專利名稱：一種核酸等溫擴增定量檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及核酸擴增檢測技術(shù)的改進。
背景技術(shù)：
在核酸檢測過程中，多數(shù)情況下樣品中的核酸含量較低，為了使檢測達到一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，需要對樣品中的待檢核酸片段進行有效擴增。1985年聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR)技術(shù)的誕生大大推動了核酸檢測技術(shù)乃至整個分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，并日漸成為核酸檢測技術(shù)中的重要手段，也同時成為現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)。隨后，又衍生出諸如逆轉(zhuǎn)錄酶—聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcriptase-PCR，簡稱RT-PCR)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real TimeFluorescent Quantified PCR)等一系列核酸擴增檢測方法，可分別用于DNA樣品和RNA樣品的擴增及定性定量檢測。由于擴增過程的誤差往往直接影響到核酸檢測的結(jié)果，因此，后續(xù)的擴增子(即核酸擴增反應(yīng)中的擴增產(chǎn)物)檢測過程就顯得尤為重要。目前，大多數(shù)核酸檢測方法都是“基因擴增+擴增子檢測”的操作模式，較為傳統(tǒng)的“PCR+電泳”檢測方法目前還被廣泛應(yīng)用。由于PCR方法在實際應(yīng)用中易引起非特異性擴增，實驗前后也容易受到環(huán)境中其他外源核酸的污染，因此常造成實驗結(jié)果的假陽性或假陰性現(xiàn)象，這樣使得該技術(shù)的實際應(yīng)用尤其是臨床檢測受到很大的局限性。實時熒光定量PCR雖然在技術(shù)上有了很大的改進，檢測反應(yīng)也達到了定量化，但其昂貴的設(shè)備及高成本的檢測，阻礙了大規(guī)模的推廣使用。
1991年Compton提出了基于核酸序列的擴增技術(shù)(Nucleic AcidSequence Based Amplification，簡稱NASBA)(Nature，350(6313)91-2，1991)，為基因擴增技術(shù)提出了新的概念。該技術(shù)是以RNA分子的逆轉(zhuǎn)錄—轉(zhuǎn)錄為技術(shù)主線，無需進行類似于PCR過程的溫度循環(huán)，通過單向等溫擴增，短時間內(nèi)形成相當(dāng)于原RNA拷貝數(shù)近百萬倍的RNA擴增子。但擴增子常采用電泳、探針雜交、點雜交等方法來完成定性檢測。此外，Gen-Probe公司也開發(fā)出與核酸擴增原理類似的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)(Transcription Mediated Amplification，簡稱TMA)(Journal ofClinical Microbiology，35(3)，676-8，1997)，其與NASBA的核酸擴增方法相同，而TMA的擴增結(jié)果是通過雜交保護測定(HybridizationProtection Assay，簡稱HPA)技術(shù)進行定性檢測。目前Gen-Probe公司利用此技術(shù)開發(fā)了沙眼衣原體和結(jié)核桿菌檢測試劑盒。無論是NASBA技術(shù)還是TMA技術(shù)，都在方法上采用單向等溫擴增，改善了PCR技術(shù)中的非特異性擴增難題，提高了反應(yīng)速率，而且反應(yīng)過程保持等溫，無需依賴PCR熱循環(huán)儀，僅用普通加熱器或水浴即可，這樣能降低檢測成本。但就目前的發(fā)展趨勢來看，NASBA與TMA尚無法達到定量檢測程度，同時TMA方法中所需的實驗材料，尤其是反應(yīng)中的酶混合物需特殊處理，屬非開放型專用試劑，檢測成本相對較高。此外，NASBA技術(shù)中所使用的禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶必須是特定生產(chǎn)商生產(chǎn)，且須在-70℃儲存，使用中效期較短，因此操作條件較為苛刻，技術(shù)推廣亦受到限制。
目前，實驗室研究及臨床檢測中所使用的核酸定量擴增檢測方法主要以實時定量PCR為主，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個反應(yīng)進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析。其熒光檢測模式分為TaqMan熒光探針、TaqMan MGB熒光探針[在熒光探針分子3′端連接非熒光淬滅劑及MGB基團(Minor Groove Binder)，亦稱為MGB探針]、SYBR Green熒光染料、分子信標(biāo)(Molecular Beacon)探針和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，簡稱FRET)探針等。實時熒光定量PCR方法雖然靈敏度和準(zhǔn)確度較高，但檢測成本相對昂貴，檢測過程也需依賴特殊設(shè)備。所以該技術(shù)在操作方法和檢測成本上都存在局限性，不適于作為常規(guī)技術(shù)推廣。在核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，目前還未見有集擴增與定量雙重功能為一體且成本低廉的相關(guān)技術(shù)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種核酸等溫擴增定量檢測技術(shù)(QuantitativeDetection with Isothermal Amplification，簡稱QDIA)，它是把核酸的等溫擴增與擴增子的定性定量檢測結(jié)合起來，使核酸樣品在一個反應(yīng)體系中完成擴增與檢測。該技術(shù)具有簡便、快速、靈敏的優(yōu)點，能克服已有技術(shù)中成本高、操作費時費力、特異性低等不足。
