專利名稱：生化分析裝置的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及利用標記物質(zhì)檢出受體或配體的生化分析裝置。
噪音技術(shù)目前在臨床檢查等的領域中要進行各種檢測物的分析，為了在短時間內(nèi)正確地進行分析這些檢測物，開發(fā)了在各種分析試劑盒、分析儀器中使用的分析用具。例如特許第3298836號公報記載了在多孔質(zhì)檢測物導入部的平均孔徑比分析部的平均孔徑大的檢測物分析用具，由于其多孔質(zhì)檢測物導入部的平均孔徑大，分析部的平均孔徑小，可進行檢測物成份的分離并且可以在短時間內(nèi)處理檢測物。
另外在基因表達解析等的分子生物學領域，在膜上設制多個含有DNA等生物高分子的點(dot)而形成的宏陣列是公知的。因為這種宏陣列能夠在一片膜上一次分析多個不同種類的樣品，在分子生物學和醫(yī)療領域有很多應用，例如將各種DNA片斷(探針)以點配制在陣列上，在該陣列上加入由mRNA等制備的靶進行雜交等，就可能一次分析多個基因的行為。
目前的宏陣列是由硝酸纖維素等的有機高分子膜構(gòu)成的，因為非常柔軟，操作時出現(xiàn)障礙容易發(fā)生彎曲，目前已經(jīng)開發(fā)了在膜狀硬質(zhì)多孔體中配制多個含有被檢物質(zhì)點的宏陣列(特開2001-83164號公報)。
另一方面，已經(jīng)開發(fā)了以下系統(tǒng)(特開2002-355036號公報)在微陣列解析系統(tǒng)或宏陣列解析系統(tǒng)中，在膜過濾器等的生化分析裝置的表面的不同位置上，滴上可與激素類，腫瘤標記物，酶，抗體，抗原，抗體催化劑，其它的蛋白質(zhì)，核酸，cDNA，DNA，RNA等以及來自生體的物質(zhì)進行特異結(jié)合且含有堿基序列或堿基的長度、組成、特性等已知的配體或受體的溶液，形成多個吸附性區(qū)域，由于和放射性標記物質(zhì)、熒光物質(zhì)、化學發(fā)光基質(zhì)接觸產(chǎn)生化學發(fā)光的標記物質(zhì)標記的受體或配體(根據(jù)激素類，腫瘤標記物，酶，抗體，抗原，抗體催化劑，其它的蛋白質(zhì)，核酸，DNA，mRNA等從生物中提取、分離等得到的，或者取樣后進行了化學處理的物質(zhì))，與吸附性區(qū)域中所含的配體或受體雜交而特異性的與配體或受體結(jié)合，根據(jù)在多個吸附性區(qū)域選擇性含有的放射性標記物質(zhì)，將蓄積性熒光體片材的輝光性熒光體層曝光，激發(fā)曝光的輝光性熒光體層(PSL photositmulated luminescence)，進行掃描，激發(fā)含有在輝光性熒光體層中的輝光性熒光體，將從輝光性熒光體層中放出的輝光進行光電檢出，生成化學解析用數(shù)據(jù)，或者對多個吸附性區(qū)域的激發(fā)光進行掃描，激發(fā)選擇性包含在多個吸附性區(qū)域中的熒光物質(zhì)，將從熒光物質(zhì)放出的熒光進行光電檢出，生成生物化學解析用數(shù)據(jù)；或者將選擇性包含在多個吸附性區(qū)域的標記物質(zhì)和化學發(fā)光物質(zhì)接觸，光電檢出從標記物質(zhì)放出的化學發(fā)光，生成生物化學解析數(shù)據(jù)的系統(tǒng)。
這種系統(tǒng)中，在生化分析裝置上形成多個結(jié)合了配體或受體的高密度吸附性區(qū)域，與由標記物質(zhì)標記的受體或配體雜交，具有在短時間內(nèi)可以分析受體或配體的優(yōu)點。
