對照組相比，在用各種化合物處理過的肝細胞中尿素合成的誘導倍數(shù)的曲線圖。
圖4是表示與未處理過的對照組相比，在用各種化合物處理過的肝細胞中白蛋白分泌的誘導倍數(shù)的曲線圖。
圖5是表示與未處理過的對照組相比，在用各種化合物處理過的肝細胞中誘導型CYP lAl活性的誘導倍數(shù)的曲線圖。
圖6是表示與未處理過的對照組相比，在用各種化合物處理過的肝細胞中基礎CYP lAl活性的曲線圖。
圖7是表示3-MC處理過的肝細胞中CYP1A1的Western印跡。
圖8表示用各種試劑處理大鼠原代肝細胞的結果。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了培養(yǎng)原代肝細胞的方法，包括在存在抗氧化劑和第二種試劑的條件下對所述肝細胞進行鋪板，其中，所述第二種試劑是(1)產(chǎn)生活性氧和活性氮類的酶的功能性抑制劑，或(2)直接抑制所述活性氧和活性氮類的試劑，或(3)增加細胞內谷胱甘肽的試劑。所述培養(yǎng)物的肝細胞具有四天以上時間的功能和/或超過一周的存活力。一種優(yōu)選實施方案提供了2-氧-噻唑烷和生育酚琥珀酸酯的組合。另一種特別優(yōu)選實施方案提供了NG-甲基精氨酸和甘露醇的組合。
通過本發(fā)明的方法培養(yǎng)的肝細胞具有長期功能。所述長期功能被定義為表現(xiàn)至少一種野生型分化功能，如細胞色素P450基因表達(有時被稱為EROD活性)異生素代謝等和/或結構，如穿孔，膽小管，雙核形成等至少三天時間。所述肝細胞優(yōu)選表現(xiàn)出EROD活性。更優(yōu)選表現(xiàn)出多種功能和結構。所述功能優(yōu)選表現(xiàn)至少五天時間，更優(yōu)選至少一周，更優(yōu)選至少兩周，更優(yōu)選至少十六天，更優(yōu)選至少三周，更優(yōu)選至少一個月。更優(yōu)選至少五十天，更優(yōu)選至少兩個月。存活力優(yōu)選至少保持一周，更優(yōu)選至少兩周，更優(yōu)選至少兩周，更優(yōu)選至少三周，更優(yōu)選至少一個月，更優(yōu)選至少兩個月。
本發(fā)明還提供了融合分子，其中，所述抗氧化劑和所述第二種試劑存在于相同的分子中。
已知氧化應激產(chǎn)生和導致了多種疾病。有關與氧化應激相關的疾病和疾病狀況的綜述，參見Drugs of the Future，vol.13(10)，p.973(1988)和Molecular and Cellular Biochemistry，vol.84，p.199(1988)。
活性氧類和活性氮類在本領域中是眾所周知的。例如，活性氧類包括，但不局限于超氧化物(O2)，羥基(OH)；過氧化物(RO2)，烷氧基(RO)，和過氧羥基(HO2)基團。活性氮類包括，但不局限于一氧化氮(NO)和二氧化氮(NO2)。
抗氧化劑起著清除自由基的作用，并因此預防對細胞的氧化破壞。起著氧化還原作用控制功能的治療為本領域所熟知，并且包括，但不局限于生育酚琥珀酸酯；甘露醇，它能清除羥基自由基；ebselen，它能清除過亞硝酸鹽和超氧化物陰離子；NOHA，它能產(chǎn)生一氧化氮；1400W，它能抑制誘導型一氧化氮合酶；n-乙酰基半胱氨酸，它能提高細胞內谷胱甘肽水平；PDTC，它能清除羥基自由基和超氧化物陰離子；以及葡糖胺。優(yōu)選的抗氧化劑是生育酚琥珀酸酯和甘露醇。
除了所述抗氧化劑之外，本發(fā)明提供了第二種試劑，它可以是產(chǎn)生活性氧和活性氮類的酶的功能性抑制劑，或直接抑制所述活性物質的試劑，或增加細胞內谷胱甘肽的試劑。
谷胱甘肽在保護細胞系統(tǒng)免受氧化損傷方面起著重要作用。谷胱甘肽是解毒肽，它與異生素(異源化學物質或化合物)綴合，使所述異生素的親水性更強，因此促進它們從身體內向外分泌。谷胱甘肽的合成涉及到兩個步驟的反應第一個步驟是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化的。谷胱甘肽合成酶能催化第二個反應。因此，在本文中，短語“細胞內谷胱甘肽的增加”或“細胞內谷胱甘肽的提高”意在表示所述谷胱甘肽三肽本身，以及決定它的合成以及與異生素綴合的酶。半胱氨酸是一種重要的氨基酸，并且是谷胱甘肽合成的速度限制物質。不過，在直接施用時，半胱氨酸可能是具有細胞毒性的。業(yè)已證實半胱氨酸藥物前體在保護細胞系統(tǒng)免受各種形式的應激方面有效。對于那些有效的試劑來說，對于要通過酶促方式或非酶促方式切割的藥物前體來說是必要的。一旦釋放了半胱氨酸，就必須轉化成谷胱甘肽，以便表現(xiàn)出治療效果。
