專利名稱：使用氨基糖苷類抗生素檢測prp的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過硫酸鏈霉素完全沉淀PrPsc的方法及其在免疫檢測或從液體或溶液中除去PrPsc中的應(yīng)用。
作為細(xì)胞朊病毒蛋白的天然或正常朊病毒蛋白，被命名為PrP或PrPc，是一種在哺乳動物的淋巴細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中廣泛表達(dá)的糖蛋白。
PrPc的構(gòu)象變化導(dǎo)致了有蛋白酶K抗性的PrPc的蛋白病原體的出現(xiàn)和增殖。將這種蛋白病原體一般稱為PrPsc或者PrPres。PrPsc在動物器官內(nèi)的積聚是多種疾病的起源，尤其是小型反芻動物的震顫病，麋鹿和羚羊的慢性惡病質(zhì)病(或者慢性消耗性病“CWD”)，牛的海綿狀腦病(ESB)和人的克-雅二氏病(MCJ)。
感染了ESB的牛在2至6年的潛伏期后才有延遲表現(xiàn)并且病癥發(fā)展緩慢，大大地減慢了流行病學(xué)模型的進(jìn)展。ESB通過攝食傳染人類，導(dǎo)致了一種新型克-雅二氏病(vMJC)的出現(xiàn)。
在發(fā)病以前看起來很健康的被感染動物體內(nèi)，尤其是患病動物的血液或尿液中很難檢測到蛋白病原體PrPsc。目前，已確認(rèn)人在攝取被感染組織時，用于人類消費(fèi)目的的動物中的PrPsc將傳染人類。因此，公共衛(wèi)生的一個主要目標(biāo)是通過檢測用于人類消費(fèi)目的的動物體內(nèi)PrPsc的存在以便將它們從食物鏈中除去，從而避免傳染。
因此，檢測生物學(xué)樣品或動物體內(nèi)PrPsc的存在已經(jīng)變得極為重要，幾個研究組正在研制免疫檢測方法(WO02/086511)。此外，為了治療vMJC，聯(lián)合使用肽、小分子或PrPsc抑制劑的方法組成了熱點(diǎn)研究的主題。然而，當(dāng)生物樣品中PrPsc的含量很低時，現(xiàn)有技術(shù)的方法總是難以通過可靠的方式鑒定PrPsc。
本發(fā)明人已經(jīng)證明氨基糖苷，優(yōu)選II類(group II)氨基糖苷，更優(yōu)選鏈霉素的一種新特性，證實(shí)了抗生素與PrPsc形成復(fù)合體并使之沉淀的能力。
因此，本發(fā)明人觀察到向多種動物來源且含有朊病毒的生物學(xué)樣品中加入氨基糖苷后，致使朊病毒的3條帶表觀分子量增加。觀察的結(jié)果和隨后的試驗(yàn)使發(fā)明人證實(shí)了氨基糖苷能與PrPsc形成復(fù)合體，這種復(fù)合能夠沉淀PrPsc，使得相對于本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的常規(guī)方法而言檢出PrPsc的可能性顯著增加。
因而，本發(fā)明的目的涉及通過沉淀濃縮PrPsc的方法，用于診斷朊病毒引起的疾病或者除去生物學(xué)液體中的朊病毒，其特征在于使源自或獲自動物或人類生物體的組織懸液或生物學(xué)液體懸液接觸抗生素，該抗生素優(yōu)選選自氨基糖苷類家族，更優(yōu)選鏈霉素。
更準(zhǔn)確地說，根據(jù)本發(fā)明的方法包括如下步驟a)向源自或獲自動物或人類生物體的組織懸液或生物學(xué)液體懸液中加入一種氨基糖苷，b)將該溶液置于合適的緩沖液中并加熱，然后離心得到的溶液，使底部和上清分離，c)電泳凝膠遷移、轉(zhuǎn)移和免疫檢測后檢測PrPsc。
本發(fā)明的方法也可包括使用一定劑量的蛋白酶，尤其是蛋白酶K消化樣品的附加步驟。因而，本發(fā)明的方法包括如下步驟a)向源自或獲自動物或人類生物體的組織懸液或生物學(xué)液體懸液中加入蛋白酶，例如蛋白酶K，b)加入一種氨基糖苷，c)將該溶液置于合適的緩沖液中并加熱，然后離心得到的溶液，使底部和上清分離，d)電泳凝膠遷移、轉(zhuǎn)移和免疫檢測后檢測PrPsc。