但是，上述生化分析裝置的吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體被結(jié)合并固定在全部吸附性區(qū)域，存在與固定于離檢測面遠的吸附性區(qū)域中的配體或受體結(jié)合的受體或配體的信號衰減的問題。在上述微陣列或宏陣列系統(tǒng)中，要求能夠更正確地分析受體或配體，信號衰減成為防礙生成正確的生物化學分析數(shù)據(jù)的原因之一。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述問題，本發(fā)明的目的是提供能夠抑制來自受體或配體的信號衰減的生化分析裝置。
另外，特開2001-83164號公報中記載了膜狀硬質(zhì)多孔體由有平均孔徑相對小的貫通孔的表層部和有平均孔徑相對大的貫通孔的基層部構(gòu)成。膜狀硬質(zhì)多孔體與本發(fā)明的在有多個孔的基板上的孔內(nèi)填充吸附性材料構(gòu)成的生化分析裝置是明顯不同的，而且由于膜狀硬質(zhì)多孔體由有平均孔徑相對小的貫通孔的表層部和有平均孔徑相對大的貫通孔的基層部構(gòu)成，是為了在滴下含有探針的溶液時，能夠使溶液更快地浸透，在這一點上與本發(fā)明不同。
本發(fā)明的生化分析裝置是由有多個孔的基板，和在所述多個孔內(nèi)填充形成吸附性區(qū)域的多孔性的吸附性材料構(gòu)成，其特征是上述吸附性區(qū)域具備有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層。
上述孔徑是指某一孔的最長孔徑和最短孔徑的平均值。相對小的孔的層和相對大的孔的層的平均孔徑的差，由于其相對小的孔的層和相對大的孔的層各層的厚度不同，不能一概而言，當相對大的孔的層的平均孔徑為1時，相對小的孔的層的平均孔徑優(yōu)選0.7以下，更優(yōu)選0.5以下，最優(yōu)選0.4以下。
對于在上述基板的一面連續(xù)有形成上述吸附性區(qū)域的上述層的情況，優(yōu)選設置吸收從通過上述基板的下層的孔傳向該孔鄰近的孔信號的信號吸收層。
本發(fā)明的生化分析裝置由有多個孔的基板，和在上述多個孔內(nèi)填充形成吸附性區(qū)域的吸附性材料構(gòu)成，其特征是上述吸附性區(qū)域具備由能與該吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體結(jié)合的官能基相對多的材料構(gòu)成的層，和由上述官能基相對少的材料構(gòu)成的層。
和吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體結(jié)合的官能基，雖然根據(jù)與吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體不同而有所不同，但是可以舉出例如羧基，氨基，通過紫外線照射能夠結(jié)合的酰胺基，通過皂化處理能夠形成酯鍵的基，以及基于硅烷偶合劑能夠結(jié)合的羥基等。
由官能基相對多的材料形成的層和由官能基相對少的材料形成的層含有的官能基量的差別，由于由官能基相對多的材料形成的層和由官能基相對少的材料形成的層各層的厚度、官能基的種類等的不同不能一概而言，當由官能基相對多的材料形成的層的官能基密度為1時，由官能基相對少的材料形成的層的官能基密度優(yōu)選0.7以下，更優(yōu)選0.5以下，最優(yōu)選0.4以下。
