專利名稱：一種中藥有效成分的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥有效成分的檢測(cè)方法，具體為利用生物膜與中藥中有效成分的相互作用檢測(cè)出中藥有效成分的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的中藥活性成分的研究，通常是采用植物化學(xué)的方法提取其中的有效部位化合物群或單體化合物，再經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。中藥成分復(fù)雜，一味中藥就含有幾十甚至數(shù)百個(gè)化合物，而一個(gè)由多種中藥組成的復(fù)方，其中化學(xué)成分就更多了，再經(jīng)過煎煮過程后，其中化學(xué)成分又可能產(chǎn)生化合或分解等新的變化。在眾多的化學(xué)成分中，而有效成分往往含量低微，因此其分離分析操作煩瑣，工作量大，周期長，成功率低，并且不能完全闡明中藥多成分，多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。
尋找有效的藥物快速篩選的方法和技術(shù)一直是國內(nèi)外制藥公司關(guān)注的焦點(diǎn)。現(xiàn)代的科學(xué)研究表明，藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性對(duì)于它的活性起關(guān)鍵作用。因?yàn)榻^大多數(shù)的藥物必須首先進(jìn)入細(xì)胞才能表現(xiàn)它的活性，而且內(nèi)用藥物還必須能透過目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜才能起作用。簡言之，藥物的活性、毒性、體內(nèi)的分布及其它生理過程都與藥物在膜上的分配狀況有關(guān)。所以，考察化合物的細(xì)胞膜的通透性是藥物活性篩選和評(píng)價(jià)的首要關(guān)鍵步驟之一。
常用的檢測(cè)藥物細(xì)胞膜的通透性的模型有有機(jī)溶劑-水系統(tǒng)如辛醇-水，ODS(十八烷基硅膠)為固定相的反相液相色譜系統(tǒng)及人工培養(yǎng)的單層小腸絨毛細(xì)胞模型，參見毛希琴等模擬生物膜色譜用于預(yù)測(cè)藥物的小腸吸收分析化學(xué)，2001(10)1135-1139。前兩種模式都只能模擬藥物在膜上的疏水作用，而無法模擬膜磷脂的極性頭部與藥物的相互作用，而后一種則顯得繁瑣、費(fèi)時(shí)。
生物膜色譜是用于考察藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性及與膜上蛋白結(jié)合情況的一種較新的方法，該方法是以硅膠或凝膠為載體，其上涂敷或鍵合上人工模擬的細(xì)胞膜或活性細(xì)胞膜制備而成色譜固定相，根據(jù)藥物與細(xì)胞膜的相互作用的強(qiáng)弱不同而將不同的藥物分離開來。該方法亦可用于從中藥中篩選與生物膜有相互作用的化學(xué)成分，但其在實(shí)際使用中存在諸多缺憾。例如1、生物膜與硅膠等載體結(jié)合后其生物學(xué)特征會(huì)受到一定的影響。2、該方法對(duì)色譜流動(dòng)相有著嚴(yán)格的限制，即必須以生理緩沖液作為流動(dòng)相，否則會(huì)破壞生物膜，這樣使色譜利用不同流動(dòng)相而實(shí)現(xiàn)不同性質(zhì)的化合物的分離的特點(diǎn)難以發(fā)揮，化合物在生物色譜上難以實(shí)現(xiàn)彼此的相互分離。3，色譜柱上的生物膜隨時(shí)都有被流動(dòng)相逐漸洗脫下來的可能，因此難以實(shí)現(xiàn)與MS，NMR聯(lián)用，從而不能提供化合物的結(jié)構(gòu)信息。4，生物色譜的制備程序復(fù)雜，嚴(yán)格，成本較高。用涂敷法制備的模擬生物膜色譜方法因?yàn)樵黾恿斯枘z介質(zhì)與模擬生物膜的結(jié)合過程，因此比較復(fù)雜。參見毛希琴等生物膜色譜及其在藥物活性成分分析中的應(yīng)用分析化學(xué)2002(2)231-236；毛希琴等，卵磷脂涂敷生物膜色譜固定相的制備及其穩(wěn)定性的考察，色譜，2001(5)433-435；賀浪沖等固定在硅膠表面細(xì)胞膜的酶活性及其色譜特性科學(xué)通報(bào)，1999(6)633-637。上述所有文章提供的圖譜對(duì)藥物的分離效果都不好，所有的流動(dòng)相是用緩沖液，不能與LC-MS聯(lián)用，且色譜柱壽命只有一個(gè)星期左右。硅膠介質(zhì)價(jià)格較高，而通常的模擬生物膜的制備方法很經(jīng)典，簡單。在毛希琴等，三種色譜模式聯(lián)用在中藥活性成分初步篩選中的應(yīng)用，分析化學(xué)2003，31(8)992-995.