更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明的方法包括如下步驟a)在5％葡萄糖溶液中勻漿獲自動物或人類生物體的生物學(xué)液體或組織，制備10％的懸液，b)向100μl得到的懸液中加入蛋白酶K，然后在37℃孵育一小時，c)向懸液中加入一種氨基糖苷，然后在37℃再孵育一小時，d)將該溶液置于合適的緩沖液中并加熱，再離心得到的溶液，使底部和上清分離，e)將底部懸浮于50μl 50％v/v 8M的尿素溶液和Laemmli變性緩沖液中，該緩沖液如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685所述。劇烈旋渦振蕩后，混合物在100℃加熱5分鐘，12,000g離心，回收上清夜用于SDS-PAGE遷移，f)在電泳凝膠上遷移后，尤其是在如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685記載的15％的聚丙烯酰胺十二烷基硫酸鹽凝膠上的單向電泳后，蛋白質(zhì)通過電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后在室溫與識別由126-160個氨基酸組成的特異表位的單克隆抗體免疫印跡60分鐘。二抗(1/5000)是與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的山羊抗體(IgG H+L)；洗滌印跡膜，使用ECL試劑盒(Amersham)在膠片(Biomex light，Kodak)上檢測信號或者使用super Signal Ultra(Pierce)通過化學(xué)發(fā)光并在Fluor S.Multimager(BioRad)顯色檢測信號。
根據(jù)本發(fā)明的方法具有不需要超速離心的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的方法還涉及朊病毒蛋白與氨基糖苷形成復(fù)合體并通過氨基糖苷沉淀朊病毒蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，生物學(xué)組織源自或獲自大腦，或其它動物或人體組織，或獲自生物學(xué)液體，比如腦脊液或血清。
本發(fā)明方法所用蛋白酶是根據(jù)它消化存在的朊病毒蛋白的能力進(jìn)行選擇，包括其消化朊病毒蛋白的正常形式的能力，并且該酶不具備消化這個蛋白的病理形式的能力。優(yōu)選蛋白酶K。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，組織在與所述氨基糖苷接觸之前在葡萄糖溶液中勻漿。優(yōu)選用5％的葡萄糖溶液。
向生物學(xué)樣品與蛋白酶K和氨基糖苷作用得到的懸液中加入100μlLaemmli緩沖液后，加熱步驟相應(yīng)于溫度升高60-150℃，優(yōu)選約100℃。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，氨基糖苷是II類氨基糖苷，優(yōu)選鏈霉素或其衍生物。
本發(fā)明也涉及所述氨基糖苷在PrPsc的沉淀、檢測甚至免疫組織化學(xué)檢測和/或診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明也涉及所述氨基糖苷用于從生物學(xué)液體中除去PrPsc的應(yīng)用。
最后，本發(fā)明也涉及用于診斷與PrPsc有關(guān)的病變的試劑盒，其特征在于含有所述氨基糖苷。
以下實(shí)施例涉及當(dāng)生物學(xué)樣品與氨基糖苷接觸時對Pcrsc的檢測的放大作用，閱讀這些實(shí)施例后可顯而易見本發(fā)明的的其它優(yōu)點(diǎn)和特征。