對于在上述基板的一面連續(xù)有形成上述吸附性區(qū)域的上述層的情況，選設置吸收從通過上述基板的下層的孔傳向該孔鄰近的孔信號的信號吸收層。
本發(fā)明的由有多個孔的基板，和上述多個孔內(nèi)填充形成吸附性區(qū)域的吸附性材料構(gòu)成的生化分析裝置，因為上述吸附性區(qū)域具備有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層，有平均孔徑相對小的孔的層，比表面積大，可使配體或受體固定化；而有平均孔徑相對大的孔的層能夠使反應液在全部生化分析裝置中均勻分配，同時能夠提高吸附性材料的自身保持性，即有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層能夠各自分擔吸附性區(qū)域的功能。
因為被固定化的配體或受體集中在平均孔徑相對小的孔的層，利用來自標記物質(zhì)的信號檢出與固定化的配體或受體特異結(jié)合的受體或配體時，若從平均孔徑相對小的孔的層一側(cè)檢出時，來自受體或配體的信號不會衰減，可以檢出。
而且本發(fā)明的由有多個孔的基板和在多個孔內(nèi)填充吸附性材料形成吸附性區(qū)域的生化分析裝置中，因為上述吸附性區(qū)域具備由和在該吸附性區(qū)域被結(jié)合的配體或受體結(jié)合的官能基相對多的材料構(gòu)成的層，和由上述官能基相對少的材料構(gòu)成的層，因此，官能基相對多的材料構(gòu)成的層中配體或受體被固定化，而對于官能基相對少的材料構(gòu)成的層，反應液在生化分析裝置中全部被均勻分配，能夠提高吸附性材料自身的保持性，同時由于受體或配體的靜電相互作用或極性相互作用，能夠防止非特異的吸附，即官能基相對多的材料層和官能基相對少的材料層能夠各自分擔吸附性區(qū)域的功能。
因為固定化的配體或受體集中在官能基相對多的材料層，利用來自標記物質(zhì)的信號檢出與固定化的配體或受體特異結(jié)合的受體或配體時，若從官能基相對多的材料層一側(cè)檢出時，受體或配體的信號不會衰減，可以檢出。
另外，對于基板下形成吸附性區(qū)域的層連續(xù)的情況下，通過設置吸收從通過基板下的層的某一孔傳向鄰近的孔信號的信號吸收層，因為某一孔檢出的受體或配體的信號傳導到基板下連續(xù)著的形成吸附性區(qū)域的層，可以抑制所述信號傳向其鄰近孔傳播的效果，由此可僅僅檢出本來所要檢出的受體或配體的信號，從而能夠正確地檢出來自各個孔的信號。


圖1是本發(fā)明生化分析裝置的示意立體圖；
圖2是本發(fā)明生化分析裝置的示意剖面圖；圖3是制造本發(fā)明生化分析裝置的實施方式示意圖；圖4是制造本發(fā)明生化分析裝置的另一實施方式示意圖；圖5是使反應液強制流動的反應器的一實施方式的示意剖面圖。
圖中1生化分析裝置；2基板；3孔；4吸附性區(qū)域；4a有平均孔徑相對小的孔的層；4b有平均孔徑相對大的孔的層；5信號吸收層具體實施方式
以下參照

本發(fā)明的實施方式，圖1是本發(fā)明生化分析裝置的示意立體圖，圖1所示的生化分析裝置1由設置多個孔3的基板2和孔3內(nèi)填充的構(gòu)成與基板2連接的吸附性區(qū)域4的多孔性材料構(gòu)成。
圖2是本發(fā)明生化分析裝置的示意剖面圖，如圖2所示的吸附性區(qū)域4由有平均孔徑相對小的孔的層4a和有平均孔徑相對大的孔的層4b構(gòu)成，在有平均孔徑相對大的孔的層4b的下層，設置吸收從通過基板2下側(cè)部6的孔3a傳向鄰近的孔3b信號的信號的吸收層5，在基板2的下側(cè)部6，形成吸附性區(qū)域的層4a及層4b連續(xù)，是通過基板2壓縮層4a及層4b和信號吸收層5的部分。
