專利名稱：一種精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外診斷試劑類，具體適用于精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換的半定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
人體的精原細(xì)胞核蛋白類型主要為富含賴氨酸殘基組蛋白，在精子成熟過(guò)程中，與精核DNA結(jié)合的堿性蛋白發(fā)生組型轉(zhuǎn)換，富含賴氨酸殘基的組蛋白逐漸被富含精氨酸與胱氨酸殘基的魚(yú)精蛋白所取代，成熟的精子核蛋白類型主要是魚(yú)精蛋白。
而蛋白組型轉(zhuǎn)換缺陷或異常可引起男性不育或胚胎早期夭折流產(chǎn)，其機(jī)理為①使精子DNA不穩(wěn)定，易受損傷而不能受孕；②一旦受精，由于核蛋白組型異常，精子核不能正常解聚，從而影響了雌雄原核的融合；③胚胎不能正常發(fā)育，造成胚胎夭折而流產(chǎn)。
精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換檢測(cè)方法有兩種，一種是提取核蛋白后電泳定量檢測(cè)，另一種是利用與賴氨酸殘基有親和力的苯胺藍(lán)染色檢測(cè)，在酸性條件下，苯胺藍(lán)與賴氨酸殘基結(jié)合生成藍(lán)色化合物，從而指示富含賴氨酸殘基蛋白質(zhì)的存在。前一方法操作復(fù)雜、對(duì)人員與設(shè)備的要求比較高，不適于臨床常規(guī)開(kāi)展；后一方法操作簡(jiǎn)單，但由于試劑配方不合理造成背景噪聲大，特異性不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于提供一種可洗去精液中的非特異性染色、背景噪聲低、信噪比大、染色結(jié)果準(zhǔn)確性、特異性好的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
本發(fā)明的次一目的在于提供一種染色效果一致、便于臨床常規(guī)應(yīng)用推廣的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
本發(fā)明的次一目的在于提供一種檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好、可實(shí)現(xiàn)批量化檢測(cè)的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，包括染色液、粘合液和洗脫液；所述洗脫液用于洗去精液染色后的非特異性染色；所述粘合液用于使精液易于粘合在載玻片上，免于洗脫。由于本發(fā)明提出的檢測(cè)試劑檢測(cè)的是不成熟精子的個(gè)數(shù)，而通常的定量檢測(cè)精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換的試劑應(yīng)該是檢測(cè)含賴氨酸殘基的組蛋白的絕對(duì)量，因此，本發(fā)明的檢測(cè)試劑為精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)的試劑。
還包括洗滌液，所述洗滌液用于洗去精子表面的粘稠部分。
還包括固定液，所述固定液用于使精子的蛋白質(zhì)分子形成交聯(lián)鍵而使之沉淀，易于染色，同時(shí)增加精液在載玻片上的粘合力。
還包括封固液，所述封固液用于使蓋玻片與載玻片之間的結(jié)合牢固。
所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液；所述粘合液是含明膠的磷酸鹽緩沖液；所述固定液是丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液；所述洗脫液是含三羥甲基氨基甲烷的水溶液。
所述洗滌液的PH值為7.2～7.6；所述粘合液的PH值為7.2～7.6，所述粘合液中明膠的重量含量為0.02～0.1％；所述固定液中丙酮的體積含量為45％～50％、甲醇的體積含量為45％～50％、40％甲醛的體積含量為4％～6％；所述洗脫液中三羥甲基氨基甲烷的重量含量為1～4％。
進(jìn)一步的，還提出一種用精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括如下步驟1)在精液中加入粘合液，并涂于載玻片上的的染色窗中，使得精液易于粘合在載玻片上；2)在步驟1)所述的精液中加入染色液，對(duì)精液進(jìn)行染色；3)對(duì)步驟2)所述的精液進(jìn)行封片，計(jì)數(shù)一定個(gè)數(shù)的精子中頭部染藍(lán)色的精子百分率。由于本發(fā)明提出的檢測(cè)方法檢測(cè)的是不成熟精子的個(gè)數(shù)，而通常的定量檢測(cè)精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換的方法應(yīng)該是檢測(cè)含賴氨酸殘基的組蛋白的絕對(duì)量，因此，本發(fā)明的檢測(cè)方法為精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)的方法。