實(shí)施例中的參照圖見后面的附圖。


圖1A是感染了震顫病的綿羊腦樣品中的PrPsc在不同數(shù)量的鏈霉素存在時，經(jīng)15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)移和免疫檢測后檢測結(jié)果的比較實(shí)施例。
圖1B是與遞增數(shù)量的鏈霉素混合前后，圖1中每條PrPsc帶測得的平均分子量的比較圖。
圖2是含有很多蛋白PrPsc的懸液在存在和不存在不同數(shù)量的鏈霉素時，經(jīng)第二個小時孵育后，對比上清和沉淀中的PrPsc經(jīng)15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)移和免疫檢測后檢測的實(shí)施例。
圖3顯示了向含有少量PrPsc的懸液中同時加入蛋白酶K和鏈霉素，結(jié)果是上清中的PrPsc消失，而沉淀中出現(xiàn)了PrPsc。
圖4A，4B和4C顯示了經(jīng)15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)移和免疫檢測后，當(dāng)加入的鏈霉素量增加時，PrPsc的檢測閾值增加。
圖5中的表涉及實(shí)施例5，顯示了使用本發(fā)明技術(shù)與使用參考技術(shù)獲得的97個動物腦中PrPsc的診斷結(jié)果的比較。
圖6顯示了用掃描探針顯微鏡(scanning probe microscopy，SPM)以非接觸模式得到的只有重組蛋白朊病毒(recPrP)(A)，有鏈霉素存在時的recPrP(B)和只有鏈霉素(C)的烘干膠片(dried film)圖像。
圖7A是患有克-雅二氏病的病人(MCJ+)和未患克—雅二氏病的病人(MCJ-)的腦脊液(LCR)樣品中蛋白朊病毒經(jīng)一定量范圍的鏈霉素處理后，經(jīng)12％bis-tris丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)移和免疫檢測后，檢測結(jié)果的比較實(shí)施例。圖7B列出了圖7A中各泳道的樣品。
圖8顯示了用一定濃度范圍內(nèi)蛋白酶K消化或者未消化和經(jīng)鏈霉素處理或者未處理后，MJC的LCR(+)和LCR(-)樣品Western印跡的結(jié)果。免疫顯色通過抗朊病毒抗體證實(shí)。圖8B列出了圖8A中各泳道的樣品。
下面實(shí)施例2，3中的生物學(xué)樣品是在5％葡萄糖溶液中勻漿牛腦獲得的。在后面的試驗(yàn)中，100μl這種懸液相當(dāng)于10mg腦組織。這樣，每個加入了蛋白酶K的樣品均由100μl組成。37℃孵育一小時后，加入或者不加鏈霉素。旋渦振蕩溶液，37℃再孵育一小時。加入100μl變性Laemmli緩沖液后，混合物在100℃加熱5分鐘，然后以12,000g離心5分鐘，回收上清用于SDS-PAGE遷移。底部也被回收并加入50μl 50％v/v8M尿素溶液和Laemmli緩沖液的溶液。經(jīng)劇烈旋渦振蕩后，混合物在100℃加熱5分鐘，以12,000g離心5分鐘，回收上清用于SDS-PAGE遷移。
實(shí)施例1實(shí)施例1涉及圖1A和1B的相關(guān)試驗(yàn)，其中遞增濃度的(0μg，62.5μg，125μg，500μg和2000μg)鏈霉素加到相當(dāng)于從920μg患有震顫病的綿羊腦中提取的恒量PrPsc中，然后離心混合物。上清用Western印跡作免疫檢測(圖1A)，測量PrPsc條帶的平均分子量(圖1B)。結(jié)果表明，隨著鏈霉素量的增加，即由0，62.5，125，500，1000和2000μg的增長，可以觀察到在鏈霉素濃度最低時，非糖基化的蛋白條帶第一個出現(xiàn)了表觀分子量的增加。隨后復(fù)合的是單糖基化蛋白條帶，最后當(dāng)鏈霉素濃度達(dá)到最大時，復(fù)合雙糖基化蛋白。
