專利名稱：小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細(xì)管電泳鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥高分子量谷蛋白亞基的鑒定方法，特別是涉及通過酸性毛細(xì)管電泳(A-CE)技術(shù)對小麥高分子量谷蛋白亞基進(jìn)行鑒定的方法。
背景技術(shù)：
小麥種子貯藏蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白組成，它們在組成上具有高度的異質(zhì)性和復(fù)雜性。醇溶蛋白分子量約在30000-80000道爾頓之間，在酸性凝膠電泳條件下，一個(gè)品種可分離出15-30個(gè)組分，根據(jù)其相對遷移率可分為α、β、γ和ω四種醇溶蛋白，它們分別占其總量的25％、30％、30％和15％。麥谷蛋白包括高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)兩種，它們分別占胚乳總蛋白含量的10％和30％左右。
大量研究證明，小麥貯藏蛋白，特別是高分子量谷蛋白亞基的組成和含量對品質(zhì)具有十分重要的作用。面粉可以加工成各種面包、面條、餅干、糕點(diǎn)、饅頭等多種專用食品，其特殊的制面特性主要是由貯藏蛋白的二硫鍵多聚體結(jié)構(gòu)決定的，其中谷蛋白主要決定面團(tuán)的彈性，而醇溶蛋白則決定面團(tuán)的延展性。目前已清楚HMW-GS由第1部分同源群染色體上的Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點(diǎn)編碼。每個(gè)位點(diǎn)均有二個(gè)緊密連鎖基因，分別控制分子量較大的x型亞基和分子量較小的y型亞基(用SDS-PAGE方法測得的分子量為90-150KD)。由于部分基因處于沉默和不表達(dá)狀態(tài)，多數(shù)普通小麥品種在SDS-PAGE圖譜上僅能檢測到3-5個(gè)高分子量谷蛋白亞基，其中2個(gè)由Glu-D1控制，1個(gè)或2個(gè)由Glu-B1控制，1個(gè)或0個(gè)由Glu-A1控制。在各個(gè)位點(diǎn)上均存在廣泛的等位基因變異，目前已在面包小麥中鑒定和命名了20多個(gè)HMW-GS等位基因。不同的亞基及其等位基因?qū)π←溒焚|(zhì)的作用各異，在已經(jīng)檢測到的高分子量谷蛋白亞基中，1Dx5+1Dy10(4)、1Bx17+1By18(3)、1Bx7+1By8(3)與1Bx13+1By16(3)、1Ax1(3)、1Ax2*(3)等亞基對或亞基與小麥優(yōu)質(zhì)品質(zhì)有關(guān)(括號(hào)內(nèi)為品質(zhì)評(píng)分)，而1Dx2+1Dy12為劣質(zhì)亞基對，亞基對1Dx4+1Dy12對品質(zhì)有重要作用，其品質(zhì)評(píng)分僅次于1Dx5+1Dy10。在我國推廣品種中1Dx5+1Dy10、1Bx17+1By18等優(yōu)質(zhì)亞基對的頻率很低，這可能是造成品質(zhì)差的重要原因之一。當(dāng)前在小麥品質(zhì)育種工作中的重點(diǎn)是對HMW-GS組成的改良，特別是要提高優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白亞基或亞基對的頻率。
近年來，盡管通過基因工程和分子標(biāo)記輔助選擇手段改良小麥品質(zhì)已顯示出很大的應(yīng)用前景，但這些方法往往費(fèi)用昂貴、分析成本高、費(fèi)工費(fèi)時(shí)，而且針對優(yōu)質(zhì)貯藏蛋白基因的基因工程和分子標(biāo)記輔助選擇方法離實(shí)際應(yīng)用還有一定距離，目前還難以滿足品質(zhì)育種工作的要求。因此急需研發(fā)新的更為可靠的優(yōu)質(zhì)基因標(biāo)記輔助選擇技術(shù)。目前常規(guī)育種方法與標(biāo)記輔助選擇技術(shù)相結(jié)合是小麥品質(zhì)改良的主要手段，其中雜交早期世代優(yōu)質(zhì)貯藏蛋白亞基快速、微量、準(zhǔn)確的鑒定是提高育種效率的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用酸性毛細(xì)管電泳技術(shù)快速鑒定小麥高分子量谷蛋白亞基的方法，主要任務(wù)是解決針對小麥種子中貯藏的高分子量谷蛋白亞基的鑒定給出酸性毛細(xì)管電泳的緩沖液的類型和添加成分、電泳條件參數(shù)和毛細(xì)管沖洗程序，該方法能在小麥雜交早期世代對小麥種子優(yōu)質(zhì)貯藏蛋白亞基作出快速、準(zhǔn)確的鑒定與篩選。