發(fā)揮半胱氨酸藥物前體作用的一種類型的化合物是噻唑烷-4-羧酸酯(Cancer，Chemotherapy and Pharmacology，Vol.28，p.166(1991)和Arch.Gerontology and Geriatrics，vol.1，p.299(1982))。例如，業(yè)已報導了將某些作為半胱氨酸藥物前體的2-取代的-噻唑烷-4-羧酸用作藥物，用于推遲哺乳動物白內障的發(fā)作。不過，參考文獻中所提到的取代基沒有一種能夠賦予所提到的2-取代的-噻唑烷-4-羧酸化合物的抗氧化或自由基清除特性。類似地，美國專利號4,868,114披露了通過讓細胞與有效量的某些L-胱氨酸藥物前體接觸而刺激哺乳動物細胞中谷胱甘肽的生物合成的方法，并且美國專利號4,952,596披露了噻唑烷-4-羧酸化合物的N-?；苌?，它具有退熱，抗炎，粘液溶解和止痛活性，此外，還具有治療局部缺血病理學的活性，以及由氧化性自由基的超量產(chǎn)生所導致的病理學方面的活性。美國專利號5,846,988披露了具有與噻唑烷-4-羧酸酯部分融合的抗氧化劑苯酚部分的融合化合物，它被用作細胞保護劑。
優(yōu)選的第二種試劑是NG-甲基精氨酸，它能抑制一氧化氮。
另一種優(yōu)選的第二種試劑是2-氧-噻唑烷，它是半胱氨酸-藥物前體，它起著谷胱甘肽前體的作用。因此，本發(fā)明還提供了優(yōu)選的第二種試劑，它起著增加包括谷胱甘肽前體在內的細胞內谷胱甘肽的作用。
肝臟在清除多種有毒物質的能力方面是突出的。
對肝臟功能起著關鍵作用的是細胞色素P450酶，它采用一種化學機制改變并且催化有毒物質的清除。在它接觸有毒試劑之后，肝臟通過誘導它們的表達調節(jié)所述酶。所述酶是我們生存所需要的。不過，它們還在用于治療各種疾病的藥物的某些組合中對疾病狀態(tài)起著負面調節(jié)的作用。細胞色素P450酶的一種負面誘導作用，可以具有病理學上的副作用。一種例子是當人體攝取醇和大劑量的醋胺酚時P450酶的誘導，它可導致急性肝功能衰竭。
使用我們的培養(yǎng)方法，可以監(jiān)測藥物候選物的長期作用。目前，每年有超過140,000種藥物候選物被投入體外試驗，不過，只有很少量的候選物投入市場。先導化合物的失敗主要是由于出乎預料的毒性以及長期效力的缺乏。與體內條件更為相似的細胞培養(yǎng)模型，能夠大大加強并且促進管道藥物的候選物測試。
用于培養(yǎng)肝細胞的改進的方法還可用于將所述肝細胞用在生物人工肝臟裝置(BAL)上。在美國，肝臟疾病是突出的健康問題，通常有十分之一的病例會導致死亡。對患有急性或晚期肝臟疾病患者進行護理治療的現(xiàn)有的標準是進行肝臟移植。使這種情況惡化的原因是，需要供體肝臟的患者的數(shù)量，比提供肝臟的供體的數(shù)量多出將近四倍。這種狀態(tài)導致了超過二分之一的患者不能得到需要的肝臟。由于對丙型肝炎感染發(fā)病的預期的增加，對這種肝炎目前還沒有疫苗或有效的治療方法，估計，到2010年，對肝臟疾病治療的需要將增加三倍?？梢詫AL裝置用在肝臟功能受損的患者身上，更像是將透析用于患有腎臟衰竭的患者。預計在下一個十年中，有效的生物人工肝臟裝置的市場將會大大增加。這在很大程度上是由于肝炎感染在世界范圍內增如。
還可將肝細胞用于生產(chǎn)用于治療和用于研究的蛋白，包括與肝細胞相關的蛋白，如TNFα和肝細胞生長因子(HGF)的生產(chǎn)。
可以將所述肝細胞用于乙型肝炎或丙型肝炎的培養(yǎng)模型中，這種模型是目前所不存在的。實際上，所述原代肝細胞培養(yǎng)物應當能夠分析病毒性肝炎感染和復制。工業(yè)和學術科學家業(yè)已進行了多年的努力，以便開發(fā)出病毒性肝炎的體外模型。這種肝炎的體外模型能夠促進抗病毒制劑的高處理量篩選，以及宿主細胞的遺傳工程，以便研究宿主防御機制。