本發(fā)明的核酸等溫擴增定量檢測技術(shù)包括樣品處理步驟及核酸等溫擴增定量檢測步驟。所采用的樣品處理步驟，是從待檢樣品中得到RNA樣本，無論樣品來自組織、細(xì)胞還是微生物病原體，最終都是要獲得其RNA樣本；組織、細(xì)胞或微生物病原體樣品可采取RNA抽提技術(shù)獲得RNA樣本；若是DNA樣品，則可通過轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到RNA樣本。本發(fā)明的特征在于，RNA樣本的等溫擴增定量檢測，是采用逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶把等溫擴增與TaqMan熒光探針檢測結(jié)合，在對RNA樣本等溫擴增的同時實現(xiàn)檢測用熒光信號的積累，且整個過程在同一反應(yīng)體系中完成。所述的逆轉(zhuǎn)錄酶為MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶。所述等溫擴增定量檢測的具體操作為將待檢RNA樣本置入反應(yīng)檢測液，在58-75℃條件下5-40分鐘，以打開RNA的二級結(jié)構(gòu)，隨后轉(zhuǎn)入35-45℃條件下反應(yīng)1-2小時，再于熒光檢測儀中檢測反應(yīng)產(chǎn)物并讀數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)樣品熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推導(dǎo)出所檢測RNA樣本的量，完成RNA樣本的定量檢測過程；其反應(yīng)檢測液由引物、TaqMan熒光探針、反應(yīng)緩沖液以及酶混合液組成。
本發(fā)明所述的反應(yīng)緩沖液各組分的終濃度為25-60mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0-9.0)，30-90mM KCl，10-20mM MgCl2，0.5-5mM脫氧核苷三磷酸(dNTPs)，1-10mM核苷三磷酸(NTPs)，4-20mM二硫蘇糖醇(DTT)，10-20％(v/v)二甲基亞砜(DMSO)；所述的引物終濃度為帶有RNA酶啟動子識別序列的引物(簡稱引物1)和第二鏈cDNA合成引物(簡稱引物2)各0.1-1μM；所述的酶混合液各組分在25μL反應(yīng)液中的量為4-75U逆轉(zhuǎn)錄酶，8-3000U RNA聚合酶，0.05-0.3U核糖核酸酶H(RNase H)，10-50U RNA酶抑制劑(RNasin Inhibitor)和0.05-5μg小牛血清白蛋白(BSA)；所述的TaqMan熒光探針終濃度為50-200nM。所述的TaqMan熒光探針可選用TaqMan探針或是TaqMan MGB探針，其探針上的熒光基團可根據(jù)熒光檢測設(shè)備或?qū)嶋H需求而定。另外，加入反應(yīng)體系中的TaqMan熒光探針可以針對RNA模板的序列設(shè)計，還可以根據(jù)cRNA擴增子的序列設(shè)計。當(dāng)然，為了提高檢測反應(yīng)的特異性和靈敏度，也可同時將上述兩種不同堿基序列的探針都加入檢測反應(yīng)體系，只需在探針設(shè)計時將兩種探針的序列位置錯開即可，防止它們在同一體系中互補而形成二聚體。兩種探針若同時使用，其5’端熒光標(biāo)記基團在必要時也可彼此不同，以便在檢測時相互區(qū)分。對于反應(yīng)中所添加的逆轉(zhuǎn)錄酶，視其種類及需要的反應(yīng)程度不同而加入不同的活力單位(用U表示)。對于RNA擴增中另一種關(guān)鍵酶--RNA聚合酶，其加入量也可視具體情況而定一般來說，若是RNA樣本量較小，RNA分子長度較短，對cRNA合成效率要求也不高，可使用活力單位較少的RNA聚合酶，每個反應(yīng)加入100U以下RNA的聚合酶即可；若是RNA樣本量較大，RNA分子長度較長，對cRNA合成效率要求較高，可使用活力單位較大的RNA聚合酶，甚至在一個反應(yīng)體系中可使用高濃度高活力單位的RNA聚合酶，如1000-3000U RNA聚合酶/反應(yīng)。
本發(fā)明的特征還在于，所述的等溫擴增定量檢測的具體操作還可以是將待檢RNA樣本置入反應(yīng)檢測液，在60-70℃條件下5-20分鐘，以打開RNA的二級結(jié)構(gòu)，隨后轉(zhuǎn)入38-42℃條件下反應(yīng)1-2小時，再于熒光檢測儀中檢測反應(yīng)產(chǎn)物并讀數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)樣品熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推導(dǎo)出所檢測RNA樣本的量，完成RNA樣本的定量檢測過程。
所述反應(yīng)緩沖液各組分的終濃度還可為30-50mM Tris-HCl(pH8.0-9.0)，42-84mM KCl，10-15mM MgCl2，1-4mM dNTPs，2-8mM NTPs，5-10mM二硫蘇糖醇(DTT)，10-15％(v/v)二甲基亞砜(DMSO)；所述的酶混合液各組分在25μL反應(yīng)液中的量可以為40-60U Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶，10-2000U T7 RNA聚合酶或10-2000U SP6RNA聚合酶或10-50U T3 RNA聚合酶，0.1-0.2U核糖核酸酶H(RNase H)，15-45U RNA酶抑制劑(RNasin Inhibitor)和0.1-3μg小牛血清白蛋白(BSA)；所述的TaqMan熒光探針終濃度為80-150nM。