所述步驟1)之前還包括如下步驟用洗滌液洗去精液中精子表面的粘稠部分；在所述步驟1)之后、步驟2)之前還包括如下步驟在精液中加入固定液，使精液中的蛋白質(zhì)變性，同時(shí)增加精液在載玻片上的粘合力；所述步驟2)之后、步驟3)之前還包括如下步驟在精液中加入封固液，用于增加載玻片與蓋玻片之間的粘合力。
所述載玻片上有至少一個(gè)染色窗，且每個(gè)染色窗的大小相同，邊界為耐酸、疏水性涂料。
由于上述技術(shù)方案，結(jié)合下面將要詳述的實(shí)施例，本發(fā)明突出的技術(shù)效果在于1、由于采用洗脫液，將染色完畢的精液中的非特異性染色洗去，只保留特異性染色的物質(zhì)(染色后的賴氨酸殘基)，背景噪聲對(duì)計(jì)數(shù)人員的干擾減小，使得染色結(jié)果易于讀取，同時(shí)結(jié)果的準(zhǔn)確性、特異性也大大提高了；2、由于調(diào)整精子的濃度一定，即在載玻片上的染色窗中的精子密度是一定的，而最終的染色效果是受染色窗中的精子密度影響的，一個(gè)載玻片上有若干個(gè)染色窗，每個(gè)染色窗內(nèi)精子密度一定，則所有染色窗的染色效果一致，可以同時(shí)讀取多組數(shù)據(jù)，便于試驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)積累，也便于臨床常規(guī)應(yīng)用的推廣；3、由于在一個(gè)載玻片上有若干個(gè)染色窗，各染色窗中的操作一致，精子密度一定，染色效果一致，從而規(guī)范了方法學(xué)，可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換的半定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好，并可實(shí)現(xiàn)批量化檢測(cè)。
具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體的實(shí)施例并結(jié)合附圖
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實(shí)施例，一種精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，包括染色液、洗滌液、粘合液、固定液、洗脫液和封固液；由于本發(fā)明提出的檢測(cè)試劑檢測(cè)的是不成熟精子的個(gè)數(shù)，而通常的定量檢測(cè)精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換的試劑應(yīng)該是檢測(cè)含賴氨酸殘基的組蛋白的絕對(duì)量，因此，本發(fā)明的檢測(cè)試劑為精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)的試劑；其中洗滌液用于洗去精子表面的粘稠部分，所述洗滌液在本發(fā)明中采用pH7.4的磷酸鹽(PBN)緩沖液，所述洗滌液是1000ml蒸餾水中含有磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.5g、十二水磷酸氫鈉(Na2HPO4·12H2O)5.8g、疊氮鈉(NaN3)0.5g；所述洗滌液中KH2PO4的重量含量為0.03～0.06％、Na2HPO4·12H2O的重量含量為0.4～0.7％、NaN3的重量含量為0.01～0.1％，所述KH2PO4、Na2HPO4·12H2O還可以用別的PBN替換，NaN3還可以用其他的防腐劑替換，而且PBN與防腐劑的含量還可以為其他值，只要能夠保證洗滌液的pH值為7.2～7，含量的多少基本不會(huì)影響洗滌液用于洗去精子表面的粘稠部分的作用；本發(fā)明中的洗滌液還可以用其他可以洗去精子表面的粘稠部分的物質(zhì)替換。
粘合液使得精液易于粘合在載玻片上，免于被洗脫；所述粘合液在本發(fā)明中采用含明膠的PBN緩沖液，所述粘合液在本發(fā)明中是1000毫升pH7.4的PBN緩沖液中含有明膠0.5g；所述粘合液中明膠的重量含量為0.02～0.1％，明膠的含量低于0.02％時(shí)，精液粘合力不強(qiáng)，容易洗脫，明膠的含量高于0.1％時(shí)，染色后的非特異性染色過(guò)多，背景噪聲過(guò)大，使得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性變差；本發(fā)明的粘合液還可以用其他能夠使精液粘合在載玻片上的物體替換。