還可將所述培養(yǎng)的肝細胞用于肝細胞冷凍貯藏。人類肝細胞的可利用性目前是無法預測的。因此，有效的冷凍貯藏技術將對研究人員和臨床醫(yī)生等有所幫助。目前，肝細胞是以在塑料上鋪板或冷凍保存的形式運輸?shù)?，并且在小瓶中冷凍輸送，不過，目前得到了最不理想的結果。肝細胞的這種現(xiàn)有的培養(yǎng)物應當避免短期功能和存活力的問題。
分析肝細胞功能表征肝細胞功能的任何分析方法都可用于確定原代細胞的長期功能。肝細胞功能的分析方法為本領域所熟知，包括，但不局限于分析肝細胞酶的活性，測定由肝細胞表達的蛋白和化合物，以及測定肝細胞中表達的基因的表達水平。
肝細胞酶的分析方法為本領域所公知。肝細胞酶包括藥物代謝酶，如CYP1A1，烏頭酸酶，和其他細胞色素。優(yōu)選的肝細胞酶是CYP1A1，包括基礎活性，以及誘導活性。例如，CYP1A1的分析方法由例如Pierce等，1996披露。在本文中，EROD是乙氧基試鹵靈O脫乙基酶活性，它又被稱為p450 CYP1A1，它是一種重要的藥物代謝酶，并且是原代肝細胞中一般藥物代謝活性的標記。細胞色素包括細胞色素C(Clementi等，1996)，和細胞色素P-450同工酶，如P-450 PB-4(IIB1)和細胞色素P-450c(IA1)。
由肝細胞表達的蛋白和化合物包括，但不局限于尿素，白蛋白分泌，和CYP1A1。例如，白蛋白的分泌是完全分化的肝細胞的特征?？梢杂帽娝苤臉藴蔈LISA分析方法測定白蛋白分泌，例如，參見Dunn等，1991?？梢酝ㄟ^檢測尿素向靛酚的轉化測定尿素合成，參見Fawcepp等，1960。在肝細胞中表達的其他蛋白包括TNFα和肝細胞生長因子(HGF)。
在肝細胞中表達的基因包括轉錄因子，這些因子決定誘導肝臟特異性基因的轉錄。例子包括，HNF-4，HNF-3，C-EBPα和C-EBPβ?？梢允褂帽绢I域眾所周知的分析方法檢測所述基因的表達水平，這些方法包括測量mRNA含量的Northern印跡，定量rtPCR，以及測定蛋白水平的Western印跡。
肝細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)本發(fā)明可使用任何肝細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)，這些系統(tǒng)是本領域眾所周知的。優(yōu)選的肝細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)包括原代肝細胞培養(yǎng)物，肝細胞細胞系，肝切片培養(yǎng)物，以及整個肝臟的外殖培養(yǎng)物。
肝細胞的任何來源都可以使用。用于原代培養(yǎng)的肝細胞可以是構成哺乳動物肝臟的任何細胞，并且所述細胞可以用本領域所公知的方法從動物的肝臟中分離。用于獲得肝細胞的肝臟供體優(yōu)選是哺乳動物或嚙齒類物種的正常的或轉基因動物供體，更優(yōu)選是馬，犬，豬，綿羊，或鼠物種。
對于諸如生物人工肝臟裝置的某些用途來說，豬供體是目前優(yōu)選的。由于便于操作較小的動物和肝臟器官，使用大約5kg-大約20kg之間的豬，優(yōu)選大約8kg，不過，任何體形的供體都可用作肝臟器官的來源。包括人類在內的其他哺乳動物來源同樣可以使用。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中，所述肝細胞是誘導過的?？梢栽趶膭游锔闻K中分離之前對肝細胞進行體內誘導，或在分離所述肝細胞之后進行體外誘導。
體內誘導優(yōu)選是通過直接向血流中注射，腹膜內注射或肌內注射，給動物供體施用至少一種誘導劑進行的；不過，誘導劑還可以使用其他途徑給供體施用，如口服，經(jīng)皮施用，或通過吸入施用。可以一次以單劑或用一定時間以不同誘導劑的獨立的劑量施用一種或多種誘導劑。所述供體可以施用兩種或兩種以上誘導劑的組合，以便上調某些需要的解毒酶，從而制備具有定制的酶活性特征的肝細胞培養(yǎng)物。所述誘導劑的給藥可以在一天內施用，或者用一段時間施用，如在從供體肝臟中分離肝細胞之前用幾小時或幾天時間施用。例如，諸如苯巴比妥的某些誘導劑在給供體注射之后是相對不穩(wěn)定的分子，因此，如果在獲得所述器官之前以多個間隔提供將更有效。藥劑中的誘導劑的量取決于(1)所使用的誘導劑，(2)供體的物類，體形和性別，(3)至少一種誘導劑的施用方式，和(4)藥劑施用的頻率。通常，當所述誘導劑是通過一系列給藥施用時，所述誘導劑的劑量可能較少。本領域技術人員能夠成功地確定如何操縱所述用藥參數(shù)，以便獲得體內誘導的肝細胞培養(yǎng)物，將其用于本發(fā)明的方法。