本發(fā)明是一種新的核酸擴增檢測技術(shù)，是將核酸等溫擴增與TaqMan熒光探針檢測有機地結(jié)合，形成等溫擴增與定量檢測于一體的高效檢測方法，可對微量的核酸樣品進行定性定量的檢測。相對于PCR擴增技術(shù)，本發(fā)明不再需要升降溫度的往復(fù)循環(huán)，整個擴增檢測過程保持恒溫；這樣降低了在“變性—退火—延伸”溫度循環(huán)中引起的非特異性擴增幾率；同時擴增過程由于恒溫，省去了熱循環(huán)儀，檢測成本也隨之降低。本發(fā)明檢測過程雖采用了與PCR的TaqMan熒光探針檢測相類似的原理，但具體方法已有改進，本反應(yīng)中熒光信號的積累是通過逆轉(zhuǎn)錄酶參與的逆轉(zhuǎn)錄過程來完成，且為等溫反應(yīng)，從而加快了反應(yīng)速率并保證了擴增體系的特異性。本發(fā)明中熒光信號的檢測只需普通的熒光檢測儀，無需依賴實時定量PCR擴增儀，在降低檢測成本的同時，簡化了操作步驟。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)簡便的反應(yīng)體系。通過逆轉(zhuǎn)錄酶將等溫擴增反應(yīng)與定量檢測反應(yīng)連接起來，“一酶兩用”，等溫擴增環(huán)節(jié)與定量檢測環(huán)節(jié)交互進行，在核酸等溫擴增的同時，實現(xiàn)TaqMan熒光探針定量檢測中熒光信號的積累，整個反應(yīng)在一個體系中完成。
(2)等溫高效的擴增體系。本發(fā)明是基于逆轉(zhuǎn)錄—再轉(zhuǎn)錄原理的核酸等溫擴增技術(shù)，在提供相應(yīng)的RNA或DNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶以及逆轉(zhuǎn)錄引物的條件下，按照一個RNA模板一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)形成一個DNA模板，然后一個DNA模板通過一次轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可生成100-1000個拷貝的RNA擴增子來計算，在恒定溫度下反應(yīng)1-2小時，能得到初始RNA樣本量106-1018倍的cRNA擴增子，相對于PCR技術(shù)而言，無需重復(fù)“變性—退火—延伸”的熱循環(huán)過程。一來降低檢測儀器的成本，二來大大提高了擴增反應(yīng)的效率，同時又減少了反應(yīng)中不必要的非特異性擴增產(chǎn)物污染。
(3)定量檢測。本發(fā)明采用在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中進行熒光探針定量檢測的技術(shù)，通過實時定量的熒光強度讀數(shù)，以及RNA樣本數(shù)量與cRNA擴增子數(shù)量之間的線性關(guān)系，達到對待測樣品定量檢測的目的。與TaqMan熒光探針檢測技術(shù)一樣，保留了寡核苷酸熒光探針與引物對靶物進行高特異性鑒別和實時定量的特性，但本發(fā)明無論從檢測時間還時檢測成本上都比現(xiàn)有TaqMan熒光探針技術(shù)要有優(yōu)勢。
(4)檢測速度快。本發(fā)明的核酸檢測技術(shù)，將擴增與檢測兩個反應(yīng)過程相融合，并在同一反應(yīng)體系中完成，整個過程沒有升降溫循環(huán)，且具有比DNA聚合反應(yīng)更快速的RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，節(jié)省時間；同時將TaqMan熒光探針與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)合，實現(xiàn)定量檢測，對cRNA擴增子的檢測更為便捷、快速、靈敏。
(5)檢測靈敏度高。采用本發(fā)明技術(shù)，RNA樣本可在1-2小時內(nèi)實現(xiàn)106-1018倍的擴增量，對于微量的RNA樣品來說，可大大提高檢測的靈敏度。最小可對10ng的RNA分子進行定量檢測。
(6)檢測設(shè)備簡單。本發(fā)明相對現(xiàn)有核酸定性定量檢測技術(shù)比較，使用普通的恒溫水浴和熒光檢測儀就可滿足，便于應(yīng)用，易于推廣。
本發(fā)明是從RNA樣本的等溫擴增技術(shù)出發(fā)，利用RNA逆轉(zhuǎn)錄—轉(zhuǎn)錄循環(huán)簡便、等溫、快速、靈敏的特點，大大提高了核酸的檢測效率，并有針對性地改進了傳統(tǒng)PCR技術(shù)中溫度往復(fù)循環(huán)、依賴特殊設(shè)備、實驗結(jié)果不穩(wěn)定等缺陷。更重要的是，在逆轉(zhuǎn)錄體系中引入了熒光探針檢測技術(shù)，使得在簡便的實驗條件下，對核酸樣品進行定量檢測成為可能。這將使本發(fā)明成為普通分子生物學(xué)實驗和臨床檢驗中常規(guī)的、高靈敏度的、低成本、低能耗的核酸檢測方法。本發(fā)明適用于各種RNA、DNA樣品的定性定量檢測，可廣泛應(yīng)用于實驗研究、臨床檢測、食品安全檢測、藥物篩選、生物戰(zhàn)劑檢測等領(lǐng)域中與核酸檢測相關(guān)的環(huán)節(jié)。由于本發(fā)明對儀器設(shè)備的依賴性較低，因此在實地檢測應(yīng)用中會有很大優(yōu)勢。
附圖及其說明附

圖1為本發(fā)明核酸等溫擴增定量檢測技術(shù)機理的示意圖。
圖中(1)樣品處理，得到檢測所需的RNA樣本。