固定液使得精子的蛋白質(zhì)分子形成交聯(lián)鍵而使之沉淀，易于染色液的染色，同時(shí)還可以增加精液在載玻片上的粘合力；所述固定液是丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液，所述固定液中丙酮的體積含量為45％、甲醇的體積含量為45％、40％甲醛的體積含量為5％，丙酮的體積含量還可以在45％～50％之間，甲醇的體積含量還可以在45％～50％之間，40％甲醛的體積含量還可以在5％4％～6％之間，丙酮、甲醇、40％甲醛的體積含量還可以為其它數(shù)值，對(duì)于精子中蛋白質(zhì)分子形成交聯(lián)鍵從而使之沉淀不會(huì)有太大影響；本發(fā)明中的固定液還可以用其他能夠使精液中的蛋白質(zhì)變性的物質(zhì)替換。
本發(fā)明所采用的染色液是苯胺藍(lán)的重量含量為1.5％、冰醋酸的體積含量為4％的水溶液，所述苯胺藍(lán)的重量含量還可以在0.4～2％之間、冰醋酸的體積含量還可以在1～5％之間，所述染色液還可以用現(xiàn)有的對(duì)精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換檢測(cè)所采用的常見(jiàn)的染色液替換。
洗脫液用于將染色后的非特異性染色物質(zhì)洗去(苯胺藍(lán)與賴氨酸殘基結(jié)合后的物質(zhì)為特異性染色的物質(zhì)，除了特異性染色的物質(zhì)，在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中其他會(huì)與染色液進(jìn)行反應(yīng)生成的染色物質(zhì)通稱為非特異性染色物質(zhì))，使得檢測(cè)結(jié)果特異性好；所述洗脫液在本發(fā)明中采用含有Tris、NaCl的水溶液，所述洗脫液中Tris的重量含量為2％、NaCl的重量含量為0.8％，所述洗脫液中Tris的重量含量還可以在1～4％之間、NaCl的重量含量還可以在0.5～2％之間，Tris、NaCl的含量超過(guò)給定范圍會(huì)使得洗脫不完全，從而背景噪聲過(guò)大，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確；本發(fā)明封固液用于使檢測(cè)過(guò)程中載玻片與蓋玻片之間粘合牢固，精液不會(huì)隨意移動(dòng)，干擾試驗(yàn)人員對(duì)數(shù)據(jù)的讀取，使得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性大大增強(qiáng)，特異性好；所述封固液可以為甘油或液體石蠟等常見(jiàn)的封固液。
上述精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑的制作工藝方法A、洗滌液的制作工藝方法1)稱取KH2PO40.5g、Na2HPO4·12H2O 5.8g、NaN30.5g置燒杯，加蒸餾水至900ml，攪拌溶解；或者稱取KH2PO40.3～0.6g g、Na2HPO4·12H2O 4～7g、NaN30.1～1.0g置燒杯，加蒸餾水至900ml，攪拌溶解。
2)調(diào)pH至7.4，加蒸餾水至1000ml，4℃保存；或者將溶液的調(diào)pH調(diào)至7.2～7.6。
B、粘合液的制作工藝方法3)稱取明膠0.2～1g，置燒杯，加洗滌液400毫升，置60℃水浴攪拌溶解。
4)用洗滌液定容至1000毫升，置4℃保存。
C、固定液的制作工藝方法5)取丙酮90毫升、甲醇90、40％甲醛10毫升，混勻后室溫保存；或者取丙酮90～100毫升、甲醇90～100毫升、40％甲醛8～12毫升，混勻后室溫保存D、染色液的制作工藝方法6)取冰醋酸3毫升，加蒸餾水至100毫升，調(diào)pH至3.5；或者取冰醋酸1～5毫升，加蒸餾水至100毫升，調(diào)pH至3.3～3.7。
7)加入苯胺藍(lán)1.5克，攪拌溶解后過(guò)濾，置4℃保存；或者加入苯胺藍(lán)0.4～2克，攪拌溶解后過(guò)濾，置4℃保存。
E、洗脫液的制作工藝方法
8)稱取Tris 2g、NaCl 0.8g，溶于80毫升蒸餾水中，攪拌溶解；或者稱取Tris 1～4g、NaCl 0.5～2g，溶于80毫升蒸餾水中，攪拌溶解，9)用1mol/LHCl調(diào)pH至7.6，用蒸餾水定容至100毫升，置4℃保存；或者用1mol/LHCl調(diào)pH至7.4～7.8，用蒸餾水定容至100毫升。置4℃保存F、封固液的制作工藝方法10)取市售純甘油(AR)，置室溫保存；其中AR表示甘油的純度為分析純，還可以用化學(xué)純等純度的甘油或者液化石臘等其他的封固液替換。