可以使用本領域所公知的任何誘導劑。誘導劑表示能夠增強或上調肝細胞功能的試劑，特別是與解毒相關的酶，特別是與解毒相關的細胞色素P450或共軛反應。如果所述誘導劑能夠保持或改善其他肝細胞的細胞功能則也是有用的，所述功能包括代謝功能，如氨清除，和合成功能，如白蛋白和轉鐵蛋白生產(chǎn)。
誘導劑選自下列一組，包括，但不局限于β-萘黃酮(BNF)，苯巴比妥，3-甲基膽蒽(3MC)，乙醇，地塞米松，芳氯物1254，2，3，7，8-四氯二苯并-p-二氧芑，吩噻嗪，氯丙嗪，isosafole，γ-氯丹，烯丙基異丙基乙酰胺(AIA)，反式-氧化茋，開篷，丙酮，異煙肼，吡啶，吡唑，4-甲基吡唑，孕烯醇酮16-α-腈(PCN)，三乙酰夾竹桃霉素(TAO)，克霉唑，clofirate，氯丁扎利，二(2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯(DEHP)，或單-(20乙基己基)鄰苯二甲酸酯(MEHP)。特別優(yōu)選的誘導劑是3-甲基膽蒽，β-萘黃酮(BNF)，和苯巴比妥。3-甲基膽蒽是最優(yōu)選的誘導劑。
在分離肝細胞之前，可以在體內使用一種或多種誘導劑，以便上調所述酶促活性。在分離之前，可以給供體施用單一誘導劑一次或多次。誘導劑可以是組合的，就是說它是在同一時間的混合物或雞尾酒，或順序的，即在不同的時間獨立施用的混合物，在施用時，能夠上調目標酶的特性。所述劑量中所包含的誘導劑的量應當足以誘導肝細胞提高它們的功能性代謝活性，而又不會高到對肝臟器官或供體來說是致命的。給供體提供誘導劑的時間應當足夠長，以便導致酶促解毒活性的上調，優(yōu)選在分離之前至少大約24小時。
所述誘導劑和其他試劑的劑量披露于美國專利號6,394,812中。
如果受體患者需要針對其中解毒酶活性表達低的適應征的肝臟輔助治療，可以用具有肝細胞特征的細胞分離物的混合物制備肝臟輔助裝置，所述肝細胞具有上調了的多種酶活性，以便獲得最大程度的解毒活性，并且提供用于治療急性衰竭的定制的培養(yǎng)物。
為了分離原代肝細胞，可以使用本領域所公知的任何方法。優(yōu)選的方法是兩個步驟的膠原酶灌注分離方法。
例如，在誘導階段之后，可以使用Seglen肝細胞分離方法的改進方法分離肝細胞，參見Seglen，P O.分離的大鼠肝細胞的制備。參見Methods in Cell Biology(D M Prescott，ed.)vol.13.Academic Press(NY，N.Y.)，1976，該文獻被收作本文參考。對所述動物進行麻醉，剖開，并且在暴露的肝臟上插管，并且用冷的乳酸化Ringers溶液進行原位灌注，然后切除肝臟，以便漂洗肝組織中的血液和多余的誘導劑。將切除的肝臟轉移到生物學安全的室內，在這里，在無菌條件下完成所述方法的其余步驟。然后用熱的，優(yōu)選37℃的EDTA快速灌注所述器官，以消化提供肝臟的物理結構的細胞外基質，然后用37℃的1mg/ml膠原酶灌注，直到消化看上去已完成(平均消化時間為大約22分鐘)。然后通過添加補充了牛血清的冷卻的Hank′s平衡的鹽溶液(HBSS)終止進一步的消化。肝臟基質的消化從所述基質結構中釋放出細胞和細胞聚集物，以便產(chǎn)生細胞懸浮液。將未消化的組織和膽囊切除，并且讓其余的組織通過200微米和100微米的不銹鋼篩網(wǎng)，以便釋放細胞和細胞聚集物。通過離心并且傾倒漂洗介質將所述細胞懸浮液洗滌二次，并且優(yōu)選在第三次漂洗之后，將細胞沉淀重新懸浮在介質中。此時，細胞可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)或者在冷凍貯藏介質中冷凍保存，進行長期保存以供將來使用。