特定濃度下結(jié)合每條PrPsc帶的鏈霉素分子的數(shù)量通過測定每條帶的分子量來估算。發(fā)明人推測當(dāng)有2000μg鏈霉素存在時，每條PrPsc帶增加的表觀分子量相當(dāng)于每條PrPsc帶吸附了10-12個鏈霉素分子。
實(shí)施例2實(shí)施例2涉及圖2的相關(guān)試驗(yàn)，其中遞增濃度的(0μl，5μl，10μl，和20μl)1g/ml的鏈霉素加到如上述方法制備的恒量生物學(xué)樣品中。當(dāng)沒有鏈霉素時，所有的PrPsc帶都鑒定為出現(xiàn)在上清中。它們應(yīng)該逐漸地并同時在底部和上清中被檢測到。上清中PrPsc的量逐漸減少，而沉淀中的量逐漸增加。加入20μl鏈霉素使PrPsc完全沉淀，所以只在沉淀中檢測到。
實(shí)施例3實(shí)施例3涉及圖3。
重復(fù)實(shí)施例2的試驗(yàn)，但是相同的腦樣品稀釋至實(shí)施例2的1/25，并在同時向腦懸液中加入蛋白酶K和鏈霉素后，孵育時間減至一小時。結(jié)果是當(dāng)沒有鏈霉素時，只在上清中檢測到PrPsc帶，而有任何濃度的鏈霉素存在時，只在底部中檢測到PrPsc帶。
實(shí)施例4實(shí)施例4涉及圖4A、4B和4C。
將感染了ESB的牛腦在5％葡萄糖溶液中勻漿，制成10％的勻漿物母液，以1∶2對該母液進(jìn)行系列稀釋，同一稀釋液制備3份，每管含有100μl相同的稀釋液。
第一組稀釋組中，每管加入體積為10μl的1μg蛋白酶K(從純液至1/64)。
第二組稀釋組中，每管同時加入5μl鏈霉素和體積為10μl的1μg蛋白酶K(從1/2至1/256)。
第三組稀釋組中，每管同時加入10μl鏈霉素和體積為10μl的1μg蛋白酶K(從1/2至1/256)。
所有管子在37℃孵育一小時，然后加入100μl Laemmli變性緩沖液。混合物在100℃加熱5分鐘，然后以12,000g離心5分鐘，回收第一組管的上清用于SDS-PAGE。除去第二組和第三組管的上清，每管中加入50μl 50％v/v 8M的尿素和Laemmli變性緩沖液。劇烈渦旋振蕩后，混合物在100℃加熱5分鐘，12,000g離心，回收第二組管和第三組管的上清。
圖4A顯示了當(dāng)沒有鏈霉素時，PrPsc的檢測極限值是1/16。
圖4B顯示了5μl鏈霉素存在時沉淀的PrPsc量檢測的PrPsc減小到1/128稀釋度，這說明檢測閾值有很大的提高。
圖4C顯示了10μl鏈霉素存在時沉淀的PrPsc量圖4C表明即使在最大稀釋度的樣品中(1/256)，檢測還是可能和典型的。
實(shí)施例5-比較實(shí)施例參考技術(shù)是基于1.2ml腦勻漿物的PrPsc抽提物之上的(Madec等，Microbia Pathogenesis，28(2000)，353-362)。將勻漿物擠過直徑0.4mm的針頭，然后每100mg腦組織用10μg蛋白酶K在37℃處理一小時。加入肌氨酰(10％)和10mM tris緩沖液(pH7.4)后，樣品在室溫孵育15分鐘，然后20℃在10％的蔗糖墊上以245,000g離心4小時(BeckmanTL 100超速離心機(jī))。最后，底部用50μl Laemmli變性緩沖液懸浮，在100℃加熱5分鐘，然后以12,000g再離心5分鐘?；厥丈锨逵糜赟DS-PAGE遷移。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，使用100μl如參考技術(shù)所述碾碎腦后得到的腦懸液。加入1μg蛋白酶K，混合物第一次孵育一小時。接著，加入20μl鏈霉素，混合物第二次孵育一小時。然后，加入100μl Laemmli變性緩沖液。在100℃加熱5分鐘，混合物以12,000g離心2分鐘。除去上清，加入50μl 50％v/v 8M的尿素和Laemmli變性緩沖液。劇烈渦旋振蕩后，混合物在100℃加熱5分鐘，12,000g離心2分鐘?；厥丈锨逵糜赟DS-PAGE遷移。