固定在吸附性區(qū)域的配體或受體集中結(jié)合在平均孔徑相對小的層4a，幾乎不與平均孔徑相對大的層4b結(jié)合，因此使用該生化分析裝置利用標記物質(zhì)檢出受體或配體時，受體或配體集中在平均孔徑相對小的層4a中，因此若從4a側(cè)檢出信號，受體或配體的信號不被衰減而能夠檢出。
另外，在基板2的下側(cè)部6形成吸附性區(qū)域的層4a和層4b連續(xù)的生化分析裝置中，雖然從孔3a向鄰近的孔3b傳播信號，但因為配體或受體集中結(jié)合在平均孔徑相對小的層4a，因此與配體或受體全部分散結(jié)合在吸附性區(qū)域的情況比較，能夠抑制在孔之間傳播的信號量，而且由于設置信號吸收層5，能夠有效地吸收從孔3a向孔3b傳播信號，能夠使鄰近孔彼此相互傳播的信號影響最小。
圖2雖然表示出有平均孔徑小的層4a和有平均孔徑大的層4b兩層組成吸附性區(qū)域，但是吸附性區(qū)域?qū)右膊幌薅閮蓪樱缈梢栽谟衅骄讖较鄬π〉目椎膶?a和有平均孔徑相對大的孔的層4b兩層之間加入該兩層平均孔徑中間的平均孔徑的層。
如圖2中所示，在基板的下側(cè)全部設置了相應的信號吸收層，或僅在4a層和4b層中間設置信號吸收層，或者如塞住孔3那樣僅設置在4b層的下部，而且也可以僅在層4a、層4b和信號吸收層5被壓縮的部分6上，或者其一部分上設置成吸收從某一孔傳向鄰近孔傳播的信號的狀態(tài)。
作為基板2的材質(zhì)，為了防止在生化分析裝置內(nèi)部的光散射，以及防止放射線或光透過，優(yōu)選使用衰減材料，可以使用金屬，陶瓷等。另外在使用開孔容易的塑料作為基板時，為了進一步衰減放射線或光，優(yōu)選在塑料內(nèi)部分散一些顆粒。
作為金屬優(yōu)選舉出銅，銀，金，鋅，鉛，鋁，鈦，錫，鉻，鐵，鎳，鈷，鉭，或者不銹鋼或黃銅等的合金；作為陶瓷，可以舉出氧化鋁，氧化鋯，氧化鎂，石英等；作為塑料優(yōu)選可以舉出聚乙烯或聚丙烯等的聚烯烴類，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯等的丙烯酸樹脂，聚氯乙烯，聚偏氯乙烯，聚氟亞乙烯，聚四氟乙烯，聚氯三氟乙烯，聚碳酸酯，聚萘二甲酸乙二酯或聚對苯二甲酸乙二酯等的聚酯，尼龍6或尼龍6，6等的脂肪族聚酰胺，聚酰亞胺，聚砜，聚亞苯基亞磺酸酯，聚二苯基硅氧烷等的硅樹脂，線性酚醛樹脂等的酚醛樹脂，環(huán)氧樹脂，聚氨酯，醋酸纖維素，或硝化纖維素等的纖維素類，丁二烯-苯乙烯共聚物等的共聚物，以及塑料混合物等等。
而且向在吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體特異地結(jié)合受體或配體，利用標記物質(zhì)檢出受體或配體時，為了能夠抑制從標記物質(zhì)發(fā)出的放射線或光，從基板的孔透過基板壁，為了使放射線或光等衰減，優(yōu)選在塑料中填充金屬氧化物顆?；虿ＡЮw維等。作為金屬氧化物顆粒可以舉出二氧化硅，氧化鋁，二氧化鈦，氧化鐵，氧化銅等，但是沒有必要限定。
作為放射線或光衰減的狀態(tài)，從標記物質(zhì)發(fā)出的放射線或光從基板的孔透過基板壁，達到鄰近的孔時的強度優(yōu)選變?yōu)?/5以下，更優(yōu)選變?yōu)?/10以下。