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括材料取樣、樣品制備、高效毛細(xì)管電泳和數(shù)據(jù)處理分析，其中材料取樣、樣品制備以及數(shù)據(jù)處理采用的是常規(guī)方法，其特征是高效毛細(xì)管電泳時(shí)的電泳緩沖液(buffer)為100-120mm磷酸-甘氨酸緩沖液，該緩沖液pH值為2.5-2.8，添加有18-22％乙腈和0.04-0.06％羥脯氨酰甲基纖維素(HPMC)，具體電泳條件參數(shù)為毛細(xì)管內(nèi)徑25或50μm毛細(xì)管長度24-28cm電壓10.0-13.5KV溫度37-40℃進(jìn)樣8-12KV，6-10sec在上述的技術(shù)方案中，為了能夠連續(xù)檢測樣品和保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳時(shí)，對毛細(xì)管進(jìn)行沖洗必須按沖洗程序操作，按照沖洗目的的不同，沖洗程序具體分為以下四種情況1、對于新的毛細(xì)管在使用前要進(jìn)行預(yù)處理沖洗，沖洗程序如下H2O 4-6min0.1MNaOH 9-12minH2O 4-6min1MH3PO48-12minBuffer 50-75min2、進(jìn)樣前對毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下
H2O 1.5-2.5min0.1MNaOH 4-6minH2O 4-6min1MH3PO44-6minBuffer 16-24min3、當(dāng)一次鑒定測定多個(gè)樣品時(shí)，兩次樣品檢測之間要進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下1MH3PO41.5-3minBuffer 1.5-2.5min4、檢測結(jié)束后對毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下1MH3PO44-6minH2O 4-6min0.1MNaOH 1.5-2.5minH2O 13-17minN29-11min通過本發(fā)明可以建立重要HMW-GS標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管電泳圖譜，進(jìn)而形成對優(yōu)質(zhì)亞基進(jìn)行鑒定的一套完整的技術(shù)體系。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)樣品用量少微量檢測是開展雜交早期世代優(yōu)質(zhì)基因選擇的關(guān)鍵。本技術(shù)只需單粒種子無胚端10-15mg胚乳面粉，并可進(jìn)行5次以上重復(fù)分析。另外，所提取的蛋白質(zhì)干樣可長期保持而不影響分離效果。
(2)分離時(shí)間短利用上述電泳參數(shù)，單個(gè)樣品一般在12min分離完成，而常規(guī)SDS-PAGE方法一般需要1-2天時(shí)間。
(3)亞基電泳模式分辨度高、易于應(yīng)用在酸性緩沖液條件下，多數(shù)HMW-GS表現(xiàn)為一個(gè)主峰和1-3個(gè)副峰(如附圖所示)。理論上A-CE技術(shù)每米理論塔板數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高效液相色譜和SDS-PAGE方法。該技術(shù)可對目前所鑒定的優(yōu)質(zhì)HMW谷蛋白亞基進(jìn)行快速分離和鑒定，包括一些SDS-PAGE和HPLC方法難以區(qū)分的亞基，如17+18，2和2*和近年來發(fā)現(xiàn)的一些遷移率很相似的新亞基，以及10和12，2和5等(RP-PLC不能有效分離)。通過與優(yōu)質(zhì)亞基標(biāo)準(zhǔn)圖譜以及單樣與混合樣的比較分析，能準(zhǔn)確鑒定5+10與2+12以及14+15、13+16、17+18、7+8、1、2*等亞基。
(4)重復(fù)性好利用上述沖洗方法可以獲得較好的重復(fù)性分離。重復(fù)間峰遷移時(shí)間和峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別小于1％和3％，無峰拖尾現(xiàn)象。
(5)分離自動(dòng)化程度高毛細(xì)管電泳從進(jìn)樣到結(jié)果分析自動(dòng)化程度高，簡便易于操作，這是傳統(tǒng)SDS-PAGE方法所無法比擬的。
(6)分析成本低除了毛細(xì)管電泳儀器較貴以外，分析成本低，一般只需一些常用試劑，所有試劑均用量很少，而且不需使用丙稀酰胺等有毒藥品。因此，與傳統(tǒng)方法相比，A-CE技術(shù)的分析成本較低。
此外，該鑒定方法對小麥流通與加工以及品種權(quán)益保護(hù)等領(lǐng)域也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖1小麥品種Hope(1，6+8，5+10)高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)的酸性毛細(xì)管電泳(A-CE)連續(xù)20次分離重復(fù)性比較圖譜。圖中顯示第1、5、10、15和20次分離的電泳圖譜。