的文獻(xiàn)中，有川芎在模擬生物膜色譜柱上和反相柱上的分離圖譜，顯而易見生物膜色譜的分離效能不理想，不如反相色譜柱；而用真正的細(xì)胞膜制備而成的生物色譜柱，其分離效能就更差了。趙小娟等淫羊藿根與葉活性成分的分析和比較，分析化學(xué)，2002(2)195-197；高琨等用細(xì)胞膜色譜法篩選研究紅毛七中的有效成分中國藥學(xué)雜志，2003(1)14-16。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的問題在于研究一種快捷，準(zhǔn)確，體現(xiàn)中藥多成分協(xié)同作用的檢測(cè)中藥中與生物膜有相互作用的化學(xué)成分的方法，盡可能地避免因生物膜的生物學(xué)特征受到影響而影響到有效成分的篩選的準(zhǔn)確性，提高有效成分的分離效果，并且在篩選有效成分的同時(shí)獲得其結(jié)構(gòu)信息，以便快速的從中藥中尋找可能具有活性的先導(dǎo)化合物或化合物群。同時(shí)該方法相對(duì)簡單、成本較低，并可以作為中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充手段。
為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
一種中藥有效成分檢測(cè)方法，包括如下步驟取待測(cè)中藥，用溶劑提取后，制成中藥提取液備用；將中藥提取液與生物膜加入到透析袋中透析；用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液透析過的液體。所述檢測(cè)方法中待測(cè)中藥是單味中藥或中藥復(fù)方；提取中藥的溶劑可以是水和/或有機(jī)溶劑；對(duì)含有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑含量高的提取液，濃縮去除全部或一定量的有機(jī)溶劑和/或用水稀釋后，制成中藥提取液備用。
該檢測(cè)方法中提取中藥的溶劑選自水、C1-C5的低級(jí)醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它們的混合物；中藥提取液中加增溶劑。所述C1-C5的低級(jí)醇是甲醇，乙醇、正丁醇；提取中藥的溶劑是中性、酸性或堿性；可選用無機(jī)酸、無機(jī)堿、有機(jī)酸或有機(jī)堿中和酸性或堿性的中藥提取液；增溶劑選自吐溫、二甲基亞砜、聚乙二醇、曲拉通或它們的混合物；按中藥提取液的體積加入0.1-5％體積的增溶劑。
上述檢測(cè)方法中的優(yōu)選方法是中藥提取液是用水或含1-30％乙醇提取制備的中藥提取液；生物膜為模擬生物膜、人體或動(dòng)物組織細(xì)胞的細(xì)胞膜，其中模擬生物膜是用卵磷脂或卵磷脂與天然磷脂的混合物制備而成；細(xì)胞膜包括內(nèi)皮細(xì)胞膜，紅細(xì)胞膜，心肌細(xì)胞膜，平滑肌細(xì)胞膜。
前述檢測(cè)方法中包括將裝有中藥提取液與生物膜的透析袋置于模擬生理?xiàng)l件下的緩沖液中透析，同時(shí)將不含生物膜的中藥提取液作為空白對(duì)照，裝入透析袋中透析，透析時(shí)溫度與時(shí)間成反比，溫度越低，膜兩側(cè)達(dá)到平衡所需要的時(shí)間越長，待膜兩側(cè)平衡后，分別用高效色譜法檢測(cè)透析過的液體，比較兩者指紋圖譜，峰面積改變的峰，即是與生物膜有相互作用的成分。生物膜是脂質(zhì)體；透析用的模擬生理?xiàng)l件的緩沖液是磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液；透析溫度為4-25℃時(shí)，透析時(shí)間為12-24小時(shí)。較優(yōu)選方法中磷酸鹽緩沖液pH 2.0-7.4，醋酸鹽緩沖液pH 2.0-7.4；用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液透析過的液體后，與液相-質(zhì)譜和/或核磁共振聯(lián)用，獲得與膜有相互作用成分的結(jié)構(gòu)信息。
本發(fā)明提供了一種快捷，準(zhǔn)確，體現(xiàn)中藥多成分協(xié)同作用的檢測(cè)中藥中與生物膜有相互作用的化學(xué)成分的方法，所述檢測(cè)包括篩選與測(cè)定，避免了因生物膜的生物學(xué)特征受到影響而影響到有效成分的篩選的準(zhǔn)確性，可與LC-MS(液相-質(zhì)譜，下文同)聯(lián)用，提高有效成分的分離效果，并且在篩選有效成分的同時(shí)獲得其結(jié)構(gòu)信息，可以快速的從中藥中尋找可能具有活性的先導(dǎo)化合物或化合物群。同時(shí)本發(fā)明方法相對(duì)簡單、成本較低，從中藥中篩選有效成分的效率顯著提高，并且可以作為中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充手段。