專(zhuān)利名稱(chēng)：抗體或嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的臭氧產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及通過(guò)檢測(cè)抗體介導(dǎo)的或嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的活性氧類(lèi)的產(chǎn)生而在體內(nèi)或體外檢測(cè)免疫或炎性反應(yīng)的領(lǐng)域。本發(fā)明還提供了通過(guò)檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞-介導(dǎo)的活性氧類(lèi)的產(chǎn)生而檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞活化的方法。本發(fā)明還涉及鑒定能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)或調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞活化的試劑的方法。
背景整個(gè)上世紀(jì)的研究已經(jīng)形成了關(guān)于抗體在免疫系統(tǒng)中的作用的一致認(rèn)識(shí)。該認(rèn)識(shí)的本質(zhì)是抗體分子不產(chǎn)生任何可檢測(cè)的產(chǎn)物。相反，抗體分子已經(jīng)被當(dāng)作一種結(jié)合分子，它僅標(biāo)記其靶標(biāo)或者僅活化其它分子或生物系統(tǒng)以應(yīng)答抗原-抗體復(fù)合體。因此，已經(jīng)認(rèn)為抗體自身不具有任何催化活性而僅用來(lái)標(biāo)記外源物質(zhì)以通過(guò)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)和/或吞噬作用進(jìn)行去除(Arlaud等，Immunol. Today，8，106-111(1987)；Sim和Reid，Immunol.Today，12，307-311(1991))。
而且，盡管嗜中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)對(duì)于破壞侵入機(jī)體的細(xì)菌是必需的，但不適當(dāng)?shù)氖戎行粤＜?xì)胞活化還能夠引起幾個(gè)問(wèn)題。例如，如果嗜中性粒細(xì)胞在吸引至肺時(shí)是嚴(yán)格接觸過(guò)抗原的，它們能夠?qū)⑵茐男悦割?lèi)釋放入肺組織。這能夠?qū)е鲁扇撕粑狡染C合征(ARDS)(Weiland等，Amer.Rev.Respir.Dis.，133218-225，1986；Idell等，Am.Rev.Respir.Dis.，1321098-1105，1985)。每年有150,000到200,000個(gè)美國(guó)人患有ARDS，既使是最好的臨床設(shè)施死亡率仍為50-80％(Balk和Bone，1983)。ARDS起因于細(xì)菌感染，血壓突然嚴(yán)重下降(休克)，以及對(duì)身體的多種其他損傷。
因此，需要改進(jìn)的方法從而使能夠快速并有效地檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞活化、炎性反應(yīng)和其他免疫反應(yīng)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了利用新近發(fā)現(xiàn)的抗體和嗜中性粒細(xì)胞還原單線(xiàn)態(tài)氧為活性氧類(lèi)的能力的方法。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)暴露于單線(xiàn)態(tài)氧(1O2*)時(shí)，抗體和嗜中性粒細(xì)胞能夠產(chǎn)生臭氧(O3)和其它活性氧類(lèi)?？贵w實(shí)現(xiàn)此種轉(zhuǎn)換不需要免疫系統(tǒng)的其它任何成分，也就是不需要補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)或吞噬作用。而且，根據(jù)本發(fā)明，由抗體包被的哺乳動(dòng)物白細(xì)胞諸如嗜中性粒細(xì)胞也能夠產(chǎn)生臭氧。
因此本發(fā)明提供了基于直接檢測(cè)活性氧類(lèi)的經(jīng)改進(jìn)測(cè)定方法，該活性氧類(lèi)是通過(guò)抗體催化和嗜中性粒細(xì)胞催化的反應(yīng)產(chǎn)生的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了測(cè)定哺乳動(dòng)物中免疫反應(yīng)或炎性反應(yīng)的方法，包括(a)施用活性氧類(lèi)的適當(dāng)化學(xué)探針；(b)從哺乳動(dòng)物獲得樣品；和(c)分析樣品中化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了嗜中性粒細(xì)胞活化的體外測(cè)定方法，包括(a)從哺乳動(dòng)物獲得嗜中性粒細(xì)胞樣品；(b)活化嗜中性粒細(xì)胞樣品中的嗜中性粒細(xì)胞；和(c)觀察在嗜中性粒細(xì)胞樣品中是否能夠檢測(cè)到活性氧類(lèi)。
也在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定能夠調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞活性的試劑的方法，其包括(a)從哺乳動(dòng)物獲得嗜中性粒細(xì)胞樣品；(b)將嗜中性粒細(xì)胞樣品暴露于測(cè)試試劑；(c)活化嗜中性粒細(xì)胞樣品中的嗜中性粒細(xì)胞；和(d)定量嗜中性粒細(xì)胞樣品所產(chǎn)生的活性氧類(lèi)的數(shù)量。
能夠被檢測(cè)的活性氧類(lèi)包括任何抗體或嗜中性粒細(xì)胞所產(chǎn)生的活性氧類(lèi)。例子包括，但不限于，超氧自由基(O2-)、羥自由基(OH·)、氫過(guò)氧自由基(peroxyl radical)、過(guò)氧化氫(H2O2)或臭氧(O3)。此種強(qiáng)活性氧類(lèi)的存在預(yù)示著增強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)(例如增加的循環(huán)抗體)或增強(qiáng)的細(xì)胞或組織相關(guān)的炎性反應(yīng)(例如嗜中性粒細(xì)胞活化)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1說(shuō)明氧依賴(lài)的吞噬細(xì)胞殺微生物作用。標(biāo)出了1O2和O2·-的互變。該活性也是抗體固有能力。
圖2說(shuō)明參與除臭劑紅(amplex red)測(cè)定的化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟?？贵w(在該圖式附圖中鑒定為IgG)將1O2轉(zhuǎn)化為O2·-，O2·-能夠自發(fā)形成過(guò)氧化氫。存在辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，過(guò)氧化氫脫乙?；⒀趸魟┘t底物，從而產(chǎn)生在587nm處發(fā)射熒光的分子。
圖3顯示存在(□)或缺乏(△)鼠單克隆抗體IgG EP2-19G2(20μM)時(shí)在PBS(pH7.4)中H2O2產(chǎn)生的最初時(shí)間過(guò)程。誤差線(xiàn)表示數(shù)據(jù)偏離平均值的范圍。
圖4顯示紫外線(xiàn)照射后鼠抗體1D4 Fab片段單晶體的熒光顯微照片和使用除臭劑紅試劑檢測(cè)H2O2。
圖5說(shuō)明抗體-介導(dǎo)的活性氧類(lèi)催化作用的時(shí)間過(guò)程和所需要的反應(yīng)條件。圖5A提供了當(dāng)存在(○)或缺乏(◆)31127抗體(馬IgG，20μM)時(shí)，使用血卟啉(40μM)和可見(jiàn)光在PBS(pH7.4)中形成H2O2的時(shí)間過(guò)程。圖5B提供了當(dāng)存在1127抗體(馬IgG，6.7μM)時(shí)在無(wú)添加物的PBS(pH7.4)(□)或含NaN3的PBS(pH7.4)(O，100μM)或PBS(pH7.4)的D2O溶液(◇)中使用血卟啉(40μM)和可見(jiàn)光產(chǎn)生H2O2的時(shí)間過(guò)程。圖5C說(shuō)明了抗體蛋白質(zhì)濃度(31127，馬IgG)對(duì)H2O2形成速率的影響。圖5D說(shuō)明氧濃度對(duì)通過(guò)31127抗體(馬IgG，6.7μM)的H2O2產(chǎn)生速率的影響。全部點(diǎn)為至少兩次重復(fù)測(cè)定的平均值。誤差線(xiàn)是實(shí)驗(yàn)測(cè)量值偏離平均值的范圍。
圖6是顯示所測(cè)得的一組蛋白質(zhì)的最初H2O2形成速率的條形圖并與抗體相比較(數(shù)據(jù)來(lái)自表1)。全部點(diǎn)為至少兩次重復(fù)測(cè)定的平均值。誤差線(xiàn)是實(shí)驗(yàn)測(cè)量值偏離平均值的范圍。OVA，雞蛋卵清蛋白；SOD，超氧化物歧化酶。
圖7A說(shuō)明在PBS(pH7.4)中馬IgG(6.7μM)的紫外線(xiàn)照射下的H2O2的形成速率。圖7B說(shuō)明馬IgG在326nm(激發(fā)＝280nm)下的熒光發(fā)射，同時(shí)測(cè)量H2O2形成。
圖8表明抗體在多種條件下的H2O2的產(chǎn)生。
圖8A說(shuō)明通過(guò)免疫球蛋白和非免疫球蛋白的H2O2的產(chǎn)生。測(cè)定是通過(guò)對(duì)透照燈(Fischer Biotech)上的密封玻璃瓶管內(nèi)磷酸緩沖鹽(PBS)[10mM磷酸鈉，150mM NaCl(pH7.4)]中的單種抗體/蛋白質(zhì)樣品(100 L，6.7μM)在20EC的環(huán)境氧條件下進(jìn)行近紫外照射(312nm，800μWcm-2)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中以一定的時(shí)間間隔取出各等份(10μL)。通過(guò)除臭劑紅方法測(cè)定H2O2濃度。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)報(bào)道為至少兩次重復(fù)測(cè)量的平均值±SEM●多克隆(poly)免疫球蛋白(Ig)G，人；O poly-IgG，馬；□poly-IgG，綿羊；單克隆(m)IgG(WD1-6G6)，鼠；△poly-IgM，人；◇mIgG(92H2)，鼠；■β-半乳糖苷酶(β-gal)；▲雞卵清蛋白(OVA)；α-乳清蛋白(α-lact)；◆牛血清清蛋白(BSA)。
圖8B說(shuō)明通過(guò)綿羊-IgG(6.7μM，200μL)長(zhǎng)期產(chǎn)生H2O2。在96-孔石英板的一個(gè)密封孔內(nèi)的PBS中近紫外照射8小時(shí)。H2O2濃度如圖8A所述進(jìn)行測(cè)定。
圖8C表明過(guò)氧化氫酶隨著時(shí)間對(duì)抗體催化的H2O2產(chǎn)生的影響。鼠單克隆抗體PCP-21H3(IgG)(6.7μM，200μL)溶液，在96-孔石英板的一個(gè)密封孔內(nèi)的PBS中被照射510分鐘。通過(guò)除臭劑紅方法測(cè)定H2O2并且然后通過(guò)加入固化于Eupergit C上的過(guò)氧化氫酶(10mg，288mU)將H2O2破壞掉。通過(guò)過(guò)濾將過(guò)氧化氫酶去除并將抗體溶液再次照射420分鐘。形成速率(0-510分鐘)＝0.368μM分鐘-1(r2＝0.998)；形成速率(511-930分鐘)＝0.398μM分鐘-1(r2＝0.987)。
圖8D表明H2O2濃度對(duì)馬poly-IgG抗體催化的最大形成速率百分比的影響。此圖可以確定H2O2對(duì)馬poly-IgG光致H2O2產(chǎn)生的IC50。用多種濃度H2O2(0-450μM)孵育馬IgG溶液(6.7μM)并且如圖8A中所述測(cè)定H2O2的起始形成速率。該圖是H2O2形成速率對(duì)H2O2濃度的曲線(xiàn)圖并顯示IC50為225μM。
圖8E表明H2O2對(duì)H2O2的抗體光致產(chǎn)生的長(zhǎng)期抑制作用和去除H2O2后其活性的完全重建。分析涉及馬poly-IgG(6.7mM在PBS pH7.4中)在H2O2(450μM)存在下的持續(xù)360分鐘的起始U.V.照射。H2O2隨后被過(guò)氧化氫酶(固定化于Eupergit C)去除并且poly-IgG樣品用UV線(xiàn)再次進(jìn)一步照射480分鐘。在每個(gè)測(cè)定中的H2O2的形成用除臭劑紅測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
圖8F表明過(guò)氧化氫酶對(duì)H2O2產(chǎn)生的影響。如圖8C所述αβ-TCR(6.7μM，200μL)溶液被照射360、367和389分鐘。測(cè)定了每次照射所產(chǎn)生的H2O2并且如圖8C所述將產(chǎn)生的H2O2破壞掉。形成速率(0-360分鐘)＝0.693μM分鐘-1(r2＝0.962)。在發(fā)展曲線(xiàn)中高于200μM的曲率與預(yù)期的被H2O2的抑制一致(見(jiàn)后)；形成速率(361-727分鐘)＝0.427μM分鐘-1(r2＝0.987)；形成速率(728-1117分鐘)＝0.386μM分鐘-1(r2＝0.991)。
圖9表明天然4C6 Fab(彩圖中的亮藍(lán)和粉紅)和H2O2存在時(shí)的4C6Fab(彩圖中的深藍(lán)和紅色)疊置。
對(duì)于圖9A，將天然4C6晶體在4mM H2O2中浸泡3分鐘，并且立即速凍以在SSRL BL9-1上收集數(shù)據(jù)。在H2O2存在時(shí)清楚地保存了二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的整體結(jié)構(gòu)完整性(RMSD Cα＝0.33，側(cè)鏈＝0.49)。在CNS中計(jì)算RMSD。
圖9B說(shuō)明苯甲酸結(jié)合到Fab 4C6。高分辨率X射線(xiàn)結(jié)構(gòu)顯示Fab 4C6可與苯甲酸進(jìn)行交叉反應(yīng)。有和沒(méi)有H2O2的4C6結(jié)合位點(diǎn)的疊置表明甚至結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的側(cè)鏈構(gòu)象也是保守的(在彩圖中亮色和暗色側(cè)鏈分別對(duì)應(yīng)+和-H2O2)。而且，苯甲酸的清晰電子密度表明Fab 4C6的結(jié)合特性在4mMH2O2中保持不變。電子密度圖是在1.5σ處所描繪的2fo-fcσ加權(quán)圖，并且在Bobscript中產(chǎn)生圖。
圖10A顯示在二極管陣列HP8452A分光光度計(jì)于Absmax280nm處測(cè)量的馬多克隆IgG的吸收光譜。
圖10B提供了馬多克隆IgG的作用光譜，在波長(zhǎng)260和320nm之間的作用光譜表明H2O2形成的最大活性在280nm處。重復(fù)進(jìn)行測(cè)定并且該測(cè)定涉及將抗體溶液[6.7μM溶于PBS(pH7.4)]加入到石英管中，然后將該石英管放置于SLM熒光分光光度計(jì)的氙弧燈和單色器所產(chǎn)生的光束中1小時(shí)。通過(guò)除臭劑紅測(cè)定法測(cè)量H2O2濃度。
圖11A說(shuō)明隨著時(shí)間由色氨酸(20μM)產(chǎn)生H2O2。產(chǎn)生條件和測(cè)定步驟如圖8A所述。
圖11B提供了氯離子對(duì)抗體-介導(dǎo)的光致H2O2產(chǎn)生的影響。將綿羊poly-IgG■(6.7μM，200μL)或馬poly-IgG▲(6.7μM，200μL)的溶液冷凍干燥至干燥并且然后將其溶于去離子水或NaCl(水溶液)中，以至于氯離子的終濃度為0-160mM。然后將樣品在20 EC環(huán)境氧條件下于透照燈(800μWcm-2)的密封玻璃管內(nèi)進(jìn)行照射并重復(fù)。在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中取出多個(gè)等份(10μL)并通過(guò)除臭劑紅測(cè)定法測(cè)定H2O2濃度。H2O2形成速率描繪為每種抗體樣品對(duì)[NaCl]的平均值±S.E.M.。
圖11C說(shuō)明在含EDTA緩沖液中透析對(duì)抗體-介導(dǎo)的光致產(chǎn)生H2O2的影響。將在含EDTA(20mM)的PBS中透析之前和之后的兩個(gè)抗體制劑即鼠單克隆抗體PCP21H3和馬多克隆IgG的H2O2光產(chǎn)生進(jìn)行比較。產(chǎn)生條件和測(cè)定步驟如圖8A所述。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)報(bào)道為至少重復(fù)測(cè)量的平均值±SEM[●透析之前鼠mIgG PCP21H3；■透析之后鼠mIgG PCP21H3；▲透析之前馬poly-IgG；◆透析之后馬poly-IgG]。
圖12提供了用含16O的H2O2或用含18O的H2O2對(duì)底物三羧乙基膦(TCEP)的氧化作用的質(zhì)譜。ESI(陰極)質(zhì)譜被作為H2O2氧化作用后的TCEP[(M-H)-249]及其氧化物[(M-H)-265(16O)和(M-H)-267(18O)]的質(zhì)譜。
圖12A提供了在H218O(98％18O)PB中16O2有氧條件下照射綿羊poly-IgG(6.7/μM)后TCEP及其氧化物的質(zhì)譜。產(chǎn)生了含16O的TCEP(在265處較大的峰)和含18O的TCEP(在267處較小的峰)的混合物。
圖12B提供了在H216OPB中富含18O2(90％18O)有氧條件下照射綿羊poly-IgG(6.7μM)后TCEP及其氧化物的質(zhì)譜。產(chǎn)生了含16O的TCEP(在265處較小的峰)和含18O的TCEP(在267處較大的峰)的混合物。
圖12C提供了在H216OPB中16O2有氧條件下進(jìn)行poly-IgG照射后TCEP及其氧化物的質(zhì)譜。測(cè)定條件和步驟如方法和材料(實(shí)施例II)中所述除了由H216O替換H218O。僅觀察到含16O的TCEP(在265處的大峰)。
圖12D提供了在20EC于H218OPB中缺氧條件下(脫氣并在氬氣條件下)照射綿羊poly-IgG(6.7μM)和H216O2(200μM)后TCEP及其氧化物的質(zhì)譜。TCEP的加入如方法和材料(實(shí)施例II)中所述。僅觀察到含16O的TCEP(在265處的大峰)。
圖12E提供了在H218OPB中16O2有氧條件下照射3-甲基吲哚(500μM)后TCEP及其氧化物的質(zhì)譜。僅觀察到含16O的TCEP(在265處的大峰)。測(cè)定條件和步驟如方法和材料(實(shí)施例II)中所述，除了由于3-甲基吲哚的分子量太小而不進(jìn)行大小排除過(guò)濾之外。因此，將TCEP加入至含3-甲基吲哚的PB溶液中。
圖12F提供了在H218OPB中16O2有氧條件下照射β-gal(50μM)后TCEP及其氧化物的質(zhì)譜。僅觀察到含16O的TCEP(在265處的大峰)。測(cè)定條件和步驟如方法和材料(實(shí)施例II)中所述。
圖13顯示如材料和方法(實(shí)施例II)中所述的抗體4C6內(nèi)的Xe結(jié)合位點(diǎn)。
圖13A提供了彩圖中以粉色的輕鏈和藍(lán)色的重鏈表示的Fab 4C6 Cα示蹤的標(biāo)準(zhǔn)側(cè)視圖。使用在5σ處描繪的最初Fo-Fc電子密度圖顯示三個(gè)結(jié)合的氙原子(彩圖中的綠色)。
圖13B提供了保守的氙位點(diǎn)1周?chē)腇ab 4C6和2CαβTCR(PDB/TCR)的覆蓋面圖。VL(彩圖中的粉色)和側(cè)鏈(彩圖中的黃色)的示蹤骨架Cα與2CαβTCR相應(yīng)的Vα(彩圖中的紅素和金色)是重疊的(使用Insight2000產(chǎn)生的圖)。
圖14圖解說(shuō)明通過(guò)抗體殺死細(xì)菌。
圖14A提供了顯示在不同實(shí)驗(yàn)條件下大腸桿菌XL1-blue和O112a，c菌株的存活率的柱形圖。存活率報(bào)道為恢復(fù)的菌落形成單位(CFU)，以實(shí)驗(yàn)開(kāi)始(t＝0分鐘)處的CFU的百分?jǐn)?shù)表示。黑色柱和淺灰色柱對(duì)應(yīng)相同實(shí)驗(yàn)條件，除了淺灰色組(2，4，6，8，10和12)暴露于可見(jiàn)光(2.7mWcm-2)60分鐘，而黑色組(1，3，5，7，9和11)放置于黑暗60分鐘。細(xì)菌細(xì)胞密度為大約107個(gè)細(xì)胞/mL。所報(bào)道的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是在以下條件下大腸桿菌XL1-blue(組1-6)和O112a，c(組7-12)的平均值±S.E.M.(n＝6)。組1-2XL1-blue細(xì)胞置于PBS中，pH7.4，4℃。組3-4HPIX(40μM)，PBS中的XL1-blue細(xì)胞，pH7.4，4℃。組5-6XL1-blue-特異單克隆抗體(25D11，20μM)、血卟啉IX(40μM)、XL1-blue細(xì)胞置于PBS，pH7.4，4℃。組7-8 O112a，c細(xì)胞置于PBS，pH7.4，4℃。組9-10HPIX(40°M)，O112a，c細(xì)胞置于PBS，pH7.4，4℃。組11-12 O112a，c-特異單克隆抗體(15404，20μM)、血卟啉IX(40μM)、O112a，c細(xì)胞置于PBS，pH7.4，4℃。
圖14B圖解說(shuō)明抗體濃度對(duì)大腸桿菌O112a，c存活率的影響。所用抗體為O112a，c-特異單克隆抗體15404。所報(bào)道的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是平均值±S.E.M(n＝3)。對(duì)應(yīng)50％細(xì)胞殺傷(EC50)的15404抗體濃度為81±6nM。
圖14C圖解說(shuō)明照射時(shí)間對(duì)大腸桿菌XL1-blue-特異鼠單克隆抗體12B2的殺菌作用的影響。該圖提供了當(dāng)存在血卟啉IX(40μM)和12B2(20μM)時(shí)大腸桿菌XL1-blue的存活率與照射時(shí)間(2.7mWcm-2)的關(guān)系。所報(bào)道的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是平均值±S.E.M(n＝3)。對(duì)應(yīng)50％細(xì)胞殺傷的照射時(shí)間為30±2分鐘。
圖14D說(shuō)明抗體驅(qū)動(dòng)殺菌作用對(duì)血卟啉IX濃度的依賴(lài)性。所用抗體為大腸桿菌XL1-blue-特異鼠單克隆抗體25D11。該圖提供了暴露于一定血卟啉IX濃度范圍與大腸桿菌XL1-blue的存活率的關(guān)系。使用了以下條件XL1-blue細(xì)胞置于PBS，pH7.4，4℃，黑暗60分鐘(＞)。XL1-blue細(xì)胞置于PBS，pH7.4，4℃，白光(2.7mWcm-2)(△)。25D11(20μM)，XL1-blue細(xì)胞置于PBS，pH7.4，4℃，黑暗60分鐘(◆)。25D11(20μM)，XL1-blue細(xì)胞置于PBS，pH7.4，4℃白光(2.7mWcm-2)照射60分鐘(◇)。
圖15提供了大腸桿菌O112a，c細(xì)胞暴露于置于PBS中的抗原特異的鼠單克隆IgG(15404，20μM)、血卟啉IX(40μM)并可見(jiàn)光4℃照射1小時(shí)(＜5％存活)后，大腸桿菌O112a，c細(xì)胞的電子顯微鏡照片。為了看到抗體吸附的位點(diǎn)，在完成殺菌測(cè)定之后加入金標(biāo)記的山羊抗鼠抗體。觀察到抗原非特異性抗體的殺菌活性潛能與抗原特異性抗體非常相似。一般在該測(cè)定系統(tǒng)中20μM抗體(非特異)殺菌率為＞95％。
圖16A-C提供了大腸桿菌XL-1 blue細(xì)胞暴露于PBS中的非特異性鼠單克隆IgG抗體(84G3，20μM)、血卟啉IX(40μM)并可見(jiàn)光4℃照射1小時(shí)(1％存活)后，大腸桿菌XL-1 blue細(xì)胞的電子顯微鏡照片。圖16A中的箭頭指向細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物的初步分離。圖16D提供了血清型大腸桿菌O112a，c細(xì)胞暴露于PBS中的抗原特異的鼠單克隆IgG(15404，20μM)、血卟啉IX(40μM)并可見(jiàn)光室溫照射1小時(shí)(＜5％存活)后，血清型大腸桿菌O112a，c細(xì)胞的電子顯微鏡照片。使用本領(lǐng)域中可用的方法進(jìn)行金標(biāo)記。
圖17A說(shuō)明了過(guò)氧化氫酶對(duì)抗體針對(duì)大腸桿菌XL1-blue的殺菌作用的影響[報(bào)道為恢復(fù)的菌落形成單位(CFU)，以實(shí)驗(yàn)開(kāi)始(t＝0分鐘)時(shí)CFU的百分?jǐn)?shù)表示]。過(guò)氧化氫酶將H2O2轉(zhuǎn)化為水(H2O)和分子氧(O2)。每組用白光(2.7mWcm-2)4℃照射60分鐘。細(xì)菌細(xì)胞密度為～107個(gè)細(xì)胞/mL。實(shí)驗(yàn)組(1-7)處理如下組1大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞和血卟啉IX(40μM)置于PBS(pH7.4)。組2大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞和非特異鼠單克隆抗體84G3(20μM)置于PBS(pH7.4)。組3大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞、血卟啉IX(40μM)和單克隆抗體84G3(20μM)置于PBS(pH7.4)。組4大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞、血卟啉IX(40μM)、單克隆抗體84G3(20μM)和過(guò)氧化氫酶(13mU/mL)置于PBS(pH7.4)。組5大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞和特異兔多克隆抗體(20μM)置于PBS(pH7.4)。組6大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞、血卟啉IX(40μM)和特異兔多克隆抗體(20μM)置于PBS(pH7.4)。組7大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞、血卟啉IX(40μM)、特異兔多克隆抗體(20μM)和過(guò)氧化氫酶(13mU/mL)置于PBS(pH7.4)。每個(gè)點(diǎn)報(bào)道為多次實(shí)驗(yàn)(n＝6)的平均值±S.E.M.。符號(hào)**表示在相同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)對(duì)照p值＜0.01。在任意黑暗對(duì)照中均沒(méi)有觀察到殺菌活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖17B說(shuō)明H2O2對(duì)大腸桿菌XL1-blue和O112a，c血清型的濃度依賴(lài)性毒性。垂直帶陰影的線(xiàn)是使用上述用于圖14和Hofman等，Infect.Immun.68，449(2000)中的條件在60分鐘的孵育過(guò)程中通過(guò)抗體產(chǎn)生的預(yù)期H2O2的濃度。35±5μM H2O2的值是由至少兩次重復(fù)的12個(gè)不同單克隆抗體的測(cè)定所確定的平均值。
圖18說(shuō)明存在或缺乏過(guò)氧化氫酶時(shí)在u.v.照射(312nm，0.8mWcm-2)PBS(pH7.4)中的抗體期間自靛藍(lán)胭脂紅1(1mM)光致產(chǎn)生磺酸靛紅2的過(guò)程。Steinbeck等，J.Biol.Chem.267，13425(1992)。每個(gè)點(diǎn)報(bào)道為至少兩次重復(fù)測(cè)定的平均值±S.E.M.。使用Graphpad Prism v.3.0軟件進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。在以下條件下觀察了磺酸靛紅2(v)的形成速率綿羊多克隆IgG(20μM)(·)v＝34.8±1.8nM/分鐘；鼠單克隆抗體33F12(20μM)(□)v＝40.5±1.5nm/分鐘；綿羊多克隆IgG(20μM)和可溶過(guò)氧化氫酶(13mU/mL)(△)v＝33.5±2.3nM/分鐘；鼠單克隆抗體33F12(20μM)和可溶過(guò)氧化氫酶(13mU/mL)()v＝41.8±1.2nM/分鐘。