結(jié)果如表1所示?？偠灾?，使用硫酸鏈霉素可更好地檢測微陽性的情況，而且可避免長時間昂貴的超速離心。
實(shí)施例6recPrP(重組蛋白朊病毒)樣品通過用等體積的水或鏈霉素溶液(1g/ml)稀釋recPrP(42μM)溶液制得。單獨(dú)鏈霉素對照用0.5g/ml溶液制備。
在剛裂開的云母上放置10μl這種溶液，37℃干燥24小時制得樣品。
使用裝有三角架的100μm掃描儀的AFM ExplorerThermomicroscope以非接觸模式進(jìn)行圖象分析，其中用帶有硅氧烷探針的塔形懸臂的提高的共振頻率(F0＝320kHz)以1Hz頻率掃描。圖像處理使用SPMlab5.1軟件，不使用濾片。
從圖6中可以看出，單獨(dú)的recPrP的圖像表現(xiàn)出圓形聚集物的結(jié)構(gòu)特征。單獨(dú)的鏈霉素膠片表現(xiàn)出假晶體(pseudo-crystalline)表面的組織結(jié)構(gòu)。含有混合物的膠片表現(xiàn)出無定形表面沒有觀察到晶體或球形組織結(jié)構(gòu)。因此，鏈霉素和PrPsc之間的相互作用抑制了混合物的兩種成分的表面組織結(jié)構(gòu)特性。
實(shí)施例7從未患有MJC患者和患有MJC患者死后采集腦脊液(LCR)樣品，優(yōu)選為非溶血性且沒有細(xì)胞碎片。一份來自未患有MJC患者的LCR樣品和一份來自患有MJC患者的LCR樣品與0.05g/ml到0.2g/ml(0.05-0.1和0.2g/ml)濃度范圍之間的鏈霉素溶液接觸。經(jīng)過旋渦勻漿后(在旋渦器上勻漿)，樣品在37℃孵育1小時，然后以12,000g離心5分鐘。
得到的底部用蛋白抽提緩沖液重懸。在100℃加熱10分鐘后，樣品以12,000g再離心5分鐘。每個上清取15μl，進(jìn)行12％bis-tris丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE。用5μl經(jīng)變性緩沖液1/100稀釋的腦PrPsc提取物平行地作為陽性對照。提取物的制備方法按照診斷克-雅二氏病的參考方案。恒壓(200V)下在一次濃縮的電泳緩沖液中電泳40分鐘。然后在恒定功率(1W)下，將蛋白向用兩個石墨電極之間的半干系統(tǒng)激活的PVDF膜轉(zhuǎn)移1小時。直接免疫顯色用0.5μg/ml偶聯(lián)了辣根過氧物酶的抗朊病毒抗體AC23(它識別人PrP的145-154氨基酸區(qū)域和動物PrP的同源區(qū)域)完成。
圖7A顯示了不用蛋白酶K消化時，鏈霉素與蛋白朊病毒良好結(jié)合。事實(shí)上，用0.1g/ml和0.2g/ml的鏈霉素處理后，觀察到一條唯一帶，它的表觀分子量變化與鏈霉素濃度成比例。對0.1g/ml鏈霉素而言，該帶的表觀大小約為50kDa。此外，帶的輪廓(彎曲的方向，衰減)表明了分子的聚集。
實(shí)施例8一份來自未患有MJC的患者的LCR和一份來自患有MJC的患者的LCR用0.5μg/ml或1μg/ml的蛋白酶K消化。平行地，等份的每個樣品不用蛋白酶K消化。輕微攪動下，37℃消化1小時。消化后，樣品在終濃度為50mg/ml的鏈霉素存在下37℃孵育一小時，然后以12,000g離心5分鐘。
然后，按照實(shí)施例7的流程抽提蛋白，通過在蛋白變性緩沖液的存在下加熱使蛋白變性并用Western印跡分析。直接免疫顯色用偶聯(lián)了辣根過氧物酶的抗體AC23(0.5μg/ml)完成。
圖8A顯示了樣品用鏈霉素處理時，觀察到一條單個低密度帶。在不用蛋白酶K消化時，僅陰性樣品中可見一條約35kDa表觀分子量的帶(LCR(-)凝膠中第5道)，然而陽性樣品中無論使用何種濃度的蛋白酶(LCR(+)凝膠中第5，6和7道)，抗性形式的蛋白朊病毒都是可見的。
