專利名稱：提取乙肝病毒核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種從血清中提取乙肝病毒核酸的方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)簡稱乙肝病毒(HBV)。是一種DNA病毒,屬于嗜肝DNA病毒科(116口3(1的￥；^丨(^6)。根據(jù)目前所知,HBV就只對(duì)人和猩猩有易感性，引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病。到目前為止，根據(jù) 一些比較權(quán)威的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，我國應(yīng)該有乙型肝炎病毒(HBV)感染者I. 2億，基本上占我國總?cè)丝诘?. 09%，其中有1/4是慢性乙肝患者，大約是3000萬?，F(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)乙肝核酸檢測(cè)的試劑盒非常多，其中核酸的提取方法也非常多，例如煮沸法、柱提取法、磁珠法等。在上述這些提取方法中均存在問題，其中煮沸法較簡便但引入的雜質(zhì)過多，而且不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；柱提取法提取步驟較多，雖然純度很高，但自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)有困難；磁珠法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化很簡單，但所用試劑昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種提取乙肝病毒核酸的方法，以使提取方法既可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，又簡便可行。基于上述目的，本發(fā)明提供的提取乙肝病毒核酸的方法包括以下步驟(I)活化磁珠采用活化劑活化磁珠，并用緩沖液洗滌活化后的磁珠；(2)抗體偶聯(lián)將活化的磁珠與乙肝病毒的特異性抗體偶聯(lián)，并用緩沖液洗滌偶聯(lián)后的磁珠；加入淬滅液，與偶聯(lián)后的磁珠混勻，并用緩沖液洗滌；在最后一次洗滌后，將磁珠重懸于緩沖液中，置于2 8°C下保存；(3)特異性結(jié)合將偶聯(lián)后的磁珠與血清混合并震蕩混勻，使得所述磁珠與血清中的乙肝病毒顆粒進(jìn)行特異性結(jié)合；作用一段時(shí)間后，用磷酸鹽緩沖液對(duì)所述磁珠進(jìn)行洗滌，富集和除雜質(zhì)；加入裂解液裂解病毒細(xì)胞，使得乙肝病毒核酸釋放到溶液中；將所述溶液煮沸，取上清液?？蛇x地，所述活化劑為I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺?？蛇x地，所述裂解液為含表面活性劑的溶液?？蛇x地，所述步驟(I)和(2)中洗滌時(shí)所用的緩沖液為2-(N_嗎啉)乙磺酸緩沖液?？蛇x地，所述方法應(yīng)用于臨床樣品的直接檢測(cè)。從上面所述可以看出，本發(fā)明提供的提取乙肝病毒核酸的方法通過將活化的磁珠與乙肝病毒的特異性抗體偶聯(lián)，使得偶聯(lián)后的磁珠在存在乙型肝炎病毒顆粒的血清中可以特異性地吸附病毒顆粒，用簡單的緩沖液即可將多余的雜質(zhì)去除，之后加入病毒裂解液將病毒細(xì)胞裂解，從而得到病毒核酸。由于磁珠的引入，可以使自動(dòng)化變得簡單，抗原抗體的高特異性反應(yīng)使得提取時(shí)間變得更短，特異性強(qiáng)；所用的試劑比較簡單易得。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。磁珠標(biāo)記抗體的工作原理為羧基磁珠表面的羧基經(jīng)過活化劑活化后可以與抗體偶聯(lián)?？乖贵w反應(yīng)的工作原理為抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于抗原決定簇(表位)和抗體超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性 與親和性。這種特性是由抗原、抗體分子空間構(gòu)型所決定的。除兩者分子構(gòu)型高度互補(bǔ)外，抗原表位和抗體超變區(qū)必須密切接觸，才有足夠的結(jié)合力?？乖贵w反應(yīng)可分為兩個(gè)階段第一階段為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)；第二階段為可見反應(yīng)階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在適當(dāng)溫度、pH、電解質(zhì)和補(bǔ)體影響下，出現(xiàn)沉淀、凝集、細(xì)胞溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)等肉眼可見的反應(yīng)，此階段反應(yīng)慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。