圖19A-C提供了在不同條件下室溫于H218O(＞95％18O)磷酸鹽緩沖液(PB，100mM，pH7.4)中靛藍(lán)胭脂紅1(1mM)氧化期間所產(chǎn)生的磺酸靛紅2[(MH)-226，(M-H)-228(18O)和(M-H)-(2×18O)]的電噴射離子化作用(陰極)質(zhì)譜。圖19A提供了在通過(guò)化學(xué)臭氧分解作用5分鐘氧化靛藍(lán)胭脂紅1(600μM于PB中)期間所產(chǎn)生的磺酸靛紅2的質(zhì)譜。圖19B提供了在通過(guò)用白光(2.7mWcm-2)照射血卟啉IX(40μM)和綿羊poly-IgG(20μM)4小時(shí)氧化靛藍(lán)胭脂紅1期間所產(chǎn)生的磺酸靛紅2的質(zhì)譜。圖19C提供了通過(guò)用白光(2.7mWcm-2)照射血卟啉IX(40μM)4小時(shí)氧化靛藍(lán)胭脂紅1期間所產(chǎn)生的磺酸靛紅2的質(zhì)譜。
圖20A說(shuō)明通過(guò)用PBS(pH7.4)中的肉豆蔻酸佛波酯(1μg/mL)在37℃活化人嗜中性粒細(xì)胞(PMN，1.5×107個(gè)細(xì)胞/mL)而氧化靛藍(lán)胭脂紅1(30μM)(＞)和形成2(□)的時(shí)間過(guò)程。使用未活化的PMN時(shí)無(wú)靛藍(lán)胭脂紅1氧化作用發(fā)生(數(shù)據(jù)未顯示)。如前所述制備嗜中性粒細(xì)胞。次氯酸(HOCl)是已知的由嗜中性粒細(xì)胞所產(chǎn)生的氧化劑。在我們的實(shí)驗(yàn)中，PBS(pH7.4)中的NaOCl(2mM)氧化1(100μM)但不斷裂1的雙鍵以產(chǎn)生磺酸靛紅2。
圖20B說(shuō)明在圖20A中所述條件下，通過(guò)活化人嗜中性粒細(xì)胞氧化靛藍(lán)胭脂紅1期間所產(chǎn)生的磺酸靛紅2的陰離子電噴射質(zhì)譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及抗體和嗜中性粒細(xì)胞具有中途攔截單線(xiàn)態(tài)氧并將其轉(zhuǎn)化為活性氧類(lèi)的能力的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，此類(lèi)活性氧類(lèi)是免疫活化、炎性反應(yīng)或嗜中性粒細(xì)胞活化的指示劑。由抗體和嗜中性粒細(xì)胞所產(chǎn)生的活性氧類(lèi)的例子包括，但不限于，臭氧(O3)、超氧自由基(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)或羥自由基(OH·)。
抗體和嗜中性粒細(xì)轉(zhuǎn)化單線(xiàn)態(tài)氧為活性氧類(lèi)的能力提供了一種用于檢測(cè)免疫活化、炎性反應(yīng)或嗜中性粒細(xì)胞活化的方法。因此，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)免疫活化、炎性反應(yīng)或嗜中性粒細(xì)胞活化的多種體外或體內(nèi)方法。也考慮了用于鑒定能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和/或嗜中性粒細(xì)胞活化的因子的方法。
定義縮略語(yǔ)(HP)血卟啉；(PBS)磷酸緩沖鹽；(OVA)雞蛋卵清蛋白；(SOD)超氧化物歧化酶；(PO)過(guò)氧化物酶；(phox)吞噬細(xì)胞氧化酶；(HRP)辣根過(guò)氧化物酶；(MS)質(zhì)譜分析；(AES)ICP-原子發(fā)射光譜法；(MS)質(zhì)譜；(QC)量子化學(xué)。
此處術(shù)語(yǔ)“試劑”用于指化學(xué)化合物，化學(xué)化合物的混合物，生物大分子，或由生物材料諸如細(xì)菌、植物、真菌或動(dòng)物(尤其是哺乳動(dòng)物)的細(xì)胞或組織制備的提取物。通過(guò)此處所述的篩選測(cè)定法對(duì)試劑作為抗體或嗜中性粒細(xì)胞調(diào)節(jié)劑的潛在活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“有效量”、“有效降低量”、“有效改善量”、“有效殺菌量”、“有效組織損傷抑制量”、“治療有效量”等等術(shù)語(yǔ)是鑒定足以獲得預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)例如疾病、失調(diào)、病癥等等的治療或疾病、失調(diào)、病癥等等的癥狀的減輕的量。在治療方法中抗體的此種有效量是導(dǎo)致降低、逆轉(zhuǎn)、改善或抑制微生物感染的量。
“工程抗體分子”是已經(jīng)通過(guò)重組技術(shù)所產(chǎn)生的多肽。此類(lèi)分子可包括能夠催化從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生至少一種活性氧類(lèi)的活性中心。此類(lèi)工程抗體分子可具有包含于多肽結(jié)構(gòu)內(nèi)的活性吲哚基。此種分子的吲哚基可以作為色氨酸殘基存在。工程抗體分子還可以包含非天然氨基酸和連接體以及模擬肽。工程抗體分子還包括進(jìn)行了修飾以去除活性中心以致于其基本上不能夠產(chǎn)生活性氧類(lèi)的抗體。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“表位”意思是指抗原中能與抗體的互補(bǔ)位結(jié)合的任何抗原決定簇。表位決定簇通常由諸如氨基酸或糖側(cè)鏈分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成并且通常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特性以及特異的電荷特性。抗原可包括多肽、脂肪酸、脂蛋白、脂類(lèi)、化學(xué)品、激素等等。在一些實(shí)施方案中，抗原包括，但不限于，來(lái)自諸如細(xì)菌的微生物或者諸如人免疫缺陷病毒、流感病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、人T-細(xì)胞白血病病毒等等病毒的蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，抗原包括，但不限于，表達(dá)于癌細(xì)胞例如肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、骨癌、白血病、淋巴瘤、腦癌等等的蛋白質(zhì)。本發(fā)明抗原還包括化學(xué)品例如乙醇、四氫大麻酚、LSD、海洛因、可卡因等等。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指增強(qiáng)或抑制本發(fā)明抗體或工程抗體分子的功能特性的能力。此種調(diào)節(jié)可以增加或降低通過(guò)抗體、嗜中性粒細(xì)胞或工程抗體分子所產(chǎn)生的至少一種活性氧類(lèi)。
“非天然”氨基酸包括D-氨基酸和天然情況下不存在的氨基酸，以4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴(lài)氨酸和其它此類(lèi)氨基酸和亞氨基酸為例進(jìn)行說(shuō)明。
術(shù)語(yǔ)“模擬肽”或“肽模擬物”描述肽類(lèi)似物，例如那些通常作為非肽藥物用于制藥工業(yè)的肽類(lèi)似物，其特性與模板肽的特性相似。(Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，1529(1986)和Evans等，J.Med.Chem.，301229(1987))。通常，模擬肽與示例多肽(即具有生物化學(xué)特性或藥理學(xué)活性的多肽)在結(jié)構(gòu)上是相似的，但具有一個(gè)或多個(gè)通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法任選地由連接鍵例如--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(順式或反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2-和--CH2SO--所替換的肽鍵。肽模擬物較天然多肽具有的優(yōu)點(diǎn)可以包括生產(chǎn)更加經(jīng)濟(jì)、更大的化學(xué)穩(wěn)定性、可改變的特異性、降低的抗原性和增強(qiáng)的藥理學(xué)特性，例如半壽期、吸收、潛能和效力。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“可藥用”、“生理可耐受”及其它們的語(yǔ)法學(xué)上的變體，當(dāng)它們指組合物、載體、稀釋劑和試劑時(shí)，可互換使用并代表能夠施用至或于哺乳動(dòng)物且不產(chǎn)生諸如惡心、頭暈、胃不舒服等等的不良生理效應(yīng)的物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”用于描述天然蛋白質(zhì)、肽、蛋白質(zhì)片段或者蛋白質(zhì)或多肽的類(lèi)似物。這些術(shù)語(yǔ)可互換使用。
如此處所使用術(shù)語(yǔ)“活性氧類(lèi)”意思是指抗體產(chǎn)生的氧類(lèi)。這些活性氧類(lèi)可以具有一個(gè)或多個(gè)不成對(duì)電子，或者因?yàn)樗鼈円子谂c其它分子發(fā)生反應(yīng)而是有活性的。此種活性氧類(lèi)包括但不限于超氧自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基、氫過(guò)氧自由基、臭氧和其它短壽命的與臭氧有著相同化學(xué)標(biāo)記的三氧加合物。
抗體的催化活性根據(jù)本發(fā)明，所有的抗體具有先前未認(rèn)識(shí)的抗體分子自身內(nèi)在的化學(xué)潛能。所有研究的抗體，不管其來(lái)源或抗原特異性，能夠轉(zhuǎn)化單線(xiàn)態(tài)氧為諸如臭氧(O3)、超氧自由基(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、氫過(guò)氧自由基或羥自由基的活性氧類(lèi)。因此更全面地認(rèn)識(shí)到抗體是一種值得注意的衍接分子，其正在被發(fā)展成為具有在脊椎動(dòng)物防御外來(lái)入侵者的前沿所發(fā)生的靶向和催化兩種功能。
從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生活性氧類(lèi)的能力存在于完整的免疫球蛋白和諸如Fab、F(ab′)2和Fv片段的抗體片段(見(jiàn)實(shí)施例)。這種活性不存在于包括RNaseA、超氧化劑物歧化酶和可以被氧化的包曼-畢爾克(Bowman-Birk)抑制劑蛋白質(zhì)在內(nèi)的其它分子(實(shí)施例1和表1)。同樣，該活性與分子中二硫化物的存在無(wú)關(guān)，縱使此種二硫化物充分富有能夠被氧化的電子(Bent等，J.Am.Chem.Soc.，872612-2619(1975))。
如果抗體是變性的則抗體從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生活性氧類(lèi)的能力將消失。這表明抗體的三維結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生過(guò)氧化物的還原過(guò)程有關(guān)。
以一種有效并且長(zhǎng)期的方式從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生活性氧類(lèi)的能力存在于免疫球蛋白和T細(xì)胞受體(實(shí)施例II，表1F)。T細(xì)胞受體享有一個(gè)與抗體相似排列的免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)域(Garcia等，Science，274209(1996))。然而，擁有這種結(jié)構(gòu)基序?qū)τ谫x子蛋白質(zhì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫的能力方面似乎不是必需的。β2-巨球蛋白是具有這種結(jié)構(gòu)基序的免疫球蛋白超家族的一員，不能夠產(chǎn)生過(guò)氧化氫(Welinder等，Mol.Immunol.，28177(1991))。
結(jié)構(gòu)研究還表明，在T細(xì)胞受體中發(fā)現(xiàn)的保守的色氨酸殘基存在于與在抗體中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)域中。在抗體和T細(xì)胞受體中高度保守的保守色氨酸殘基周?chē)男蛄泻徒Y(jié)構(gòu)表明這些周?chē)慕Y(jié)構(gòu)也可能在允許從單線(xiàn)態(tài)氧至活性氧類(lèi)的催化作用中起著作用。
此外，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)被活化時(shí)嗜中性粒細(xì)胞能夠產(chǎn)生活性氧類(lèi)?？贵w和嗜中性粒細(xì)胞的催化活性能夠被用作檢測(cè)免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)和嗜中性粒細(xì)胞的活化。
用于檢測(cè)免疫和炎性反應(yīng)的方法本發(fā)明提供了用于檢測(cè)基于體液和細(xì)胞的免疫和炎性反應(yīng)的方法。該方法利用新發(fā)現(xiàn)的抗體和嗜中性粒細(xì)胞還原單線(xiàn)態(tài)氧為活性氧類(lèi)的能力。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定哺乳動(dòng)物內(nèi)免疫反應(yīng)或炎性反應(yīng)的方法，其包括(a)施用用于活性氧類(lèi)的化學(xué)探針；(b)從哺乳動(dòng)物中得到樣品；和(c)分析樣品中化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定嗜中性粒細(xì)胞活化的體外測(cè)定方法，包括(a)從哺乳動(dòng)物中得到嗜中性粒細(xì)胞樣品；(b)在嗜中性粒細(xì)胞樣品中活化嗜中性粒細(xì)胞；和(c)觀察嗜中性粒細(xì)胞樣品中活性氧類(lèi)是否被檢測(cè)到。
也在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定能調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞活性的試劑的方法，其包括(a)從哺乳動(dòng)物中得到嗜中性粒細(xì)胞樣品；(b)將嗜中性粒細(xì)胞樣品暴露于受試試劑；(c)在嗜中性粒細(xì)胞樣品中活化嗜中性粒細(xì)胞；和(d)定量由嗜中性粒細(xì)胞樣品產(chǎn)生的活性氧類(lèi)的量。
這些測(cè)定方法易于實(shí)施因?yàn)閷?duì)于這些測(cè)定方法的基本要求包括用于活性氧類(lèi)的化學(xué)探針和受試者或受試樣品。在一些情況下，可以通過(guò)使用作為抗體介導(dǎo)活性氧類(lèi)產(chǎn)生的底物的單線(xiàn)態(tài)氧源來(lái)增強(qiáng)活性氧類(lèi)的產(chǎn)生。然而，單線(xiàn)態(tài)氧能夠體內(nèi)產(chǎn)生，因此施用單線(xiàn)態(tài)氧源可能沒(méi)有必要。
能提供單線(xiàn)態(tài)氧源的分子包括那些不需要其它因子或誘導(dǎo)物而能夠產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧的分子和當(dāng)暴露于誘導(dǎo)物后能夠產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧的“敏化劑”分子。不需要其它因子或誘導(dǎo)物而能夠產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧的分子的例子包括但不限于內(nèi)過(guò)氧化物。在一些實(shí)施方案中，所使用的內(nèi)過(guò)氧化物可以是蒽-9，10二丙酸內(nèi)過(guò)氧化物。敏化劑分子的例子包括，但不限于蝶呤、黃素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基釕(II)復(fù)合體、玫瑰紅染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹紅菌甲素(hypocrellin)、玉紅花青苷(rubrocyanin)、喹哪啶藍(lán)(pinacyanol)或別花青苷(allocyanin)。
當(dāng)暴露于誘導(dǎo)物時(shí)敏化劑分子可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧。一種此種的類(lèi)誘導(dǎo)物是光。根據(jù)敏化劑的類(lèi)型和結(jié)構(gòu)，此種光可以是可見(jiàn)光、紫外光或紅外線(xiàn)。
使用本發(fā)明方法可以檢測(cè)到的活性氧類(lèi)包括任何抗體產(chǎn)生的氧類(lèi)和任何嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的氧類(lèi)。此種活性氧類(lèi)的例子包括，但不限于，超氧自由基(O2-)、羥自由基(OH·)、氫過(guò)氧自由基、過(guò)氧化氫(H2O2)或臭氧(O3)。此種強(qiáng)大的活性氧類(lèi)的存在預(yù)示著增強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)(例如增強(qiáng)的循環(huán)抗體)或增強(qiáng)的細(xì)胞或組織相關(guān)的炎性反應(yīng)(例如嗜中性粒細(xì)胞的活化)?？梢员粰z測(cè)的免疫和炎性反應(yīng)的類(lèi)型在下面有更詳細(xì)的討論。
因此本發(fā)明提供了用于檢測(cè)抗體的方法。所有的抗體分子屬于一種叫作免疫球蛋白的血漿蛋白質(zhì)家族。它們基本的結(jié)構(gòu)單元為免疫球蛋白折疊或結(jié)構(gòu)域，在免疫系統(tǒng)和其它生物識(shí)別系統(tǒng)中的許多分子中以多種形式被采用。典型的免疫球蛋白具有四條多肽鏈，包含稱(chēng)為可變區(qū)的抗原結(jié)合區(qū)，并且包含稱(chēng)為恒定區(qū)的非可變區(qū)域。
使用本發(fā)明的方法可以檢測(cè)任何抗體。此外，抗體可以是只要能夠催化產(chǎn)生活性氧類(lèi)的多種形式中的任何一種，包括整個(gè)免疫球蛋白、Fv、Fab、F(ab′)2或其它片段、或包括可變結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的單鏈抗體或其它形式。如此處所使用所有這些術(shù)語(yǔ)均歸于廣義的術(shù)語(yǔ)“抗體”內(nèi)。本發(fā)明意在檢測(cè)任何類(lèi)型的抗體并且不限于那些能夠識(shí)別特異抗原并與其起免疫反應(yīng)的抗體。然而，對(duì)于一些應(yīng)用，抗體或它們的片段對(duì)于抗原是免疫特異性的。
如本發(fā)明所使用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的分子還有它們的片段，諸如能夠結(jié)合到抗原表位的Fab，F(xiàn)(ab′)2和Fv。這些抗體片段保留了與它們的抗原或受體選擇性結(jié)合的一些能力并且定義如下(1)Fab，該片段包含抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段，能夠通過(guò)用木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體產(chǎn)生，消化后得到完整的輕鏈和重鏈的一部分；(2)Fab’，抗體分子的一種片段，能夠通過(guò)對(duì)整個(gè)抗體用胃蛋白酶處理，然后通過(guò)還原產(chǎn)生，得到完整的輕鏈和重鏈的一部分；從每一個(gè)抗體分子可以得到兩個(gè)Fab’片段；(3)F(ab′)2，經(jīng)用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體但隨后不進(jìn)行還原處理所得到的抗體片段；F(ab′)2是通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起的兩個(gè)Fab’片段的二聚體；(4)Fv，定義為包含作為兩條鏈表達(dá)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的遺傳工程片段；和(5)單鏈抗體(“sFv”)，定義為包含輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)，并用一個(gè)適當(dāng)?shù)亩嚯慕宇^連接在一起的、作為遺傳學(xué)融合單鏈分子的遺傳工程分子。
可以檢測(cè)到任何哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)物種的抗體或來(lái)源于哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)物種的任何樣品的抗體。此種哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)包括人、狗、貓和家畜，例如馬、牛、綿羊、山羊、雞、火雞等等。來(lái)源于此種哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)的樣品可以得到用于測(cè)試。此種樣品可以是，例如，組織樣品或諸如全血、血清、血漿、滑膜液、淋巴、尿、唾液、粘液或眼淚的體液。
用于活性氧類(lèi)的化學(xué)探針通過(guò)抗體和嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧類(lèi)可以用化學(xué)探針來(lái)檢測(cè)。用于活性氧類(lèi)的化學(xué)探針包括任何天然或合成的、含有能夠被氧化的烯烴并產(chǎn)生可檢測(cè)的氧化產(chǎn)物的化合物。用于活性氧類(lèi)的化學(xué)探針的例子包括3-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基苯甲酸、靛藍(lán)胭脂紅、均二苯代乙烯、膽固醇等等。當(dāng)氧化后此種化學(xué)探針產(chǎn)生諸如酮、醛、醚的氧化產(chǎn)物和相關(guān)產(chǎn)物。
例如，3-乙烯基苯甲酸(3)和4-乙烯基苯甲酸(4)化學(xué)探針和通過(guò)它們與活性氧類(lèi)反應(yīng)產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物(5a，5b，6a和6b)的結(jié)構(gòu)描述如下 3-乙烯基3 3-羧基5a 3-環(huán)氧乙烷基6a4乙烯基4 4-羧基5b 4-環(huán)氧乙烷基6b另一個(gè)用于活性氧類(lèi)的有用的化學(xué)探針的例子是靛藍(lán)胭脂紅(1)，活性氧類(lèi)可以將其轉(zhuǎn)化為環(huán)α-酮酰胺(磺酸靛紅，2)。這些化合物顯示如下。
在一些實(shí)施方案中，可以選擇本領(lǐng)域的一種技術(shù)來(lái)檢測(cè)特定的活性氧類(lèi)，例如，臭氧。例如通過(guò)使用靛藍(lán)胭脂紅可以檢測(cè)臭氧并將其與其它活性氧類(lèi)區(qū)分開(kāi)來(lái)。靛藍(lán)胭脂紅被臭氧(O3)的裂解可以使用同位素的方法與被1O2*的裂解相區(qū)別。例如，當(dāng)臭氧是氧化劑時(shí)18O摻入到環(huán)α-酮酰胺2的內(nèi)酰胺羰基。當(dāng)1O2*是氧化劑時(shí)沒(méi)有發(fā)生此種18O摻入到環(huán)α-酮酰胺2的內(nèi)酰胺羰基。
化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物可以通過(guò)使用高壓液相色譜法、質(zhì)譜測(cè)定法、紫外分光光度法、可見(jiàn)分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、諸如熒光顯微鏡或熒光光譜測(cè)定法的熒光方法來(lái)檢測(cè)。如實(shí)施例所述開(kāi)展了可仿效的測(cè)定方法。
因此，在一些實(shí)施方案中將化學(xué)探針施用于哺乳動(dòng)物，并收集哺乳動(dòng)物體液的樣品以確定化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物是否已經(jīng)產(chǎn)生。如果此種氧化產(chǎn)物已經(jīng)產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物可能發(fā)生了炎性反應(yīng)或增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，將化學(xué)探針加入到來(lái)源于哺乳動(dòng)物體液的體外測(cè)定中并且測(cè)定該測(cè)試混合物以了解化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物是否存在。此種體外測(cè)定法對(duì)于例如確定是否體液存在增強(qiáng)了的活化嗜中性粒細(xì)胞的水平是有用的。
單線(xiàn)態(tài)氧的內(nèi)源性產(chǎn)生最近公開(kāi)的抗體的化學(xué)勢(shì)在體內(nèi)的作用依賴(lài)于關(guān)鍵底物1O2*的可得性。然而，1O2*會(huì)在多種生理事件中產(chǎn)生并且在體內(nèi)也是可得的。參見(jiàn)J.F.Kanofsky Chem.-Biol.Interactions 70，1(1989)以及其中的參考文獻(xiàn)。例如，包括再灌注會(huì)產(chǎn)生1O2*。X.Zhai和M.Ashraf Am.J.Physiol.269(HeartCirc.Physiol.38)H1229(1995)。在吞噬作用過(guò)程中嗜中性粒細(xì)胞的活化也產(chǎn)生1O2*。J.R.Kanofsky，H.Hoogland，R.Wever，S.J.Weiss J.Biol.Chem.263，9692(1988)；Babior等，Amer.J.Med.，10933-34(2000)。通過(guò)照射存在于卟啉癥患者皮膚中的無(wú)金屬卟啉前體也產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧(1O2)。
此外，底物1O2*可以通過(guò)吞噬作用或再灌注入足以使抗體產(chǎn)生可檢測(cè)水平活性氧類(lèi)的量的方式產(chǎn)生。例如，吞噬體的體積大約1.0×10-15升。因此，此處所鑒定的反應(yīng)不需要高度有效，因?yàn)樵谌绱诵〉捏w積內(nèi)僅有幾百個(gè)分子具有微摩爾濃度。實(shí)際上，吞噬體內(nèi)1O2*的濃度計(jì)算為高達(dá)摩爾濃度。E.P.Reeves等，Nature 416，291(2002)。關(guān)于抗體分子的數(shù)量，通過(guò)用細(xì)菌和熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行滴定和免疫金研究能夠得出相同的估計(jì)(圖2)。這些分析表明大約有105個(gè)抗體分子結(jié)合到每個(gè)細(xì)菌上并且此數(shù)量將相當(dāng)于吞噬體中毫摩爾的抗體濃度。因此，通過(guò)甚至最保守的估計(jì)，吞噬體內(nèi)1O2*和抗體的濃度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)那些用于此處所提供的作為例證的實(shí)施例中的量。
單線(xiàn)態(tài)分子氧(1O2)也可以在殺微生物過(guò)程中以直接和間接方式產(chǎn)生。單線(xiàn)態(tài)分子氧(1O2)可以直接通過(guò)例如黃素蛋白氧化酶的作用產(chǎn)生(Allen，R.C.，Stjernholm，R.L.，Benerito，R.R.和Steele，R.H.，著者Cormier，M.J.，Hercules，D.M.和Lee，J.(Plenum，New York)，498-499頁(yè)(1973)；Klebanoff.S.J.在《在寄主抗性中的吞噬細(xì)胞》(National Institute ofChild Health and Human Development，Orlando，F(xiàn)L)(1974))一書(shū)中。作為選擇，1O2可以在殺微生物過(guò)程中間接產(chǎn)生，例如象在吞噬體發(fā)現(xiàn)的那樣在低pH的溶液中O2·-的非酶歧化作用(Stauff，J.，Sander，U.和Jaeschke，W.，化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光，著者，Williams，R.C.和Fudenberg，H.H.(Intercontinental Medical Book Corp.，New York)，131-141頁(yè)(1973)；Allen，R.C.，Yevich，S.J.，Orth，R.W.t和Steele，R.H.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，60，909-917(1974))。