(2)建立QDIA反應(yīng)體系，帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的引物1及TaqMan熒光探針與RNA模板退火結(jié)合，此在58-75℃完成。
(3)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈，同時TaqMan熒光探針5′端熒光基團在逆轉(zhuǎn)錄酶5′-3′外切酶活性作用下被切下，游離于液相反應(yīng)體系中，發(fā)射熒光；其cDNA第一鏈的合成繼續(xù)。
(4)用RNase H處理RNA-DNA雜合體中的RNA單鏈。
(5)引物2與cDNA第一鏈雜交結(jié)合。
(6)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第二鏈。
(7)在RNA聚合酶作用下，以帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的cDNA雙鏈為模板，等溫擴增得到大量cRNA。
(8)引物2與cRNA單鏈雜交結(jié)合，開始QDIA反應(yīng)循環(huán)。
(9)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈。
(10)用RNase H處理RNA-DNA雜合體中的RNA單鏈。
(11)引物1及TaqMan熒光探針與cDNA單鏈雜交結(jié)合。
(12)TaqMan熒光探針5′端熒光基團在逆轉(zhuǎn)錄酶5′-3′外切酶活性作用下被切下，游離于液相反應(yīng)體系中，發(fā)射熒光；同時繼續(xù)合成cDNA第二鏈。
(13)通過熒光檢測儀讀取體系中的熒光強度。
(14)在RNA聚合酶作用下，以帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的cDNA雙鏈為模板，等溫擴增得到大量cRNA。
以下結(jié)合附圖就本發(fā)明技術(shù)機理作詳細(xì)說明。
本發(fā)明包括有兩個反應(yīng)步驟，即樣品處理、等溫擴增定量檢測。(一)樣品處理(如圖中(1)所示)。此步驟是從待檢樣品中分離出核酸分子，最終獲得RNA樣本。本發(fā)明通過對RNA靶分子的檢測，提出基因檢測技術(shù)的新思路，而對RNA擴增子的檢測也最能體現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢。從樣品中釋放RNA分子，可采取RNA抽提技術(shù)，最常見的是用Trizol試劑一步法提取(美國專利No.5,346,994)，這種方法相對高效、快捷、重復(fù)性高。另外，也可采取酶裂解法及加熱法。若是需要提取mRNA，可直接采用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的FastTrack mRNA提取試劑盒，簡便易行?？傊瑥臉悠芳?xì)胞中有效地釋放出RNA分子即可。在此得到的RNA樣本數(shù)量相對較少，而且RNA很容易降解，不便于直接檢測，因此需要通過擴增途徑才可達到需要的檢測靈敏度。若是DNA樣品，可通過在DNA序列上添加RNA聚合酶啟動子序列，結(jié)合轉(zhuǎn)錄過程，得到RNA樣本。具體的方法是在94-98℃將DNA樣品變性，然后轉(zhuǎn)至55-65℃，使預(yù)先加入體系的帶有RNA聚合酶啟動子序列的上游引物與不帶有RNA聚合酶啟動子序列的下游引物結(jié)合，接著在Taq DNA聚合酶參與下進行延伸反應(yīng)，從而得到5′端帶有RNA聚合酶啟動子序列的DNA樣品。隨后，在相應(yīng)的RNA聚合酶存在下，進行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到特異性的待檢RNA樣本。(此過程中所使用的RNA聚合酶應(yīng)與后續(xù)過程中所使用的RNA聚合酶相區(qū)分，以免在體系中相互污染，影響檢測結(jié)果。如在等溫擴增定量檢測反應(yīng)體系中選用T7 RNA聚合酶，則在該RNA樣品制備過程中選用SP6 RNA聚合酶或其他合適的RNA聚合酶)。
(二)等溫擴增定量檢測(如圖中(2)-(14)所示)。包括RNA靶分子的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)(2)-(6)、RNA等溫擴增環(huán)節(jié)(7)和定量檢測環(huán)節(jié)(8)-(14)。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)是將得到的RNA樣本進行特異的逆轉(zhuǎn)錄，為下一步的等溫擴增提供有效的特異模板。在檢測樣品中特定基因區(qū)段或基因位點之初，通過選擇特異性的寡核苷酸引物對，確定待測的基因區(qū)段或基因位點。由于本發(fā)明是依照轉(zhuǎn)錄原理，因此，特異引物(位于RNA樣本基因方向下游)在其5′末端需連接依賴于DNA的RNA聚合酶所識別的啟動子序列；這樣，通過逆轉(zhuǎn)錄得到的雙鏈cDNA的基因下游方向?qū)蠁幼有蛄小Ａ硗?，鑒于逆轉(zhuǎn)錄引物在后期定量檢測中的作用，在引物設(shè)計時需考慮引物的退火溫度與定量檢測中所需TaqMan熒光探針退火溫度之間的關(guān)系。
逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)(如圖中(2)-(6)所示)中包括cDNA雙鏈的合成、TaqMan熒光探針的參入與熒光信號的積累。在已有技術(shù)中通過逆轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA雙鏈需要經(jīng)歷cDNA第一鏈和第二鏈兩個合成步驟，第一步往往通過逆轉(zhuǎn)錄酶完成，接著在DNA聚合酶I、RNase H(有時在長片段cDNA逆轉(zhuǎn)錄過程中還用到DNA連接酶)的參與下完成第二步。本發(fā)明的方法將這兩個步驟合并為一步完成，并且參入TaqMan熒光探針的定量檢測。在此過程中，所采用的逆轉(zhuǎn)錄酶具有依賴RNA的DNA聚合酶活性，可在寡核苷酸引物存在下，以單鏈RNA作為模板合成第一鏈cDNA片段。在cDNA第一鏈合成之初，特異性TaqMan熒光探針就已與引物1一起結(jié)合于模板RNA之上，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，一邊合成cDNA第一鏈，一邊通過逆轉(zhuǎn)錄酶的5′→3′外切酶活性，使得TaqMan探針5′端的熒光基團被切下，游離于溶液當(dāng)中進行熒光信號積累，這是第一輪定量檢測的熒光信號積累。接著，當(dāng)另一條寡核苷酸引物與cDNA第一鏈退火后，這種逆轉(zhuǎn)錄酶以cDNA第一鏈作為模板，進行引物延伸，從而合成cDNA第二鏈。因此，整個cDNA雙鏈合成過程是在一個反應(yīng)體系中完成，只需逆轉(zhuǎn)錄酶一種酶催化，無需DNA聚合酶參與。此步反應(yīng)中的逆轉(zhuǎn)錄酶是反應(yīng)中關(guān)鍵酶，它決定了RNA擴增子能否得到高效的擴增；同時，該酶與現(xiàn)有的TMA和NASBA技術(shù)中所使用的逆轉(zhuǎn)錄酶不相同，它在反應(yīng)中同時具有對RNA樣本進行逆轉(zhuǎn)錄和積累熒光信號的雙重作用。具體過程是，在合成第一鏈cDNA時以單鏈RNA樣本為模板，體系中的引物1為第一鏈cDNA逆轉(zhuǎn)錄引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶活性，合成第一鏈cDNA；接下來在引物2和核糖核酸酶H參與下，利用逆轉(zhuǎn)錄酶依賴DNA的DNA聚合酶活性，合成第二鏈cDNA。這樣，所合成的雙鏈cDNA的一端將會帶上RNA聚合酶啟動子序列。通過從單鏈RNA到雙鏈cDNA的逆轉(zhuǎn)錄過程，得到帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的雙鏈cDNA，從而為后續(xù)RNA等溫擴增過程提供模板。
在RNA等溫擴增環(huán)節(jié)中(如圖中(7)所示)，本發(fā)明利用已合成的帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的雙鏈cDNA作為模板，在RNA聚合酶的參與下，通過轉(zhuǎn)錄方式，大量合成與初始RNA模板互補的RNA擴增子(complementary RNA，簡稱cRNA)。這是一個單向、等溫的核酸快速擴增過程。
定量檢測環(huán)節(jié)(如圖中(8)-(14)所示)。本發(fā)明通過等溫擴增得到大量的cRNA擴增子之后，在體系中的逆轉(zhuǎn)錄酶和引物1及引物2參與下，cRNA擴增子又會重復(fù)合成cDNA雙鏈。由于cRNA與檢測體系中起始RNA樣本為互補關(guān)系，因此，在新一輪的cDNA合成過程中，第一鏈cDNA將以cRNA單鏈為模板，通過引物2的延伸而合成，第二鏈cDNA將以新合成的第一鏈cDNA為模板，通過引物1的延伸而合成。在這種情況下，反應(yīng)體系中的TaqMan探針在與新合成的cDNA第一鏈雜交后，會在cDNA第二鏈合成的過程中被具有5′→3′外切酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶所作用，使得TaqMan探針5′端的熒光基團被切下，游離于溶液當(dāng)中，其熒光信號隨著反應(yīng)的循環(huán)增加，進而積累到可被熒光檢測儀讀數(shù)，然后通過標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品量與其經(jīng)過QDIA反應(yīng)得到的熒光信號之間的線性關(guān)系，推導(dǎo)出所測RNA樣本的量，完成RNA樣品定量檢測過程。反之，若探針與新合成的cDNA未完全雜交，探針上的熒光基團也不會被逆轉(zhuǎn)錄酶分解，溶液中也就沒有熒光信號讀出。
TaqMan熒光探針主要在RNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA的過程中與cDNA單鏈雜交并參與熒光信號的積累(如圖中(2)-(4)和(11)-(13)所示)。當(dāng)然，加入反應(yīng)體系中的TaqMan熒光探針可以針對RNA模板的序列設(shè)計，在圖中(2)-(4)和(11)-(13)與cDNA單鏈雜交并通過逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生檢測用熒光信號的積累；也可以根據(jù)cRNA擴增子的序列設(shè)計，在圖中(5)-(6)和(9)-(10)中與cDNA單鏈雜交并通過逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生檢測用熒光信號的積累。為了提高檢測反應(yīng)的特異性和靈敏度，也可同時將兩種探針都加入檢測體系，只需在探針設(shè)計時將兩種探針的序列位置錯開即可，防止它們在同一體系中互補而形成二聚體。此外，兩種探針若同時使用，其5’熒光標(biāo)記基團在必要時也可彼此不同，以便在檢測時相互區(qū)分。
具體實施例方式