在血清學(xué)反應(yīng)中，以上兩階段往往不能嚴(yán)格分開，往往受反應(yīng)條件(如溫度、pH、電解質(zhì)、抗原抗體比例等)的影響。因此，本發(fā)明基于上述兩種實(shí)驗(yàn)原理，提出一種提取乙肝病毒核酸的方法，所述方法包括以下步驟(I)活化磁珠采用活化劑活化磁珠，并用緩沖液洗滌活化后的磁珠；(2)抗體偶聯(lián)將活化的磁珠與乙肝病毒的特異性抗體偶聯(lián)，并用緩沖液洗滌偶聯(lián)后的磁珠；加入淬滅液，與偶聯(lián)后的磁珠混勻，并用緩沖液洗滌；在最后一次洗滌后，將磁珠重懸于緩沖液中，置于2 8°C下保存；(3)特異性結(jié)合將偶聯(lián)后的磁珠與血清混合并震蕩混勻，使得所述磁珠與血清中的乙肝病毒顆粒進(jìn)行特異性結(jié)合；作用一段時(shí)間后，用磷酸鹽緩沖液對(duì)所述磁珠進(jìn)行洗滌，富集和除雜質(zhì)；加入裂解液裂解病毒細(xì)胞，使得乙肝病毒核酸釋放到溶液中；將所述溶液煮沸，取上清液。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所用實(shí)驗(yàn)材料及裝置如下BioMagPlus 竣基磁珠，2. 5mL, I. 5 μ m, 20mg/mL ；I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDAC)，0. IOg ；15mL尖頭離心管；磁分離架；O. 05M的L- 一水嗎啉乙磺酸緩沖溶液(MES緩沖液，pH 5. 2)，2 X 175mL ；淬滅液(1MGlycine, pH 8. O), 25mL ；磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)，125mL。其中，PBS緩沖液8g NaCl.O. 2g KC1、1. 44g Na2HPO4 和 0. 24gKH2P04，溶于 800ml蒸懼水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4,再加蒸懼水定容至IL ;最后配制成0. l%Tween 20的PBS緩沖液。裂解液0.lmol/L Tris-HCl, (pH 8. 0),0. l%TritonX-100,0. 05%Tween20, lmg/ml蛋白酶 K，50mmol/L KCl。所述提取乙肝病毒核酸方法的具體操作步驟如下
一、磁珠與抗體的偶聯(lián)(一)、活化I、移取O. 5mL(IOmg)的Bi0MagPlus羧基磁珠至15mL尖頭離心管內(nèi)，并放置在磁
分離架上直到上清液完全變清徹后，用吸管小心移棄上清液。2、加5mL MES緩沖液充分混勻洗滌，將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清液。3、重復(fù)步驟2三次；最后一次洗滌后，將磁珠重懸于5mL MES緩沖液中。
4、將EDAC從冷藏處取出置于室溫30分鐘，準(zhǔn)確稱取所需的EDAC(例如，約I. 6mgEDAC/mg磁珠)加入裝有磁珠的離心管內(nèi)。5、劇烈振蕩搖勻。6、室溫下，將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上活化反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)過程中，注意不讓磁珠沉淀聚集在一起。7、將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清液。8、重復(fù)步驟2四次，得到活化磁珠。(二 )、活化后的磁珠與抗體偶聯(lián)I、計(jì)算需要偶聯(lián)的乙肝病毒的特異性抗體量，每mg活化的羧基磁珠可以偶聯(lián)20 500ug抗體。2、將抗體加至5mL MES緩沖液中配制成抗體儲(chǔ)液。3、吸取50 μ L抗體儲(chǔ)液于950 μ L MES緩沖液中，配成1:20的抗體液。4、將抗體液加入到裝有活化磁珠的離心管內(nèi)，劇烈振蕩混勻，室溫下，將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，所述偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間約16 24小時(shí)。5、將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清液。6、磁珠于重懸5mL MES緩沖液中，振蕩搖勻，將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清液。