根據(jù)需要，可將上述精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑制作成試劑盒，其中濃縮洗滌液(10×)0.3～0.5ml、粘合液0.5～1.5ml、固定液50～150ul、染色液50～150ul、濃縮洗脫液(5×)10～50ml、封固液40～60ul。
上述試劑盒的優(yōu)選方案是濃縮洗滌液(10×)0.4ml、粘合液0.1ml、固定液100ul、染色液100ul、濃縮洗脫液(5×)20ml、封固液50ul。
試驗(yàn)例，由于本發(fā)明提出的檢測(cè)方法檢測(cè)的是不成熟精子的個(gè)數(shù)，而通常的定量檢測(cè)精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換的方法應(yīng)該是檢測(cè)含賴氨酸殘基的組蛋白的絕對(duì)量，因此，本發(fā)明的檢測(cè)方法為精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)的方法；用精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑對(duì)精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換進(jìn)行半定量檢測(cè)的具體步驟如下一、樣本準(zhǔn)備新鮮液化精液，或-20℃貯存精液標(biāo)本。
二、試劑準(zhǔn)備1、洗滌應(yīng)用液配制以蒸餾水10倍稀釋濃縮洗滌液，4℃貯存。
2、洗脫應(yīng)用液配制以蒸餾水5倍稀釋濃縮洗脫液，4℃貯存。
三、操作步驟1、精液液化并計(jì)數(shù)，以洗滌液調(diào)整精子濃度至40×106/ml；在計(jì)數(shù)及調(diào)節(jié)精子濃度之前務(wù)必將精液充分混勻，防止精子分布不均，造成精子濃度計(jì)數(shù)誤差過(guò)大，精子數(shù)量過(guò)多容易發(fā)生重疊，不利于脫色及結(jié)果觀察；采用40×106/ml濃度的精子，在0.6cm染色窗內(nèi)的精子染色強(qiáng)度好；由于最后精子的染色效果受載玻片上染色窗內(nèi)精子密度的影響，不同數(shù)量精子染色后脫色時(shí)間差異較大，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和良好的重復(fù)性，在保證一定面積的染色窗內(nèi)精子數(shù)目一定的前提下，不同濃度的精子也會(huì)有相似的染色效果，因此，洗滌液對(duì)精子濃度的調(diào)整也可以調(diào)整到其他的濃度；2、取上述調(diào)整后的精液1ml，加于Eppendorf管內(nèi)，1000g離心10min，由于精漿會(huì)粘附在玻片上干擾染色，因此去精漿，其中離心的時(shí)間只要可以充分分離精漿即可；3、在上述去精漿后的精液中加1ml洗滌液，充分混勻。1000g離心3分鐘，由于上清液中含有洗滌液和精漿，因此去上清液，為了要達(dá)到精漿除掉至不干擾染色效果為止，需要反復(fù)多次采用離心棄上清液的方式進(jìn)行洗滌，洗滌次數(shù)不限，一般在實(shí)際試驗(yàn)操作中洗滌3次即可；在精子洗滌過(guò)程中可能由于以下原因?qū)е戮舆^(guò)度丟失①相對(duì)離心力偏小(計(jì)算公式RCF＝(r/min)2×R(cm)×1.118×10-6)；②離心時(shí)間過(guò)短；③去上清液時(shí)不慎將精子沉淀物一并吸棄；4、精液最后一次離心棄上清液后，加1ml粘合液，其中棄上清液要求盡量吸去上層液體、保留下層精子；5、取5ul上述精液涂片，涂片范圍必須滿布玻片染色窗，空氣干燥；涂片前精子懸液必須充分混勻，涂片時(shí)應(yīng)將精子懸液均勻分布于整個(gè)染色窗，精子涂片后應(yīng)水平放置待干，以免懸液傾向一側(cè)造成局部精子過(guò)于重疊，導(dǎo)致脫色不均勻；而且玻片潔凈度要求很高，最好采用試劑盒配套載玻片，載玻片從冷藏冰箱取出后應(yīng)平衡至溫室后方可開(kāi)封，并將載玻片置室溫長(zhǎng)期密封保存，小心勿與載玻片接觸，以免污染涂片區(qū)；6、加固定液充分固定上述染色窗內(nèi)的精液，固定的時(shí)間要避免精子在染色及洗脫過(guò)程中在玻片上脫落，否則會(huì)無(wú)法在未染色前觀察效果，一般在實(shí)際試驗(yàn)操作中需要固定90秒，甩去固定液；7、載玻片以自來(lái)水輕輕沖洗7次，每次1秒鐘，其中沖洗的次數(shù)、時(shí)間、程度不限于輕輕沖洗7次，每次1秒，而以能夠洗凈固定液為準(zhǔn)；甩去玻片表面積水，加染