因?yàn)?O2具有如此高的反應(yīng)性，因此以前認(rèn)為它在氧清除劑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中是一個(gè)終點(diǎn)。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗體和嗜中性粒細(xì)胞可以中途攔截1O2并且有效地將其還原成活性氧類(lèi)，因此提供了一種用于體內(nèi)檢測(cè)免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)和嗜中性粒細(xì)胞活化的手段。
免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)引起免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)的原因通常分為感染的和非感染的。人免疫系統(tǒng)中主要的對(duì)抗感染和疾病的細(xì)胞是血液循環(huán)中的白細(xì)胞(白血球)。白細(xì)胞是骨髓產(chǎn)生的，其中所述骨髓產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其它白細(xì)胞。大約50-65％的白細(xì)胞是“嗜中性粒細(xì)胞”。當(dāng)造血系統(tǒng)功能正常時(shí)，血小板和嗜中性粒細(xì)胞快速增殖并高速率周轉(zhuǎn)，而不像淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞那樣長(zhǎng)壽命。
在免疫反應(yīng)過(guò)程中，B淋巴細(xì)胞的激活和分化導(dǎo)致了能夠通過(guò)本發(fā)明方法檢測(cè)到的高親和抗原特異性抗體的分泌?？贵w的產(chǎn)生常常與感染有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明任何類(lèi)型的感染均可被檢測(cè)。通過(guò)本發(fā)明的方法可以檢測(cè)涉及細(xì)菌和病毒以及其它寄生蟲(chóng)的感染性疾病?？梢詸z測(cè)的感染實(shí)體的例子包括微生物、病毒、寄生蟲(chóng)等等?？梢詸z測(cè)的微生物包括，但不限于，諸如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi)、大腸桿菌(Escherichia coli)、大腸桿菌O157H7、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、霍亂弧菌、幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、金黃色葡萄球菌的多抗性菌株、屎腸球菌(Enterococcus faecilum)的萬(wàn)古霉素抗性菌株或糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的萬(wàn)古霉素抗性菌株的微生物。
可以檢測(cè)的病毒感染包括，但不限于，諸如甲型肝炎病毒(hepatitis Avirus)、乙型肝病毒(hepatitis B virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、人免疫缺陷癥病毒(human immunodeficiency virus)(HIV)、痘病毒(poxviruses)、皰疹病毒(herpes viruses，)、腺病毒(adenoviruses)、乳多空病毒(papovaviruses)、細(xì)小病毒(parvoviruses)、呼腸孤病毒(reoviruses)、環(huán)狀病毒(orbiviruses)、細(xì)小核糖核酸病毒(picornaviruse)、輪狀病毒(rotaviruses)、甲病毒(alphaviruses)、風(fēng)疹病毒(rubivirues)、A型和B型流感病毒(influenza virus type A and B)、黃病毒(flaviviruses)、冠形病毒(coronaviruses)、副粘病毒(paramyxoviruses)、麻疹病毒(morbilliviruses)、肺病毒(pneumoviruses)、彈狀病毒(rhabdoviruses)、狂犬病病毒(lyssaviruses)、正粘液病毒(orthmyxovirus)、布尼亞病毒(bunyaviruses)、白蛉病毒(phleboviruses)、納伊羅病毒(nairoviruses)、嗜肝DNA病毒(hepadnaviruses)、沙粒病毒(arenaviruses)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)、腸病毒(enteroviruses)、鼻病毒(rhinoviruses)或線(xiàn)狀病毒(filovirus)的病毒感染。
炎性反應(yīng)是血管化的組織對(duì)局部損傷的反應(yīng)。這種損傷可以有多種原因，包括感染和直接的物理?yè)p傷。當(dāng)遭受損傷后，凝固系統(tǒng)和纖溶酶系統(tǒng)與適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)系統(tǒng)反應(yīng)一起開(kāi)始啟動(dòng)以產(chǎn)生有利于免疫激活的初期反應(yīng)。提高的血流量、毛細(xì)血管滲透性和包括補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的那些趨化因子調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞遷移至損傷位點(diǎn)。嗜中性粒細(xì)胞是參與急性炎性反應(yīng)的主要細(xì)胞類(lèi)型，而淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在慢性炎性反應(yīng)中更普遍。
可以認(rèn)為炎性反應(yīng)是有益的，因?yàn)闆](méi)有它感染不能夠被制止，傷口永遠(yuǎn)不能愈合，并且發(fā)生組織和器官的永久性損傷和接下來(lái)死亡。
然而，炎性反應(yīng)也是潛在有害的。在炎性反應(yīng)過(guò)程中活化的嗜中性粒細(xì)胞釋放多種降解酶包括蛋白水解酶和氧化酶到周?chē)募?xì)胞外環(huán)境中。嗜中性粒細(xì)胞釋放的物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致潛在有害的副反應(yīng)。雖然循環(huán)的嗜中性粒細(xì)胞的半壽期為6-8小時(shí)，活化細(xì)胞的血管外存活可以接近四天?；罨氖戎行粤＜?xì)胞的數(shù)量和它們活化的程度與組織損傷直接相關(guān)。在體內(nèi)，當(dāng)嗜中性粒細(xì)胞死亡后，它們被組織吞噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬，這是一個(gè)炎性反應(yīng)消退的重要的過(guò)程。在體外，經(jīng)過(guò)幾天的階段后嗜中性粒細(xì)胞經(jīng)歷自發(fā)的凋亡，可以通過(guò)細(xì)胞因子或調(diào)節(jié)劑對(duì)其凋亡進(jìn)行增強(qiáng)或抑制。對(duì)瀕死的嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用現(xiàn)在被公認(rèn)為是消退炎性反應(yīng)的主要方式(J.Savill，J.Leukoc.Biol.，61375，1997)。
其中嗜中性粒細(xì)胞在組織損傷中起作用的非感染性疾病包括痛風(fēng)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、免疫血管炎、嗜中性粒細(xì)胞皮膚病、腎小球腎炎、炎性腸病、心肌梗塞、ARDS(成人呼吸窘迫綜合征)、哮喘、肺氣腫和惡性腫瘤。炎性反應(yīng)導(dǎo)致了心肌梗塞、局部缺血再灌注損傷、超敏反應(yīng)、腎病、異常平滑肌紊亂、肝病、癌細(xì)胞的增殖、接受放射治療的癌癥病人的炎性反應(yīng)、血管炎、腎小球性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成人呼吸窘迫綜合征、局部缺血疾病、心臟病、中風(fēng)、腸局部缺血、再灌注損傷、血色沉著病、獲得性免疫缺陷綜合征、肺氣腫、器官移植、胃潰瘍、高血壓、先兆子癇、神經(jīng)性疾病(多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默氏疾病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化和肌肉萎縮癥)、酒精中毒和吸煙相關(guān)的疾病相關(guān)的病理。
在美國(guó)每年有數(shù)百萬(wàn)的人進(jìn)行針對(duì)上述疾病的治療。然而，在一種適當(dāng)?shù)闹委煵捎弥?，必須檢測(cè)炎性反應(yīng)并且分類(lèi)為感染性的或者非感染性的。
免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的篩選本發(fā)明還提供了用于鑒定能夠調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞活性的試劑的方法。此種方法包括步驟(a)從哺乳動(dòng)物中得到嗜中性粒細(xì)胞樣品；(b)將嗜中性粒細(xì)胞樣品暴露于測(cè)試試劑；(c)激活嗜中性粒細(xì)胞樣品中的嗜中性粒細(xì)胞；和(d)定量嗜中性粒細(xì)胞樣品產(chǎn)生的活性氧類(lèi)的數(shù)量。
其它實(shí)施方案包括對(duì)由嗜中性粒細(xì)胞樣品產(chǎn)生的信號(hào)同適當(dāng)?shù)膶?duì)照進(jìn)行比較。此種適當(dāng)?shù)膶?duì)照可以是沒(méi)有暴露于測(cè)試試劑的同一類(lèi)型嗜中性粒細(xì)胞樣品的對(duì)照樣品。使用這種類(lèi)型的對(duì)照有利于分析測(cè)試試劑是否對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的活化有任何影響。
在其它實(shí)施方案中，方法還包括將嗜中性粒細(xì)胞樣品與能夠從分子氧產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧的試劑相接觸。此種方法還包括照射樣品混合物、化學(xué)探針和產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧的試劑。嗜中性粒細(xì)胞上的抗體可以通過(guò)抗體還原單線(xiàn)態(tài)氧為過(guò)氧化物或過(guò)氧化氫或臭氧。
照射步驟可以用紅外線(xiàn)、紫外線(xiàn)或可見(jiàn)光來(lái)完成，其選擇依賴(lài)于所用的敏化劑。
用此處所述的方法可以檢測(cè)所形成的活性氧類(lèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)其它的篩選方法中，也考慮了用于實(shí)現(xiàn)與抗原發(fā)生抗體免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定法的方法。該方法包含步驟A.在單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生介質(zhì)中使固定有組合物的底物，該組合物包含含有抗原或抗體的第一種試劑，與包含能與第一種試劑反應(yīng)以產(chǎn)生固定化的抗原-抗體復(fù)合物的抗原或抗體的第二種組合物相接觸，其中在氧存在時(shí)抗體能夠從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生過(guò)氧化物或過(guò)氧化氫；和B.檢測(cè)抗體產(chǎn)生的活性氧類(lèi)，從而檢測(cè)抗體與抗原的免疫反應(yīng)性。
反應(yīng)和檢測(cè)方法如此處所述。在一方面，第一組合物是抗原并且第二組合物是抗體。在相反方面，第一組合物是抗體而第二組合物是抗原。
本發(fā)明進(jìn)一步考慮了用于實(shí)施檢測(cè)抗體對(duì)抗原免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定法的相似方法，此處的抗原是固定化的并且與抗體組合物相接觸。
此類(lèi)免疫測(cè)定方法是對(duì)那些周知的評(píng)價(jià)抗原-抗體免疫反應(yīng)性和鑒定抗原和/或抗體的方法的改進(jìn)。本方法優(yōu)于先前其它免疫測(cè)定方法的優(yōu)點(diǎn)在于本方法除去了至少一個(gè)方法步驟和/或加入了二級(jí)標(biāo)記的免疫反應(yīng)性分子，標(biāo)記是放射活性化合物或者是酶的化合物。
在本發(fā)明中，最低需求是單線(xiàn)態(tài)氧、抗體試劑、抗原試劑、和能與從抗體產(chǎn)生的活性氧類(lèi)進(jìn)行反應(yīng)的化學(xué)探針。一種可以被使用的此種反應(yīng)物是AMPLEXTMRed。它是Molecular Probes(Eugene，Oregon)出售的商業(yè)可得的試劑，用于在免疫測(cè)定法中與抗體產(chǎn)生的過(guò)氧化氫進(jìn)行反應(yīng)。它是以試劑盒出售的，該試劑盒提供了使用用于測(cè)定的熒光微孔板或熒光計(jì)測(cè)量過(guò)氧化氫的一步熒光法。測(cè)定法基于使用對(duì)過(guò)氧化氫高度敏感和穩(wěn)定的探針10-乙?；?3，7-二羥基吩噁嗪對(duì)過(guò)氧化氫進(jìn)行檢測(cè)。在辣根過(guò)氧化物酶存在的情況下，AMPLEXTMRed試劑與過(guò)氧化氫以1∶1的化學(xué)計(jì)量進(jìn)行反應(yīng)以產(chǎn)生高熒光的試鹵靈，這提供了一種檢測(cè)機(jī)制檢測(cè)在200微升體積內(nèi)的少至10皮摩爾的過(guò)氧化氫。
相反，現(xiàn)有的免疫測(cè)定技術(shù)，包括放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶-免疫測(cè)定法(EIA)和經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，都需要使用如RIA中的放射性標(biāo)記的免疫反應(yīng)性分子或額外標(biāo)記的免疫反應(yīng)性分子。本發(fā)明既不需要潛在有害的放射性同位素以標(biāo)記分子，也不需要通常稱(chēng)為二級(jí)抗體的額外免疫反應(yīng)性試劑，其中所述的二級(jí)抗體通常與酶連接，以允許檢測(cè)與一級(jí)抗體及抗原形成的復(fù)合體。在后一測(cè)定法中，二級(jí)抗體與所形成的抗原-抗體復(fù)合體的反應(yīng)(通常通過(guò)抗一級(jí)抗體的特異性免疫反應(yīng)性)是通過(guò)對(duì)所偶聯(lián)的酶特異的產(chǎn)生顏色的底物溶液來(lái)測(cè)定的。概括而言，在本發(fā)明中，抗體介導(dǎo)的過(guò)氧化氫的產(chǎn)生用不需要放射性試劑、不需要額外的試劑和/或混合步驟、而具有高檢測(cè)能力的方法進(jìn)行測(cè)定，這些額外的試劑和/或混合步驟在例如美國(guó)專(zhuān)利3,905,767；4,016,043；USRE032696和4,376,110中被應(yīng)用，此處對(duì)其公開(kāi)進(jìn)行引用作為參考。
治療方法本發(fā)明提供了當(dāng)其產(chǎn)生被認(rèn)為是正當(dāng)時(shí)，例如用于抑制微生物感染、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、溶解細(xì)菌、清除病毒、靶向癌細(xì)胞用于氧化劑誘導(dǎo)的裂解等等過(guò)程，而產(chǎn)生氧化劑的方法。例如，本發(fā)明提供了抗體介導(dǎo)的活性氧類(lèi)的產(chǎn)生以抗擊細(xì)菌感染或病毒感染。活性氧類(lèi)作為抗微生物劑來(lái)消滅細(xì)菌或病毒。因此，為了增強(qiáng)這種過(guò)程，人們可以使用本發(fā)明的方法以提供抗體組合物到該區(qū)域?qū)е戮植炕钚匝躅?lèi)濃度提高。
本發(fā)明包括的治療方法基于使用能從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生活性氧類(lèi)的抗體，包括1)抑制微生物的增殖，或靶向和殺死病人體內(nèi)微生物，當(dāng)抗體識(shí)別微生物表達(dá)的抗原并與其起免疫反應(yīng)時(shí)，2)抑制癌細(xì)胞的增殖或靶向和殺死病人體內(nèi)癌細(xì)胞，當(dāng)抗體識(shí)別癌細(xì)胞表達(dá)的抗原并與其起免疫反應(yīng)時(shí)，3)抑制病人體內(nèi)與嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)相關(guān)的組織損傷，例如當(dāng)炎性反應(yīng)起因于細(xì)菌感染或病人患有自身免疫性疾病時(shí)，4)增強(qiáng)病人體內(nèi)吞噬細(xì)胞的殺菌效果，5)促進(jìn)具有開(kāi)放性創(chuàng)傷的病人傷口的愈合，當(dāng)臭氧、過(guò)氧化物或過(guò)氧化氫刺激成纖維細(xì)胞的增殖和/或免疫反應(yīng)進(jìn)一步包括淋巴細(xì)胞的增殖時(shí)，6)刺激細(xì)胞增殖，例如刺激病人傷口的成纖維細(xì)胞增殖，和相似情形。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療微生物感染和其它疾病的的治療方法，這些方法得益于諸如超氧自由基、羥自由基、臭氧或過(guò)氧化氫的活性氧類(lèi)增強(qiáng)的產(chǎn)生。此種方法在正當(dāng)需要此種活性氧類(lèi)產(chǎn)生的情況下能夠使用任何抗體產(chǎn)生活性氧類(lèi)。
本發(fā)明還涉及包括經(jīng)過(guò)改變含有一個(gè)額外還原中心的工程抗體在內(nèi)的工程分子的用途，該還原中心的存在提供了當(dāng)希望產(chǎn)生活性氧類(lèi)時(shí)，從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生活性氧類(lèi)的額外能力。當(dāng)需要增強(qiáng)活性氧類(lèi)產(chǎn)生時(shí)，與具有兩個(gè)保守的色氨酸殘基的非工程抗體相比，使用具有兩個(gè)以上還原中心的工程分子是恰當(dāng)?shù)摹?br> 在另一個(gè)方面，抗體可以是如上面所提供的或可選擇地從遞送進(jìn)入細(xì)胞的表達(dá)載體表達(dá)的重組抗體。在本文中表達(dá)載體還可以表達(dá)敏化劑分子(見(jiàn)下)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于抑制微生物生長(zhǎng)的方法，其中將微生物與含有能從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生此種活性氧類(lèi)的抗體的組合物相接觸。該方法對(duì)于非特異或者免疫特異(抗原結(jié)合)的完整抗體或抗體片段是成功的。此類(lèi)抗體片段包括單鏈抗體及此處所述的工程分子和抗體。然而，當(dāng)需要對(duì)抗微生物的局部活性時(shí)，抗體可以是對(duì)微生物相關(guān)的抗原特異的。例如，抗體可以選擇性地結(jié)合微生物表面的抗原。
抗體組合物可以在體內(nèi)遞送到受到微生物感染或其它疾病或能夠從暴露于活性氧類(lèi)而受益的其它疾病的受試者中。優(yōu)選的體內(nèi)遞送方法包括靜脈內(nèi)給藥、局部給藥、吸入給藥、插管給藥、腔內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、皮下給藥或通過(guò)含有抗體的脂質(zhì)體給藥。
細(xì)胞表面可作為例證的抗體濃度范圍為1-5微摩爾。然而，濃度會(huì)依賴(lài)所希望的結(jié)果而變化，此時(shí)所提供抗體的量是足以得到預(yù)期生理效應(yīng)即活性氧類(lèi)或它的衍生氧化物的產(chǎn)生而產(chǎn)生氧化應(yīng)激的抗體的量。用抗體組合物進(jìn)行治療性處理的劑量和時(shí)間與下面描述的用于抗氧化劑的劑量和時(shí)間相一致。
本發(fā)明方法進(jìn)一步考慮了在產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的活性氧類(lèi)或其衍生氧化物的方法中將抗體-抗原復(fù)合物暴露于紫外線(xiàn)、紅外線(xiàn)或可見(jiàn)光的照射下。為了增強(qiáng)活性氧類(lèi)的產(chǎn)生，光敏劑，也作為敏化劑提到，產(chǎn)生活性氧類(lèi)的量可以在此處所述的治療方法中使用。如此處所定義，敏化劑是能夠誘導(dǎo)或增加單線(xiàn)態(tài)氧濃度的任何分子。敏化劑可以在照射存在的情況下使用，此種照射過(guò)程包括暴露于紫外線(xiàn)、紅外線(xiàn)或可見(jiàn)光下足以活化敏化劑的一段時(shí)間。作為例證的時(shí)間和條件在實(shí)施例中進(jìn)行描述。
敏化劑的活性氧類(lèi)產(chǎn)生量是足以得到預(yù)期生理效應(yīng)即在正當(dāng)需要此種活性氧類(lèi)和其衍生物的多種情況下通過(guò)抗體介導(dǎo)從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生活性氧的敏化劑的量。在一些實(shí)施方案中，敏化劑被偶聯(lián)到抗體上。偶聯(lián)有敏化劑的抗體通常能夠結(jié)合到抗原上，即抗體仍保留有效的抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而允許發(fā)生抗原識(shí)別和結(jié)合。
作為例證的敏化劑包括但不限于蝶呤、黃素、血卟啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基釕(II)復(fù)合體、玫瑰紅染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹紅菌甲素。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過(guò)施用增強(qiáng)單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生的方法來(lái)增強(qiáng)活性氧類(lèi)的產(chǎn)生。還原的單線(xiàn)態(tài)氧是活性氧類(lèi)或其衍生氧化物的來(lái)源。一種增強(qiáng)單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生的方法是包括對(duì)產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧有用的任何分子、化合物或試劑在內(nèi)的前體藥物。如此處所描述，此種前體藥物在將抗體施用于預(yù)期靶細(xì)胞、組織或器官施用或?qū)⒖贵w與其相接觸的同時(shí)，或在此種施用或接觸之后，進(jìn)行施用。當(dāng)前體藥物的施用在抗體的施用之后時(shí)，抗體已經(jīng)有機(jī)會(huì)與其靶抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)并形成抗體-抗原復(fù)合物。增強(qiáng)單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生的方法于是在抗體-抗原識(shí)別位點(diǎn)增強(qiáng)諸如過(guò)氧化氫、臭氧、超氧自由基或它們的衍生氧化物的活性氧類(lèi)的產(chǎn)生。該實(shí)施例具有特別的優(yōu)點(diǎn)，例如，在預(yù)期的位點(diǎn)或位置產(chǎn)生治療用預(yù)期的過(guò)氧化物、臭氧或過(guò)氧化氫的增強(qiáng)的局部積累的能力。
優(yōu)選的前體藥物是，例如，濃度大約1微摩爾至大約50微摩爾的內(nèi)過(guò)氧化物。在抗體-抗原復(fù)合物位點(diǎn)所能達(dá)到的優(yōu)選的內(nèi)過(guò)氧化物濃度為大約10微摩爾。
本發(fā)明中的抗體的抗原靶可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的或可得到的任何抗原?？乖梢允谴嬖谟诩?xì)胞、組織或器官內(nèi)的任何抗原，在那里活性氧類(lèi)的存在和抗體介導(dǎo)的產(chǎn)生該性活氧簇的過(guò)程是所期望的?？乖梢源嬖谟谌芤褐?，例如，在細(xì)胞外液中。抗原可以是，例如，蛋白質(zhì)、多肽、脂肪酸、低密度脂蛋白、與炎性反應(yīng)相關(guān)的抗原、癌細(xì)胞抗原、細(xì)菌抗原、病毒抗原或相似分子。
抗原相關(guān)的細(xì)胞包括但不限于微生物、內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、血細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、結(jié)締組織和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。
因此，例如，可以用本發(fā)明的抗體治療下列靶微生物有機(jī)體的感染氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)、芽胞桿菌屬(Bacillus spp.)、擬桿菌屬(Bacteroides spp.)、彎曲桿菌屬(Campylobacter spp.)、梭菌屬(Clostridiumspp.)、腸桿菌屬(Enterobacter spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、埃希氏菌屬(Escherichia spp.)、腹螺菌屬(Gastrospirillum sp.)、纏繞桿菌屬(Helicobacter spp.)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella spp.)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella spp.)、志賀氏菌屬(Shigella spp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、弧菌屬(Vibriospp.)、耶爾森氏菌屬(Yersinia spp.)等等。使用本發(fā)明的抗體能夠治療的感染包括那些與葡萄球菌感染(金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))、斑疹傷寒(傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhi))、食物中毒(諸如O157H7的大腸桿菌)、桿菌性痢疾(痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteria))、肺炎(銅綠假單胞菌(Psuedomonas aerugenosa)和/或洋蔥假單胞菌)、霍亂(霍亂弧菌(Vivrio cholerae))、潰瘍(幽門(mén)螺旋桿菌)和其它相關(guān)的感染。大腸桿菌血清型0157H7涉及腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒性綜合征(HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的發(fā)病機(jī)理。本發(fā)明的抗體對(duì)于耐藥的和多藥耐藥的細(xì)菌菌株，例如金黃色葡萄球菌的多抗藥性菌株和屎腸球菌和糞腸球菌的萬(wàn)古霉素抗性菌株，也是有效的。
本發(fā)明的抗微生物組合物對(duì)于抗病毒也是有效的。本發(fā)明的抗微生物組合物對(duì)于抗病毒也是有效的。術(shù)語(yǔ)“病毒”指的是DNA和RNA病毒、類(lèi)病毒和朊病毒。病毒包括包膜和無(wú)包膜病毒，例如，甲型肝炎病毒、乙型肝病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、乳多空病毒、細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、輪狀病毒、甲病毒、風(fēng)疹病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、黃病毒、冠形病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、彈狀病毒、狂犬病病毒、正粘液病毒、布尼亞病毒、白蛉病毒、納伊羅病毒、嗜肝DNA病毒、沙粒病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腸病毒、鼻病毒或線(xiàn)狀病毒。