7、重復(fù)步驟6 —次。8、加入5mL淬滅液，振蕩搖勻，室溫下將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上30分鐘。9、將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清液。(三)、洗滌和貯存偶聯(lián)后的磁珠I、在步驟(二)所得的溶液中加入5ml緩沖液，并劇烈振蕩搖勻進(jìn)行洗滌，將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清液。2、重復(fù)步驟I三次。3、最后一次洗漆后,將磁珠重懸于2ml洗漆緩沖液內(nèi)，此時(shí)磁珠的濃度約為5mg/
mLo4、置于2 8°C下保存。其中，必須注意的是I、偶聯(lián)時(shí)不能使用含有氨基(例如，三氨基甲烷鹽酸緩沖液(Tris))或是羧基(例如乙酸鹽、檸檬酸鹽等)的緩沖液。2、可以通過偶聯(lián)后的洗滌來去除偶聯(lián)時(shí)產(chǎn)生的非偶聯(lián)吸附物。3、延長振蕩的時(shí)間有利于重懸磁珠。
二、偶聯(lián)后的磁珠與血清中的乙肝病毒顆粒特異性結(jié)合并制備核酸。I、將磁珠懸起，混合均勻，吸取50 μ L磁珠與100 μ L待測(cè)血清混合。2、震蕩混勻30s，放置5min，反復(fù)2次。3、放置在磁分離架上，磁珠吸附Imin。4、小心將上清吸走,盡量洗干凈。5、用200 μ L的PBS緩沖液將磁珠重懸，混均勻。
6、重復(fù)步驟3、步驟4。7、重復(fù)步驟5、步驟6兩次。8、加入50 μ L裂解液，將磁珠混勻。9、100。0煮51^11。10、至于磁分離架上，上清即可作為模板擴(kuò)增；如不用，-20°C下保存。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)挑取20份含不同濃度的乙型肝炎病毒的血清樣本進(jìn)行提取，之后用商品化試劑盒對(duì)提取前后的血清進(jìn)行檢測(cè)，比較提取前后的病毒核酸數(shù)量變化。20份血清來自于臨床，用上?？迫A的試劑盒進(jìn)行提取，擴(kuò)增定量，測(cè)試結(jié)果見表
Io表I科華試劑盒測(cè)定臨床血清HBVDNA拷貝數(shù)
權(quán)利要求
1.一種提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)活化磁珠采用活化劑活化磁珠，并用緩沖液洗滌活化后的磁珠； (2)抗體偶聯(lián)將活化的磁珠與乙肝病毒的特異性抗體偶聯(lián)，并用緩沖液洗滌偶聯(lián)后的磁珠；加入淬滅液，與偶聯(lián)后的磁珠混勻，并用緩沖液洗滌；在最后一次洗滌后，將磁珠重懸于緩沖液中，置于2l°C下保存； (3 )特異性結(jié)合將偶聯(lián)后的磁珠與血清混合并震蕩混勻，使得所述磁珠與血清中的乙肝病毒顆粒進(jìn)行特異性結(jié)合；作用一段時(shí)間后，用磷酸鹽緩沖液對(duì)所述磁珠進(jìn)行洗滌，富集和除雜質(zhì)；加入裂解液裂解病毒細(xì)胞，使得乙肝病毒核酸釋放到溶液中；將所述溶液煮沸，取上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述活化劑為I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述裂解液為含表面活性劑的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述步驟(I)和(2)中洗滌時(shí)所用的緩沖液為2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求r4任意一項(xiàng)所述的提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法應(yīng)用于臨床樣品的直接檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取乙肝病毒核酸的方法，所述方法通過將活化的磁珠與乙肝病毒的特異性抗體偶聯(lián)，使得偶聯(lián)后的磁珠在存在乙型肝炎病毒顆粒的血清中可以特異性地吸附病毒顆粒，用簡單的緩沖液即可將多余的雜質(zhì)去除，之后加入病毒裂解液將病毒細(xì)胞裂解，從而得到病毒核酸。由于磁珠的引入，可以使自動(dòng)化變得簡單，抗原抗體的高特異性反應(yīng)使得提取時(shí)間變得更短，特異性強(qiáng)；所用的試劑比較簡單易得。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102816754SQ20121024573
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:北京利德曼生化股份有限公司