為了有效地遮蔽來自放射性標記物質(zhì)的電子線等的放射線，基板的平均密度一般為0.6g/cm3以上，優(yōu)選1-20g/cm3，更優(yōu)選2-10g/cm3的范圍。因為電子線的透過距離和密度成反比，若放射性物質(zhì)是32P，33P，35S，14C等的一般放射性同位素(RI)，通過使基板2的平均密度在上述范圍內(nèi)，來自固定在各孔3中的樣品的RI的電子線能夠被基板2的隔壁遮蔽，因此能夠防止基于電子線的透過、散射使放射線圖像分解能的降低。
基板2的厚度通常優(yōu)選為50-1000μm范圍，更優(yōu)選100-500μm范圍。
對于基板2上孔3的開口部的面積(大小)，為了提高孔3的密度，一般低于5mm2，優(yōu)選低于1mm2，更優(yōu)選低于0.3mm2，最優(yōu)選低于0.01mm2，而且優(yōu)選在0.001mm2以上。
孔3的間距(鄰近兩孔中心之間的距離)優(yōu)選0.05-3mm范圍，孔3的間隔(鄰近兩孔從端部到端部之間的距離)優(yōu)選0.01-1.5mm范圍，孔3的數(shù)量(密度)一般為10個/cm3，優(yōu)選100個/cm3，更優(yōu)選500個/cm3，最優(yōu)選1000個/cm3以上，而且優(yōu)選在100000個/cm3以下，最好在10000個/cm3以下。另外，孔3沒有必要如圖1那樣全部是等間隔的，劃分為幾個區(qū)間(單位)每個區(qū)間分別有不同數(shù)量的多個孔也是可以的。
作為在基板2上開多個孔3的方法，可以舉出用銷打孔的沖孔法，在電極上脈沖狀外加高電壓而使基板揮發(fā)的放電加工法，蝕刻法，激光照射方法等。當基板的材料是金屬材料或塑料時，在基板表面進行電暈放電或?qū)嵤┑入x子體放電，涂覆黏合劑后，將用于形成吸附性區(qū)域的吸附性材料用壓延的方法貼合來制造生化分析裝置。作為黏合劑，優(yōu)選使用苯乙烯-丁二烯橡膠，丙烯腈-丁二烯橡膠。作為涂覆黏合劑的方法，優(yōu)選舉出輥涂，金屬線涂覆，浸漬涂覆，葉片涂覆等的方法。在基板上壓延用于形成吸附性區(qū)域的吸附性材料時，可以將基板和形成吸附性區(qū)域的材料事先分割成片以后，間歇壓延?？梢詫⒒搴托纬晌叫詤^(qū)域的材料各自以長尺寸的帶狀在兩個輥筒之間連續(xù)傳送。
作為形成吸附性區(qū)域的多孔材料，優(yōu)選使用多孔質(zhì)材料或纖維材料，而且可以將多孔質(zhì)材料或纖維材料一起使用形成吸附性區(qū)域。本發(fā)明中為形成吸附性區(qū)域使用的多孔性材料，優(yōu)選使用任何有機材料或無機材料，也可以使用有機/無機材料的復合材料。
對于為形成吸附性區(qū)域使用的有機多孔質(zhì)材料，沒有特別的限制，優(yōu)選使用活性炭等的碳多孔質(zhì)材料或能夠形成膜過濾器的多孔質(zhì)材料。作為能夠形成膜過濾器的多孔質(zhì)材料，優(yōu)選使用在溶劑中可以溶解的聚合物。作為可以在溶劑中溶解的聚合物，可以使用纖維素衍生物(例如硝化纖維素，再生纖維素，纖維素乙酸酯，醋酸纖維素，酪酸醋酸纖維素等)，脂肪族聚酰胺類(例如尼龍6，尼龍66，尼龍410等)，聚烯烴類(例如聚乙烯，聚丙烯等)，含氯聚合物類(例如聚氯乙烯，聚偏氯乙烯等)，含氟樹脂類(例如聚氟亞乙烯，聚四氟化物等)，聚碳酸酯，聚砜，藻酸及其衍生物(例如藻酸，藻酸鈣，藻酸/聚賴氨酸多離子配合物等)及骨膠原等，也可以使用上述聚合物的共聚物或復合體。
作為形成吸附性區(qū)域的纖維材料，沒有特別的限制，優(yōu)選可以舉出上述的纖維素衍生物，脂肪族聚酰胺類等。
作為形成吸附性區(qū)域的無機多孔質(zhì)材料，沒有特別的限制，優(yōu)選可以舉出金屬(例如鉑，金，鐵，銀，鎳，鋁等)，金屬氧化物(例如氧化鋁，二氧化硅，氧化鈦，沸石)，金屬鹽(例如磷灰石，硫酸鈣等)及其復合體。