可受益于在細(xì)胞、組織或器官以及細(xì)胞外區(qū)室中活性氧類(lèi)產(chǎn)生或增強(qiáng)的其它治療性疾病對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的。例如此類(lèi)疾病進(jìn)一步描述于McCord，Am.J.Med.，108652-659(2000)，其所公開(kāi)的內(nèi)容此處引用作為參考。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的方法可以對(duì)針對(duì)這些微生物品種的抗微生物活性進(jìn)行評(píng)價(jià)?？刮⑸锘钚酝ㄟ^(guò)例如鑒定本發(fā)明的抗體阻止特定微生物物種生長(zhǎng)的的最低抑菌濃度(MIC)而進(jìn)行確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗微生物活性是當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)劑量或劑量反應(yīng)方法測(cè)量時(shí)能夠殺死50％微生物的抗體的量。
評(píng)估用此處所述的抗體治療微生物感染時(shí)治療有效劑量的方法包括測(cè)定抗體制備物的最低抑菌濃度，在此濃度下基本上沒(méi)有微生物能夠體外生長(zhǎng)。此種方法允許計(jì)算單位體積中為了抑制微生物生長(zhǎng)或殺死50％微生物所需要的大約抗體量。例如，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的微稀釋法能夠測(cè)定此種數(shù)量。例如，制備了一系列含有相同體積培養(yǎng)基和基本上相同量的微生物的微生物培養(yǎng)管，并且加入一份抗體。每一份包含不相同量的抗體于相同體積的溶液中。將微生物培養(yǎng)相應(yīng)于一至十代的時(shí)間段并且測(cè)定培養(yǎng)基中微生物的數(shù)量。
培養(yǎng)基的光密度值也能夠用于評(píng)價(jià)是否已經(jīng)發(fā)生了微生物生長(zhǎng)-如果光密度沒(méi)有明顯的增加，則沒(méi)有發(fā)生明顯的微生物生長(zhǎng)。然而，如果光密度增加了，就已經(jīng)發(fā)生了微生物的生長(zhǎng)。為了確定當(dāng)暴露于抗體之后有多少微生物細(xì)胞仍然活著，可以在抗體加入的時(shí)刻(時(shí)間0)和此后有規(guī)律的間隔取出一小份培養(yǎng)基。將小份涂布微生物培養(yǎng)板，將平板在易于微生物生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)克隆時(shí)，計(jì)算那些克隆數(shù)量。
組合物本發(fā)明的抗體、敏化劑或化學(xué)探針可以制劑成多種可接受的組合物。此類(lèi)藥物組合物可以以各種適合于所選擇的施用途徑，即口服或腸胃外施用，通過(guò)靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、局部或皮下途徑的形式施用于哺乳動(dòng)物宿主，例如人類(lèi)患者。
當(dāng)抗體、敏化劑和化學(xué)探針足夠堿或足夠酸以致形成穩(wěn)定無(wú)毒的酸或堿鹽時(shí)，將此類(lèi)抗體、敏化劑和化學(xué)探針作為鹽進(jìn)行施用是適當(dāng)?shù)??？伤幱名}的例子是由能形成生理上可接受陰離子的酸形成的有機(jī)酸加成鹽，例如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸酯。也可以形成合適的無(wú)機(jī)鹽，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、重碳酸鹽和碳酸鹽。
使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序，例如用諸如胺的足夠堿的化合物與提供可生理用陰離子的適當(dāng)酸進(jìn)行反應(yīng)，可以得到可藥用鹽。也可以得到堿金屬(例如鈉、鉀或鋰)或堿土金屬(例如鈣)的羧酸鹽。
從而，本發(fā)明的抗體、敏化劑和化學(xué)探針可以進(jìn)行全身性的施用，例如與諸如惰性稀釋藥或可同化可食用的載體的可藥用賦形劑組合口服。它們可以包封在硬的或軟的明膠膠囊外殼中，可以壓制成片劑，或直接摻入到病人的食物中。對(duì)于口服治療給藥，抗體、敏化劑和化學(xué)探針可以與一種或多種賦形劑結(jié)合并以可吸收的片劑、含片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸液、糖漿劑、糯米紙囊劑等等形式使用。此種組合物和藥劑應(yīng)該包含至少0.1％的活性成分。組合物和制劑的百分比當(dāng)然是可變的并且方便的在特定單位劑型重量的大約2％至大約60％之間。在此種治療上有用的組合物中氧化劑和氧清除劑的量是那些可以得到有效劑量水平的量。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等等還可以包含以下可以加入的成分諸如西黃蓍膠、阿拉伯樹(shù)膠、玉米淀粉或明膠的粘合劑；諸如磷酸氫二鈣的賦形劑；諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等等的崩解劑；諸如硬脂酸鎂的潤(rùn)滑劑；和諸如蔗糖、果糖、乳糖或天冬酰苯丙氨酸甲酯的甜味劑或諸如薄荷、冬青油或櫻桃調(diào)味料的調(diào)味劑。當(dāng)單位劑型是膠囊時(shí)，除了上述類(lèi)型的物質(zhì)外，它可以含有諸如植物油或聚乙二醇的液態(tài)載體。其它多種物質(zhì)可以作為包衣存在或改變固體單位劑型的物理形狀。例如，可以將片劑、丸劑或膠囊劑用明膠、蠟、蟲(chóng)膠或糖等等包衣。糖漿或酏劑可包含活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或果糖、作為防腐劑的羥苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯、諸如櫻桃或橙香味的染料和調(diào)味料。當(dāng)然，用于制備任何單位劑型的任何材料都應(yīng)當(dāng)是可藥用的并且所使用的量基本上是無(wú)毒的。此外，活性成分可以摻入到持續(xù)釋放的制劑或設(shè)備中。
對(duì)于創(chuàng)傷的治療，可以采用對(duì)受試者的創(chuàng)傷進(jìn)行局部應(yīng)用。含有抗體的組合物可以直接應(yīng)用于傷口或者先施用于繃帶上然后應(yīng)用于傷口上。受益于在細(xì)胞、組織、器官或細(xì)胞外區(qū)室中產(chǎn)生或提高的過(guò)氧化物、臭氧或過(guò)氧化氫的其它治療疾病對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是可知的并且已被McCord，Am.J.Med.，108652-659(2000)進(jìn)行了綜述，此處對(duì)其公開(kāi)引用作為參考。
抗體、敏化劑和化學(xué)探針還可以通過(guò)灌注或注射從靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。抗體、敏化劑和化學(xué)探針的溶液用水來(lái)制備，任選地與無(wú)毒的表面活性劑混合。分散體還可以制備在甘油、液體聚乙二醇、醋酸甘油和它們的混合物中和油中。在通常的儲(chǔ)存和使用條件，這些制劑可以包含阻止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。
適于注射或灌注的藥物劑型包括包含抗體、敏化劑和化學(xué)探針的無(wú)菌水溶液或分散劑或無(wú)菌粉劑，這些抗體、敏化劑和化學(xué)探針適于臨時(shí)制備無(wú)菌注射或灌注溶液或分散劑，任選地用脂質(zhì)體包封。在所有情況下，在制造和儲(chǔ)存的條件下最終的劑型應(yīng)該是無(wú)菌的、流質(zhì)的和穩(wěn)定的。液態(tài)載體或媒介物可以是包含例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等等)、植物油、無(wú)毒的甘油酯和它們的適當(dāng)?shù)幕旌衔锏娜軇┗蛞后w分散介質(zhì)。其適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以通過(guò)，例如，脂質(zhì)體的形成、在分散劑中維持所需顆粒大小、或者使用表面活性劑來(lái)維持。通過(guò)多種抗菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、三梨酸、硫柳汞等等阻止微生物的活動(dòng)。在許多情況下，優(yōu)選的包括等滲試劑，例如糖、緩沖液或氯化鈉。通過(guò)在可注射的組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠產(chǎn)生對(duì)可注射組合物的延長(zhǎng)吸收。
通過(guò)將抗體、敏化劑或化學(xué)探針以需要的量摻入到恰當(dāng)?shù)木哂?，如果需要，上述列舉的其它成分的溶劑中，然后過(guò)濾滅菌來(lái)制備無(wú)菌可注射溶液。至于用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，該技術(shù)能夠得到氧化劑和氧清除劑加上存在于先前過(guò)濾滅菌溶液中的任何附加需要的成分的粉末。
對(duì)于局部施用，可以將抗體、敏化劑或化學(xué)探針以純化形式即為液體時(shí)進(jìn)行應(yīng)用。然而，它們通常需要作為組合物或制劑與可以是固體或液體的皮膚可接受的載體組合在一起被施用于皮膚上。
有用的固體載體包括諸如滑石粉、粘土、維晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等等細(xì)微的固體。有用的液體載體包括水、醇類(lèi)或乙二醇或水-醇/乙二醇混合物，本發(fā)明的組合物可以以有效水平溶解于或分散，任選地借助于無(wú)毒的表面活性劑，于其中。為了優(yōu)化用于特定用途的特性可以添加例如香味的佐劑和額外的抗微生物劑。最終的液體組合物可以從用于浸透繃帶和其它敷料的吸收劑墊中應(yīng)用，或使用泵型或氣霧劑型噴霧器噴霧于受影響區(qū)域。
為了直接施用于使用者的皮膚，諸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、修飾的纖維素或修飾的礦物材料的增稠劑也可以與液體載體一起使用以形成可以被涂開(kāi)的糊劑、凝膠、軟膏等等。
用于遞送本發(fā)明的抗體、敏化劑或化學(xué)探針到皮膚的皮膚病用組合物的例子在本領(lǐng)域是熟知的；例如，參見(jiàn)Jacquet等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,608,392)，Geria(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,992,478)，Smith等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,559,157)和Wortzman(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,820,508)。
本發(fā)明抗體、敏化劑或化學(xué)探針的有用的劑量可以通過(guò)比較它們的體外活性和在動(dòng)物模型內(nèi)的體內(nèi)活性來(lái)決定。在小鼠和其它動(dòng)物的有效劑量外推至人的方法是本領(lǐng)域熟知的；例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,938,949。通常，在例如洗劑的液體組合物中本發(fā)明的抗體、敏化劑或化學(xué)探針的濃度可以大約0.1-25重量％，優(yōu)選的大約0.5-10重量％。在諸如凝膠或粉末的半固體或固體組合物中濃度大約0.1-5重量％，優(yōu)選的大約0.5-2.5重量％。
用于治療所需要的抗體、敏化劑或化學(xué)探針、或活性鹽或它們的衍生物的量不但隨著所選定的特定鹽而變化，而且隨著給藥途徑、被治療病情的性質(zhì)和病人的年齡和病情而變化并且最終由主管醫(yī)師或臨床醫(yī)師作出判斷。
然而，一般而言，適宜的劑量會(huì)在從大約0.5到大約100毫克/公斤范圍內(nèi)，即從每天大約10到大約75毫克/公斤體重，例如每天3到大約50毫克/公斤受試者體重，優(yōu)選地在6-90毫克/公斤/天范圍內(nèi)，最優(yōu)選地在15-60毫克/公斤/天范圍內(nèi)。
抗體、敏化劑或化學(xué)探針?lè)奖愕匾詥挝粍┬褪┯?；例如，含?-1000毫克，方便地10-750毫克，最方便地50-500毫克活性成分/單位劑型。
理想地，抗體、敏化劑或化學(xué)探針的施用應(yīng)達(dá)到抗體、敏化劑或化學(xué)探針的血漿濃度峰值從大約0.005到大約75μM，優(yōu)選地，大約0.01-50μM，最優(yōu)選地，大約0.1-大約30μM。這可以通過(guò)，例如，靜脈內(nèi)注射0.05-5％的抗體、敏化劑或化學(xué)探針的溶液，任選地以鹽形式注射，而達(dá)到，或者作為含有大約1-100毫克抗體、敏化劑或化學(xué)探針的大丸劑而口服達(dá)到。通過(guò)連續(xù)輸注以提供大約0.01-5.0毫克/公斤/小時(shí)或者通過(guò)周期性灌注大約0.4-15毫克/公斤抗體、敏化劑或化學(xué)探針來(lái)維持預(yù)期的血液濃度水平。
目的劑量可以方便地以單一劑量呈現(xiàn)或者作為以適當(dāng)?shù)拈g隔施用例如每天2、3、4或更多亞劑量的分份劑量呈現(xiàn)。亞劑量本身可以進(jìn)一步再分，例如，分成許多個(gè)個(gè)別寬松間隔給藥，例如從吸入器多次吸入或向眼應(yīng)用多滴滴劑。
本發(fā)明的治療組合物、包括工程抗體和包含用于促進(jìn)抗體活性的此處所述的額外還原中心的其它分子在內(nèi)的抗體以與劑量制劑相一致的模式和治療有效劑量進(jìn)行施用。施用的量和周期依賴(lài)于接受治療的受試者、受試者身體利用有效成分的能力和所期望達(dá)到的治療效果的程度。需要施用的有效成分的精確的量依賴(lài)于從業(yè)者的判斷并且對(duì)每一個(gè)個(gè)體都是特殊的。然而，用于不同類(lèi)型應(yīng)用的適宜劑量范圍依賴(lài)于給藥途徑。對(duì)于給藥的適宜方案也是可變的，但是典型的是初次給藥后接著在一定時(shí)間間隔重復(fù)劑量給藥以致于達(dá)到治療處理所期望的結(jié)果。
本發(fā)明的治療組合物包含可藥用的載體和抗體、敏化劑或化學(xué)探針。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)為了治療目的施用于哺乳動(dòng)物或病人時(shí)治療組合物不具有免疫原性。
包含溶解或分散于其中的活性成分的藥物組合物制劑是本領(lǐng)域眾多周知的并且不需要根據(jù)劑型加以限制。一般此類(lèi)組合物制備成可注射的液體溶液或混懸液，然而，也可以制備成適用于溶液或混懸液的在使用前溶于液體的固體形式。制劑也可以是乳化的。
可以將活性成分與可藥用的且與活性成分相容的賦形劑相混合，并且以適宜的量用于此處所述的治療方法。合適的賦形劑是，例如，水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如果期望，組合物可以含有微量輔助物質(zhì)諸如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖劑等等，以增強(qiáng)活性成分的效力。
本發(fā)明的治療組合物可以包括其中的可藥用鹽組分?？伤幱名}包括與諸如鹽酸或磷酸的無(wú)機(jī)酸或諸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等等的有機(jī)酸形成的酸加成鹽(與多肽的游離氨基形成)。與游離羧基形成的鹽還可以從例如鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵的無(wú)機(jī)堿，和諸如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的有機(jī)堿得到。
可藥用載體在本領(lǐng)域是熟知的。作為例證的液體載體是除了活性成分和水外不含其它物質(zhì)的水溶液，或含有諸如在生理pH值的磷酸鈉的緩沖液、生理鹽水或兩者例如磷酸緩沖鹽水的水溶液。更進(jìn)一步，液體載體可以包含一種以上緩沖鹽、以及諸如氯化鈉和氯化鉀的鹽、右旋糖、聚乙二醇和其它溶質(zhì)。
液體組合物還可以包含除了水外的并且與水不相容的液相。此種額外液相的例子是甘油、例如棉子油的植物油和水-油乳劑。
通過(guò)參考下面的非限定性實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。當(dāng)用它們的某些優(yōu)選的實(shí)施方案作為參考進(jìn)行詳細(xì)描述本發(fā)明時(shí)，可以認(rèn)識(shí)到修改和變異是處于所描述和要求保護(hù)的精神和范圍內(nèi)的。
實(shí)施例I具有內(nèi)在破壞抗原能力的抗體材料和方法抗體下面完整抗體均從PharMingen獲得49.2(小鼠IgG2bк)，G155-178(小鼠IgG2aк)，107.3(小鼠IgG1к)，A95-1(大鼠IgG2b)，G235-2356(倉(cāng)鼠IgG)，R3-34(大鼠IgGк)，R35-95(大鼠IgG2aк)，27-74(小鼠IgE)，A110-1(大鼠IgG1λ)，145-2C11(倉(cāng)鼠IgGlк)，M18-254(小鼠IgAк)和MOPC-315(小鼠IgAλ)。下面抗體從Pierce獲得31243(綿羊IgG)，31154(人IgG)，31127(馬IgG)和31146(人IgM)。
下面的F(ab’)2片段從Pierce獲得31129(兔IgG)，31189(兔IgG)，31214(山羊IgG)，31165(山羊IgG)和31203(小鼠IgG)。A蛋白，G蛋白，胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑(包曼-畢爾克抑制劑)，β-乳球蛋白A，α-乳清蛋白，肌紅蛋白，β-半乳糖苷酶，雞卵清蛋白，抑酶肽，胰蛋白酶原，凝集素(花生)，凝集素(Jacalin)，牛血清白蛋白，超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶從Sigma獲得。核糖核酸酶IA從Amersham Pharmacia得到。以下的免疫球蛋白是使用雜交瘤技術(shù)內(nèi)部獲得OB2-34C12(小鼠IgG1к)，SHO1-41G9(小鼠IgG1к)，OB3-14F1(小鼠IgG2aк)，DMP-15G12(小鼠IgG2aк)，AD1-19G1(小鼠IgG2bк)，NTJ-92C12(小鼠IgG1к)，NBA-5G9(小鼠IgG1к)，SPF-12H8(小鼠IgG2aк)，TIN-6C11(小鼠IgG2aк)，PRX-1B7(小鼠IgG2aк)，HA5-19A11(小鼠IgG2aк)，EP2-19G2(小鼠IgG1к)，GNC-92H2(小鼠IgG1к)，WD1-6G6(小鼠IgG1к)，CH2-5H7(小鼠IgG2bк)，PCP-21H3(小鼠IgG1к)和TM1-87D7(小鼠IgG1к)。DRB多克隆(人IgG)和DRB-b12(人IgG)由Dennis R.Burton(Scripps研究所)提供。1D4 Fab(結(jié)晶的)由Ian A.Wilson(Scripps研究所)提供。
所有的測(cè)定方法都是在PBS(10mM磷酸鹽/160mM氯化鈉，pH7.4)中進(jìn)行的。根據(jù)需要，商品化的蛋白質(zhì)溶液樣品在PBS中進(jìn)行透析。除臭劑紅過(guò)氧化氫測(cè)定試劑盒(A-12212)從Molecular Probes得到。
抗體/蛋白質(zhì)照射.除非特別說(shuō)明，測(cè)定溶液(100μl，6.7μM蛋白質(zhì)溶于PBS，pH7.4)加入到玻璃瓶中，用螺旋帽密封并用紫外(312nm，8000μWcm-2Fischer-Biotech透照燈)或可見(jiàn)光進(jìn)行照射。
過(guò)氧化氫的定量測(cè)定.將一份(20μl)從蛋白質(zhì)溶液中取出并加入到含有反應(yīng)緩沖液(80μl)的96-孔微孔板(Costar)的一個(gè)孔中。然后加入工作液(100μl/400μM除臭劑紅試劑1/2單位/毫升辣根過(guò)氧化物酶)并且在暗處孵育30分鐘。然后使用CytoFluor微孔板閱讀儀(4000型，PerSeptive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA；激發(fā)/發(fā)射530/580nm)測(cè)定孔中組分的熒光。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定過(guò)氧化氫的濃度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行，并且形成速率以至少兩次測(cè)量的平均值來(lái)提供。
敏化作用和猝滅測(cè)定.將溶于PBS(pH7.4，4％二甲基甲酰胺)中31127溶液(100μl馬IgG，6.7μM)和血卟啉IX(40μM)放置于近光帶處。如此處所描述對(duì)過(guò)氧化氫濃度進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定還在D2O中有NaN3(100mM)或PBS存在的情況下進(jìn)行。
氧依賴(lài).使用凍/融方法在氬環(huán)境下將溶于PBS(pH7.4)中的31127(1.6ml，馬IgG，6.7μM)溶液嚴(yán)格除氣。通過(guò)注射器將一份(100μl)導(dǎo)入已經(jīng)用適當(dāng)O2/Ar混合物(0-100％)清除的用隔封閉的玻璃瓶中。用Orion862A溶解氧測(cè)量計(jì)測(cè)定溶解氧含量。將這些溶液劇烈渦旋混勻，放置20分鐘，然后再次渦旋混勻。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用含必需O2/Ar混合物的注射器以維持大氣壓。用氣體密閉的注射器取出一份(20μl)并用此處所述的方法測(cè)定過(guò)氧化氫的濃度。用酶動(dòng)力學(xué)(Enzyme Kinetics)v1.1計(jì)算機(jī)程序(用于確定參數(shù)Vmax和Km)將三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析。
使用化學(xué)1O2源，在黑暗中由抗體產(chǎn)生過(guò)氧化氫.將溶于PBS(pH7.4)中的綿羊IgG 31243(100μl，20μM)溶液和3，3N-(1，4-亞萘基)二丙酸二鈉(25mM溶于D2O)內(nèi)過(guò)氧化物置于黑暗的溫室中(37EC)30分鐘。用此處所述的方法測(cè)定過(guò)氧化氫濃度。
通過(guò)Fab1D4晶體的過(guò)氧化氫形成.將1D4Fab片段的晶體混懸液(2μl)用PBS(198μl，pH7.4)進(jìn)行稀釋并輕輕地渦旋混勻。離心之后，將上情液取出，并且進(jìn)一步重復(fù)2次洗滌步驟。然后將所剩余的晶體混懸液用PBS，pH7.4(100μl)進(jìn)行稀釋?zhuān)⑶壹尤氲绞LISA板的一個(gè)孔中。在紫外線(xiàn)照射30分鐘后，加入除臭劑紅工作溶液(100μl)，并且在熒光顯微鏡上察看混合物。
抗體熒光與過(guò)氧化氫形成。將溶于PBS(pH7.4)的31127(1.0ml馬IgG，6.7μM)溶液置于石英容器中并且用紫外光照射40分鐘。以10分鐘的間隔，用SPF-500C熒光分光光度計(jì)(SLM-Aminco，Urbana，IL；激發(fā)/發(fā)射，280/320)測(cè)定溶液的熒光。在同一時(shí)間點(diǎn)，取出一份(20μl)溶液，并且用此處所述的方法測(cè)定過(guò)氧化氫的濃度。
通過(guò)過(guò)氧化氫酶對(duì)過(guò)氧化氫的消耗.將EP2-19G12溶液(100μl小鼠IgG，以20μM的濃度溶于PBS，pH7.4)用紫外光照射30分鐘，在此時(shí)間之后用結(jié)合試驗(yàn)(stick test)(EM Quant Peroxide Test Sticks)確定過(guò)氧化氫的濃度為2毫克/升。加入過(guò)氧化氫酶[1μl，Sigma，3.2M(NH4)2SO4，pH6.0]，并且1分鐘后發(fā)現(xiàn)H2O2的濃度達(dá)到0毫克/升。
變性.將Eppendorf管中的IgG 19G12(100μl，6.7μM)加熱至100EC2分鐘。將最終的溶液轉(zhuǎn)移至玻璃的、螺口小瓶中并且用紫外線(xiàn)照射30分鐘。30分鐘后測(cè)定H2O2的濃度。
結(jié)果和討論通過(guò)一組完整免疫球蛋白和抗體片段的過(guò)氧化氫起始形成速率的測(cè)量值收集于表1.據(jù)信Ig-產(chǎn)生的O2·-可以發(fā)生自發(fā)岐化作用變成H2O2，然后H2O2和N-乙?；?3，7-二羥基吩嗪1(除臭劑紅)作為協(xié)同底物被辣根過(guò)氧化酶利用，以產(chǎn)生高熒光的9-羥基-3-異吩噁唑酮2(最大激發(fā)563nm，最大發(fā)射587nm)(圖2)(Zhou，M.，Diwu，Z.，Panchuk-Voloshina，N.和Haugland，R.P.，Anal.Biochem.，253，162-168(1997))。為了證實(shí)對(duì)緩沖液的照射不能夠產(chǎn)生O2·-并且抗體不是簡(jiǎn)單地充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)歧化酶而起作用(Petyaev，I.M.和Hunt，J.V.，Redox Report，2，365-372(1996))，將過(guò)氧化物歧化酶在PBS中被照射。在這些條件下，過(guò)氧化氫的產(chǎn)生速率與單獨(dú)PBS照射情況下的相同。
表1.通過(guò)免疫球蛋白產(chǎn)生過(guò)氧化氫*
*測(cè)定條件在材料和方法中描述。
H至少2次測(cè)定的平均值。在PBS中H2O2的背景形成速率是0.005nmol/分鐘并且在有SOD存在時(shí)在PBS中H2O2的背景形成速率是0.003nmol/分鐘。
至于在環(huán)境條件下(275μM)PBS中的氧濃度，對(duì)于超過(guò)10％的反應(yīng)過(guò)氧化氫形成速率是線(xiàn)性的。在得到足夠氧的情況下，每個(gè)蛋白質(zhì)分子可以產(chǎn)生至少40當(dāng)量H2O2而活性上或結(jié)構(gòu)片段上沒(méi)有明顯的減少。在存在或缺乏抗體19G2時(shí)過(guò)氧化氫形成的起始時(shí)間過(guò)程的例子示于圖3A。隨后通過(guò)加熱使得蛋白質(zhì)變性該活性喪失了。
表1中的數(shù)據(jù)顯示抗體從1O2產(chǎn)生H2O2的普遍的能力。好像多種物種共享此種功能并且該種能力不依賴(lài)于所研究重鏈和輕鏈組分或抗原特異性。
對(duì)于完整抗體的過(guò)氧化氫形成的起始率是高度保守的，在整組中變化從0.15納摩爾/分鐘/毫克[克隆A95-1(大鼠IgG2b)]到0.97納摩爾/分鐘/毫克(克隆PCP-21H3，鼠單克隆IgG)。雖然可得到的信息更加局限于組分抗體片段，該活性好像在Fab和F(ab’)2片段中均存在。
如果該活性是由于污染造成的，那么活性將存在于從不同來(lái)源得到的所有抗體或抗體片段。然而，為了進(jìn)一步排除污染，從中得到高分辨率x-射線(xiàn)結(jié)構(gòu)(在1.7D)的鼠抗體1D4Fab晶體被用來(lái)研究它們產(chǎn)生H2O2的能力(圖4)。在這些晶體中清晰地觀察到了1O2的還原。
對(duì)此種抗體轉(zhuǎn)化的研究支持單線(xiàn)態(tài)氧作為中間體被還原。無(wú)論是存在還是不存在紫外線(xiàn)照射，抗體在缺氧條件下不會(huì)發(fā)生過(guò)氧化氫的形成。而且，在環(huán)境有氧條件下而沒(méi)有照射時(shí)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生不會(huì)發(fā)生。在水溶液中存在已知的3O2的光敏劑血卟啉(HP)(Kreitner，M.，Alth，G.，Koren，H.，Loew，S.和Ebermann，R.，Anal.Biochem.，213，63-67(1993))的情況下用可見(jiàn)光照射抗體導(dǎo)致過(guò)氧化氫的形成(圖5A)。所觀察到的形成速率曲線(xiàn)存在彎曲是因?yàn)樵跍y(cè)定混合物中存在氧的消耗。對(duì)光激發(fā)的HP和氧的相互作用會(huì)導(dǎo)致O2·-的形成(Beauchamp，C.和Fridovich，I.，Anal.Biochem.，44，276-287(1971)；Srinivasan，V.S.，Podolski，D.，Westrick，N.J.和Neckers，D.C.，J.Am.Chem.Soc.，100，6513-6515(1978))的擔(dān)心可以通過(guò)使用只有敏化劑的適當(dāng)背景實(shí)驗(yàn)而大大消除(數(shù)據(jù)示于圖5A)。使用HP和可見(jiàn)光使得H2O2有效形成再次肯定了1O2的中間體地位并且表明對(duì)于Ig實(shí)現(xiàn)該還原功能而言紫外線(xiàn)照射不是必需的。
此外，將綿羊抗體31243在黑暗中37EC條件下與1O2的化學(xué)源[內(nèi)過(guò)氧化物3N，3N-(1，4-亞萘基)二丙酸鹽]進(jìn)行孵育導(dǎo)致過(guò)氧化氫的形成。