圖2小麥品種中國春、Hope和硬粒小麥品種Simeto高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細(xì)管電泳分離圖譜。
A中國春(N，7+8，2+12)B Hope(1，6+8，5+10)C Simeto(N，7+8)圖3密穗小麥(Triticum compactum L.，2n＝6x＝42，AABBDD)Club20(N，17+18，2+12)和面包小麥品種Kontrast(N，17+18，5+10)單樣及混合樣(1∶1)HMW-GS酸性毛細(xì)管電泳分離與鑒定圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.材料取樣用小麥品種Hope的種子作為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取種子無胚乳端10-15mg用于谷蛋白提取和毛細(xì)管電泳。
2.樣品制備高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)提取方法備用試劑A.50％正丙醇
B.50％正丙醇+1％DTTC.丙酮(分析純)D.20％乙腈+0.1％三氟乙酸(TFA)操作方法(1)取單粒種子，用刀片切取無胚乳端(約10-15mg)，準(zhǔn)確稱量后用硫酸紙和小鐵錘扎碎成細(xì)粉，放入1.5ml離心管中；(2)加入50％正丙醇1ml，45℃水浴提取10分鐘，10000rpm離心5分鐘，去掉上清液；(3)重復(fù)上述步驟三次，攙留的上清液用濾紙吸干；(4)加入50％正丙醇+1％DTT 800μl，45℃震蕩提取30分鐘，1200rpm離心10分鐘，取上清液轉(zhuǎn)入干凈的1.5ml新離心管中；(5)加入預(yù)冷分析純丙酮至終濃度40％，室溫靜置沉淀30分鐘，12000rpm離心15分鐘，所得沉淀即為HMW-GS；(6)按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、離心后即可進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析；同時(shí)也可將沉淀放入-20℃中保存，待需要時(shí)溶解進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。
3.高效毛細(xì)管電泳(HPCE)儀器設(shè)備Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生產(chǎn)的高效毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(配有軟件用于系統(tǒng)操作和數(shù)據(jù)處理)。彈性石英毛細(xì)管柱內(nèi)徑為50μm，長度為25.5cm，外層涂有聚酰亞胺保護(hù)層，內(nèi)壁均未涂層。
備用試劑毛細(xì)管電泳緩沖液100mm磷酸-甘氨酸緩沖液(該緩沖液pH值為2.50，添加有20％乙腈和0.05％羥脯氨酰甲基纖維素(HPMC))；雙蒸水。
毛細(xì)管柱沖洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.雙蒸水D.電泳緩沖液毛細(xì)管沖洗程序a.新毛細(xì)管預(yù)處理程序H2O 5min0.1MNaOH 10minH2O 5min1MH3PO410minBuffer60minb.樣品間沖洗程序1MH3PO42minBuffer2minc.每天實(shí)驗(yàn)沖洗程序進(jìn)樣前沖洗H2O2min0.1MNaOH5minH2O5min1MH3PO45minBuffer 20mind.結(jié)束實(shí)驗(yàn)沖洗1MH3PO45minH2O5min0.1MNaOH2minH2O15minN210min毛細(xì)管電泳條件電壓12.5KV溫度40℃進(jìn)樣10KV，8sec電極由+向-。
數(shù)據(jù)處理利用Biofocus Integrator軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，同時(shí)將電泳結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASC碼，進(jìn)行Excel處理分析。
對小麥品種Hope(1，6+8，5+10)高分子量谷蛋白亞基連續(xù)20次重復(fù)分離得到的電泳圖譜如圖1所示。
實(shí)施例21.材料取樣分別用小麥品種中國春、Hope和硬粒小麥種子作為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取種子無胚乳端10-15mg用于谷蛋白提取和毛細(xì)管電泳。