通過使用鏈霉素使LCR中蛋白朊病毒的檢測成為可能。事實(shí)上，不用蛋白酶K消化檢測的總PrP(細(xì)胞的和病理的)由于鏈霉素的存在而被放大，而且PrPsc出乎意料地被優(yōu)先檢測。用蛋白酶K消化后，本技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在未患有克-雅二氏病的患者的LCR和患有相同病的患者的LCR之間表現(xiàn)出顯著不同的信號。因此，鏈霉素對生物學(xué)液體中PrPsc的檢測非常重要。
此外，氨基糖苷比如鏈霉素可用于通過接觸氨基糖苷而沉淀PrPsc從而除去PrPsc。
權(quán)利要求
1.一種檢測PrP、特別是PrPsc的方法，其特征在于使源自或獲自動物或人類生物體的組織或生物學(xué)液體接觸抗生素，該抗生素優(yōu)選選自氨基糖苷類家族。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于a)向源自或獲自動物或人類生物體的組織懸液或生物學(xué)液體懸液中加入一種氨基糖苷，b)將該溶液置于合適的緩沖液中并加熱，然后離心所得到的溶液，并使底部和上清分離，c)電泳凝膠遷移、轉(zhuǎn)移和免疫檢測后檢測PrPsc。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于a)向源自或獲自動物或人類生物體的組織懸液或生物學(xué)液體懸液中加入蛋白酶K，b)加入一種氨基糖苷，c)將該溶液置于合適的緩沖液中并加熱，然后離心所得到的溶液，并使底部和上清分離，d)電泳凝膠遷移、轉(zhuǎn)移和免疫檢測后檢測PrPsc。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述生物學(xué)組織來自或獲自動物或人的腦部或其它組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其特征在于所述蛋白酶是蛋白酶K。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其特征在于在與所述氨基糖苷接觸前，將所述組織或生物學(xué)液體在葡萄糖溶液中勻漿。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其特征在于加熱步驟相應(yīng)于使溫度升高60-150℃之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述氨基糖苷是II類氨基糖苷。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述氨基糖苷是鏈霉素。
10.氨基糖苷在PrPsc的沉淀、檢測和/或診斷的應(yīng)用，甚至在免疫組織化學(xué)檢測中。
11.氨基糖苷用于從組織或生物學(xué)液體中除去PrPsc的應(yīng)用。
12.用于診斷與PrPsc相關(guān)的病變的試劑盒，其特征在于含有氨基糖苷。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其特征在于所述氨基糖苷是II類氨基糖苷。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的試劑盒，其特征在于所述氨基糖苷是鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過沉淀濃縮PrP
文檔編號G01N33/68GK1729396SQ200380106773
公開日2006年2月1日 申請日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者阿利·穆薩, 安東尼·威廉·科爾曼, 安娜·本奇克－雷尼耶, 帕特里克·沙阿加爾蒂安, 埃爾韋·佩龍, 安布魯瓦茲·馬丁 申請人:法國食品衛(wèi)生安全署, 國立科學(xué)研究中心, 克洛德·貝納爾－里昂大學(xué), 生物梅里埃公司