適當選擇上述形成吸附性區(qū)域的多孔性材料，形成有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層，或者形成能與在吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體結(jié)合的官能基相對多的材料構(gòu)成的層和官能基相對少的材料構(gòu)成的層。
另外，信號吸收層可以由上述多孔性材料中的吸收光或放射線等的物質(zhì)混合形成，對于信號是化學發(fā)光或熒光的場合，可以混合吸收所述光波長的色素等，對于信號是放射線的場合，可以混合作為放射線遮蔽物質(zhì)的鉛或鎢等的重金屬的顆粒來形成。
吸附性區(qū)域具備有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層，或者由可與吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體結(jié)合的官能基相對多的材料的層和所述官能基相對少的材料的層構(gòu)成，為此將含有不同種類的多孔質(zhì)材料的溶液(以下稱為原液)順次流延或涂布在支持體上后，在多孔性聚合物的不良溶劑，或良溶劑和不良溶劑的化合物中浸漬以后，水洗干燥；或者將不同種類的原液分別流延或涂布在支持體上，通過慢慢干燥用另外的方法制造。
圖3是制造本發(fā)明生化分析裝置的一個實施方式的略圖，圖3所示的生化分析裝置是將孔徑不同的兩層的多孔性膜21和基板2重合壓延，通過將多孔性膜21壓入基板2的孔3的方法制造。雖然壓延，孔3中壓入的部分的多孔性膜的孔的孔徑在壓入孔中時幾乎沒有變化。
如圖3(a)所示，形成孔3的基板2和多孔性膜21重合，在壓延輥22和支持輥23之間傳送壓延；如圖3(b)所示，將多孔性膜21壓入到基板2的孔3中。此時通過加熱壓延輥22和支持輥23的方法可以將多孔性膜21軟化。
另外本發(fā)明的生化分析裝置可以通過注入原液的方法制造，圖4是制造本發(fā)明生化分析裝置的另一種實施方式的略圖。在連續(xù)或間歇地傳送的基板2的上方，配置將原液31和33注入基板2的孔3中的分配器30和32。另外為了明確圖4中原液和層的形成的關系，繪制了相應的形成原液內(nèi)容物的層。分配器30向各孔間歇地注入原液31，分配器32繼續(xù)將原液31注入以后向各孔間歇注入原液33。注入原液31、33以后，提供一定風速的風控制基板12的溫度和濕度，慢慢揮發(fā)溶劑，能夠形成兩種不同種類的層。
本發(fā)明的生化分析裝置能夠廣泛用于利用標記物質(zhì)檢出受體或配體的鑒定方法，該方法中，在具有結(jié)合了配體或受體的多個多孔性吸附性區(qū)域的生化分析裝置中的配體或受體上，與添加了受體或配體的反應液中的受體或配體進行特異結(jié)合。
作為一個實施方式，本發(fā)明生化分析裝置，能夠廣泛用于檢出標記受體或標記配體的鑒定方法，在該方法中，在具有結(jié)合了配體或受體的多個多孔性吸附性區(qū)域的生化分析裝置中的配體或受體上，與添加了由標記物質(zhì)標記的標記受體或標記配體的反應液中的受體或配體進行特異結(jié)合。
標記受體或標記配體是和在多孔性吸附性區(qū)域中結(jié)合的配體或受體特異結(jié)合的激素類、腫瘤標記物、酶、抗體、抗原、抗體催化劑、其它蛋白質(zhì)、核酸、DNA、mRNA等的從生物中采集提取、分離的物質(zhì)，或者是采集后經(jīng)過化學處理的、由標記物質(zhì)標記的物質(zhì)。