中藥指紋圖譜是現(xiàn)在用于中藥質(zhì)量控制的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，但現(xiàn)行指紋圖譜存在的一個(gè)突出問題就是不能提供該中藥的藥理信息。例如，圖2中表示的當(dāng)歸補(bǔ)血湯的紅色線圖譜(位置在上方)即是當(dāng)歸補(bǔ)血湯的指紋圖譜，它僅僅能提供中藥材所含成分的化學(xué)信息。應(yīng)用本發(fā)明方法將當(dāng)歸補(bǔ)血湯與模擬生物膜作用后再做指紋圖譜，如圖2中當(dāng)歸補(bǔ)血湯的藍(lán)色線圖(位置在下方)，可以看出共有12個(gè)峰的峰面積發(fā)生了明顯的變化。藥物與生物膜的相互作用是藥物產(chǎn)生藥理活性的前提，在用指紋圖譜進(jìn)行中藥質(zhì)量控制時(shí)，這些有變化的峰應(yīng)該是重點(diǎn)控制的對(duì)象，因?yàn)樗麄儾趴赡苁窃撍幍幕钚晕镔|(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明方法將透析技術(shù)與液相色譜聯(lián)用，結(jié)果比生物色譜方法更加簡便，結(jié)論更可靠。本發(fā)明圖1是當(dāng)歸補(bǔ)血湯在280nm的檢測(cè)條件下在模擬生物膜色譜柱上的分離圖譜，圖2是在相同檢測(cè)波長下的當(dāng)歸補(bǔ)血湯與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜的改變，標(biāo)號(hào)表示峰面積有改變的峰?？梢姺迕娣e有改變的峰比模擬生物色譜柱的峰要多。
以下對(duì)本發(fā)明中藥有效成分篩方法的進(jìn)一步描述透析膜的選擇。所述的透析膜是指具有一定分子截止量的能允許分子量小于其截止分子量的物質(zhì)在溶液中自由透過，而分子量大于其截止分子量的物質(zhì)不能透過的薄膜，亦稱為半透膜?？筛鶕?jù)用途將之制成一定的形狀，如袋狀的就叫透析袋。目前市售的透析膜有數(shù)十種規(guī)格，其型號(hào)的劃分標(biāo)準(zhǔn)是以其分子截至量為依據(jù)，如分子截至量為12000的透析膜允許分子量小于12000的分子自由透過，而分子量大于12000的分子則不能透過。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要選擇不同分子截止量的透析膜，中藥中成分復(fù)雜，其有成分可能是各種各樣的化合物，如蛋白質(zhì)，多糖，肽類，及小分子物質(zhì)等，如果我們的研究對(duì)象是中藥中的大分子物質(zhì)，則需要選用分子截至量大一點(diǎn)的半透膜，以保證游離的蛋白質(zhì)能夠自由透過，如僅需要研究其中的小分子物質(zhì)，則可以選擇分子截至量小一些的透析膜，只需要保證小分子物質(zhì)可以自由透過透析膜就行了，該透析膜能有效的保證中藥中與生物膜結(jié)合后的分子不能透過透析膜，而沒有結(jié)合的可以自由透過。
生物膜的制備。生物膜可以是模擬生物膜，所述的模擬生物膜是用指卵磷脂或卵磷脂與組成生物細(xì)胞膜的天然磷脂的混合物制備而成；也可以是來自于人體或動(dòng)物組織細(xì)胞的細(xì)胞膜，如內(nèi)皮細(xì)胞膜，紅細(xì)胞膜等。模擬的生物膜是目前研究的國外研究的熱點(diǎn)之一，因?yàn)樗c真的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，但是制作和保存比真的細(xì)胞膜要簡單，方便得多，因此在新藥研究的早期常常被拿來考察先導(dǎo)化合物與細(xì)胞膜相互作用的情況，以指導(dǎo)進(jìn)一步的活性篩選工作。脂質(zhì)體是一種比較簡便的模擬生物膜，生物膜的基本結(jié)構(gòu)是相同于脂質(zhì)體的脂雙層結(jié)構(gòu)，但是真正的生物膜還含有其它的物質(zhì)如膽固醇，蛋白質(zhì)等，那么越接近于真的生物膜的模擬生物膜，其制備也就越復(fù)雜。隨著模擬生物膜制備技術(shù)的不斷改進(jìn)，其與真的細(xì)胞膜的差別將會(huì)越來越小。目前還沒有商品化的生物膜，一般是根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自己制備。模擬生物膜的制備方法可參考文獻(xiàn)平其能等現(xiàn)代藥劑學(xué)第一版，中國醫(yī)藥科技出版社，597-606；細(xì)胞膜的制備可參考文獻(xiàn)徐叔云等，藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，人民衛(wèi)生出版社第二版522-527。