通過(guò)可見(jiàn)光下的馬IgG和HP(40μM)的H2O2的形成速率隨著D2O存在而增加并且隨著1O2淬滅劑NaN3(40mM)存在而降低(圖5B)(Hastu，N.，Merkel，P.B.，Radlick，P.和Kearns，D.R.Tetrahedron Lett.，49-52(1972))。已知用D2O替代H2O會(huì)通過(guò)對(duì)1O2增加大約10倍的壽命而促進(jìn)1O2介導(dǎo)的過(guò)程(Merkel，P.B.，Nillson，R.和Kearns，D.R.，J.Am.Chem.Soc.，94，1030-1031(1972))。
過(guò)氧化氫形成速率與IgG濃度在0.5和20μM之間成比例但是在較高濃度時(shí)開(kāi)始彎曲(圖5C)。由于存在反應(yīng)的可能，蛋白質(zhì)溶液中1O2的壽命預(yù)期低于在純水中的。因此可以認(rèn)為所觀察到的彎曲可能是由于因?yàn)榕c抗體發(fā)生反應(yīng)而使得1O2壽命降低造成的。
很明顯，氧濃度對(duì)所觀察到的H2O2產(chǎn)生速率的影響表明大約200μM氧的明顯飽和狀態(tài)(圖5D)。因此，還原機(jī)制可能涉及抗體分子中一個(gè)或多個(gè)氧結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)原始形成速率數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性回歸處理并且通過(guò)擬合Michaelis-Menten方程，得到Kmapp(O2)為187μM和Vmaxapp為0.4納摩爾/分鐘/毫克。這種抗體的速率等同于所觀察到的線(xiàn)粒體酶在體內(nèi)還原分子氧的速率。
抗體還原1O2的機(jī)制仍處于被確定中。然而，因?yàn)樵诤蠩DTA(4mM)的PBS中徹底透析之后抗體的活性保持不變所以金屬介導(dǎo)的氧化還原過(guò)程的參與被大大降低了。這是抗體自身氨基酸組成的內(nèi)在能力。芳香族氨基酸例如色氨酸(Trp)可以通過(guò)電子轉(zhuǎn)移被1O2氧化(Grossweiner，L.I.，Curr.Top.Radiat.Res.Q.，11，141-199(1976))。此外，二硫化物富含能夠被氧化的足夠的電子(Bent.D.V.和Hayon，E.，J.Am.Chem.Soc.，87，2612-2619(1975))。因此，這里存在一種潛在的可能性，即色氨酸殘基和/或所有抗體同源的鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵負(fù)責(zé)1O2的還原。為了研究抗體的這種能力在什么程度上被其它蛋白質(zhì)所共享和調(diào)查還原的機(jī)制，研究了一組其它蛋白質(zhì)(圖6)。
與抗體相反，雖然其它蛋白質(zhì)能轉(zhuǎn)化1O2成為O2·-，但這決不是一個(gè)普遍的特性。不含有Trp殘基而含有幾個(gè)二硫鍵的RNA酶A和超氧化物歧化酶不能夠還原1O2。相似地，含有七個(gè)二硫鍵而不含有Trp殘基的包曼-畢爾克抑制劑(Voss，R.-H.，Ermler，U.，Essen，L.-O.，Wenzl，G.，Kim，Y.-M.和Fleeker，P.，Eur.J.Biochem.，242，122-131(1996)；Baek，J.和Kim，S.，Plant Physiol.，102，687(1993))不能夠還原1O2。相反，只含有2個(gè)Trp殘基的雞卵清蛋白(Feldhoff，R.和Peters，T.J.，Biochem.J.，159，529-533(1976))是最有效的還原1O2的蛋白質(zhì)之一。
考慮到當(dāng)變性后抗體活性會(huì)喪失，好像關(guān)鍵殘基在蛋白質(zhì)的位置比它們的絕對(duì)數(shù)量更關(guān)鍵。因?yàn)闉榱舜龠M(jìn)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)中大多數(shù)芳香族殘基普遍地埋藏在內(nèi)部(Burley，S.K.& Petsko，G.A.，Science，229，23-28(1985))，所以用熒光淬滅實(shí)驗(yàn)以表面和隱蔽的殘基相對(duì)貢獻(xiàn)的方式探究了還原過(guò)程的性質(zhì)。通過(guò)吸收紫外線(xiàn)，特別是有致敏劑例如分子氧或臭氧存在的情況下，蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸被修飾了(Foote，C.S.，Science，162，963-970(1968)；Foote，C.S.，F(xiàn)ree Radicals Biol.，2，85-133(1976)；Gollnick，K.，Adv.Photochem.，6，1-122(1968))。通過(guò)[2+2]環(huán)加成作用色氨酸與1O2發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生N-甲酰犬尿氨酸或犬尿素，已知它們都能明顯淬滅所埋藏色氨酸殘基的發(fā)射光(Mach，H.，Burke，C.J.，Sanyal，G.，Tsai，P.-K，Volkin，D.B.和Middaugh，C.R.蛋白質(zhì)和多肽的形成和遞送，著者Cleland，J.L.和Langer，R.(美國(guó)化學(xué)會(huì)，Denver，CO)(1994))。在40-分鐘的照射過(guò)程中，馬IgG的內(nèi)在熒光快速淬滅到其原始數(shù)值的30％，然而過(guò)氧化氫的產(chǎn)生自始至終是線(xiàn)性的(r2＝0.998)(圖7)。如果單線(xiàn)態(tài)氧的還原是由于抗體色氨酸殘基，那么暴露于溶劑中的色氨酸好像比隱藏色氨酸殘基的貢獻(xiàn)程度要小。這種因素有助于解釋為什么這種能力在抗體中是高度保守的。在多于99％的已知抗體中，存在2個(gè)色氨酸殘基，并且都是深埋在內(nèi)部的色氨酸36和色氨酸47(Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.和Foeller，C.，與免疫有關(guān)蛋白質(zhì)的序列(U.S.Department of Health and human Services，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)(1991))。
在整個(gè)自然界，生物體自身通過(guò)產(chǎn)生相對(duì)簡(jiǎn)單化學(xué)物質(zhì)的方式進(jìn)行防御。在單分子水平，這種機(jī)制被認(rèn)為隨著在脊椎動(dòng)物中免疫系統(tǒng)的出現(xiàn)而大部被拋棄。據(jù)認(rèn)為一旦靶向設(shè)施得到進(jìn)化則殺滅機(jī)制就移到別處。當(dāng)前的結(jié)果使得對(duì)于一些分子內(nèi)的殺滅作用進(jìn)行重新認(rèn)識(shí)。在一定意義上，這種化學(xué)免疫系統(tǒng)，除了加入了更加復(fù)雜和多樣的靶向成分外，類(lèi)似于低等生物體內(nèi)的純化學(xué)防御機(jī)制。
考慮到理想的殺滅系統(tǒng)必須使用宿主分子并以降低自身?yè)p傷的局部方式進(jìn)行的這樣一種限制，人們很難想象到比1O2更公正的選擇。因?yàn)榧热淮嬖诹嗽摲磻?yīng)分子，一個(gè)要問(wèn)的重要問(wèn)題就是抗體對(duì)其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是什么。關(guān)鍵的問(wèn)題是通過(guò)將暫時(shí)的單線(xiàn)態(tài)氧(壽命4μs)轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的O2·-，它現(xiàn)在才能接近過(guò)氧化氫和它能產(chǎn)生的所有毒性產(chǎn)物。此外，超氧化物是唯一一個(gè)等同于氧清除級(jí)聯(lián)反應(yīng)中殘留的分子氧。因此，這種“再循環(huán)”可能作為加強(qiáng)殺微生物過(guò)程的關(guān)鍵機(jī)制。單分子氧的另一個(gè)益處是它只存在于當(dāng)宿主受到攻擊時(shí)，因此使它成為“事件-觸發(fā)的”底物。并且由于存在用于抵御的使用附屬系統(tǒng)的可選擇的途徑，在許多情況下免疫系統(tǒng)的這種化學(xué)武器功能可能是沉默的。然而，這就是說(shuō)這里會(huì)有很多疾病狀態(tài)，此種狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)抗體和單線(xiàn)態(tài)氧是并列的，從而導(dǎo)致了細(xì)胞和組織的損傷?？紤]到人類(lèi)多種事件導(dǎo)致單線(xiàn)態(tài)氧的產(chǎn)生，抗體對(duì)其的激活可能導(dǎo)致從自身免疫到再灌注損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的很多種疾病(Skepper等，Microsc.Res.Tech.，42，369-385(1998))。
實(shí)施例II抗體催化水的氧化方法和材料結(jié)晶學(xué)使用標(biāo)準(zhǔn)程序用木瓜蛋白酶消化IgG 4C6并且將Fab’片段進(jìn)行純化(Harlow和Lane)。將Fab’從13-18％PEG 8K，0.2M ZnAc，0.1M二甲砷酸鹽，pH6.5中進(jìn)行結(jié)晶。將晶體在氙氣存在下200psi加壓2分鐘(Soltis等，J.Appl.Cryst.，30，190，(1997))并且隨后用液氮瞬間冷卻。在SSRL BL9-2上以2.0的分辨率收集數(shù)據(jù)。使用坐標(biāo)通過(guò)分子置換從天然4C6結(jié)構(gòu)中計(jì)算結(jié)構(gòu)，并且氙原子位點(diǎn)從不同F(xiàn)ourier圖上的強(qiáng)峰中鑒定出來(lái)。在CNS(Briinger等，Acta.Crystallogr.，D54，905(1998))中做出精細(xì)結(jié)構(gòu)至最終R＝23.1％和Rfree＝25.7％。當(dāng)將它們的B值固定于高出環(huán)境蛋白質(zhì)的B值50％之后兩個(gè)氙原子的占據(jù)位點(diǎn)被精確定下來(lái)。在Bobscript(R.M.Esnouf，Acta Crystallog.，D55，938(1999))中產(chǎn)生圖。
Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)掃描為了決定在它們的結(jié)構(gòu)中Trp，Tyr，Cys，Met的數(shù)目分析了人和小鼠序列的Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)。如果有太多的殘基刪除或缺少片段則淘汰該序列。這允許對(duì)可得的3894序列的2068條進(jìn)行高度確定性分析。數(shù)值報(bào)道為CH、VH、CL和VL(к和λ.)區(qū)域Trp 15.5(14-31)，Tyr 30.4(13-47)，Cys 19.3(15-29)，Met 11.6(7-32)，His 13.3(8-28)的括弧內(nèi)范圍的平均總數(shù)?？傆?jì)＝90.1(49-167)。
電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜學(xué)在Varian，Axial VistaSimultaneous ICP-AES光譜儀上進(jìn)行mAb PCP21H3的電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)實(shí)驗(yàn)。將小鼠單克隆抗體(PCP21H3)完全透析入含有20mM EDTA的磷酸鈉緩沖鹽水(PBS，50mM pH7.4)中。在典型的測(cè)定中，將300μL10.5％HNO3溶液加入到100μL10mg/mL的抗體溶液中并在70℃孵育14小時(shí)。然后用MQH2O將該溶液稀釋至2mL并且然后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。ICP-AES分析結(jié)果報(bào)道為百萬(wàn)分之幾(μg/mL)Ag0.0026(每個(gè)抗體分子0.0072個(gè)原子)；Al0.0098(每個(gè)抗體分子0.113個(gè)原子)；As0.0062(每個(gè)抗體分子0.025個(gè)原子)；Ba在檢測(cè)水平以下；Ca0.0355(每個(gè)抗體分子0.266個(gè)原子)。
所觀察的高Ca濃度是用于我們測(cè)定系統(tǒng)的磷酸鹽緩沖系統(tǒng)的污染的結(jié)果。為了觀察Ca(II)對(duì)抗體-介導(dǎo)的H2O2速率的影響，使用圖8A圖解說(shuō)明中概括的測(cè)定過(guò)程通過(guò)加入多種濃度的CaC12(0-100μM)進(jìn)行抗體樣品的照射。發(fā)現(xiàn)該過(guò)程不依賴(lài)于Ca(II)濃度；Cd 0.0007(每個(gè)抗體分子0.0187個(gè)原子)；Ce 0.0012(每個(gè)抗體分子0.003個(gè)原子)；Co 0.0013(每個(gè)抗體分子0.007個(gè)原子)；Cr 0.0010(每個(gè)抗體分子0.006個(gè)原子)；Cu 0.0014(每個(gè)抗體分子0.007個(gè)原子)；Fe 0.0089(每個(gè)抗體分子0.048個(gè)原子)；Gd0.0008(每個(gè)抗體分子0.001個(gè)原子)；K 0.0394(每個(gè)抗體分子0.302個(gè)原子)；La 0.0007(每個(gè)抗體分子0.002個(gè)原子)；Li 0.0013(每個(gè)抗體分子0.056個(gè)原子)；Mg 0.0027(每個(gè)抗體分子0.033個(gè)原子)；Mn 0.0007(每個(gè)抗體分子0.004個(gè)原子)；Mo 0.0023(每個(gè)抗體分子0.007個(gè)原子)；Na 102.0428(每個(gè)抗體分子1332個(gè)原子)；Ni 0.0007(每個(gè)抗體分子0.004個(gè)原子)；P14.3521(每個(gè)抗體分子138.9個(gè)原子)；Pb低于檢測(cè)水平；Rb 0.0007(每個(gè)抗體分子0.002個(gè)原子)；Se低于檢測(cè)水平；V 0.0109(每個(gè)抗體分子0.019個(gè)原子)；W 0.0119(每個(gè)抗體分子0.019個(gè)原子)；Zn 0.0087(每個(gè)抗體分子0.040個(gè)原子)。
氧同位素實(shí)驗(yàn)在典型的實(shí)驗(yàn)中，將抗體(6.7μM，100μL)或非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)(50μM，100μL)在PB(160mM磷酸鹽，pH7.4)中的溶液冷凍干燥并且然后溶于H2O2(100μL，98％)中。在MS中要將氯化鈉排除以使信號(hào)抑制降至最低。在MS測(cè)定中，為了產(chǎn)生可檢測(cè)數(shù)量的H2O2，有必要使用較高濃度的非免疫球蛋白蛋白質(zhì)。在密封石英試管內(nèi)飽和16O2需氧條件下用UV-透照燈20EC照射蛋白質(zhì)溶液8小時(shí)。8小時(shí)后使用除臭劑紅測(cè)定法測(cè)定H2O2濃度(Zhou等，Anal.Biochem.，253，162(1997))。然后通過(guò)離心過(guò)濾樣品使其通過(guò)microcon(大小排阻過(guò)濾器)以去除蛋白質(zhì)并重新測(cè)定H2O2濃度。加入TCEP(新鮮制備的20mM于H218O中的原液)(約相對(duì)H2O22mol當(dāng)量)并將其靜置于37℃15分鐘，這段時(shí)間后全部H2O2已經(jīng)進(jìn)行了反應(yīng)。每個(gè)測(cè)定之前新鮮制備H218O中的TCEP溶液，因?yàn)?8O慢慢摻入TCEP的羧酸(超過(guò)幾天的時(shí)間)。在測(cè)定時(shí)間過(guò)程期間，由于該途徑而沒(méi)有18O摻入發(fā)生。而且，沒(méi)有18O從H218O摻入16O氧化膦。249m/z處的峰是TCEP的(M-H)-。由于在測(cè)定中使用了相對(duì)H2O2過(guò)量的TCEP(兩倍)，在所有MS中均觀察到249處的峰。
將來(lái)自蛋白質(zhì)樣品的重復(fù)比率的16O/18O冷凍干燥在一起是合理的(±10％)。然而，在冷凍干燥過(guò)程中去除蛋白質(zhì)結(jié)合水分子的問(wèn)題意味著來(lái)自不同批的冷凍干燥樣品之間所觀察到的比率可能是變化的，變化多至2∶1到4∶1(當(dāng)從H216O冷凍干燥時(shí))。因此，如下嚴(yán)格的冷凍干燥和除氣操作是重要的。在這方面，由于相對(duì)易于去除蛋白質(zhì)結(jié)合氧分子，18O2和H216O實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)出遠(yuǎn)低于測(cè)定間的變異性。
來(lái)自不同物種的抗體在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)給出了相似比率，描述如下16O∶18O∶WD1-6G6mIgG(鼠)2.1∶1；poly-IgG(馬)2.2∶1；poly-IgG(綿羊)2.2∶1；EP2-19G2mIgG(鼠)2.1∶1；CH2-5H7mIgG(鼠)2.0∶1；poly-IgG(人)2.1∶1。比率基于兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，除了poly-IgG(馬)以外，該值是10次測(cè)量的平均值。所有測(cè)定和條件如上所述。
在典型的實(shí)驗(yàn)中，將綿羊或馬poly-IgG(6.7μM，100μL)的PB(160mM磷酸鹽；pH7.4)溶液在氬條件下脫氣30分鐘。然后用18O2(90％)飽和該溶液并按如上所述進(jìn)行照射。然后如文中所述進(jìn)行測(cè)定和操作。
通過(guò)血卟啉IX的3O2致敏作用測(cè)定H2O2的產(chǎn)生與1O2形成效率的關(guān)系測(cè)定法是H.Sakai和共同研究者，Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.，2371，264(1995)所研發(fā)的方法的修改方法。簡(jiǎn)而言之，使用透照燈的白光照射在PBS(50mM，pH7.4)溶液中的馬poly-IgG(1mg/mL)和血卟啉IX(40μM)。取出等份(50μL)并同時(shí)測(cè)定H2O2和3-氨基鄰苯二甲酸的濃度。通過(guò)除臭劑紅法測(cè)定H2O2的濃度(zhou等，Anal.Biochem.，253，162(1997))。在使用Adsorbosphere-C18柱子的Hitachi D4000系列儀器上通過(guò)反相HPLC測(cè)定3-氨基鄰苯二甲酸的濃度，UV分光光度檢測(cè)器在254nm處，并且乙腈/水(0.1％TFA)18∶82的流動(dòng)相流速為1mL/分鐘(魯米諾保留時(shí)間＝7.4分鐘且3-氨基鄰苯二甲酸保留時(shí)間3.5分鐘)。通過(guò)與對(duì)照樣品比較峰高和峰面積進(jìn)行比較測(cè)定魯米諾和3-氨基鄰苯二甲酸的濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生了由血卟啉IX形成的1O2的量(直接與所形成的3-氨基鄰苯二甲酸的量成比率)和由抗體形成的H2O2的量。在白光下不含血卟啉IX的抗體不形成有意義量的1O2。
對(duì)除臭劑紅測(cè)定可以測(cè)定除了H2O2之外的蛋白質(zhì)-過(guò)氧化物衍生物的擔(dān)心減少，因?yàn)槭褂迷摲椒y(cè)定的表觀H2O2濃度不依賴(lài)于是否從樣品中去除照射的蛋白質(zhì)(通過(guò)大小排阻過(guò)濾)。
量子化學(xué)方法全部QC計(jì)算是使用Jaguar[Jaguar 4.0，Schrdinger，有限公司，Portland，Oregon，1998.見(jiàn)B.H.Greeley，T.V.Russo，D.T.Mainz，R.A.Friesner，J.-M.Langlois，W.A.Goddard III，R.E.Donnelly，J.Chem.Phys.，101，4028(1994)]利用密度功能理論(DFT)的B3LYP flavor進(jìn)行的[J.C.Slater于分子和固體的量子理論，第4卷分子和固體的自相一致的場(chǎng)，McGraw Hill，New York，(1974)]，其包括泛化的梯度近似值和精確的互變。6-31G**基礎(chǔ)設(shè)定用于全部原子。所有幾何圖完全最適化。計(jì)算震動(dòng)頻率以保證每個(gè)最小值是真實(shí)的局域極小值(僅陽(yáng)性頻率)并保證過(guò)渡態(tài)(TS)僅具有單一虛頻率(Hessian陰性特征值)。此類(lèi)QC計(jì)算已經(jīng)證明對(duì)于簡(jiǎn)單有機(jī)分子具有～3kcal/mol的精確度。非閉合外殼分子例如O2和3O2預(yù)期具有較大誤差。然而，此類(lèi)誤差預(yù)期是系統(tǒng)的從而QC結(jié)果的機(jī)械函式將是正確的。全部能量學(xué)報(bào)道為未進(jìn)行零點(diǎn)能量或溫度校正的kcal/mol。
結(jié)果和討論抗體能夠從單線(xiàn)態(tài)分子氧(1O2)產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)。然而，直到此處所報(bào)道才知道該過(guò)程是催化性的。目前顯示抗體作為一類(lèi)蛋白質(zhì)是唯一的，因?yàn)楫?dāng)存在任意可辨別的輔因子和電子供體時(shí)，它們能夠從1O2產(chǎn)生多至500摩爾當(dāng)量的H2O2，而不降低速率。基于同位素?fù)饺朐囼?yàn)和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，提出了抗體能夠促進(jìn)無(wú)先例地將H2O加入1O2產(chǎn)生H2O3，作為反應(yīng)級(jí)聯(lián)中的第一個(gè)中間體H2O3最終導(dǎo)致形成H2O2。使用氙的X射線(xiàn)結(jié)晶學(xué)研究指出抗體折疊中保守的氧結(jié)合位點(diǎn)，在這里能夠起始該化學(xué)作用。這些發(fā)現(xiàn)暗示出免疫球蛋白針對(duì)1O的獨(dú)特的保護(hù)功能并且提出這樣一個(gè)問(wèn)題，是否需要解毒1O2在免疫球蛋白折疊的進(jìn)化中起到的決定性作用。
抗體，不管來(lái)源或抗原特異性，都能夠從單線(xiàn)態(tài)分子氧(1O2)產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)從而潛在調(diào)整防御性識(shí)別和在相同分子內(nèi)殺傷(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。根據(jù)該發(fā)現(xiàn)的潛在化學(xué)和生物學(xué)上的意義，已經(jīng)觀察了該過(guò)程中抗體的機(jī)械基礎(chǔ)和結(jié)構(gòu)定位。這些組合的研究揭示，與其它蛋白質(zhì)相比，抗體可以催化水和單線(xiàn)態(tài)氧之間無(wú)先例的一組化學(xué)反應(yīng)。
動(dòng)力學(xué)研究長(zhǎng)期UV照射研究揭示抗體-介導(dǎo)的H2O2產(chǎn)生是比非免疫球蛋白蛋白質(zhì)情況下更加有效的過(guò)程(圖8A)。一般，抗體呈現(xiàn)速率開(kāi)始逐漸降低之前H2O2形成線(xiàn)性增加至40摩爾當(dāng)量H2O2(圖8B)。相比之下，非免疫球蛋白蛋白質(zhì)顯示短“脈沖”式H2O2產(chǎn)生隨后隨著光氧化作用發(fā)生而淬滅(圖8A)。
與其它蛋白質(zhì)相比，如鼠單克隆IgG PCP21H3所示(圖8C)的、如果在測(cè)定中使用過(guò)氧化氫酶將產(chǎn)生的H2O2去除，抗體則能夠以與實(shí)驗(yàn)起始的速率一樣的速率重新進(jìn)行H2O2的光產(chǎn)生。過(guò)氧化氫介導(dǎo)的H2O2損壞后的這種H2O2連續(xù)線(xiàn)性產(chǎn)生曲線(xiàn)對(duì)于所測(cè)定的所有抗體是保守的。因此，在過(guò)程中積累的H2O2正在抑制其自身的形成(可逆的)。表觀IC50估計(jì)為225μM(圖8D)。
通過(guò)底物、過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物、或反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)酶催化功能的抑制作用通常作為活性位點(diǎn)現(xiàn)象強(qiáng)有力的證據(jù)。已經(jīng)注意到抗體-介導(dǎo)的光致產(chǎn)生H2O2是使用分子氧可飽和的(Kmapp(O2187μM)(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。H2O2的這種形式產(chǎn)物抑制作用提供了此種結(jié)合位點(diǎn)現(xiàn)象的進(jìn)一步證據(jù)。
關(guān)于通過(guò)抗體光產(chǎn)生H2O2的早期報(bào)道沒(méi)有使用探測(cè)到能夠產(chǎn)生的H2O2最大量(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。通過(guò)反復(fù)循環(huán)UV照射抗體樣品隨后通過(guò)過(guò)氧化氫酶去除產(chǎn)生的H2O2已經(jīng)檢測(cè)了這一問(wèn)題(圖8C顯示兩個(gè)此類(lèi)循環(huán))。在一系列實(shí)驗(yàn)中，UV-照射和加入過(guò)氧化氫酶的循環(huán)進(jìn)行多至10次循環(huán)(馬poly IgG的PBS溶液，pH7.4)。在這些實(shí)驗(yàn)期間產(chǎn)生了＞500摩爾當(dāng)量(equiv.)的H2O2，而觀察到僅輕微降低了初始速率。除了抗體之外，迄今為止所發(fā)現(xiàn)的能以此種有效且長(zhǎng)期方式產(chǎn)生H2O2的唯一其它蛋白質(zhì)是αβT細(xì)胞受體(αβTCR)(圖8F)。有意思的是，αβTCR的免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)域享有與抗體相似的排列(Garcia等，Science，274，209(1996))。然而，象β2-微球蛋白所顯示的那樣，擁有這種結(jié)構(gòu)基序好像對(duì)蛋白質(zhì)的H2O2產(chǎn)生能力不是必需的，縱使β2-微球蛋白是免疫球蛋白超家族的一員但它不能夠產(chǎn)生H2O2(Welinder等，Mol.Immunol.，28，177(1991))。
抗體結(jié)構(gòu)對(duì)抗H2O2的氧化效應(yīng)明顯沒(méi)有活性。當(dāng)在H2O2存在下暴露于標(biāo)準(zhǔn)紫外線(xiàn)照射條件下6小時(shí)(以足以完全抑制H2O2產(chǎn)生的濃度)，一旦通過(guò)過(guò)氧化氫酶破壞掉抑制性的H2O2，多克隆馬IgG抗體樣品變得完全活化(圖8E)。甚至在暴露于H2O2之后，以一恒定速率、在較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生H2O2的能力，揭示抗體的結(jié)構(gòu)折疊對(duì)化學(xué)品的抗性和其它蛋白質(zhì)所遭受的光氧化修飾的抗性是明顯的，并且是至今未引起注意的。對(duì)在標(biāo)準(zhǔn)條件下UV照射8小時(shí)后的抗體樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析后顯示抗體分子既沒(méi)有明顯的片段化也沒(méi)有凝聚。
為了確定在H2O2存在的條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化(它可能促成了H2O2的明顯抑制效應(yīng))，甚至在側(cè)鏈位置的水平也沒(méi)有變化，在存在和不存在H2O2的情況下測(cè)定了Fab 4C6的x-射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)。之所以選擇Fab4C6是因?yàn)樗奶烊痪w的衍射分辨率高于任何其它公開(kāi)的抗體(～1.3D)。對(duì)于用3mM H2O2浸泡之前和之后4C6結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)參數(shù)均方根差(RMSD)進(jìn)行了比較。所用原子的RMSD＝0.412D，Cα原子的RMSD＝0.327D，主鏈原子的RMSD＝0.328D，側(cè)鏈原子的RMSD＝0.488D。鼠Fab4C6(Li等，J.Am.Chem.Soc.，117，3308(1995))的天然結(jié)構(gòu)和H2O2處理后的結(jié)構(gòu)疊置是可以重疊的，因此強(qiáng)化了抗體折疊對(duì)H2O2穩(wěn)定性的證據(jù)(圖9)。