所述細胞作為細胞懸浮液或在適合動物細胞或組織培養(yǎng)的表面上鋪板培養(yǎng)，如培養(yǎng)皿，燒瓶，或滾瓶，它們能夠進行肝細胞培養(yǎng)和維持?？梢詫⑺黾毎麚饺肷锓磻髦?，以懸浮液形式或在諸如培養(yǎng)珠或纖維的培養(yǎng)基質或在平面或膜上鋪板的形式。所述細胞能夠在它上面生長的合適的細胞生長基質，可以是任何生物學相容的材料，細胞可以附著在它上面，并且提供要形成的細胞基質結構的附著方式?？梢杂米骷毎L表面的材料如玻璃，不銹鋼，聚合物，包括聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚偏乙烯，聚二甲基硅氧烷，含氟聚合物，以及氟化乙烯丙烯，以及硅基質，包括熔融石英，多晶硅，或硅晶體。為了增強細胞貼著或功能，或這兩者，可以對所述細胞生長表面材料進行化學處理或修飾，使其帶靜電荷，或用諸如細胞外基質成分或肽的生物物質涂敷。在一種實施方案中，所述肝細胞是在放置在培養(yǎng)表面，如涂層或凝膠形式的膠原上的細胞外基質的表面內或表面上培養(yǎng)的。在另一種實施方案中，所述肝細胞是在液體可滲透的膜或氣體可滲透的膜上培養(yǎng)的。存在于肝臟中的其他細胞也可以摻入誘導過的肝細胞中，如內皮細胞；Kupfer細胞，特化的巨噬細胞樣細胞，和成纖維細胞。肝細胞與一種或多種上述或其他類型細胞的共培養(yǎng)物可能是優(yōu)化肝細胞功能所需要的。
在一種實施方案中，可以將體內誘導過的肝細胞接種到被用作或整合在LAD中的生物反應器中。某些LAD設計是以空心纖維盒設計為基礎的，其中，將所述肝細胞接種到空心纖維的空腔內，或接種到空心纖維的外面。起著培養(yǎng)基質作用的空心纖維允許液體或氣體通過空心纖維轉運。其他LAD設計采用了平面培養(yǎng)基質。位于兩個膠原凝膠層之間的肝細胞培養(yǎng)物披露于授予Dunn等的美國專利號5,602,026和5,942,436中。使用平面培養(yǎng)基質的另一種設計披露于Bader等的美國專利號5,658,797和國際PCT公開號WO 96/34087中。某些平面基質可以進行顯微造型，以便能夠以共同培養(yǎng)物的形式在基質上的不同部位同時培養(yǎng)兩種或兩種以上類型的細胞，正如由Bhatia等所披露的。上述披露了培養(yǎng)基質和方法，以及它們作為生物反應器裝置用于治療需要肝臟輔助的患者的用途的專利的內容，被收作本文參考。
用于培養(yǎng)肝細胞的優(yōu)選的生物反應器設計采用了氣體可滲透的，液體不可滲透的膜，它限定了生物反應器腔室的兩個區(qū)域。將肝細胞接種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的膜的表面上，同時不僅在培養(yǎng)基中，而且還跨所述膜進行加氧和其他氣體轉運。在另一種實施方案中，對所述膜進行處理，以便改善細胞的附著作用，如通過改變所述膜的電荷，通過電暈放電，或通過用細胞外基質成分，肽，細胞粘附分子或其他化學物質處理所述膜或進行包被。用于所述膜的優(yōu)選包被物是膠原。
在培養(yǎng)時，所述細胞優(yōu)選與細胞培養(yǎng)基接觸一定時間，以便保持它們的代謝活性和最佳的肝細胞功能。雖然它們的濃度不同，細胞培養(yǎng)基以葡萄糖，氨基酸，維生素和無機離子，以及其他基礎培養(yǎng)基成分的形式提供了細胞的基礎營養(yǎng)來源。培養(yǎng)基通常包括養(yǎng)分基礎，還補充了一種或多種其他成分，如氨基酸，生長因子，激素，抗細菌劑和抗真菌劑。在肝細胞分離之后用于該方法的一種優(yōu)選的培養(yǎng)基包括Williams′E培養(yǎng)基，新生牛血清(NBCS)，葡萄糖，胰島素，胰高血糖素，氫化可的松，HEPES，上皮生長因子(EGF)，和谷氨酰胺。在一種更優(yōu)選的實施方案中，補充了本發(fā)明的抗氧化劑和第二種試劑的培養(yǎng)基包括Williams′E培養(yǎng)基，補充了最多1％的新生牛血清(NBCS)，4.5g/l葡萄糖，0.5U/ml胰島素，7ng/ml胰高血糖素，7.5.mu.g/ml氫化可的松，10mM HEPES，20ng/ml EGF，和200mM谷氨酰胺。肝細胞培養(yǎng)領域的技術人員可以確定要使用的上述培養(yǎng)基成分或它們的功能性等同物的其他濃度。