中藥的提取。所述的中藥包括單味中藥以及由數(shù)味中藥組成的復(fù)方。針對(duì)不同中藥所含有效成分的理化性質(zhì)，可以任選合適的溶媒進(jìn)行提取。但是，將與生物膜作用和透析膜接觸的提取液，必須是不會(huì)破壞生物膜和透析膜的。一般以水或低濃度的醇為宜，例如在30％以下的乙醇條件下，模擬生物膜有一定的穩(wěn)定性，高濃度的會(huì)破壞模擬生物膜的脂雙層結(jié)構(gòu)。也就是說，對(duì)待篩的中藥進(jìn)行提取時(shí)可以用任何溶劑。在提取液是水液或低濃度的醇液的情況下，可以直接將提取液與生物膜作用進(jìn)行透析。如果是用高濃度的醇或其它可能破壞生物膜結(jié)構(gòu)的有機(jī)溶劑、酸性或堿性溶劑提取中藥，對(duì)該提取液要進(jìn)行一定的處理，如采用濃縮去除全部或一定量的有機(jī)溶劑和/或用水稀釋的方法，或者在去除有機(jī)溶劑后加入少量的不破壞生物膜結(jié)構(gòu)的增容劑，如1％的吐溫等，或者進(jìn)行中和。原則上，其濃縮去除有機(jī)溶劑的程度和/或用水稀釋的量和/或加入增容劑的含量，以不破壞生物膜和半透膜結(jié)構(gòu)為適度，在實(shí)際操作中，這種適度通過簡單測(cè)試是容易掌握的。例如取少量待測(cè)提取液與生物膜接觸，觀察生物膜的變化，如有融溶現(xiàn)象則表明該提取液需要進(jìn)一步除去有機(jī)溶劑和/或用水稀釋。提取液中提取物的濃度只要達(dá)到可以檢測(cè)的限度就行，濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)效果并無顯著影響。
透析。將中藥提取液與生物膜混合后，按常規(guī)透析方法進(jìn)行透析，膜兩側(cè)平衡后進(jìn)行色譜分析。同時(shí)，用沒有與生物膜結(jié)合的中藥提取液作一平行的空白對(duì)照。可以用模擬生理?xiàng)l件下的不同的PH值的緩沖液進(jìn)行透析，在不同的PH條件下藥物與生物膜結(jié)合的情況是不同的，這可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來定，人體的不同部位的PH值也是不同的如胃中pH為酸性，腸中為堿性。4℃低溫透析時(shí)一般達(dá)到平衡需要24小時(shí)，而25℃室溫透析時(shí)達(dá)到平衡只需要12小時(shí)，隨著溫度的升高，達(dá)到平衡的時(shí)間將會(huì)縮短，但當(dāng)溫度太高時(shí)，中藥的提取液特別是水提液很容易變質(zhì)，因此需要調(diào)整適宜的溫度以保證節(jié)省時(shí)間和保證中藥成分的穩(wěn)定。一般以4℃平衡24小時(shí)為宜。
色譜檢測(cè)。用高效色譜法分別檢測(cè)中藥提取液透析過的液體和作為空白對(duì)照的提取液，比較、分析兩者圖譜的改變。其中峰面積顯著減少的峰即是與生物膜具有相互作用的化學(xué)成分，其峰面積的改變的相對(duì)百分比表明其與生物膜作用的強(qiáng)弱。如果測(cè)試樣品是整個(gè)中藥或復(fù)方的提取物，那么說得到的就是整個(gè)中藥中的成分與生物膜的相互作用情況，如果樣品是單一化合物或一類或幾類化合物，那么得到的就是單一化合物或一類或幾類化合物與生物膜的相互作用情況。至于單一化合物、一類化合物、幾類化合物、單味中藥提取物，復(fù)方中藥提取物他們之間與生物膜相互作用有何差異，也可以進(jìn)一步考察，如阿魏酸單體，當(dāng)歸提取液中的阿魏酸，當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液中的阿魏酸分別與生物膜作用有何差別，我們可以通過比較他們與生物膜作用后峰面積的改變的百分比是否一致來看出中藥中其它成分是否對(duì)它與生物膜的相互作用有影響。由于中藥中含有許多成分，由于高效液相具有很高的分離效能，中藥提取液通過高效液相會(huì)出現(xiàn)許多峰，一般而言，在一種洗脫條件下，一個(gè)峰就代表一個(gè)成分或者結(jié)構(gòu)相似的幾個(gè)成分。同時(shí)，如果在某種洗脫條件下不能分開的成分，可以換一種洗脫條件將之分開。通過本發(fā)明的篩選方法，就能快速、簡便地發(fā)現(xiàn)在全部的峰中，有的峰與生物膜有相互作用，有的沒有相互作用，有的相互作用強(qiáng)，有的相互作用弱。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是要從中藥中尋找與生物膜有相互作用的峰，因?yàn)榕c膜發(fā)生相互作用是藥物發(fā)揮作用的前提。對(duì)于與生物膜沒有相互作用的峰，就極有可能是無效成分。


圖1、是當(dāng)歸補(bǔ)血湯在280nm的檢測(cè)條件下在模擬生物膜柱上的分離圖譜，僅見5個(gè)峰在模擬生物膜色譜柱上有明顯的保留，并且峰很寬。
圖2、是當(dāng)歸補(bǔ)血湯與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有12個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，這些峰面積有改變的峰是與生物膜有相互作用的成分，其中第12號(hào)峰經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯。