液覆蓋涂片區(qū)，染色5min，其中染色時(shí)間不限于5秒鐘，只需充分染色即可；8、以自來(lái)水緩緩沖洗染色后的精液7次，每次1秒鐘，其中沖洗的次數(shù)、時(shí)間不限于沖洗7次，每次1秒鐘，而以洗凈載玻片上染色窗中未與精子或其他細(xì)胞結(jié)合的染料為準(zhǔn)，以自來(lái)水洗滌組織片時(shí)，要求水流較緩，且不可正對(duì)涂片區(qū)域沖洗，若所用自來(lái)水水質(zhì)較差，應(yīng)使用蒸餾水代替自來(lái)水；然后將組織片浸泡至洗脫液中準(zhǔn)確脫色18～20min，或至組織片無(wú)明顯藍(lán)色為止，其中脫色時(shí)間必須嚴(yán)格加以控制，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，弱陽(yáng)性精子過(guò)度脫色造成結(jié)果假陰性，而脫色時(shí)間過(guò)短，組織片背景噪聲過(guò)高結(jié)果難以判斷；立即甩去脫色液，以自來(lái)水快速洗滌7次，洗滌的次數(shù)、時(shí)間不重要，但脫色完畢后應(yīng)立即以自來(lái)水洗去組織片表面洗脫液，以免脫色時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)；9、甩去組織片表面附著積水，迅速吹干或晾干，由于自來(lái)水也有脫色作用，因此以自來(lái)水迅速?zèng)_洗脫液后，應(yīng)盡量甩去玻片表面積水，然后將玻片豎起，迅速吹干或晾干，以免自來(lái)水在組織片滯留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而繼續(xù)脫色；10、封片于載玻片檢測(cè)區(qū)域加封固液1滴，當(dāng)同時(shí)對(duì)一塊載玻片上的若干個(gè)染色窗中的精液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在各染色窗中各加封固液1滴后以蓋片封片，載玻片若不加封固液而直接進(jìn)行觀察，精子會(huì)皺縮且背景有噪音干擾，加封固液封片是為了獲得色彩鮮艷、對(duì)比清晰的觀察效果，但封片時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(＞6小時(shí))結(jié)果有差異，為滿足延后觀察時(shí)間要求，可在臨觀察前6小時(shí)內(nèi)再加封固液封片；油鏡計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)數(shù)個(gè)數(shù)不限，主要是保證固定大小的染色窗中的精子數(shù)目一定，便于各染色窗中精液染色效果的一致即可，其中鏡下結(jié)果觀察，應(yīng)選擇組織片中央精子分布均勻區(qū)域計(jì)數(shù)，由于精子懸液未充分混勻或分布不均，造成局部精子疊加而不易脫色，因此若出現(xiàn)成團(tuán)精子染成藍(lán)色，則不應(yīng)將其作為陽(yáng)性精子計(jì)數(shù)；不成熟精子頭部呈藍(lán)色，精子核呈明顯藍(lán)色為強(qiáng)陽(yáng)性，精子不染色或極淡藍(lán)色為陰性，由于精子核蛋白存在組蛋白-魚(yú)精蛋白過(guò)渡期，因此少數(shù)精子染色較淺，染色程度超過(guò)組織片中或正常對(duì)照精子的陰性精子平均底色2倍者，可計(jì)數(shù)為陽(yáng)性精子，精子核局部染藍(lán)色亦應(yīng)判為陽(yáng)性；計(jì)算頭部著色精子百分率，頭部著色精子的百分率與精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換之間是對(duì)應(yīng)關(guān)系，即頭部著藍(lán)色精子就是核蛋白組型轉(zhuǎn)換不成熟精子。
四、正常參考值頭部染藍(lán)色精子≤30％五、臨床適用性可作為評(píng)價(jià)男性精液質(zhì)量的一種可靠指標(biāo)。
權(quán)利要求
1.一種精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，包括染色液，其特征是，還包括粘合液和洗脫液；所述洗脫液用于洗去精液染色后的非特異性染色；所述粘合液用于使精液易于粘合在載玻片上，免于洗脫。
2.如權(quán)利要求1所述的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，其特征在于還包括洗滌液，所述洗滌液用于洗去精子表面的粘稠部分的。
3.如權(quán)利要求2所述的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，其特征在于還包括固定液，所述固定液用于使精子的蛋白質(zhì)分子形成交聯(lián)鍵而使之沉淀，易于染色，同時(shí)增加精液在載玻片上的粘合力。