用于培養(yǎng)肝細胞的另一種優(yōu)選的培養(yǎng)基利用了業(yè)已添加了pleiotrophin(PTN)，胎牛血清(FBS)和煙酰胺或它們的類似物的培養(yǎng)基。更優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)基還包括抗壞血酸或它的類似物(例如L-抗壞血酸磷酸鹽)。還向該培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基中添加了上述抗氧化劑和第二種試劑。
例如，在日本專利申請?zhí)?33985/1996中披露的培養(yǎng)方法的一種實施方案中，肝細胞是在混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，該培養(yǎng)基包括含有FBS和煙酰胺或它們的類似物的培養(yǎng)基，所述成分作為肝細胞的集落形成成分，以及3T3細胞的條件培養(yǎng)基(CM)，作為肝細胞的生長促進因子，其中，向所述現(xiàn)有用途的培養(yǎng)基中添加PTN取代3T3細胞的CM。
化合物PTN是一種肝素結合蛋白，并且它作為生長因子和神經(jīng)細胞的營養(yǎng)因子的作用是已知的。某些研究者業(yè)已報導了它們促進諸如成纖維細胞，內皮細胞，上皮細胞等的體細胞分裂的作用，不過，還報導了與所述作用相反的作用，因此，PTN對體細胞的作用尚未確定(The Journal of Biological Chemistry，Vol.267，No.36，pp.25889-25897，1992)。
化合物PTN是作為重組人PTN通過商業(yè)渠道(R & D SystemsInc.)獲得的，并且還可將這種商業(yè)產(chǎn)品用于本發(fā)明的方法中。使用披露于美國專利號6,136,600中的分離和純化方法，還可以從按照與日本專利申請133985/1996相同的方法制備的3T3細胞的CM或從其他動物細胞的培養(yǎng)上清液中獲得。另外，來自3T3細胞的PTN可以通過使用PTN的一部分已知的氨基酸序列作為探針，從現(xiàn)有的cDNA文庫中分離PTN的編碼序列，然后在合適的宿主載體系統(tǒng)中表達該編碼序列而獲得。
添加了PTN，F(xiàn)BS，抗壞血酸或它們的類似物和煙酰胺或它的類似物的培養(yǎng)基，是含有表皮生長因子和DMSO的特殊的DMEM培養(yǎng)基。表皮生長因子(EGF)和DMSO對于集落形成來說不是必需的，不過，優(yōu)選將它們添加到所述培養(yǎng)基中，因為它們具有促進集落形成的作用。通過低速離心獲得的級份，除了肝細胞之外，還包括內皮細胞，Kupffer′s星形細胞，星形細胞，膽管上皮細胞，并且被認為提供了具有特殊環(huán)境的肝細胞，并且所述煙酰胺或它的類似物，抗壞血酸或它的類似物和DMSO能抑制所述非實質細胞的生長，因此，使它能選擇性地培養(yǎng)并且增殖實質肝細胞。例如，添加到所述培養(yǎng)基中的這些成分的量，可以是大約0.1ng/ml-10.mu.g/ml的PTN，5-30％的FBS，0.1-1.0mM的抗壞血酸或它的類似物，1-100ng/ml的EGF，1-20mM的煙酰胺或它的類似物，以及0.1-2％的DMSO。培養(yǎng)是在5％CO2氣體中，低于2個大氣壓下，在大約37℃下進行的。
在另一種優(yōu)選實施方案中，在分離之后對肝細胞進行冷凍貯藏保存，直到需要摻入到生物反應器中。細胞懸浮液，細胞單層，以及工程化組織結構的冷凍貯藏是冷凍貯藏領域所公知的?？梢詫⒗鋬鲑A藏用于長期保存，庫存，和運輸。在需要的時候，將所述培養(yǎng)物從冷凍保存物中取出，解凍，漂洗冷凍防腐劑，并且做好使用的準備。
在分離之后或者在從冷凍貯藏保存物中取出之后，在一種優(yōu)選實施方案中，所述體內誘導的肝細胞優(yōu)選摻入到生物反應器中，并且在其中培養(yǎng)?？梢允褂脕碜杂靡换蚨鄤┫嗤恼T導劑或多種誘導劑誘導過的單一分離物的肝細胞。在另一種實施方案中，在生物反應器中與從體內誘導的供體中分離的肝細胞一起培養(yǎng)從未誘導過的供體獲得的肝細胞。在另一種實施方案中，將來自通過相同的誘導劑或至少兩種不同的誘導劑誘導過的兩個或兩個以上供體分離物的肝細胞在相同的生物反應器中組合在一起。如果所述生物反應器具有多個培養(yǎng)室或區(qū)，來自業(yè)已用不同的誘導劑預先處理過的不同供體的肝細胞可以分離，不過，它們是同時使用的，以便實現(xiàn)所述生物反應器的總體功能。將具有不同酶活性特征的體內誘導的肝細胞培養(yǎng)物組合在被用作LAD的生物反應器，對于用所述生物反應器中的培養(yǎng)物進行治療的患者來說是有利的。在一種實施方案中，所述生物反應器可能包括若干種具有不同的體內誘導的肝細胞培養(yǎng)物的分離物，以便給患者提供上調的酶的完整的特征，從而獲得最大程度的解毒活性。另一種實施方案是這樣一種方案，其中，可以用接種了具有某些選定的酶促活性的一種或多種體內誘導的肝細胞的分離物接種過的生物反應器治療患者，它能夠增強或取代某些酶促活性水平，其中，患者的肝臟能表達低水平的某些解毒酶。