圖3是當(dāng)歸與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜?？梢娪?個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。其中第6號(hào)峰經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯。
圖4是黃芪與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有8個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。
圖5是當(dāng)歸補(bǔ)血湯與內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)合后與空白對(duì)照比較圖譜，可見有7個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1篩選黃芪中的有效成分黃芪為一經(jīng)典的補(bǔ)氣中藥，研究表明，其中含有多糖，皂苷，生物堿，揮發(fā)油，黃酮等多種成分。如果將其中的成分一個(gè)個(gè)提取出來進(jìn)行活性成分的篩選，無疑是個(gè)非常復(fù)雜的過程，采用本發(fā)明篩選方法可以快速的從中尋找其與生物膜有相互作用的可能的活性成分。
黃芪的提取取粉碎的黃芪20g，加入90％的乙醇200ml浸泡1h，水浴回流提取1h，提取液在45度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入20ml pH為7.4的磷酸緩沖液充分溶解，4000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 模擬生物膜(脂質(zhì)體)的制備采用經(jīng)典的注射法(參見平其能等現(xiàn)代藥劑學(xué)第一版，中國醫(yī)藥科技出版社，597-606)，制備模擬生物膜(脂質(zhì)體)。脂質(zhì)體是一種比較簡便的模擬生物膜，生物膜的基本結(jié)構(gòu)是相同于脂質(zhì)體的脂雙層結(jié)構(gòu)。
稱取卵磷脂(華東師范大學(xué)化工廠)0.5g，用4ml無水乙醇溶解，將其裝入一個(gè)10ml的注射器中，另取一個(gè)小燒杯，內(nèi)裝10ml pH值為7.4的磷酸緩沖液，將其置入帶磁力攪拌的水浴鍋中，小燒杯內(nèi)放一攪拌子，將水浴鍋溫度調(diào)節(jié)至60度左右，開啟磁力攪拌，用鐵架臺(tái)固定注射器，使注射器中的卵磷脂溶液自由滴入小燒杯中，滴完后繼續(xù)攪拌至無醇味即得脂質(zhì)體溶液。
透析取長約7cm的分子截止量為12000的透析袋(北京華美生物工程有限公司)1個(gè)，將一端用細(xì)線扎緊。其中加入1ml上法制備的脂質(zhì)體溶液和1ml當(dāng)歸提取液；置入20度室溫下透析15h使袋內(nèi)外達(dá)到平衡，另取1個(gè)透析袋做平行空白對(duì)照，即用1ml磷酸緩沖液代替脂質(zhì)體，其余操作相同。取試管內(nèi)的溶液1ml，過濾后用高效液相進(jìn)行分析。
檢測(cè)條件C18色譜柱，Angilent系列高效液相色譜系統(tǒng)，DAD紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相甲醇水梯度洗脫。檢測(cè)波長280nm，標(biāo)記有阿拉伯?dāng)?shù)字的峰表示峰面積有改變的峰，即與模擬生物膜有結(jié)合的成分。
結(jié)果圖4是黃芪與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有8個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。
實(shí)施例2篩選當(dāng)歸的有效成分當(dāng)歸的提取取粉碎的當(dāng)歸5g，加入100ml水浸泡1h，100度油浴提取1h，提取液在50度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入5ml pH為7.0的醋酸緩沖液充分溶解，4000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 模擬生物膜(脂質(zhì)體)的制備稱取卵磷脂(華東師范大學(xué)化工廠)0.5g，用5ml無水乙醇溶解，將其裝入一個(gè)10ml的注射器中，另取一個(gè)小燒杯，內(nèi)裝10ml pH值為7.0醋酸緩沖液，將其置入帶磁力攪拌的水浴鍋中，小燒杯內(nèi)放一攪拌子，將水浴鍋溫度調(diào)節(jié)至60度左右，開啟磁力攪拌，用鐵架臺(tái)固定注射器，使注射器中的卵磷脂溶液自由滴入小燒杯中，滴完后繼續(xù)攪拌至無醇味即得脂質(zhì)體溶液。