將抗體介導(dǎo)的光致產(chǎn)生H2O2的作用譜和抗體蛋白質(zhì)對(duì)相應(yīng)的相同波長(zhǎng)范圍(260-320nm)的吸收譜并列列于圖10。兩個(gè)譜實(shí)際上與在蛋白質(zhì)中色氨酸最大UV吸收相同的激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)所觀察到的H2O2產(chǎn)生的最大效率是可重疊的。
檢測(cè)通過(guò)馬IgG產(chǎn)生H2O2的效率與通過(guò)用血卟啉IX敏化3O2(A＝0.22在磷酸緩沖液pH7.0中)和可見(jiàn)光下而導(dǎo)致1O2形成效率的關(guān)系，表明對(duì)于每275±25摩爾當(dāng)量的通過(guò)敏化作用產(chǎn)生的1O2，通過(guò)抗體分子產(chǎn)生1摩爾當(dāng)量H2O2(Wilkinson等，J.Phys.Chem.Ref.Data，22，113(1993)；Sakai等，Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.，2371，264(1995))。
電子源的問(wèn)題. 由抗體介導(dǎo)的從單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生H2O2所引出的機(jī)制問(wèn)題不得不嚴(yán)格的劃分為兩個(gè)下列問(wèn)題一個(gè)是關(guān)于該過(guò)程中的電子源問(wèn)題并且另一個(gè)是關(guān)于該過(guò)程的化學(xué)機(jī)制問(wèn)題?？紤]到從1O2到H2O2的轉(zhuǎn)化過(guò)程中需要2摩爾當(dāng)量電子，每個(gè)抗體分子當(dāng)量能夠產(chǎn)生＞500H2O2當(dāng)量的事實(shí)提出了一個(gè)尖銳的電子儲(chǔ)備問(wèn)題。對(duì)于電子來(lái)源研究開(kāi)始于最不同的可能性。通過(guò)蛋白質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移極其容易地并且顯著大距離地發(fā)生(Winkler等，Pure＆Appl.Chem.，71，1753(1999)；Winkler，Curr.Opin.Chem.Biol.，4，192(2000))。考慮的第一個(gè)電子源是涉及到在正常的蛋白質(zhì)光氧化過(guò)程中引用的、一般作為電子供體的殘基的集合體。在照射和過(guò)氧化氫酶處理的重復(fù)循環(huán)中通過(guò)抗體和αβ-TCR產(chǎn)生的幾乎恒定的H2O2產(chǎn)生速率(圖8C和8E)則與此種機(jī)制相背，因?yàn)槟軌虮谎趸臍埢兊弥饾u耗盡使得在H2O2的產(chǎn)生中將不得伴隨著速率的顯著降低。這種速率的降低將進(jìn)一步加重因?yàn)橛捎诘鞍踪|(zhì)變得具有更多正電荷使得剩余的未氧化殘基的氧化還原電位將不得不提高。
正常的蛋白質(zhì)光氧化過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)過(guò)程，該過(guò)程導(dǎo)致1O2和其它活性氧類(lèi)(ROS)例如超氧負(fù)離子(O2·-)、氫過(guò)氧自由基(HO2·)和H2O2的產(chǎn)生(Foote，Science，162，963(1968))。當(dāng)前對(duì)機(jī)制的思考將蛋白質(zhì)對(duì)光氧化的敏感性與多達(dá)五種氨基酸色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(和胱氨酸)、蛋氨酸(Met)和組氨酸(His)聯(lián)系起來(lái)(Straight和Spikes，在Singlet O2，A.A.Frimer，著者(CRC Press，Inc.，Boca raton，F(xiàn)lorida，1985)，IV9卷，91-143頁(yè)；Michaeli和Feitelson，Photochem.Photobiol.，59，284(1994))。通過(guò)Trp和分子氧光致產(chǎn)生H2O2是一個(gè)已進(jìn)行很好表征的過(guò)程，該過(guò)程涉及，至少部分涉及，從1O2到能夠自發(fā)歧化成H2O2和3O2的O2·的形成和還原(McMormick和Thompson，J.Am.Chem.Soc.，100，312(1978))。由于色氨酸能夠轉(zhuǎn)化為對(duì)近UV(λmax320nm)敏化劑特別有效的N，N-甲酰犬尿氨酸(NFK)，因此色氨酸，不論是作為單個(gè)氨基酸還是作為蛋白質(zhì)的成分，在有氧條件下對(duì)近UV照射(300-375nm)特別敏感(Walrant和Santus，Photochem.Photobiol.，19，411(1974))。然而，在近UV照射(圖11A)過(guò)程中Trp光氧化伴隨著H2O2的亞化學(xué)計(jì)量的產(chǎn)生(約0.5摩爾當(dāng)量)(McMormick和Thompson，J.Am.Chem.Soc.，100，312(1978))并且在光致產(chǎn)生H2O2中最有效的非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)β-半乳糖苷酶從其39Trp殘基中只產(chǎn)生5.9mol當(dāng)量的H2O2(圖8A)(Fowler和Zabin，J.Biol.Chem.，253，5521(1978))。
對(duì)人和小鼠抗體重鏈和輕鏈序列Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)的掃描(對(duì)3894個(gè)序列的2068個(gè)序列進(jìn)行了分析)顯示在其完整結(jié)構(gòu)中抗體很少有超過(guò)15個(gè)Trp殘基的(平均值＝15.5，范圍為14-31個(gè)Trp殘基)(Kabat等，免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)的序列(US Department of Health and人Services，PublicHealth Service，NIH，第5版，1991)；Martin，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能和遺傳學(xué)，25，130(1996))。實(shí)際上，即使將涉及上文的蛋白質(zhì)光氧化過(guò)程的所有氨基酸全體參與抗體介導(dǎo)的H2O2產(chǎn)生，這些殘基(平均＝90.1，范圍為49-167個(gè)反應(yīng)殘基)還是達(dá)不到產(chǎn)生500摩爾當(dāng)量H2O2的足夠數(shù)量。
考慮到氯離子是已知的通過(guò)蒽醌三激發(fā)態(tài)而光致產(chǎn)生H2O2的適宜電子源(Scharf和Weitz，Symp.Quantum Chem.Biochem.，Jerusalem 12卷(Catal.Chem.Biochem.Theory Exp.)，355-365頁(yè)(1979))，接下來(lái)研究了作為還原等價(jià)物的氯離子(以150mM存在于PBS)的電勢(shì)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)免疫球蛋白的H2O2產(chǎn)生速率不依賴(lài)于氯離子濃度時(shí)(圖11B)，這種可能性很快就大打折扣。
研究了金屬離子的可能的作用。雖然此類(lèi)離子很難以此種可以作為電子源的數(shù)量存在于抗體中，痕量的它們可能會(huì)作為催化氧化還原中心起著中心作用。為了所有的實(shí)踐目的，開(kāi)展了允許在此過(guò)程中涉及的微量金屬被排除的實(shí)驗(yàn)。例如，在將抗體樣品用含EDTA的緩沖液完全透析之前和之后抗體介導(dǎo)的光致產(chǎn)生H2O2的速率沒(méi)有發(fā)生變化(圖11C)。將抗體樣品用EDTA處理后，ICP-原子發(fā)射光譜分析(AES)顯示剩余的微量金屬離子存在的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于百萬(wàn)分率。對(duì)于該反應(yīng)中涉及的微量金屬，它對(duì)于所有的抗體都是普遍的因?yàn)樗治龅乃锌贵w都有這種內(nèi)在能力。人們普遍接受結(jié)合金屬不是抗體的一個(gè)內(nèi)在的特征并且這與我們對(duì)抗體晶體還有在Brookhaven數(shù)據(jù)庫(kù)中可得到的大約300種抗體結(jié)構(gòu)的分析相一致。
因此所有的觀察強(qiáng)制性的指向了鑒定電子源的需要，這種電子源并不意味著蛋白質(zhì)晶體的失活并且解釋了高轉(zhuǎn)化數(shù)量和因此解釋了類(lèi)似的非限制性的電子源。
對(duì)1O2的化學(xué)電位作了更廣的考慮。從先前的報(bào)道中可以清楚地推斷出在抗體介導(dǎo)的機(jī)制中存在分子氧的高能態(tài)的參與(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。簡(jiǎn)言之，抗體介導(dǎo)的光致產(chǎn)生H2O2速率在D2O中提高了并且在1O2猝滅劑疊氮化納存在的情況下降低了。此外，抗體還表現(xiàn)出通過(guò)使3O2在可見(jiàn)光下對(duì)血卟啉IX敏化，并且在黑暗中對(duì)內(nèi)過(guò)氧化物3N，3N-(1，4-亞萘基)二丙酸二鈉(一種化學(xué)1O2源)敏化而產(chǎn)生H2O2。1O2的參與還與抗體介導(dǎo)的H2O2產(chǎn)生的作用光譜和抗體成分色氨酸的吸收光譜的緊密相似性相一致(圖10)。
考慮到1O2的已知化學(xué)作用使其具有作為超-親電子試劑“二噁乙烯”的化學(xué)作用的概念(Foote，Acc.Chem.Res.，1，104(1968)，迄今未知的可能性認(rèn)為是在抗體存在的情況下，水分子能作為親核試劑加到1O2上并且形成作為中間體的H2O3。因此，正在變成被氧化至H2O2的水能夠?qū)崿F(xiàn)電子源的作用。
為了驗(yàn)證通過(guò)1O2抗體催化H2O的光氧化的假設(shè)，進(jìn)行了通過(guò)確定H2O2中氧的來(lái)源的氧同位素實(shí)驗(yàn)。使用經(jīng)過(guò)修改的標(biāo)準(zhǔn)H2O2檢測(cè)方法(Han等，Anal.Biochem.，234，107(1996))測(cè)定了H2O2中16O/18O的含量。簡(jiǎn)單的說(shuō)，這種方法包括用三羥乙基膦(TCEP)的還原，然后對(duì)相應(yīng)的氧化膦用質(zhì)譜(MS)分析(圖12)。
這些實(shí)驗(yàn)顯示抗體的UV照射，在氧存在時(shí)，導(dǎo)致在從水到H2O2的過(guò)程中有氧的摻入(圖12A和12B)。在H218O(98％18O)磷酸鹽緩沖液(PB)中16O2濃度飽和的條件下，綿羊poly-IgG被照射后，在氧化膦的MS分析中所觀察到16O/18O比率的相對(duì)豐度是2.2±0.2∶1(圖12A)。當(dāng)用H216OPB中18O富含的分子氧混合物(90％18O)進(jìn)行反向的實(shí)驗(yàn)時(shí)，觀察到了相反的比率(1∶2.0±0.2)(圖12B)。這些比率的數(shù)值呈現(xiàn)出很好的可重復(fù)性(+10％，n＝10)并且發(fā)現(xiàn)于所研究的所有抗體中。
開(kāi)展了下述的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。首先，在16O2和H216O的條件下，照射poly-IgG(馬)產(chǎn)生H216O2(圖12C)。當(dāng)將H216O2(400μM于PB，pH7.0)自身在H218O中照射4小時(shí)后沒(méi)有18O的摻入。這種結(jié)果減輕了顧慮，即18O摻入到H2O2中可能通過(guò)酸催化的與水的交換而發(fā)生或者通過(guò)一種涉及H216O2的均裂和與來(lái)源于水的H18O·的重組的機(jī)制而發(fā)生。為了檢查抗體能夠催化H216O2產(chǎn)生和催化其與H218O發(fā)生酸催化交換的可能性，觀察了在惰性氣體中UV照射后的在綿羊poly-IgG(6.7μM)存在的情況下H216O2(200μM)在H216O2(98％18O)PB中的同位素交換。觀察到只有微量的18O摻入到H216O2中(圖12D)。
對(duì)β-半乳糖苷酶(在產(chǎn)生H2O2方面最有效的非免疫球蛋白蛋白質(zhì))和3-甲基吲哚也進(jìn)行了同位素實(shí)驗(yàn)。在該兩種情況下，光氧化導(dǎo)致了18O以可以忽略不計(jì)的量摻入到H2O2中(圖12E和12F)，說(shuō)明在該蛋白質(zhì)中吲哚環(huán)自身和色氨酸殘基僅作為1O2的還原劑起作用的觀點(diǎn)。
這種觀點(diǎn)通過(guò)觀察進(jìn)一步得到支持，觀察發(fā)現(xiàn)照射3-甲基吲哚產(chǎn)生不包括從H218O而來(lái)的氧摻入的H2O2。用色氨酸進(jìn)行的相同實(shí)驗(yàn)的確發(fā)生了以16O/18O比率為1.2∶1的交換。這種結(jié)果被認(rèn)為是由于銨作為分子內(nèi)廣義酸起作用，質(zhì)子化3′-氫過(guò)氧化物的非對(duì)映混合物的內(nèi)部氧。應(yīng)該注意雖然從化學(xué)的觀點(diǎn)看是它是有趣的，但它不能解釋通過(guò)抗體的催化產(chǎn)生H2O2，因?yàn)樗且粋€(gè)化學(xué)當(dāng)量的過(guò)程并且蛋白質(zhì)中的Trp殘基不含有游離銨基。
化學(xué)機(jī)制.所研究的所有抗體能夠通過(guò)單線(xiàn)態(tài)氧催化水的氧化。對(duì)于通過(guò)1O2進(jìn)行H2O的氧化過(guò)程中反應(yīng)物和產(chǎn)物的熱力學(xué)平衡(反應(yīng)熱，ΔHr＝+28.1kcal/mol)(D.R.Lide，在化學(xué)和物理學(xué)手冊(cè)，第73版，(CRC，1992))需要化學(xué)計(jì)算，其中在其轉(zhuǎn)化入兩個(gè)H2O2分子的過(guò)程中，一個(gè)以上的1O2分子將不得不參加到每個(gè)氧化的水分子中?；瘜W(xué)計(jì)算假定在涉及從三氧產(chǎn)生單氧之間沒(méi)有其它光能參與該過(guò)程。對(duì)假想機(jī)械途徑的定量化學(xué)推理和熱力學(xué)考慮一起使得有可能如用方程1b或者c進(jìn)行全部化學(xué)計(jì)算(全部能量是從氣相實(shí)驗(yàn)生成熱計(jì)算得到的并報(bào)道為kcal/mol)； ΔHro＝28.1 (1a)； ΔHro＝5.6 (1b)；ΔHro＝-16.9(1c)最近關(guān)于通過(guò)碲-介導(dǎo)的氧化還原過(guò)程進(jìn)行金屬催化1O2和水轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化氫的過(guò)渡態(tài)的報(bào)道(Detty和Gibson，J.Am.Chem.Soc.，112，4086(1990))，為1O2和H2O能夠被轉(zhuǎn)化為H2O2的過(guò)程提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)并且，因此能夠克服該過(guò)程的能量需求。認(rèn)為抗體-介導(dǎo)的光氧化過(guò)程機(jī)理涉及將一分子水加成到一分子1O2形成三氧化二氫作為H2O2形成途徑中第一個(gè)中間體。抗體作為催化劑的功能將不得不提供特殊分子環(huán)境，該環(huán)境將穩(wěn)定有關(guān)其可逆形成的關(guān)鍵中間體并且，或者，將通過(guò)多渠道化其轉(zhuǎn)化為H2O2加速中間體的消耗。此種環(huán)境的基本特征可以包括在由抗體特異性環(huán)境所提供的活化部位所組成的水分子的特殊相互影響因素。
由于H2O3在生物系統(tǒng)中還未檢測(cè)到，其在體內(nèi)的化學(xué)作用相當(dāng)程度上來(lái)自推測(cè)，并且其體外特性已經(jīng)成為大量實(shí)驗(yàn)和理論處理的論題(C.Deby，La Recherche，228，378(1991)；Sawyer，氧化學(xué)(Oxford UniversityPress，Oxford，1991)；Cerkovnik和Plesnicar，J.Am.Chem.Soc.，115，12169(1993)；Vincent和Hillier，J.Phys.Chem.，99，3109(1995)；Plesnicar等，Chem.Eur.J.，6，809(2000)；Corey等，J.Am.Chem.Soc.，108，2472(1986)；Koller和Plesnicar，J.Am.Chem.Soc.，118，2470(1996)；Cacace等，Science，285，81(1999))。Plesnicar和其共同研究者們已經(jīng)表明H2O3(從臭氧還原產(chǎn)生的)分解為H2O和1O2(Koller和Plesnicar，J.Am.Chem.Soc.，118，2470(1996))。應(yīng)用微觀可逆性的原則，推測(cè)逆向反應(yīng)將也是由一個(gè)或多個(gè)水分子所催化的。為了描繪此過(guò)程似乎合理的反應(yīng)途徑和能量學(xué)，如此處所述首先使用了量子化學(xué)(QC)方法原理(B3LYP密度功能理論)。結(jié)果說(shuō)明于方程式2a-c(全部能量報(bào)道為kcal/mol)
(2a)0.069.5 15.5(2b)0.031.5 15.5(2c)0.015.5 15.5水和1O2產(chǎn)生H2O3的直接反應(yīng)是非常不利的，它具有70kcal/mol的激活勢(shì)壘(方程式2a)。然而，隨著加入第二或第三個(gè)水分子，發(fā)現(xiàn)一個(gè)協(xié)調(diào)的過(guò)程分別將激活勢(shì)壘降低至31.5和15.5kcal/mol。事實(shí)上這些加入的水確實(shí)具有催化劑的作用(在方程式2b中第2個(gè)水的H進(jìn)入產(chǎn)物HOOOH，同時(shí)用第一個(gè)水的H代替它)。與水的第一個(gè)HO鍵能(119kcal/mol)和1O2的鍵能(96kcal/mol)相比，這些勢(shì)壘是小的。注意到方程式2b和方程式2c中的逆反應(yīng)分別僅具有15.5或0kcal/mol的勢(shì)壘，表明大體積水和富含水的系統(tǒng)中H2O3是不穩(wěn)定的。因此，對(duì)于產(chǎn)生和利用H2O3的抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)最佳位點(diǎn)預(yù)期是位于緊靠沒(méi)有此種水的疏水區(qū)的、其中定位有水和水二聚體的位點(diǎn)。
來(lái)源于抗體催化的水光氧化的氧化膦內(nèi)的16O/18O比率明顯地限制反應(yīng)過(guò)程的選擇，通過(guò)該過(guò)程這種初級(jí)中間物H2O3將被轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物H2O2。對(duì)化學(xué)上參與從2摩爾H2O產(chǎn)生2摩爾H2O2并通過(guò)此種過(guò)程的機(jī)理細(xì)節(jié)的1O2的分子的數(shù)量來(lái)初步測(cè)定比率。2.2∶1的比率準(zhǔn)確地符合從特定機(jī)制中預(yù)測(cè)的值，在該機(jī)制中兩分子1O2和兩分子H2O被轉(zhuǎn)化成兩分子H2O2和一分子的分子氧(由于熱力學(xué)反應(yīng)其也許是3O2)。此種機(jī)制的例子是兩分子H2O3到H2O4和H2O2的SN2類(lèi)型的歧化反應(yīng)，然后是前者分解成H2O2和3O2。使用量子化學(xué)方法(B3LYP密度功能理論)在系統(tǒng)方法中解決了復(fù)雜的問(wèn)題，該復(fù)雜問(wèn)題就是對(duì)于有或沒(méi)有1O2參與的從H2O3到H2O2的轉(zhuǎn)化的理論可行反應(yīng)途徑的限定。這些研究表明H2O3的廣泛對(duì)接(docking)計(jì)算和對(duì)于大量蛋白質(zhì)其形成和轉(zhuǎn)化成H2O2的過(guò)渡態(tài)。的確在抗體(和αβ-T細(xì)胞受體)的區(qū)域中一個(gè)具有分離的水并接近疏水區(qū)的區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)穩(wěn)定該種種類(lèi)的獨(dú)特位點(diǎn)。這種廣泛的研究表明對(duì)于從H2O3到H2O2的轉(zhuǎn)化的理論可行化學(xué)途徑的整個(gè)范圍的潛在存在。
結(jié)合到抗體的氙的結(jié)構(gòu)研究。對(duì)于抗體，不論是起源或抗原特異性，或αβ-TCR介導(dǎo)此種反應(yīng)的保守能力，開(kāi)展了X-射線(xiàn)結(jié)構(gòu)研究以尋找這些免疫球蛋白折疊蛋白質(zhì)內(nèi)的可能的保守反應(yīng)位點(diǎn)。對(duì)于潛在位點(diǎn)的關(guān)鍵性限制是分子氧(1O2或者三線(xiàn)態(tài)氧，具有接近的潛在敏化殘基，優(yōu)選的是色氨酸)和水必須是能夠共定位的并且沿著該途徑過(guò)渡態(tài)和中間物在該位點(diǎn)內(nèi)或其附近必須是穩(wěn)定的。
有強(qiáng)有力的證據(jù)支持Xe和O2共定位于蛋白質(zhì)內(nèi)相同空穴內(nèi)的觀點(diǎn)(Tilson等，J.Mol.Biol.，199，195(1988)；Schoenborn等，Nature，207，28(1965))。因此，氙氣用作重原子示蹤物以定位鼠單克隆抗體4C6內(nèi)可能易于進(jìn)入分子氧的空穴(Li等，J.Am.Chem.Soc.，117，3308(1995))。
已鑒定了三個(gè)氙位點(diǎn)(圖13A)，并且如在蛋白質(zhì)中其它氙-結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)所觀察到的一樣全部占據(jù)疏水空穴(Scott和Gibson，Biochemistry，36，11909(1997)；Prangé等，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學(xué)，30，61(1998))。精細(xì)的天然結(jié)構(gòu)和氙-衍生結(jié)構(gòu)的重疊顯示除了加入氙以外，在蛋白質(zhì)骨架或構(gòu)想側(cè)鏈內(nèi)或者結(jié)合水分子的位點(diǎn)內(nèi)幾乎不具有可以辨別的改變。
在這里已經(jīng)更加詳細(xì)地分析了氙I結(jié)合位點(diǎn)(Xe1位點(diǎn))，因?yàn)樵谒锌贵w和αβTCR內(nèi)它都是保守的(圖13B)。Xe1位于離不變Trp距離為 的VL的β-片層之間高度保守區(qū)的中間。Xe1位點(diǎn)夾在兩個(gè)β-片層之間，包含VL的免疫球蛋白折疊，大約距離外部分子表面 Xe1位點(diǎn)2(Xe2)位于抗原結(jié)合袋的基底處，正好在幾個(gè)高度保守的殘基上面，這在抗體的重鏈和輕鏈之間形成了結(jié)構(gòu)上保守的界面(圖13A)。VLVH界面內(nèi)的殘基主要是疏水的并且包括保守的芳香族側(cè)鏈，例如TrpH109。
Fab4C6中用于Xe1的接觸側(cè)鏈?zhǔn)茿laL19、IleL21、LeuL73和IleL75，它們是所有抗體中高度保守的脂肪族側(cè)鏈(Kabat等，免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)的序列分析(美國(guó)衛(wèi)生和人類(lèi)服務(wù)部，Public Health Service，NIH，第5版，1991))。因此，在全部所檢測(cè)抗體的該區(qū)域內(nèi)僅觀察到輕微的結(jié)構(gòu)改變。值得注意的是，幾個(gè)其它高度保守且不變的殘基位于該氙位點(diǎn)緊密相鄰的位置，包括TrpL35、PheL62、TyrL86、LeuL104，以及CysL23和CysL88之間的二硫鍵。TrpL35堆疊抵抗二硫鍵并距氙原子僅 在該結(jié)構(gòu)中，由于TrpL35是Xe1最靠近的Trp，TrpL35可以是假定的分子氧敏化劑。將2CαβTCR結(jié)構(gòu)與全部可獲得的TCR結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較表明該Xe1疏水袋在TCR中也是高度保守的(圖5B)(Garcia，Science，274，209(1996))。
人β2-微球蛋白，其不產(chǎn)生H2O2，不具有限定抗體Xe1結(jié)合袋的相同精細(xì)結(jié)構(gòu)特征，盡管其總體上的免疫球蛋白折疊。同樣，β2-微球蛋白不含有在抗體和TCR中都存在的保守的Trp殘基。如果TrpL35(抗體)或Trpα34(TCR)是氧敏化劑，在β2-微球蛋白中缺乏相應(yīng)的Trp可以與其不催化水的氧化反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)相關(guān)。
因此，氙實(shí)驗(yàn)已經(jīng)鑒定了至少一個(gè)既易進(jìn)入分子氧也位于不變Trp附近的保守區(qū)(VL)內(nèi)的位點(diǎn)；一個(gè)等同的保守位點(diǎn)也可能位于VH折疊內(nèi)。在VH結(jié)構(gòu)域內(nèi)通過(guò)使VL與VH相關(guān)的假性2折疊旋轉(zhuǎn)軸幾乎可以精確再現(xiàn)Xe1位點(diǎn)周?chē)慕Y(jié)構(gòu)和序列。盡管氙結(jié)合位點(diǎn)不定位于該結(jié)構(gòu)域，認(rèn)為分子氧仍然能夠進(jìn)入相應(yīng)的VH空穴內(nèi)。可能還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)所提出的重鏈氙位點(diǎn)，因?yàn)閮H對(duì)結(jié)晶施壓作用2分鐘，這2分鐘時(shí)間可能不足以建立完全的平衡，或者僅僅因?yàn)榕c氧比較對(duì)于VH側(cè)面上相應(yīng)的空穴而言氙太大，或者由于晶體管殼(crystal packing)。在其它抗體實(shí)驗(yàn)中，僅在不對(duì)稱(chēng)單元的兩個(gè)分子中的一個(gè)分子內(nèi)發(fā)現(xiàn)了氙結(jié)合位點(diǎn)，這表明晶體管殼能夠調(diào)節(jié)Xe進(jìn)入晶體。對(duì)這些位點(diǎn)周?chē)男蛄泻徒Y(jié)構(gòu)進(jìn)行的分析顯示在抗體和TCR中它們都是高度保守的，因此提供了對(duì)為什么抗體和TCR中的Ig-折疊能夠參與這種不尋?；瘜W(xué)作用的一種可能的理解。
因其催化地將1O2轉(zhuǎn)化為H2O2的能力，抗體在蛋白質(zhì)中是獨(dú)特的。認(rèn)為該過(guò)程參與通過(guò)H2O2產(chǎn)生相關(guān)事件進(jìn)行殺傷。另外，抗體能夠執(zhí)行使有機(jī)體抵抗1O2的功能。這將需要通過(guò)過(guò)氧化氫酶進(jìn)一步將過(guò)氧化氫加工成水和三線(xiàn)態(tài)氧。
實(shí)施例III抗體的抗微生物活性本實(shí)施例表明針對(duì)細(xì)菌的抗體能夠通過(guò)產(chǎn)生活性氧類(lèi)殺死那些細(xì)菌。
材料和方法抗體和細(xì)胞制備從Pierce獲得綿羊(31243)和馬(31127)多克隆抗體并直接使用，不進(jìn)行進(jìn)一步純化。大腸桿菌O112a，c-特異的鼠單克隆抗體(15404)從QEDbiosciences獲得并直接使用，不進(jìn)行進(jìn)一步純化。大腸桿菌非特異鼠單克隆抗體33F12和84G3從Scripps Hybridoma實(shí)驗(yàn)室獲得并在＞98％純度(基于SDS-PAGE分析)時(shí)使用。單克隆抗體33F12是催化醛醇反應(yīng)的鼠單克隆IgG。Wagner等，Science 270，1797(1995)。大腸桿菌XL1-B從Stratagene獲得。大腸桿菌O112a，c(ATCC 12804)是腸侵染性大腸桿菌，能夠感染營(yíng)養(yǎng)不良和免疫功能不佳的個(gè)體。L.Siegfried，M.Kmetove，H.Puzova，M.Molokacova，J.Filka，J.Med.Microbiol.41，127(1994)。
以下抗體制備是通過(guò)以下方法在室內(nèi)進(jìn)行制備的。
大腸桿菌XL-1 blue特異的兔多克隆IgG在免疫的當(dāng)天(第0天)，將新西蘭白兔(2.5kg)從每只耳朵預(yù)先放血10ml并且然后用加熱殺死(65℃，15分鐘)的化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌XL-1(OD600＝1)(650μl和350μl磷酸鹽緩沖生理鹽水，PBS ph 7.4)進(jìn)行皮下注射。免疫后14天(第14天)，白兔以與第一次相同的方式接受第二次注射。免疫后28天(第28天)，白兔以與第一次和第二次注射相同的方式接受第三次注射。在免疫后35天(第35天)，將白兔從耳朵放血50ml.在免疫后42天(第42天)，將白兔從耳朵放血50ml.