2.樣品制備高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)提取方法選用的備用試劑和操作方法與實(shí)施例1相同，得到的HMW-GS沉淀可以按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、離心后即可進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析；也可將沉淀放入-20℃中保存，待需要時(shí)溶解進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。
3.高效毛細(xì)管電泳(HPCE)儀器設(shè)備Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生產(chǎn)的高效毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(配有軟件用于系統(tǒng)操作和數(shù)據(jù)處理)。彈性石英毛細(xì)管柱內(nèi)徑為50μm，長度分別為28cm，外層涂有聚酰亞胺保護(hù)層，內(nèi)壁均未涂層。
備用試劑毛細(xì)管電泳緩沖液110mm磷酸-甘氨酸緩沖液(該緩沖液pH值為2.60，添加有18％乙腈和0.04％羥脯氨酰甲基纖維素(HPMC))；雙蒸水。
毛細(xì)管柱沖洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.雙蒸水D.電泳緩沖液毛細(xì)管沖洗程序
a.新毛細(xì)管預(yù)處理程序H2O 4min0.1MNaOH 9minH2O 4min1MH3PO48minBuffer50minb.樣品間沖洗程序1MH3PO41.5minBuffer1.5minc.每天實(shí)驗(yàn)沖洗程序進(jìn)樣前沖洗H2O 1.5min0.1MNaOH 4minH2O 4min1MH3PO44minBuffer16mind.結(jié)束實(shí)驗(yàn)沖洗1MH3PO44minH2O 4min0.1MNaOH 1.5minH2O 13minN29min毛細(xì)管電泳條件電壓10KV溫度37℃進(jìn)樣8KV，10sec電極由+向-。
數(shù)據(jù)處理利用Biofocus Integrator軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，同時(shí)將電泳結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASC碼，進(jìn)行Excel處理分析。
中國春、Hope和硬粒小麥品種Simeto高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細(xì)管電泳分離圖譜如圖2所示。
實(shí)施例31.材料取樣分別用密穗小麥Club20和面包小麥品種Kontrast的種子作為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取種子無胚乳端10-15mg用于谷蛋白提取和毛細(xì)管電泳。然后再用分別由密穗小麥Club20和Kontrast的種子提取的高分子量谷蛋白亞基按1∶1混合后制成的樣品作為試驗(yàn)材料。
2.樣品制備高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)提取方法選用的備用試劑和操作方法與實(shí)施例1相同，得到的HMW-GS沉淀可以按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、離心后即可進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析；也可將沉淀放入-20℃中保存，待需要時(shí)溶解進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。
3.高效毛細(xì)管電泳(HPCE)儀器設(shè)備Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生產(chǎn)的高效毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(配有軟件用于系統(tǒng)操作和數(shù)據(jù)處理)。彈性石英毛細(xì)管柱內(nèi)徑為50μm，長度分別為24cm，外層涂有聚酰亞胺保護(hù)層，內(nèi)壁均未涂層。
備用試劑毛細(xì)管電泳緩沖液120mm磷酸-甘氨酸緩沖液(該緩沖液pH值為2.80，添加有22％乙腈和0.06％羥脯氨酰甲基纖維素(HPMC))；雙蒸水。
毛細(xì)管柱沖洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.雙蒸水D.電泳緩沖液毛細(xì)管沖洗程序a.新毛細(xì)管預(yù)處理程序
H2O6min0.1MNaOH12minH2O6min1MH3PO412minBuffer 75minb.樣品間沖洗程序1MH3PO43minBuffer 2.5minc.每天實(shí)驗(yàn)沖洗程序進(jìn)樣前沖洗H2O2.5min0.1MNaOH6minH2O6min1MH3PO46minBuffer 24mind.結(jié)束實(shí)驗(yàn)沖洗1MH3PO46minH2O6min0.1MNaOH 2.5minH2O17minN211min毛細(xì)管電泳條件電壓13.5KV溫度38℃進(jìn)樣12KV，6sec電極由+向-。