4.如權(quán)利要求3所述的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，其特征在于還包括封固液，所述封固液用于使蓋玻片與載玻片之間的結(jié)合牢固。
5.如權(quán)利要求4所述的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液；所述粘合液是含明膠的磷酸鹽緩沖液；所述固定液是丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液；所述洗脫液是含三羥甲基氨基甲烷的水溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述洗滌液的PH值為7.2～7.6；所述粘合液的PH值為7.2～7.6，所述粘合液中明膠的重量含量為0.02～0.1％；所述固定液中丙酮的體積含量為45％～50％、甲醇的體積含量為45％～50％、40％甲醛的體積含量為4％～6％；所述洗脫液中三羥甲基氨基甲烷的重量含量為1～4％。
7.一種用如權(quán)利要求1所述的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，包括如下步驟1)在精液中加入粘合液，并涂于載玻片上的的染色窗中，使得精液易于粘合在載玻片上；2)在步驟1)所述的精液中加入染色液，對(duì)精液進(jìn)行染色；3)對(duì)步驟2)所述的精液進(jìn)行封片，計(jì)數(shù)一定個(gè)數(shù)的精子中頭部染藍(lán)色的精子百分率。
8.如權(quán)利要求7所述的用精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，所述步驟1)之前還包括如下步驟用洗滌液洗去精液中精子表面的粘稠部分；在所述步驟1)之后、步驟2)之前還包括如下步驟在精液中加入固定液，使精子的蛋白質(zhì)分子形成交聯(lián)鍵而使之沉淀，同時(shí)增加精液在載玻片上的粘合力；所述步驟2)之后、步驟3)之前還包括如下步驟在精液中加入封固液，用于增加載玻片與蓋玻片之間的粘合力。
9.如權(quán)利要求8所述的用精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液，所述洗滌液的PH值為7.2～7.6；所述粘合液是含明膠的磷酸鹽緩沖液，所述粘合液中明膠的重量含量為0.02～0.1％；所述固定液是丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液，所述固定液中丙酮的體積含量為45％～50％、甲醇的體積含量為45％～50％、40％甲醛的體積含量為4％～6％；所述洗脫液是含三羥甲基氨基甲烷的水溶液，所述洗脫液中三羥甲基氨基甲烷的重量含量為1～4％。
10.如權(quán)利要求7-9其中之一所述的用精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于所述載玻片上有至少一個(gè)染色窗，且每個(gè)染色窗的大小相同，邊界為耐酸、疏水性涂料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)試劑，包括染色液、粘合液和洗脫液；所述洗脫液用于洗去精液染色后的非特異性染色；所述粘合液用于使精液易于粘合在載玻片上，免于洗脫。進(jìn)一步的，還提出一種用精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換半定量檢測(cè)的方法，包括如下步驟1)在精液中加入粘合液，并涂于載玻片上的的染色窗中，使得精液易于粘合在載玻片上；2)在步驟1)所述的精液中加入染色液，對(duì)精液進(jìn)行染色；3)對(duì)步驟2)所述的精液進(jìn)行封片，計(jì)數(shù)一定個(gè)數(shù)的精子中頭部染藍(lán)色的精子百分率。由于采用洗脫液，將染色完畢的精液中的非特異性染色洗去，只保留特異性染色的物質(zhì)，背景噪聲對(duì)計(jì)數(shù)人員的干擾減小，使得染色結(jié)果易于讀取，結(jié)果準(zhǔn)確、特異。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1746658SQ20041004066
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月8日
發(fā)明者傅劍華, 劉瑜, 胡家純, 何林, 何小紅 申請(qǐng)人:深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司