透析取長約7cm的分子截止量為12000的透析袋(北京華美生物工程有限公司)1個(gè)，將一端用細(xì)線扎緊后加入1ml上法制備的脂質(zhì)體溶液和1ml當(dāng)歸提取液，然后將另一端用細(xì)線扎緊；放入4度的冰箱中透析24h使袋內(nèi)外達(dá)到平衡，另取1個(gè)透析袋做平行空白對(duì)照，即用1ml醋酸緩沖液代替脂質(zhì)體，其余操作相同。取試管內(nèi)的溶液1ml，過濾后用高效液相進(jìn)行分析。
檢測(cè)條件同例1結(jié)果圖3是當(dāng)歸與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有6個(gè)峰的峰面積有顯著的改變.，其中第6號(hào)峰經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯。
實(shí)施例3當(dāng)歸補(bǔ)血湯與模擬生物膜有相互作用的成分的篩選當(dāng)歸補(bǔ)血湯的提取取粉碎當(dāng)歸(市售)5g，黃芪(市售)25g，加入10倍量的75％乙醇浸泡1h，回流提取1h，提取液在50度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入30ml pH為7.0的磷酸緩沖液30ml充分溶解，4000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 模擬生物膜的制備稱取卵磷脂(華東師范大學(xué)化工廠)0.6g和膽固醇0.3g，用6ml無水乙醇溶解，將其裝入一個(gè)10ml的注射器中，另取一個(gè)小燒杯，內(nèi)裝10ml pH值為7.0磷酸緩沖液，將其置入帶磁力攪拌的水浴鍋中，小燒杯內(nèi)放一攪拌子，將水浴鍋溫度調(diào)節(jié)至60度左右，開啟磁力攪拌，用鐵架臺(tái)固定注射器，使注射器中的卵磷脂溶液自由滴入小燒杯中，滴完后繼續(xù)攪拌至無醇味即得脂質(zhì)體溶液。
透析取長約7cm的分子截止量為12000的透析袋(北京華美生物工程有限公司)1個(gè)，將一端用細(xì)線扎緊。加入1ml上法制備的脂質(zhì)體溶液和1ml當(dāng)歸補(bǔ)血湯；將另一端扎緊。放入一個(gè)裝有8ml的pH為7.0的磷酸緩沖液的試管中，放入4度的冰箱中透析24h使袋內(nèi)外達(dá)到平衡，另取1個(gè)透析袋做平行空白對(duì)照，即用1ml磷酸緩沖液代替脂質(zhì)體，其余操作相同。取試管內(nèi)的溶液1ml，過濾后用高效液相進(jìn)行分析。
檢測(cè)條件同實(shí)施例1結(jié)果圖2是當(dāng)歸與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有12個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，其中第12號(hào)峰經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯。實(shí)施例4
當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同提取工藝的提取液中與模擬生物膜有相互作用的成分的篩選①取粉碎當(dāng)歸5g，黃芪25g，加入10倍量的水浸泡1h，100度油浴提取1h，提取液在50度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入15ml pH為7.0的磷酸緩沖液充分溶解，4000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 模擬生物膜的制備同實(shí)施例3透析同實(shí)施例3檢測(cè)條件同實(shí)施例3結(jié)果峰的數(shù)目與實(shí)施例三的基本一致，但部分峰的峰面積有所減小，即用水提的含量有所減小。但實(shí)施例三圖譜中峰面積減小的峰同樣在此例中峰面積減小了。
②取粉碎當(dāng)歸(市售)5g，黃芪(市售)25g，加入10倍量的75％乙醇浸泡1h，回流提取1h，提取液在50度條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉溶劑，剩余部分加入30ml含0.5％吐溫的pH為7.0的磷酸緩沖液30ml充分溶解，4000rpm/min離心10min，普通濾紙過濾，置負(fù)20度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 模擬生物膜的制備同實(shí)施例3透析取長約7cm的分子截止量為12000的透析袋(北京華美生物工程有限公司)1個(gè)，將一端用細(xì)線扎緊。加入1ml上法制備的脂質(zhì)體溶液和1ml當(dāng)歸補(bǔ)血湯；將另一端扎緊，放入一個(gè)裝有8ml含0.5％吐溫的pH為7.0的磷酸緩沖液的試管中，放入4度的冰箱中透析24h使袋內(nèi)外達(dá)到平衡，另取1個(gè)透析袋做平行空白對(duì)照，即用1ml磷酸緩沖液代替脂質(zhì)體，其余操作相同。取試管內(nèi)的溶液1ml，過濾后用高效液相進(jìn)行分析。