實施例1細(xì)菌rRNA樣品的QDIA檢測方法以下介紹通過本發(fā)明來鑒別細(xì)菌，以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(亦稱綠膿桿菌)的檢測為例。將含有綠膿桿菌的臨床標(biāo)本處理得到細(xì)菌懸液，或直接從綠膿桿菌培養(yǎng)物得到菌懸液；加入細(xì)菌裂解液釋放細(xì)菌RNA(細(xì)菌裂解液中將會有大量的細(xì)菌rRNA)，或是按107細(xì)菌細(xì)胞/mL Trizol的量進行細(xì)菌RNA抽提，得到RNA樣品。配制13μL反應(yīng)體系緩沖液[40mM Tris-HCl(pH8.5)，42mM KCl，15mM MgCl2，1mM dNTPs，2mM NTPs，10mM DTT，15％(v/v)DMSO]。首先在緩沖液中加入0.2μM綠膿桿菌23SrRNA引物1(帶有T7 RNA聚合酶啟動子識別序列)、0.2μM綠膿桿菌23SrRNA引物2、100nM TaqMan熒光探針(此探針針對綠膿桿菌23SrRNA序列設(shè)計，在其5’末端標(biāo)記FAM熒光基團，起到報告基團作用，當(dāng)然也可以是其他熒光基團；3’末端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團，起到淬滅熒光基團作用)和2μL RNA樣本液，混勻后置于65℃作用15分鐘，然后將反應(yīng)管置于40℃水浴，加入酶混合液(包括50U MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，40UT7 RNA聚合酶，0.2U RNase H，20U RNasin Inhibitor和2.6μg BSA，補足反應(yīng)體系至25μL)，混勻反應(yīng)液，孵育2小時。冰浴終止反應(yīng)后將反應(yīng)物置于熒光檢測儀中，根據(jù)所用報告基團選取適當(dāng)濾光片，檢測熒光強度。如果反應(yīng)管中的熒光強度與空白對照的比值達到一定數(shù)值(如5倍以上)，則可確定特異性熒光探針與RNA等溫擴增產(chǎn)物進行了特異性雜交，證明了綠膿桿菌的存在。同時，根據(jù)RNA模板陽性對照經(jīng)過同樣反應(yīng)條件得到的熒光強度與RNA標(biāo)準(zhǔn)量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可推導(dǎo)出樣品中綠膿桿菌初始的RNA樣本量，從而完成綠膿桿菌的定量檢測。
通過檢測細(xì)菌16S或23SrRNA來鑒別細(xì)菌已是一種十分常見的方法，但已有技術(shù)是采用PCR方法檢測細(xì)菌rDNA為主。本發(fā)明采用細(xì)菌23SrRNA保守區(qū)段擴增與特異性探針結(jié)合的方法，定量檢測細(xì)菌。檢測中所使用的引物對是針對細(xì)菌23SrRNA保守區(qū)段設(shè)計的引物2和帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的引物1。從RNA的檢測入手，通過本發(fā)明方法鑒定細(xì)菌，尤其是從臨床樣本中檢測細(xì)菌，將具有很大的實際意義。樣品中的細(xì)菌在不增菌以前，數(shù)量很低，不宜檢測。細(xì)菌中的RNA拷貝數(shù)要比基因組DNA大，因此對RNA進行檢測，在第一步就增加了檢出幾率，同時又結(jié)合等溫擴增，將RNA量增加，然后用定量手段檢測。本發(fā)明同樣可應(yīng)用于臨床中對其他一些病原微生物的快速檢測，比如結(jié)核桿菌、梅毒螺旋體等等。此外，在食品安全檢測中，還可對大腸桿菌、李斯特桿菌、沙門氏桿菌、病毒及其他非細(xì)胞型微生物等常見病原體進行定量檢測。
實施例2真核細(xì)胞mRNA樣品的QDIA檢測方法以下介紹通過本發(fā)明來對人癌癥特定基因?qū)?yīng)的mRNA量進行檢測。用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的FastTrack mRNA提取試劑盒從人HeLa細(xì)胞懸液中提取mRNA樣本。配制25μL反應(yīng)體系混合液(其包括13μL反應(yīng)緩沖液[50mM Tris-HCl(pH8.3)，80mM KCl，12mM MgCl2，2mM dNTPs，4mM NTPs，6mM DTT，10％(v/v)DMSO]，引物1和引物2各250nM，TaqMan熒光探針120nM[此探針針對人癌癥相關(guān)基因設(shè)計，在其5’末端標(biāo)記VIC熒光基團，起到報告基團作用，當(dāng)然也可以是其他熒光基團，3’末端標(biāo)記NFQ-MGB基團(非熒光淬滅劑與MGB基團的復(fù)合物)]，3μL RNA樣本液，酶混合液[3μg BSA，40U MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，2000U T7 RNA聚合酶，0.1U RNaseH，15U RNasin Inhibitor])。將反應(yīng)體系在62℃作用10分鐘，然后轉(zhuǎn)入42℃水浴孵育1小時，然后將反應(yīng)物置于熒光檢測儀中，根據(jù)所用報告基團選取適當(dāng)濾光片，檢測熒光強度。方法與例1相同，推導(dǎo)出樣品中人HeLa細(xì)胞初始的RNA樣品量，從而完成人癌癥基因mRNA的定量檢測。
本方法可應(yīng)用于真核細(xì)胞基因表達量的研究。檢測對象為真核細(xì)胞mRNA，所選用的引物為隨機引物和帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的Oligo-dT，然后結(jié)合針對特定基因所設(shè)計的TaqMan熒光探針，對該基因?qū)?yīng)的mRNA量進行檢測，從而達到基因表達量檢測的目的。本實例中采用高濃度T7 RNA聚合酶目的有二一來提高cRNA產(chǎn)量，二來提高熒光探針檢測效率。