血清允許在室溫靜置1-2小時(shí)，然后放置于4℃過(guò)夜并以2500-3500轉(zhuǎn)每分旋轉(zhuǎn)15分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至新的園底管(50ml)中并在9-10K轉(zhuǎn)每分旋轉(zhuǎn)15分鐘。將這些上清液轉(zhuǎn)移至干凈的圓錐形管(50ml)中并儲(chǔ)存于-10℃。然后通過(guò)ELISA(見(jiàn)下)測(cè)試血清，1∶1稀釋于PBS并且然后濾過(guò)0.2μM的濾器。測(cè)定血清樣品的蛋白質(zhì)濃度(Abs280)。然后將血清樣品裝到蛋白G柱子(Amersham Gamma-Bind G，10mg蛋白質(zhì)/ml珠子)上。用3倍柱體積的PBS pH7.4洗滌所結(jié)合的抗體并且然后2倍柱體積的醋酸(0.1M，pH3.0)進(jìn)行洗脫。用Tris緩沖液(1M，pH9.0)中和洗脫峰(每4ml級(jí)分加0.5ml)并且然后透析回PBS。
大腸桿菌XL-1 blue特異的鼠單克隆IgG在第0天，129只Gix+小鼠(6-8周，每組4只)接受腹膜內(nèi)注射加熱殺死(65℃，15分鐘)的化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌XL-1，溶于含50μl磷酸鹽緩沖生理鹽水，PBS ph 7.4的150μl體積，OD600＝1。在第14天時(shí)，小鼠以與第一次相同的方式接受第二次注射。在第28天時(shí)，小鼠以與第一次和第二次注射相同的方式接受第三次注射。在第35天時(shí)，將小鼠通過(guò)眼球內(nèi)穿刺取血。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備了12株XL-1 blue特異的單克隆抗體。通過(guò)硫酸銨沉淀然后通過(guò)裝入蛋白G柱子(Amersham Gamma-Bind G，10mg蛋白質(zhì)/ml珠子)純化抗體制劑。用3倍柱體積的PBS pH7.4洗滌所結(jié)合的抗體并且然后2倍柱體積的醋酸(0.1M，pH3.0)進(jìn)行洗脫。用Tris緩沖液(1M，pH9.0)中和洗脫峰(每4ml級(jí)分加0.5ml)并且然后透析回PBS。
用于確定抗體結(jié)合至活的或殺死的大腸桿菌的通用ELISA方法讀取大腸桿菌XL1-blue冷凍甘油儲(chǔ)存液的OD600并將活細(xì)菌儲(chǔ)存液稀釋于PBS至OD600＝1.0。將25微升一份的細(xì)菌放置于96-孔高結(jié)合(hi-bind)ELISA板內(nèi)并使其在37℃過(guò)夜干燥。輕輕用dH2O洗板兩次。用BLOTTO(50μl/孔)在室溫包被板子各孔30分鐘并且通過(guò)震蕩去除該包被液。然后將所測(cè)定的含抗體的樣品稀釋于BLOTTO并將25μl該溶液加入每個(gè)孔。在保溫盒內(nèi)將板子在37℃孵育1小時(shí)，用dH2O(10x)輕輕洗板并在每個(gè)孔中加入25μl溶于BLOTTO的第二抗體(HRP-山羊抗兔結(jié)合物，1∶2000)。在保溫盒內(nèi)將板子在37℃孵育1小時(shí)并用dH2O(10x)輕輕洗板。加入顯色底物(50μl/孔)并于30分鐘后在450nm讀取數(shù)值。
死細(xì)菌樣品也用于ELISA分析。以上述相同的方式處理樣品，但在加入并吸附于ELISA微孔板之前，將大腸桿菌加熱處死(65℃，15分鐘)。
殺菌試驗(yàn)在典型的實(shí)驗(yàn)中，重復(fù)沉淀(3×3,500轉(zhuǎn)每分)大腸桿菌培養(yǎng)物(在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600＝0.2-0.3)并重懸于PBS(pH7.4)。然后將PBS懸浮的細(xì)胞加入玻璃瓶管中并冷卻至4℃。加入血卟啉IX(40μM)和抗體(20μM)并將玻璃瓶管或放置于看片燈上(可見(jiàn)光，2.8mWcm-2)或放置于4℃黑暗并孵育1小時(shí)。通過(guò)瓊脂板上菌落形成單位(CFU)的恢復(fù)率測(cè)定存活率。每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)進(jìn)行兩次。
顯微鏡研究如下述制備樣品用于電子顯微鏡觀察。用溶于二甲砷酸鹽(0.1M)的多聚甲醛(2％w/v)、戊二醛(2.5％w/v)在0℃固定細(xì)胞1.75小時(shí)然后進(jìn)行沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸于溶于二甲砷酸鹽(0.1M)的OsO4(1％w/v)，使其靜置30分鐘并且然后進(jìn)行沉淀。然后連續(xù)用乙醇和環(huán)氧丙烷將沉淀脫水，包埋于樹(shù)脂并且然后進(jìn)行切片。用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛將切片染色。對(duì)于金標(biāo)記研究，所用步驟如上詳述并補(bǔ)充以下步驟。第一，將樣品沉淀并用新鮮的等滲緩沖液洗滌以去除未結(jié)合的一級(jí)抗體。第二，將樣品重懸于已經(jīng)用12nm的金顆粒共價(jià)修飾的山羊抗小鼠抗體溶液中，并孵育90分鐘。
在水溶液條件下O3的分解通過(guò)以下方法測(cè)定在所用的水溶液條件下O3的分解速率。將臭氧(通過(guò)使氧穿過(guò)Polymetrics臭氧發(fā)生器產(chǎn)生)在室溫使其通過(guò)石英管(1cm2)中的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)溶液進(jìn)行冒泡2分鐘。然后在裝備有22℃恒溫箱架的Hitachi紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定260nm(ε＝2,700M-lcm-1)處光密度時(shí)間依賴(lài)性改變至少5個(gè)半壽期。參見(jiàn)Takeuchi等，Anal.Chim.Acta.230，183(1990)。然后使用Graphpad Prism V3.0軟件從OD對(duì)時(shí)間曲線(xiàn)上圖解確定O3的半壽期(數(shù)據(jù)為顯示)。通過(guò)分光光度計(jì)限定測(cè)定的靈敏性精確至為t＝0時(shí)OD的±0.1％(～1μM)。
臭氧測(cè)定在典型的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)存在或缺乏含有或不含過(guò)氧化氫酶(13mU/mL)的抗體(20μM)時(shí)在透照燈(312nm，0.8mWcm-2)上室溫照射石英微孔板內(nèi)的靛藍(lán)胭脂紅1(1mM)的PBS(pH7.4)溶液(終體積200μL)，重復(fù)兩次。在不同時(shí)間點(diǎn)取出樣品(20μL)并浸入磷酸鹽緩沖液(100mM，pH3.0，180μL)淬滅。在微孔板讀值器(Spectramax)中測(cè)定610nm處的OD值。通過(guò)LC-MS(連接到Hitachi M-8000離子收集器電噴射質(zhì)譜儀上的HitachiD-7000HPLC(陰離子檢測(cè)模式))測(cè)定磺酸靛紅2的產(chǎn)生。LC條件是球形填料RP-C18柱子和乙腈水(30∶70)流動(dòng)相流速1mL/分鐘。機(jī)內(nèi)分離器用于將0.2mL/分鐘柱流出物傳送入MS?；撬岬寮t2RT＝3.4分鐘，[MH]-226。
對(duì)多種活性氧類(lèi)進(jìn)行測(cè)試以確定靛藍(lán)胭脂紅1是否能夠通過(guò)其它活性氧類(lèi)而不是臭氧轉(zhuǎn)化成為磺酸靛紅2。
表2所觀察到的通過(guò)不同活性氧類(lèi)的靛藍(lán)胭脂紅1a的氧化作用和18O同位素?fù)饺氕h(huán)狀α-酮酰胺2b。
a氧化作用是在所指定的條件下將各個(gè)氧化劑加入靛藍(lán)胭脂紅1(1mM)的磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)之前或之后通過(guò)室溫在微孔板讀值器內(nèi)以下610nm處吸光度的改變進(jìn)行測(cè)定的。
b18O摻入是通過(guò)在每種氧化劑特定的條件下用H218O(＞95％標(biāo)記的)進(jìn)行PB(100mM，pH7.4)中的靛藍(lán)胭脂紅1氧化作用和通過(guò)陰離子電噴射質(zhì)譜測(cè)定法監(jiān)測(cè)環(huán)狀α-酮酰胺2的同位素譜確定的。在測(cè)定條件下已裝入α-酮酰胺2的酰胺羰基的標(biāo)記物不與水發(fā)生互換。
c將靛藍(lán)胭脂紅(1，1mM)加入到臭氧(～600μM)PB(100mM，pH7.0)溶液中。
d通過(guò)用可見(jiàn)光(2.7mW/cm-2)照射血卟啉IX(40μM)溶液和1(1mM)的PB溶液1小時(shí)觀察1O2*的作用。
e參見(jiàn)參考文獻(xiàn)42。
f將溶于DMSO的過(guò)氧化鉀(10mM)加入1的PB(100mM，pH7.0)溶液中以至于最終有機(jī)共溶劑為5％。
gPB中終濃度為2mM。
h未檢測(cè)。
i將靛藍(lán)胭脂紅(1，1mM)加入到NaOCl(20mM)的PBS(pH7.4)溶液中并且在完全漂白溶液之后通過(guò)HPLC測(cè)定環(huán)狀α-酮酰胺2的形成。
初步研究揭示了，當(dāng)存在紫外光(312nm，0.8mWcm-2)時(shí)環(huán)狀α-酮酰胺2內(nèi)酰胺羰基氧與水發(fā)生快速和可逆的互換。然而，用白光照射時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不發(fā)生可辨別的互換。因此，全部18O同位素?fù)饺朐囼?yàn)使用血卟啉IX(40μM)和白光(2.7mWcm-2)作為1O2*來(lái)源而進(jìn)行。
使用以下含有正常碳-碳雙鍵的額外化學(xué)探針進(jìn)行進(jìn)一步研究。
3-乙烯基3 3-羧基5a 3-環(huán)氧乙烷基6a4乙烯基4 4-羧基5b 4-環(huán)氧乙烷基6b通過(guò)其水溶液溶解度結(jié)合易于通過(guò)HPLC檢測(cè)而指導(dǎo)探針3-和4-乙烯基苯甲酸(分別為3和4)的選擇。在典型的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)存在或缺乏抗體4C6或綿羊多克隆抗體(20μM)時(shí)，將3-乙烯基苯甲酸3(1mM)或4-乙烯基苯甲酸4(1mM)的PBS(pH7.4)溶液在室溫進(jìn)行照射(312nm，0.8mW/cm-2)。定時(shí)取出等份(20μL)并1∶3稀釋于乙腈∶水(1∶1)。通過(guò)反相HPLC測(cè)定產(chǎn)物組合物。
3-乙烯基苯甲酸3(1mM)PBS(pH7.4)溶液的室溫常規(guī)臭氧分解作用導(dǎo)致苯甲醛衍生物5a的產(chǎn)生，同時(shí)伴有比率為～10∶1的小量相應(yīng)環(huán)氧化物6a的產(chǎn)生。同樣，在上述相同條件下4的臭氧分解作用導(dǎo)致以～9∶1的比率形成4-羧基苯甲醛5b和對(duì)應(yīng)的環(huán)氧乙烷5b。在典型的實(shí)驗(yàn)中，在室溫將3或4(1mM)的PBS(pH7.4)溶液加入到O3PBS(600μM)溶液中并使其靜置5-10分鐘。以該種方式而不是通過(guò)使O3/O2混合物穿過(guò)反應(yīng)水溶液進(jìn)行3和4的臭氧分解作用以阻止3和4的進(jìn)一步氧化作用，進(jìn)一步氧化會(huì)導(dǎo)致芳族環(huán)的羥基化作用和片段化。通過(guò)反相HPLC闡明產(chǎn)物混合物和底物轉(zhuǎn)化。在Hitachi D-7000機(jī)器上使用Spherisorb RP-18柱子進(jìn)行HPLC分析并且流動(dòng)相為乙腈和水(0.1％TFA)(30∶70)流速為1mL/分鐘。通過(guò)紫外檢測(cè)(254nm)(RT3＝7.84分鐘；RT5a＝4.02分鐘；RT6a＝3.82分鐘；RT48.50分鐘；RT5b＝3.72分鐘；RT6b＝4.25分鐘)進(jìn)行定位。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較將峰面積轉(zhuǎn)化為濃度。
嗜中性粒細(xì)胞上的抗體檢測(cè)已知在嗜中性粒細(xì)胞的表面具有抗體。熒光激活細(xì)胞分選術(shù)用于測(cè)定在靜息或活化條件下每個(gè)細(xì)胞存在的免疫球蛋白分子的數(shù)量。在靜息條件下每個(gè)細(xì)胞大約有50,000個(gè)抗體分子，當(dāng)活化后將增加到每個(gè)細(xì)胞大約65,000個(gè)抗體分子。
結(jié)果抗體的抗微生物活性如上所說(shuō)明，通過(guò)經(jīng)由三氧化二氫(H2O3)中間體的過(guò)程，抗體可催化從單線(xiàn)態(tài)氧(1O2*)和水產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)。該實(shí)施例中提供的結(jié)果說(shuō)明抗體能夠利用該過(guò)程有效地殺死細(xì)菌。
最初的殺菌研究利用兩株革蘭陰性菌大腸桿菌菌株(XL1-blue和O-112a，c)。大腸桿菌XL1-B從Stratagene獲得。大腸桿菌O112a，c(ATCC12804)是能夠感染營(yíng)養(yǎng)不良和免疫反應(yīng)不佳個(gè)體的腸侵染性大腸桿菌菌株。Siegfried等，J.Med.Microbiol.41，127(1994)。
1O2*離子具有殺菌作用。Berthiaume等，Biotechnology 12，703(1994)。然而，通過(guò)抗體起始H2O2產(chǎn)生需要暴露于底物1O2*。Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)。因此，僅使用1O2*產(chǎn)生系統(tǒng)自身將不會(huì)殺死大腸桿菌?？贵w能夠利用分別由內(nèi)源性或外源性敏化劑或化學(xué)材料，使用紫外光或白光，或高溫分解諸如蒽-9，10-二丙酸內(nèi)過(guò)氧化物，所產(chǎn)生的1O2*。因此，僅通過(guò)實(shí)驗(yàn)思路例如反應(yīng)效率和細(xì)胞或底物對(duì)照射的敏感性可以指導(dǎo)1O2*產(chǎn)生系統(tǒng)的選擇。在這些試驗(yàn)中，選擇血卟啉IX(HPIX，40μM)作為有效的3O2敏化劑。Wilkinson等，J.Phys.Chem.Ref.Data 22，113(1993)。當(dāng)在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)中在4±1℃用白光(光通量2.7mWcm-2)照射1小時(shí)時(shí)，對(duì)于兩種大腸桿菌血清型(～107個(gè)細(xì)胞/mL)血卟啉IX具有可忽略的殺菌活性。
在典型的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)沉淀(3×3,500轉(zhuǎn)每分)細(xì)胞并將其重懸于PBS(pH7.4)重復(fù)用PBS洗滌大腸桿菌培養(yǎng)物(處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600＝0.2-0.3)。然后將PBS重懸的細(xì)胞加入到玻璃瓶管中并冷卻至4℃。加入血卟啉IX(HPIX，40μM)和抗體(20μM)并將玻璃瓶管或放置于看片燈(可見(jiàn)光，2.8mWcm-2)上或放置于黑暗4℃并孵育1小時(shí)。通過(guò)瓊脂糖平板上菌落形成單位(CFU)確定存活率。每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)進(jìn)行兩次。
將單克隆抗體(20μM)加入血卟啉IX和細(xì)菌的混合物導(dǎo)致殺死＞95％的細(xì)菌(圖14A)?？贵w的殺菌活性是抗體濃度的函數(shù)。例如，使用10μM抗原特異性鼠單克隆抗體15404能夠獲得O112a，c細(xì)胞＞95％的殺傷。這些數(shù)據(jù)表明殺死50％細(xì)胞的有效抗體濃度(EC50)是81±6nM(圖14B)。對(duì)于針對(duì)XL1-blue大腸桿菌菌株的單克隆抗體(25D11)也觀察到相似的濃度對(duì)殺傷依賴(lài)性，觀察到在大約10μM處最大殺傷為＞95％。
抗體-介導(dǎo)的殺菌活性作為照射時(shí)間的函數(shù)而增加(圖14C)并隨著增加血卟啉IX的濃度而增加(光通量固定于2.7mWcm-2)(圖14D)。抗體-介導(dǎo)的細(xì)菌殺傷與血卟啉IX濃度和光照射成比例關(guān)系的觀察結(jié)果表明在該過(guò)程中1O2*和水氧化途徑都具有關(guān)鍵作用。關(guān)鍵地是，當(dāng)缺乏1O2*時(shí)，免疫球蛋白對(duì)大腸桿菌的存活具有可忽略的影響。
對(duì)照顯示冷休克和血卟啉IX毒性不影響菌落形成單位(CFU)的明顯損失。而且，共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)顯示抗體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞聚集也不助于抗體處理組中CFU的缺乏。細(xì)菌細(xì)胞的熒光分析表明在血卟啉IX處理的大腸桿菌細(xì)胞中膜相關(guān)敏化劑的量不通過(guò)抗體結(jié)合而增加。最后，由于難以排除微量金屬在抗體殺菌作用中的潛在作用，所以EDTA(2mM)的存在對(duì)所使用的測(cè)定系統(tǒng)中細(xì)菌的存活沒(méi)有影響。
抗體的殺菌潛能表現(xiàn)為一般現(xiàn)象。進(jìn)行測(cè)試的所有12株鼠單克隆抗體(1xкγ、7xкγ2a、3xкγ2b、1xкγ3同種型)和一株兔多克隆抗體(滴度120,000)樣品都是殺菌的。非特異抗體也能夠產(chǎn)生殺菌劑。僅1O2*是水氧化途徑活化所必需的-此種活化不依賴(lài)于抗體-抗原聯(lián)合體。關(guān)于這方面，研究了對(duì)大腸桿菌細(xì)胞表面抗原沒(méi)有特異性的10個(gè)非特異鼠單克隆抗體、一個(gè)非特異綿羊抗體制劑和一個(gè)馬多克隆IgG樣品并且全部具有殺菌活性。觀察到抗原非特異抗體的殺菌活性潛能與抗原特異性抗體非常相似。在測(cè)定系統(tǒng)中一般20μM抗體(非特異)具有＞95％的殺菌性?？贵w的殺菌作用不僅僅是非特異蛋白質(zhì)作用，因?yàn)樵谠摐y(cè)定系統(tǒng)中牛血清白蛋白(BSA，20μM)呈現(xiàn)出無(wú)細(xì)菌殺傷性。
為了能夠洞察所觀察的細(xì)菌殺傷的特性，通過(guò)電子顯微鏡研究了所殺死的細(xì)菌的形態(tài)學(xué)。金標(biāo)記二級(jí)抗體用于使形態(tài)學(xué)損傷與細(xì)菌細(xì)胞壁上抗體結(jié)合的位點(diǎn)相關(guān)。
殺傷與在細(xì)菌細(xì)胞壁中抗原-抗體聯(lián)合體位點(diǎn)處孔洞的產(chǎn)生相關(guān)(圖15)。由呈現(xiàn)于細(xì)菌樣品內(nèi)的形態(tài)學(xué)的排列證明該過(guò)程表現(xiàn)為一種逐漸的過(guò)程。在殺菌途徑中具有清楚的階段，其中氧化損傷導(dǎo)致細(xì)胞壁和質(zhì)膜對(duì)水的滲透性增加。
細(xì)菌處于大約30大氣壓的內(nèi)壓力下，因此膜的任意衰弱都能夠?qū)е聻?zāi)難性的破裂。該過(guò)程顯示首先在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)之間的界面處觀察到輕微的破壞(圖16A)，隨著細(xì)胞壁從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物清楚地分離該破壞變得更加嚴(yán)重(圖16B)。持續(xù)的水流入導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重畸形和殘缺(圖16C)，最終導(dǎo)致在抗體吸附位點(diǎn)處細(xì)胞壁和質(zhì)膜的破裂和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物的噴出(圖16D)。在這方面，有趣的是所觀察到的由抗體-介導(dǎo)的殺傷所誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)改變與當(dāng)細(xì)菌被吞噬作用所破壞時(shí)所見(jiàn)到的改變相似。Hofman等，Infect.Immun.68，449(2000)。
殺菌劑的化學(xué)特性如果H2O2是抗體催化的水氧化途徑的最終產(chǎn)物(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)；P.Wentworth，Jr.等，Science 293，1806(2001))，那么僅H2O2將可作為殺傷劑。通過(guò)過(guò)氧化氫酶，該酶將H2O2轉(zhuǎn)化為水(H2O)和分子氧(O2)，提供針對(duì)非特異性抗體殺菌活性的完全保護(hù)的觀察(圖17A)強(qiáng)化了該結(jié)論。
由非特異性抗體所產(chǎn)生的H2O2的量是35±5μM。由特異性抗體所產(chǎn)生的H2O2的量是可變的。距離接近的問(wèn)題使得直接進(jìn)行溶液中H2O2與復(fù)雜細(xì)菌膜表面上所產(chǎn)生的H2O2的效果之間的比較。例如，研究了過(guò)氧化氫酶(13mU/mL)對(duì)11種大腸桿菌抗原特異性鼠單克隆抗體和11種大腸桿菌非特異性鼠單克隆抗體的殺菌活性的保護(hù)效應(yīng)。在所有具有非特異性抗體的情況下，過(guò)氧化氫酶完全減弱了殺菌活性。然而對(duì)于抗原特異性抗體，通過(guò)過(guò)氧化氫酶保護(hù)作用的程度依賴(lài)于所使用的單克隆抗體并且在很大范圍內(nèi)變化。因此，H2O2產(chǎn)生(直接產(chǎn)生于細(xì)菌膜表面或溶液內(nèi))的距離影響由過(guò)氧化氫酶所提供的保護(hù)的程度。因此，僅將溶液中H2O2的效應(yīng)與抗原非特異性抗體所產(chǎn)生的H2O2進(jìn)行了比較。