檢測(cè)條件同實(shí)施例3結(jié)果峰的數(shù)目與實(shí)施例三的基本一致，但部分峰的峰面積有所增加，如實(shí)施例3中12號(hào)峰蒿本內(nèi)酯的峰面積顯著增加，即吐溫對(duì)某些成分具有增溶作用。但實(shí)施例三圖譜中峰面積減小的峰同樣在此例中峰面積減小了。
實(shí)施例5當(dāng)歸補(bǔ)血湯與內(nèi)皮膜具有相互作用的有效成分的篩選當(dāng)歸補(bǔ)血湯的提取同實(shí)施例3
內(nèi)皮細(xì)胞膜的制備取健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)術(shù)后12小時(shí)以內(nèi)的臍帶，立即浸泡在4度無菌臍帶采集液中。按Jaffe法加以改良后進(jìn)行培養(yǎng)。用0.1％的膠原酶消化分離內(nèi)皮細(xì)胞，以2×104/ml細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，用含20％小牛血清的M199培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。傳代至細(xì)胞生長穩(wěn)定后，轉(zhuǎn)入4個(gè)500ml的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，合并4瓶細(xì)胞，參照文獻(xiàn)制備內(nèi)皮細(xì)胞膜徐叔云等，藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，人民衛(wèi)生出版社第二版524-525。
透析取長約7cm的分子截止量為12000的透析袋(北京華美生物工程有限公司)1個(gè)，將一端用細(xì)線扎緊。加入1ml上法制備的內(nèi)皮細(xì)胞膜溶液和1ml當(dāng)歸補(bǔ)血湯；將另一端扎緊。放入一個(gè)裝有8ml的pH為7.0的磷酸緩沖液的試管中，放入4度的冰箱中透析24h使袋內(nèi)外達(dá)到平衡，另取1個(gè)透析袋做平行空白對(duì)照，即用1ml磷酸緩沖液代替內(nèi)皮細(xì)胞膜溶液，其余操作相同。取試管內(nèi)的溶液1ml，過濾后用高效液相進(jìn)行分析。
檢測(cè)條件C18色譜柱，Angilent系列高效液相色譜系統(tǒng)，DAD紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相甲醇水梯度洗脫。檢測(cè)波長313nm，標(biāo)記有阿拉伯?dāng)?shù)字的峰表示峰面積有改變的峰，即與內(nèi)皮細(xì)胞膜有結(jié)合的成分。
結(jié)果圖5是當(dāng)歸補(bǔ)血湯與內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有7個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。
篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析(參見圖1-5)圖1是當(dāng)歸補(bǔ)血湯在280nm的檢測(cè)條件下在模擬生物膜柱上的分離圖譜，僅見5個(gè)峰在模擬生物膜色譜柱上有明顯的保留，并且峰很寬。圖2是當(dāng)歸補(bǔ)血湯與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有12個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，這些峰面積有改變的峰是與生物膜有相互作用的成分，其中第12號(hào)峰經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為有效成分藁本內(nèi)酯。圖3是當(dāng)歸與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有6個(gè)峰的峰面積有顯著的改變，其中第6號(hào)峰經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可以確定為藁本內(nèi)酯。圖4是黃芪與模擬生物膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有8個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。圖5是當(dāng)歸補(bǔ)血湯與內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)合后透析與空白對(duì)照比較圖譜，可見有7個(gè)峰的峰面積有顯著的改變。藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸揮發(fā)油中的主要成分，約占當(dāng)歸揮發(fā)油的45％，當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)子宮具有雙向調(diào)節(jié)作用。