數(shù)據(jù)處理利用Biofocus Integrator軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，同時(shí)將電泳結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASC碼，進(jìn)行Excel處理分析。
密穗小麥Club20(N，17+18，2+12)和面包小麥品種Kontrast(N，17+18，5+10)單樣及混合樣(1∶1)HMW-GS的酸性毛細(xì)管電泳分離與鑒定圖譜如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細(xì)管電泳鑒定方法，包括材料取樣、樣品制備、高效毛細(xì)管電泳和數(shù)據(jù)處理分析，其中材料取樣、樣品制備以及數(shù)據(jù)處理采用的是常規(guī)方法，其特征是高效毛細(xì)管電泳時(shí)的電泳緩沖液為100-120mm磷酸-甘氨酸緩沖液，該緩沖液pH為2.5-2.8，添加有18-22％腈和0.04-0.06％羥脯氨酰甲基纖維素，具體電泳條件參數(shù)為毛細(xì)管的內(nèi)徑為25或50μm，長度為24-28cm電壓10.0-13.5KV溫度37-40℃進(jìn)樣8-12KV，6-10sec。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細(xì)管電泳鑒定方法，其特征在于為了能夠連續(xù)檢測樣品和保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳時(shí)，對毛細(xì)管進(jìn)行沖洗必須按沖洗程序操作，按照沖洗目的的不同，沖洗程序具體分為以下四種情況(1)對于新的毛細(xì)管在使用前要進(jìn)行預(yù)處理沖洗，沖洗程序如下H2O 4-6min0.1M NaOH 9-12minH2O 4-6min1M H3PO48-12minBuffer 50-75min(2)進(jìn)樣前對毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下H2O 1.5-2.5min0.1M NaOH 4-6minH2O 4-6min1M H3PO44-6minBuffer 16-24min(3)當(dāng)一次鑒定測定多個(gè)樣品時(shí)，兩次樣品檢測之間要進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下1M H3PO41.5-3minBuffer 1.5-2.5min(4)檢測結(jié)束后對毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下1M H3PO44-6minH2O 4-6min0.1M NaOH 1.5-2.5minH2O 13-17minN29-11min
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細(xì)管電泳鑒定方法，其特征在于通過本發(fā)明能夠建立小麥HMW-GS的標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管圖譜，進(jìn)而形成對小麥高分子量谷蛋白亞基進(jìn)行鑒定的一套完整的技術(shù)體系。
全文摘要
本發(fā)明涉及小麥高分子量谷蛋白亞基的鑒定方法，特別是涉及通過酸性毛細(xì)管電泳(A－CE)技術(shù)對小麥高分子量谷蛋白亞基進(jìn)行鑒定的方法。小麥貯藏蛋白，特別是高分子量谷蛋白亞基的組成和含量對品質(zhì)具有十分重要的作用。當(dāng)前在小麥品質(zhì)育種工作中的重點(diǎn)是對HMW－GS組成的改良，特別是要提高優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白亞基或亞基對的頻率。目前常規(guī)育種方法與標(biāo)記輔助選擇技術(shù)相結(jié)合是小麥品質(zhì)改良的主要手段，其中雜交早期世代優(yōu)質(zhì)蛋白亞基快速、微量、準(zhǔn)確的鑒定是提高育種效率的關(guān)鍵。本發(fā)明的主要任務(wù)是解決針對小麥種子中貯藏的高分子量谷蛋白亞基的鑒定給出酸性毛細(xì)管電泳的緩沖液類型和添加成分、電泳條件參數(shù)和毛細(xì)管沖洗程序。
文檔編號(hào)G01N30/38GK1570623SQ20041003725
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者晏月明, 余建中, 姜怡, 安學(xué)麗, 胡英考 申請人:首都師范大學(xué)