可以將所述生物反應器用于培養(yǎng)所述細胞，以便生產(chǎn)細胞產(chǎn)物或對諸如通常由肝臟代謝的毒素的物質產(chǎn)生功能性作用。所述生物反應器可以用作肝臟輔助裝置或作為它的整體部分，用于治療需要肝臟輔助的患者。具有上調了的酶促活性的肝細胞可用于被用作肝臟輔助裝置的各種類型的生物反應器中。適合這一目的的生物反應器包括懸浮裝置，空心纖維，徑流表面和平面基質，如細胞培養(yǎng)物。
業(yè)已在體內誘導過的肝細胞，可用于治療需要肝臟輔助的患者，所述肝細胞是在生物反應器中培養(yǎng)的，生物反應器被用作肝臟輔助裝置或整合在該裝置上。通常，肝細胞灌注培養(yǎng)基和患者血漿或血液，是通過該裝置在獨立的流通回路中循環(huán)的。所述流通回路通過膜彼此接觸，以便進行氣體，毒素和白蛋白的交換，不過，還提供了肝細胞和患者之間的免疫學屏障。
應用對于肝臟生物學家，毒理學家，和藥理學研究者來說，改進的肝細胞是有用的。因為所述培養(yǎng)的肝細胞的短的半衰期，使用標準方法一直不能夠適當?shù)匮芯亢芏喱F(xiàn)象。
因此，本發(fā)明提供了在藥物開發(fā)期間使用具有改善了的長期功能的肝細胞篩選具有長期毒性的化合物的方法。P450酶的誘導是候選化合物在藥物發(fā)現(xiàn)過程中是否能進一步開發(fā)的重要因素。更精確地預測P450誘導是藥理學生產(chǎn)方法繼續(xù)進行的一個步驟。在肝臟毒理學領域，在接觸和毒性出現(xiàn)之間存在顯著的滯后。培養(yǎng)原代肝細胞的標準方法只得到了能保持功能幾天時間的細胞；不過，很多試劑不會馬上表現(xiàn)出它們的毒性作用。例如，黃曲霉毒素，它是由霉菌產(chǎn)生的一種有毒代謝物，需要很多天時間才能在人體上表現(xiàn)出它的作用。因此，本發(fā)明的肝細胞可用于研究代謝的異生素的較長時間的長期作用。
目前，每年有超過140,000種藥物候選物被投入體外試驗，不過，只有很少幾種能夠上市。先導化合物的失敗在很大程度上是由于出乎預料的毒性，以及效力的缺乏。其表現(xiàn)更類似于體內條件的細胞培養(yǎng)模型，將大大加強并且促進管道藥物的候選物測試。在藥物開發(fā)期間可以將本發(fā)明的肝細胞用于確定候選化合物的毒性，必須測定所述化合物的肝臟毒性。這一目的可以在分離的肝細胞上實現(xiàn)，不過，如果所述毒性是在超過三天的長時間接觸之后出現(xiàn)，現(xiàn)有的肝細胞培養(yǎng)方法不能夠檢測所述毒性。使用本發(fā)明的肝細胞，可以監(jiān)測藥物候選物的長期作用。
本發(fā)明還提供了用具有改善了的長期功能的肝細胞篩選用于治療肝臟的候選藥物的方法。用于治療肝臟的藥物可以在本發(fā)明肝細胞的長期培養(yǎng)物中更好地測試；所述肝細胞的改善了的功能提供了對效能，有效性，和毒性的改善了的測試。
本發(fā)明還提供了將具有改善了的長期功能的肝細胞用在生物人工肝臟裝置上的方法。預計在下一個十年中，對有效的生物人工肝臟裝置的需要將會大大增加，這在很大程度上由于世界范圍內的肝炎感染的增加。
本發(fā)明還提供了將具有改善了的長期功能的肝細胞用于生產(chǎn)蛋白的方法，包括在肝細胞中內源表達的蛋白，如TNF-α和肝細胞生長因子(HGF)，用于治療和研究目的。
實施例1在新分離的肝細胞中的活性氧和氮類的調節(jié)，及其對肝細胞表型和功能的影響。
為了研究不同化合物對肝細胞功能和表現(xiàn)型的影響，按照本領域眾所周知的方法分離肝細胞，并且在膠原夾心結構中培養(yǎng)。通過添加2nM 3-甲基膽蒽(3-MC)誘導肝細胞。通過EROD分析方法測定CYP1A1，參見Pearce等，1996的描述。通過ELISA測定白蛋白分泌，參見Dunn等，1991的描述。使用本領域眾所周知的技術進行Western印跡分析，使用CYP1A1的抗體。