權(quán)利要求
1.一種中藥有效成分檢測(cè)方法，包括如下步驟取待測(cè)中藥，用溶劑提取后，制成中藥提取液備用；將中藥提取液與生物膜加入到透析袋中透析；用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液透析過的液體。
2.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于待測(cè)中藥是單味中藥或中藥復(fù)方；提取中藥的溶劑可以是水和/或有機(jī)溶劑；對(duì)含有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑含量高的提取液，濃縮去除全部或一定量的有機(jī)溶劑和/或用水稀釋后，制成中藥提取液備用。
3.權(quán)利要求2的檢測(cè)方法，其特征在于提取中藥的溶劑選自水、C1-C5的低級(jí)醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它們的混合物；中藥提取液中加入增溶劑。
4.權(quán)利要求3的檢測(cè)方法，其特征在于C1-C5的低級(jí)醇是甲醇，乙醇、正丁醇；提取中藥的溶劑是中性、酸性或堿性；選用無機(jī)酸、無機(jī)堿、有機(jī)酸或有機(jī)堿中和酸性或堿性的中藥提取液；增溶劑選自吐溫、二甲基亞砜、聚乙二醇、曲拉通或它們的混合物；按中藥提取液的體積加入0.1-5％體積的增溶劑。
5.權(quán)利要求4的檢測(cè)方法，其特征在于中藥提取液是用水或含1-30％乙醇提取制備的中藥提取液。
6.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于生物膜為模擬生物膜、人體或動(dòng)物組織細(xì)胞的細(xì)胞膜。
7.權(quán)利要求6的檢測(cè)方法，其特征在于模擬生物膜是用卵磷脂或卵磷脂與天然磷脂的混合物制備而成；細(xì)胞膜包括內(nèi)皮細(xì)胞膜，紅細(xì)胞膜，心肌細(xì)胞膜，平滑肌細(xì)胞膜。
8.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于將裝有中藥提取液與生物膜的透析袋置于模擬生理?xiàng)l件下的緩沖液中透析，同時(shí)將不含生物膜的中藥提取液作為空白對(duì)照，裝入透析袋中透析，透析時(shí)溫度與時(shí)間成反比，溫度越低，膜兩側(cè)達(dá)到平衡所需要的時(shí)間越長，待膜兩側(cè)平衡后，分別用高效色譜法檢測(cè)透析過的液體，比較兩者指紋圖譜，峰面積改變的峰，即是與生物膜有相互作用的成分。
9.權(quán)利要求8的檢測(cè)方法，其特征在于生物膜是脂質(zhì)體；透析用的模擬生理?xiàng)l件的緩沖液是pH2.0-7.4的磷酸鹽或pH2.0-7.4的醋酸鹽緩沖液；透析溫度為4-25℃時(shí)，透析時(shí)間為12-24小時(shí)。
10.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于用高效色譜法檢測(cè)中藥提取液透析過的液體后，與液相-質(zhì)譜和/或核磁共振聯(lián)用，獲得與膜有相互作用成分的結(jié)構(gòu)信息。
全文摘要
一種利用生物膜與中藥中有效成分的相互作用測(cè)出中藥有效成分的方法，包括將中藥提取液與生物膜加入到透析袋中透析，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照，用高效色譜法分別檢測(cè)中藥提取液透析過的液體與空白對(duì)照液透析過的液體，比較兩者指紋圖譜的改變，峰面積改變的峰，即是與生物膜有相互作用的成分，運(yùn)用LC－MS，NMR等技術(shù)，獲得與膜有相互作用成分的結(jié)構(gòu)信息，該方法快捷，準(zhǔn)確，相對(duì)簡單，成本較低，從中藥中篩選有效成分的效率顯著提高，并且可以作為中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充手段。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1595141SQ20041004102
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日
發(fā)明者李萍, 盛亮洪, 李睿巖, 李松林, 齊煉文 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)