實施例3DNA樣品的QDIA檢測方法當(dāng)DNA樣品需要采用本發(fā)明方法進行檢測時，需從待測樣品中分離出DNA。分離的方法可采用加熱、酶解或化學(xué)抽提的方法。將DNA樣品與上游引物(帶有SP6 RNA聚合酶啟動子識別序列)和下游引物混合，在95℃使DNA雙鏈變性，然后在65℃使引物與DNA退火，并在Taq DNA聚合酶參與下進行鏈延伸反應(yīng)，從而得到上游帶有SP6 RNA聚合酶啟動子識別序列的DNA雙鏈，在SP6 RNA聚合酶作用下形成正鏈RNA，這便得到后續(xù)等溫擴增的RNA樣本。預(yù)先配制50μL反應(yīng)體系混合液，其包括32mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM KCl，10mM MgCl2，3mM dNTPs，6mM NTPs，8mM DTT，6％(v/v)DMSO，引物1和引物2各0.3μM，TaqMan熒光探針A 80nM(此探針針對人癌癥相關(guān)基因設(shè)計，在其5’末端標(biāo)記TET熒光基團，起到報告基團作用，3’末端標(biāo)記DABCYL基團，起到淬滅熒光基團作用)，TaqMan熒光探針B 75nM(此探針針對人癌癥相關(guān)基因設(shè)計，在其5’末端標(biāo)記ROX熒光基團，3’末端標(biāo)記DABCYL基團)，RNA樣本液2μL，酶混合液(1μg BSA，60U MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，50U T3 RNA聚合酶，0.2U RNase H，40U RNasinInhibitor)。將不含酶混合液的反應(yīng)體系在68℃作用5分鐘，然后轉(zhuǎn)入41℃水浴孵育1.5小時，然后將反應(yīng)物置于熒光檢測儀中，根據(jù)所用報告基團選取適當(dāng)?shù)臑V光片，檢測熒光強度。方法與例1相同，推導(dǎo)出樣品中待的RNA樣本量，然后通過DNA樣品轉(zhuǎn)錄為RNA過程中兩種核酸之間的數(shù)量關(guān)系，可推算出待測的DNA樣品數(shù)量。
本方法針對DNA樣品進行QDIA檢測的情況而設(shè)計，與實例1、2中所不同的是，在QDIA檢測之前，有一步用RNA聚合酶啟動子序列對DNA進行修飾的過程，接著通過轉(zhuǎn)錄作用，將DNA樣品轉(zhuǎn)化為RNA樣品。所使用的QDIA引物可針對核酸樣品來源而選擇。此外，采用兩個熒光探針同時進行特異性定量檢測，探針A針對RNA模板序列設(shè)計，探針B針對cRNA擴增子序列設(shè)計，兩探針在5’端的熒光標(biāo)記基團不同，檢測結(jié)果中的熒光信號可彼此區(qū)分。
實施例4組織中RNA樣品的QDIA檢測方法以下將介紹通過QDIA方法來對動物組織中相應(yīng)RNA進行檢測。在小鼠組織中按50-100mg/ml比例加入TRIZOL試劑進行處理，按照TRIZOL試劑盒說明，釋放細(xì)胞中的總RNA，得到檢測中所需的RNA樣本。配制25μL反應(yīng)體系混合液(其包括13μL反應(yīng)緩沖液[55mM Tris-HCl(pH8.6)，70mM KCl，12mM MgCl2，4mM dNTPs，8mM NTPs，5mM DTT，15％(v/v)DMSO]，引物1和引物2各0.6μM，TaqMan熒光探針120nM[此探針針對小鼠相關(guān)基因設(shè)計，在其5’末端標(biāo)記VIC熒光基團，起到報告基團作用，當(dāng)然也可以是其他熒光基團，3’末端標(biāo)記NFQ-MGB基團(非熒光淬滅劑與MGB基團的復(fù)合物)]，1.5μL RNA樣本液，酶混合液[38U禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶，1000U SP6 RNA聚合酶，0.15U RNase H，28U RNasin Inhibitor，0.5μg BSA])。將反應(yīng)體系在58℃作用20分鐘，然后轉(zhuǎn)入38℃水浴孵育2小時，然后將反應(yīng)物置于熒光檢測儀中，根據(jù)所用報告基團選取適當(dāng)濾光片，檢測熒光強度。方法與例1相同，推導(dǎo)出樣品中人HeLa細(xì)胞初始的RNA樣品量，從而完成人癌癥基因mRNA的定量檢測。
本方法可應(yīng)用于動物組織特定基因及表達量的檢測分析。檢測對象為動物組織中的RNA，選用的QDIA引物為隨機引物和帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的Oligo-dT，然后結(jié)合針對特定基因所設(shè)計的TaqMan熒光探針，對該基因及表達量進行檢測分析。
本發(fā)明中所涉及的主要試劑說明MMLV(鼠白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Epicentre公司生產(chǎn))AMV(禽成髓細(xì)胞瘤病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Seikagaku America公司生產(chǎn))RNase H(核糖核酸酶H)(美國Invitrogen公司生產(chǎn))T7 RNA聚合酶(美國Epicentre公司生產(chǎn))SP6 RNA聚合酶(美國Epicentre公司生產(chǎn))T3 RNA聚合酶(美國Epicentre公司生產(chǎn))Tris-HCl緩沖液(實驗室配制)DTT(二硫蘇糖醇)(美國Epicentre公司生產(chǎn))DMSO(二甲基亞砜)(美國Sigma公司生產(chǎn))BSA(小牛血清白蛋白)(美國Sigma公司生產(chǎn))dNTPs(脫氧核苷三磷酸混合液)(美國Invitrogen公司生產(chǎn))NTPs(核苷三磷酸混合液)(美國Epicentre公司生產(chǎn))RNasin Inhibitor(RNA酶抑制劑)(美國Amersham Pharmacia公司生產(chǎn))TaqMan熒光探針(寶生物工程(大連)有限公司)引物1(帶有RNA聚合酶啟動子識別序列)(寶生物工程(大連)有限公司合成)引物2(寶生物工程(大連)有限公司合成)RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品(實驗室自行合成)TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司生產(chǎn))FastTrack mRNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司生產(chǎn))Taq DNA聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司)