在圖1中示出了CYP lA1的誘導機制。圖2是表示各種治療的氧化還原作用控制機制的表格。
圖3是表示與未處理過的對照組相比，在用各種化合物處理并且培養(yǎng)16天時間的肝細胞中尿素合成的誘導倍數(shù)的曲線圖。
圖4是表示與未處理過的對照組相比，在用各種化合物處理并且培養(yǎng)8天時間的肝細胞中白蛋白分泌的誘導倍數(shù)的曲線圖。
圖5是表示與未處理過的對照組相比，在用各種化合物處理并且培養(yǎng)16天時間的肝細胞中誘導型CYP1A1活性的誘導倍數(shù)的曲線圖。
圖6是表示與未處理過的對照組相比，在用各種化合物處理并且培養(yǎng)14天時間的肝細胞中基礎CYP1A1活性的曲線圖。
圖7是表示3-MC處理過的肝細胞中，培養(yǎng)8天，12天和16天時間的CYP1A1的Western印跡。
以上實驗表明，抗氧化劑在原代肝細胞中增強CYPlA1的誘導性方面是有效的。NFkB核轉運對于肝細胞功能來說是重要的。一氧化氮的效果(通過抑制一氧化氮或提供一氧化氮檢測)是可檢測的，但是是很有限的。在抗氧化劑類型中，清除羥基自由基或增加細胞內谷胱甘肽在保持P450功能方面是最有效的。葡糖胺保護P450功能的機制正在研究之中，并且可以像抗氧化劑那樣起作用，這種觀點是基于以下發(fā)現(xiàn)在激活的巨噬細胞中，葡糖胺能抑制NO合成。
實施例2大鼠原代肝細胞分析了用本發(fā)明方法制備的大鼠原代肝細胞的功能。如圖8所示，測定了在處理過的和未處理過的大鼠原代肝細胞中EROD活性的平均增加倍數(shù)。所述數(shù)量是平均值，超過1.2的水平是顯著的。EROD是乙氧基試鹵靈O脫乙基酶活性，它又被稱為p450 CYPlAl，它是一種重要的藥物代謝酶，并且是原代肝細胞中普通藥物代謝活性的標記。
實施例3小鼠原代肝細胞還檢驗了使用本發(fā)明方法的小鼠原代肝細胞的功能。通過使用OTZ和生育酚琥珀酸酯，使用本發(fā)明的方法，我們能夠在分離之后，維持哺乳動物肝細胞超過50天時間，并且將EROD活性保持這么長的時間。參見圖9。在未處理過的組中幾乎沒有EROD活性，而在處理組中具有3.5倍的活性。試驗重復進行了四次，示出了平均值。
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本文所披露的所有文獻都被收作本文參考。
權利要求
1.一種用于培養(yǎng)原代肝細胞的方法，包括在存在抗氧化劑和第二種試劑的條件下對原代肝細胞進行鋪板，其中，所述第二種試劑是(1)產(chǎn)生活性氧類和活性氮類的酶的功能性抑制劑，(2)直接抑制所述活性氧類和活性氮類的試劑，或(3)增加細胞內谷胱甘肽的試劑，其中，所述原代肝細胞能夠保持功能至少5天時間。
2.如權利要求1的方法，其中，所述抗氧化劑是生育酚琥珀酸酯或羥基自由基清除劑。
3.如權利要求2的方法，其中，所述羥基自由基清除劑是甘露醇。
4.如權利要求1的方法，其中，所述第二種試劑是谷胱甘肽前體或一氧化氮抑制劑。
5.如權利要求4的方法，其中，所述谷胱甘肽前體是2-氧-噻唑烷。
6.如權利要求4的方法，其中，所述一氧化氮抑制劑是NG-甲基精氨酸。
7.如權利要求1的方法，其中，所述抗氧化劑和第二種試劑是2-氧-噻唑烷和生育酚琥珀酸酯。
8.如權利要求1的方法，其中，所述抗氧化劑和第二種試劑是NG-甲基精氨酸和甘露醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于培養(yǎng)具有改善了的長期功能和改善了的存活力的原代肝細胞的方法，包括在存在抗氧化劑和作為能產(chǎn)生活性氧和活性氮類的酶的功能性抑制劑的試劑的條件下對所述肝細胞進行鋪板。一種優(yōu)選的實施方案提供了2－氧－噻唑烷和生育酚琥珀酸酯的組合。另一種特別優(yōu)選實施方案提供了N
文檔編號G01N33/50GK1685038SQ03823405
公開日2005年10月19日 申請日期2003年7月30日 優(yōu)先權日2002年7月30日
發(fā)明者J·K·利奇, S·R·坦嫩鮑姆 申請人:麻省理工學院