在4℃使用可見(jiàn)光(2.7mWcm-2)照射PBS(pH7.4)含有血卟啉IX(40μM)的混合物1小時(shí)期間由非特異性抗體(20μM)所產(chǎn)生的H2O2的形成平均速率(35±5μM/小時(shí))是高度保守的。該平均值是從10種鼠單克隆IgG和一種綿羊和一種馬多克隆IgG(n＝12)確定的。
然而，當(dāng)將H2O2對(duì)兩種大腸桿菌細(xì)胞系的毒性進(jìn)行定量時(shí)，由非特異性抗體所產(chǎn)生的H2O2的量35±5μM單獨(dú)不能夠解釋殺菌活性的潛能就變得很明顯了(圖17B)。該數(shù)值為低于殺死50％細(xì)菌所必需的量的1到4個(gè)數(shù)量級(jí)之間，這取決于細(xì)胞系是否分別是XL1-blue或O112a，c。
H2O2與抗體組合和/或H2O2與血卟啉IX組合并不比單獨(dú)H2O2對(duì)細(xì)菌更有毒性。對(duì)這些變量進(jìn)行測(cè)定以確定在H2O2和測(cè)定中負(fù)責(zé)殺菌活性潛能的其他成分之間是否可以發(fā)生相互作用。具體而言，對(duì)于針對(duì)大腸桿菌O112a，c的殺菌活性測(cè)試了以下情況的組合
1.H2O2(2mM)和非特異性抗體(20μM)；2.H2O2(2mM)和抗原特異性抗體(20μM)；和3.H2O2(2mM)和HPIX(40μM)。
每組使用可見(jiàn)光(2.7mWcm-2)4℃照射1小時(shí)。對(duì)于這些組合的任意一項(xiàng)與單獨(dú)H2O2(2mM)相比沒(méi)有觀察到殺傷的增強(qiáng)。
H2O2對(duì)大腸桿菌的毒性低于抗體所產(chǎn)生的毒性的發(fā)現(xiàn)使得有必要重復(fù)檢驗(yàn)使用過(guò)氧化氫酶的實(shí)驗(yàn)。一種可能性是H2O2與也由抗體所產(chǎn)生的一些其它種類(lèi)化學(xué)品起反應(yīng)，產(chǎn)生其它殺菌分子并且因此，通過(guò)破壞H2O2，過(guò)氧化氫酶可阻止其它種類(lèi)化學(xué)品的形成。另一種可能性是處于形成H2O2途徑上的殺菌劑同時(shí)也是過(guò)氧化氫酶的底物。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明臭氧(O3)是由抗體產(chǎn)生的。在所使用的水溶液條件下，臭氧是非常長(zhǎng)壽的(t1/2＝66秒)。因此，臭氧是長(zhǎng)壽的足以通過(guò)諸如靛藍(lán)胭脂紅1(一種用于檢測(cè)水溶液系統(tǒng)中O3的敏感試劑)這一化學(xué)探針進(jìn)行檢測(cè)。Takeuchi等，Anal.Chem.61，619(1989)；Takeuchi等，Anal.Chim.Acta.230，183(1990)。水溶液中靛藍(lán)胭脂紅1的常規(guī)臭氧分解作用導(dǎo)致靛藍(lán)胭脂紅1的特征吸光度(γmax610nm，ε＝20,000LM-1m-1)的褪色(bleaching)和環(huán)狀α-酮酰胺2的形成(圖18A)。
為了證明臭氧是由抗體產(chǎn)生的，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。在不存在抗體時(shí)使用紫外光(312nm，0.8mWcm-2)照射靛藍(lán)胭脂紅1的PBS(pH7.4)溶液。沒(méi)有觀察到褪色。然而，當(dāng)在存在綿羊多克隆抗體(20μM)或鼠單克隆抗體33F12(20μM)條件下進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)時(shí)觀察到靛藍(lán)胭脂紅1的褪色(圖18B)。電噴射質(zhì)譜測(cè)定法和HPLC分析證實(shí)在該過(guò)程中形成了環(huán)狀α-酮酰胺2。照射(312nm，0.8mWcm-2)靛藍(lán)胭脂紅1(1mM)2小時(shí)后綿羊多克隆抗體和單克隆抗體33F12分別產(chǎn)生4.1μM和4.9μM環(huán)狀α-酮酰胺2。抗體介導(dǎo)的靛藍(lán)胭脂紅1轉(zhuǎn)化為環(huán)狀α-酮酰胺2的最初速率是線(xiàn)性的，不依賴(lài)于抗體制劑(綿羊多克隆IgG＝34.8±1.8nM/分鐘，33F12＝40.5±1.5nM/分鐘)(圖18B)。
靛藍(lán)胭脂紅1C＝C雙鍵的氧化斷裂是臭氧檢測(cè)的敏感探針。Takeuchi等，Anal.Chem.61，619(1989)；Takeuchi等，Anal.Chim.Acta.230，183(1990)。然而，此種斷裂不是對(duì)臭氧特異的。在特定條件下進(jìn)行使用表2中列出的氧化劑的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以測(cè)試那些氧化劑是否也能夠氧化靛藍(lán)胭脂紅1。此種實(shí)驗(yàn)證實(shí)單線(xiàn)態(tài)氧(1O2)能夠通過(guò)氧化性雙鍵斷裂褪色靛藍(lán)胭脂紅1溶液形成環(huán)狀α-酮酰胺2。當(dāng)紫外照射時(shí)通過(guò)抗體產(chǎn)生1O2*。Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)；Wentworth等，Science 293，1806(2001)。因此尋找了由1O2*氧化斷裂靛藍(lán)胭脂紅1形成環(huán)狀α-酮酰胺2與由O3形成之間的分析差別。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)臭氧是氧化劑時(shí)，通過(guò)觀察18O摻入環(huán)狀α-酮酰胺2的內(nèi)酰胺羰基能夠?qū)⑼ㄟ^(guò)O3斷裂與通過(guò)1O2*斷裂區(qū)別開(kāi)來(lái)。當(dāng)1O2*是氧化劑時(shí)，不發(fā)生此種18O摻入到環(huán)狀α-酮酰胺2的內(nèi)酰胺羰基內(nèi)。因此在含有磷酸鹽緩沖液(PB，100mM，pH7.4)的H218O(＞95％18O)內(nèi)進(jìn)行了同位素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)(表2和圖19)，通過(guò)使用可見(jiàn)光(2.7mWcm-2)照射血卟啉IX(40μM)產(chǎn)生了1O2*。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了在18O-水中靛藍(lán)胭脂紅1和2都進(jìn)行緩慢但自發(fā)的同位素?fù)饺氲街械逅{(lán)胭脂紅1和2的酮-羰基基團(tuán)，但是不摻入到2的內(nèi)酰胺羰基基團(tuán)。因此，2質(zhì)譜中的診斷標(biāo)記是由對(duì)應(yīng)18O摻入的雙同位素?fù)饺氲?的酮和內(nèi)酰胺羰基基團(tuán)內(nèi)所產(chǎn)生的[M-H]-230片段。因此，在氧化產(chǎn)物的質(zhì)譜中，當(dāng)在H218O中通過(guò)化學(xué)臭氧分解作用進(jìn)行靛藍(lán)胭脂紅1的氧化(圖19B)時(shí)，而不是通過(guò)1O2*氧化靛藍(lán)胭脂紅1(圖19C)時(shí)，觀察到了質(zhì)量峰[M-H]-230。參見(jiàn)Gorman等，于Singlet OxygenChemistry，205(1988)。
當(dāng)存在綿羊IgG(20μM)和血卟啉IX(40μM)使用可見(jiàn)光(2.8mWcm-2)照射靛藍(lán)胭脂紅1(100μM)時(shí)，形成了氧化產(chǎn)物2且其質(zhì)譜證明水的18O交換入內(nèi)酰胺羰基(圖19A)。這些數(shù)據(jù)表明當(dāng)存在抗體時(shí)臭氧是靛藍(lán)胭脂紅1的氧化劑。
為了進(jìn)一步證實(shí)臭氧是由抗體產(chǎn)生的，測(cè)試了以下額外的包含正常碳-碳雙鍵的化學(xué)探針。
3-乙烯基3 3-羧基5a 3-環(huán)氧乙烷基6a4-乙烯基4 4-羧基5b 4-環(huán)氧乙烷基6b在典型的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)存在或缺乏抗體4C6或綿羊多克隆抗體(20μM)時(shí)在室溫照射(312nm，0.8mW/cm-2)3-乙烯基苯甲酸3(1mM)或4-乙烯基苯甲酸4(1mM)的PBS(pH7.4)溶液。定時(shí)取出等份(20μL)并1∶3稀釋于乙腈∶水(1∶1)。通過(guò)反相HPLC確定產(chǎn)物組合物。
當(dāng)存在綿羊多克隆IgG(20μM)時(shí)使用紫外光(312nm，0.8mWcm-2)照射化合物3和4(1mM)溶液，導(dǎo)致分別形成3-羧基苯甲醛5a和3-環(huán)氧乙烷基苯甲酸6a(比率為15∶1，3小時(shí)后轉(zhuǎn)化3的1.5％)和4-羧基苯甲醛5b和4-環(huán)氧乙烷基苯甲酸6b(比率為10∶1，3小時(shí)后轉(zhuǎn)化4的2％)。當(dāng)化合物3和4以常規(guī)方式進(jìn)行臭氧化時(shí)也觀察到這些產(chǎn)物。而且，這些結(jié)果與存在綿羊多克隆抗體或鼠單克隆抗體33F12使用紫外光照射靛藍(lán)胭脂紅1時(shí)的那些觀察結(jié)果相似，其中觀察到靛藍(lán)胭脂紅1的褪色(圖18B)。另外，如果不存在抗體，不能觀察到褪色，但存在抗體時(shí)觀察到指示臭氧的氧化產(chǎn)物。
形成明顯對(duì)照的是，在相似條件下由血卟啉IX(40μM)和可見(jiàn)光(2.7mWcm-2)所產(chǎn)生的1O2*不引起任意可檢測(cè)的3或4的氧化。因此，3-乙烯基苯甲醛3和4-乙烯基苯甲醛4對(duì)臭氧具選擇性，并且臭氧必須是通過(guò)反應(yīng)中所存在的抗體產(chǎn)生。
由活化的嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生臭氧的證據(jù)嗜中性粒細(xì)胞是宿主抵抗細(xì)菌的重要部分并且已知在其細(xì)胞表面具有抗體，而且當(dāng)活化時(shí)，產(chǎn)生包括1O2*在內(nèi)的強(qiáng)氧化劑的混合物。Steinbeck等，J.Biol.Chem.267，13425(1992)；Steinbeck et al.，J.Biol.Chem.268，15649(1993)。因此，這些細(xì)胞提供了非光化學(xué)、生物來(lái)源的1O2*和能夠?qū)⒃摰孜锿ㄟ^(guò)水氧化途徑進(jìn)行加工的抗體。機(jī)體的大部分區(qū)域不能利用光化學(xué)能量。因此，如果嗜中性粒細(xì)胞提供細(xì)胞來(lái)源的1O2，對(duì)活化后由抗體包被的嗜中性粒細(xì)胞所釋放出的氧化劑進(jìn)行分析能夠提供關(guān)于由此類(lèi)抗體所產(chǎn)生的臭氧或H2O2是否可以具有生理學(xué)相關(guān)性的指示。
如M.Markert，P.C.Andrews和B.M.Babior Methods Enzymol.105，358(1984)所述制備人嗜中性粒細(xì)胞。肉豆蔻酸佛波酯(1μg/mL)活化后，嗜中性粒細(xì)胞(1.5×107個(gè)細(xì)胞/mL)產(chǎn)生將靛藍(lán)胭脂紅1氧化斷裂成磺酸靛紅2(圖19和圖20B)的氧化劑。雖然次氯酸(HOCl)是已知由嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的氧化劑，但PBS(pH7.4)中NaOCl(2mM)的測(cè)試表明氧化靛藍(lán)胭脂紅1(100μM)但不斷裂靛藍(lán)胭脂紅1的雙鍵以產(chǎn)生磺酸靛紅2。當(dāng)在18O水中進(jìn)行靛藍(lán)胭脂紅1氧化作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)50％的內(nèi)酰胺羰基氧由18O組成，正如由所分離的斷裂產(chǎn)物磺酸靛紅2的質(zhì)譜中[M-H]-230質(zhì)譜峰的強(qiáng)度所顯示(圖20B)。該18O摻入表明臭氧是由抗體包被的嗜中性粒細(xì)胞所產(chǎn)生的。
圖20A圖解說(shuō)明通過(guò)已經(jīng)用PBS(pH7.4)中的肉豆蔻酸佛波酯(1μg/mL)在37℃活化的人嗜中性粒細(xì)胞(PMN，1.5×107個(gè)細(xì)胞/mL)氧化靛藍(lán)胭脂紅1(30μM)(＞)和形成磺酸靛紅2(□)的時(shí)間過(guò)程。有意思的是，在嗜中性粒細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中觀察到來(lái)自靛藍(lán)胭脂紅1的磺酸靛紅2的幾乎50％的可能產(chǎn)量(潛在60μM的25.1±0.3μM)，顯示了在該氧化途徑中負(fù)責(zé)該轉(zhuǎn)化的氧化劑的有效濃度。
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所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)此處引用作為參考。雖然在本發(fā)明的上述說(shuō)明書(shū)中已經(jīng)描述了其優(yōu)選的實(shí)施方案，并且為了說(shuō)明已經(jīng)描述了一些細(xì)節(jié)，對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員很明顯本發(fā)明還允許其它實(shí)施方案并且此處所述的某些細(xì)節(jié)可以在不偏離本發(fā)明基本原則的范圍內(nèi)進(jìn)行相當(dāng)?shù)母淖儭?br> 本發(fā)明的以下聲明試圖根據(jù)本說(shuō)明書(shū)所給出的上述描述表征本發(fā)明的可能要素。因?yàn)樵撋暾?qǐng)是臨時(shí)申請(qǐng)，這些聲明可能在當(dāng)準(zhǔn)備和遞交非臨時(shí)申請(qǐng)時(shí)發(fā)生改變。如果發(fā)生此類(lèi)變化，則根據(jù)非臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)岢龅臋?quán)利要求，此類(lèi)變化不用于影響等效物的范圍。根據(jù)35U.S.C.§111(b)，權(quán)利要求不是臨時(shí)申請(qǐng)所必需的。因此，本發(fā)明的聲明不能解釋為按照35U.S.C.§112的權(quán)利要求。
權(quán)利要求
1.測(cè)定哺乳動(dòng)物中免疫應(yīng)答的方法，其包括(a)將用于活性氧類(lèi)的化學(xué)探針施與哺乳動(dòng)物；(b)從哺乳動(dòng)物獲得樣品；和(c)對(duì)所述樣品分析化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物。
2.聲明1的方法，其中化學(xué)探針是能夠被氧化并產(chǎn)生可檢測(cè)氧化產(chǎn)物的烯烴。
3.聲明1的方法，其中化學(xué)探針是3-乙烯基-苯甲酸、4-乙烯基-苯甲酸、靛藍(lán)胭脂紅、均二苯代乙烯或膽固醇。
4.聲明1的方法，其中活性氧類(lèi)是抗體產(chǎn)生的氧類(lèi)。
5.聲明1的方法，其中活性氧類(lèi)是超氧自由基、羥自由基、氫過(guò)氧自由基或過(guò)氧化氫。
6.聲明1的方法，其中活性氧類(lèi)是臭氧或具有臭氧化學(xué)標(biāo)簽的任一化學(xué)物類(lèi)。
7.聲明1的方法，其中樣品是體液。
8.聲明5的方法，其中體液是金血、血清、血漿、滑膜液、淋巴液、尿液、唾液、粘液或眼淚。
9.聲明1的方法，其中樣品是組織樣品。
10.聲明1的方法，其中化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物可通過(guò)高壓液相色譜法、質(zhì)譜法、紫外光分光光度法、可見(jiàn)光分光光度法、液相色譜法、氣相光譜測(cè)定法、或液相色譜結(jié)合質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。
11.測(cè)定哺乳動(dòng)物中炎性反應(yīng)的方法，其包括(a)將用于活性氧類(lèi)的化學(xué)探針施與哺乳動(dòng)物；(b)從哺乳動(dòng)物獲得樣品；和(c)對(duì)所述樣品分析化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物。
12.聲明11的方法，其中化學(xué)探針是能夠被氧化并產(chǎn)生可檢測(cè)氧化產(chǎn)物的烯烴。
13.聲明11的方法，其中化學(xué)探針是3-乙烯基-苯甲酸、4-乙烯基-苯甲酸、靛藍(lán)胭脂紅、均二苯代乙烯或膽固醇。
14.聲明11的方法，其中活性氧類(lèi)是抗體產(chǎn)生的氧類(lèi)。
15.聲明11的方法，其中活性氧類(lèi)是超氧自由基、羥自由基、氫過(guò)氧自由基或過(guò)氧化氫。
16.聲明11的方法，其中活性氧類(lèi)是臭氧或具有臭氧化學(xué)標(biāo)簽的化學(xué)物類(lèi)。
17.聲明11的方法，其中樣品是體液。
18.聲明17的方法，其中體液是全血、血清、血漿、滑膜液、淋巴液、尿液、唾液、粘液或眼淚。
19.聲明11的方法，其中樣品是組織樣品。
20.聲明11的方法，其中化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物可通過(guò)高壓液相色譜法、質(zhì)譜法、紫外光分光光度法、可見(jiàn)光分光光度法、液相色譜法、氣相光譜測(cè)定法、或液相色譜結(jié)合質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。
21.嗜中性粒細(xì)胞活性的體外測(cè)定法，其包括(a)從哺乳動(dòng)物獲得嗜中性粒細(xì)胞樣品；(b)活化嗜中性粒細(xì)胞樣品中的嗜中性粒細(xì)胞；和(c)觀察是否能夠在嗜中性粒細(xì)胞樣品中檢測(cè)到活性氧類(lèi)。
22.聲明21的方法，其中活性氧類(lèi)是嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的氧類(lèi)。
23.聲明21的方法，其中活性氧類(lèi)是抗體產(chǎn)生的氧類(lèi)。
24.聲明21的方法，其中活性氧類(lèi)是超氧自由基、羥自由基、氫過(guò)氧自由基或過(guò)氧化氫。
25.聲明21的方法，其中活性氧類(lèi)是臭氧或具有臭氧化學(xué)標(biāo)簽的化學(xué)物類(lèi)。
26.聲明21的方法，其中活性氧類(lèi)用化學(xué)探針進(jìn)行檢測(cè)。
27.聲明26的方法，其中化學(xué)探針是能夠被氧化并產(chǎn)生可檢測(cè)氧化產(chǎn)物的烯烴。
28.聲明26的方法，其中化學(xué)探針是3-乙烯基-苯甲酸、4-乙烯基-苯甲酸、靛藍(lán)胭脂紅、均二苯代乙烯或膽固醇。
29.聲明27的方法，其中對(duì)化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)以確定嗜中性粒細(xì)胞樣品中是否存在活性氧類(lèi)。
30.聲明29的方法，其中氧化產(chǎn)物通過(guò)高壓液相色譜法、質(zhì)譜法、紫外光分光光度法、可見(jiàn)光分光光度法、液相色譜法、氣相光譜測(cè)定法、或液相色譜結(jié)合質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。
31.鑒定能夠調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞活性的試劑的方法，其包括(a)從哺乳動(dòng)物獲得嗜中性粒細(xì)胞樣品；(b)將嗜中性粒細(xì)胞樣品暴露于測(cè)試試劑；(c)活化嗜中性粒細(xì)胞樣品中的嗜中性粒細(xì)胞；和(d)定量嗜中性粒細(xì)胞樣品所產(chǎn)生的活性氧類(lèi)的量。
32.聲明31的方法，其中該方法進(jìn)一步包括定量未暴露于測(cè)試試劑但來(lái)自相同哺乳動(dòng)物的嗜中性粒細(xì)胞樣品所產(chǎn)生的活性氧類(lèi)的量。
33.聲明31的方法，其中嗜中性粒細(xì)胞樣品是體液。
34.聲明33的方法，其中體液是全血、滑膜液或淋巴液。
35.聲明31的方法，其中嗜中性粒細(xì)胞樣品是組織樣品。
36.聲明31的方法，其中活性氧類(lèi)是嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的氧類(lèi)。
37.聲明31的方法，其中活性氧類(lèi)是抗體產(chǎn)生的氧類(lèi)。
38.聲明31的方法，其中活性氧類(lèi)是超氧自由基、羥自由基、氫過(guò)氧自由基或過(guò)氧化氫。
39.聲明31的方法，其中活性氧類(lèi)是臭氧或具有臭氧化學(xué)標(biāo)簽的化學(xué)物類(lèi)。
40.聲明31的方法，其中活性氧類(lèi)的量用化學(xué)探針進(jìn)行定量。
41.聲明40的方法，其中化學(xué)探針是能夠被氧化并產(chǎn)生可檢測(cè)氧化產(chǎn)物的烯烴。
42.聲明40的方法，其中化學(xué)探針是3-乙烯基-苯甲酸、4-乙烯基-苯甲酸、靛藍(lán)胭脂紅、均二苯代乙烯或膽固醇。
43.聲明40的方法，其中對(duì)化學(xué)探針的氧化產(chǎn)物進(jìn)行定量。
44.聲明43的方法，其中氧化產(chǎn)物是通過(guò)高壓液相色譜法、質(zhì)譜法、紫外光分光光度法、可見(jiàn)光分光光度法、液相色譜法、氣相光譜測(cè)定法、或液相色譜結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定法進(jìn)行定量的。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測(cè)能夠產(chǎn)生活性氧類(lèi)的抗體和嗜中性粒細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1739028SQ200380108725
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2003年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者P·溫特沃斯, R·A·勒納 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司, 斯克里普斯研究所