權(quán)利要求
1.一種核酸等溫擴增定量檢測技術(shù)，采用有逆轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)錄原理，其擴增檢測對象是從樣品中得到待檢RNA樣本，樣品可為細(xì)胞、組織或者微生物，也可以是已獲取的DNA；其特征在于，RNA樣本的等溫擴增定量檢測，是采用逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶把等溫擴增與TaqMan熒光探針檢測結(jié)合，在對RNA樣本等溫擴增的同時實現(xiàn)檢測用熒光信號的積累，其是在同一反應(yīng)體系中完成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測技術(shù)，其特征在于，所述的逆轉(zhuǎn)錄酶為MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測技術(shù)，其特征在于，所述的等溫擴增定量檢測的具體操作為將待檢測RNA樣本置入反應(yīng)檢測液，在58-75℃條件下5-40分鐘，再轉(zhuǎn)入35-45℃條件下反應(yīng)1-2小時，然后用熒光檢測儀檢測；其中反應(yīng)檢測液由引物、TaqMan熒光探針、反應(yīng)緩沖液和酶混合液組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測技術(shù)，其特征在于，所述的等溫擴增定量檢測的具體操作為將待檢測RNA樣本置入反應(yīng)檢測液，在60-70℃條件下5-20分鐘，再轉(zhuǎn)入38-42℃條件下反應(yīng)1-2小時，然后用熒光檢測儀檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測技術(shù)，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖液各組分的終濃度為25-60mM Tris-HCl，30-90mM KCl，10-20mM MgCl2，0.5-5mM dNTPs，1-10mM NTPs，4-20mMDTT，10-20％(v/v)DMSO；所述的引物終濃度為引物1為0.1-1μM，引物2為0.1-1μM；所述的酶混合液各組分在25μL反應(yīng)液中的量為4-75U逆轉(zhuǎn)錄酶，8-3000U RNA聚合酶，0.05-0.3U RNase H，10-50U RNasin Inhibitor和0.05-5μg BSA；所述的TaqMan熒光探針終濃度為50-200nM。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測技術(shù)，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖液各組分的終濃度為30-50mM Tris-HCl，42-84mM KCl，10-15mM MgCl2，1-4mM dNTPs，2-8mM NTPs，5-10mM DTT，10-15％(v/v)DMSO；所述的酶混合液各組分在25μL反應(yīng)液中的量為40-60U MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，10-2000U T7 RNA聚合酶或10-2000U SP6 RNA聚合酶或10-50U T3 RNA聚合酶，0.1-0.2URNase H，15-45U RNasin Inhibitor和0.1-3μg BSA；所述的TaqMan熒光探針終濃度為80-150nM。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測技術(shù)，其特征在于，所述的酶混合液是在RNA樣本和反應(yīng)緩沖液經(jīng)60-70℃處理后加入，再進行38-42℃的擴增檢測反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測技術(shù)，其特征在于，所述的TaqMan熒光探針選用TaqMan熒光探針或是TaqMan MGB熒光探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測技術(shù)，其特征在于，所述的TaqMan熒光探針在同一反應(yīng)體系中是一種或是兩種不同的TaqMan熒光探針。
全文摘要
一種核酸等溫擴增定量檢測技術(shù)，本發(fā)明采用逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶把等溫擴增與TaqMan熒光探針檢測結(jié)合，在同一反應(yīng)體系中實現(xiàn)對RNA樣本的等溫擴增和檢測用熒光信號的積累，可對微量的核酸樣品進行定性定量檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(1)等溫擴增降低非特異性擴增幾率，(2)定量檢測、結(jié)果穩(wěn)定，(3)檢測速度快、特異性好、靈敏度高，(4)設(shè)備簡單、成本低，(5)操作簡便，易于推廣。本發(fā)明適用于實驗研究、臨床檢測、食品安全檢測、藥物篩選、生物戰(zhàn)劑檢測等領(lǐng)域中的核酸檢測。
文檔編號G01N21/76GK1661359SQ200410025890
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者杜蓬, 陳超 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司