作為標記物質(zhì)可以舉出放射線標記物質(zhì)，熒光標記物質(zhì)，通過使與化學發(fā)光基質(zhì)接觸而產(chǎn)生化學發(fā)光的標記物質(zhì)等，標記物質(zhì)自身可以是利用放射線，發(fā)光，發(fā)色或光照射會放出熒光的物質(zhì)，也可以是使標記物質(zhì)與任何化學物質(zhì)接觸，標記物質(zhì)使化學物質(zhì)分解或反應等而發(fā)光，發(fā)色或放出熒光的物質(zhì)。作為前者的標記物質(zhì)，可以使用放射線同位素，發(fā)光物質(zhì)中的吖啶鎓酯等，發(fā)色物質(zhì)中的金膠體粒子等，熒光物質(zhì)中的熒光素等；作為后者的標記物質(zhì)可以使用酶，例如優(yōu)選使用堿性磷酸酯酶，過氧化物酶，熒光素酶，β-半乳糖苷酶，在這些酶中，通過和化學發(fā)光物質(zhì)或色素基質(zhì)或熒光物質(zhì)接觸，能夠各自放出化學發(fā)光，發(fā)色或熒光。
作為化學發(fā)光基質(zhì)在是堿性磷酸酯酶，過氧化物酶，熒光素酶的場合，沒有特別的限制，可以使用雙環(huán)氧乙烷(dioxetane)，魯米諾，蟲熒光素；作為色素基質(zhì)，在酶是堿性磷酸酯酶的場合，可以使用對硝基苯酚磷酸，在酶是過氧化物酶的場合，可以使用4-氨基安替比林和陶粒達(トリンダ-)試劑的組合，二氨基聯(lián)苯胺，四甲基聯(lián)苯胺；在酶是β-半乳糖苷酶的場合，可以使用對硝基苯酚β-D-半乳糖苷等。作為熒光物質(zhì)，在酶是堿性磷酸酯酶的場合使用4-甲基umbelli(ウンベリ)苯基磷酸，在酶是過氧化物鎂的場合，可以使用3(4-羥基苯基)丙酸，在酶是β-半乳糖苷酶的場合，可以使用4-甲基umbelli(ウンベリ)苯基β-D-半乳糖苷。
作為其它實施方式，本發(fā)明生化分析裝置也能夠應用于檢出受體或配體的鑒定方法，該方法中，在具有結(jié)合了配體或受體的多個多孔性吸附性區(qū)域的生化分析裝置中的配體或受體上，與添加了受體或配體的反應液進行特異結(jié)合、受體或配體與由標記物質(zhì)標記的標記體特異結(jié)合。
這也適合用于將檢出的受體或配體夾入到吸附性區(qū)域的配體或受體和標記體之間，即所謂稱為夾層法的方法。此處所述的受體或配體是與多孔性吸附性區(qū)域中結(jié)合的配體或受體特異結(jié)合的激素，腫瘤標記物，酶，抗體，抗原，抗體催化劑，其它蛋白質(zhì)，核酸，DNA，mRNA等的從生物中采集提取、分離的物質(zhì)，或者是采集后經(jīng)過化學處理的物質(zhì)。
所謂標記物質(zhì)標記的標記體是上述標記物質(zhì)標記的、能與受體或配體的反應部位特異結(jié)合的抗原，抗體，激素，腫瘤標記物，抗體催化劑，其它的蛋白質(zhì)，核酸、cDNA，DNA，RNA等，其特性，組成，結(jié)構(gòu)或堿基序列或堿基的長度等是公知的。
另一種形式的本發(fā)明生化分析裝置，能夠用于檢出輔助物質(zhì)結(jié)合受體或輔助物質(zhì)結(jié)合配體的鑒定方法，該方法中，在具有結(jié)合了配體或受體的多個多孔性吸附性區(qū)域的生化分析裝置中的配體或受體上，與添加了結(jié)合輔助物質(zhì)的輔助物質(zhì)結(jié)合受體或輔助物質(zhì)結(jié)合配體的反應液中的輔助物質(zhì)結(jié)合受體或輔助物質(zhì)結(jié)合配體進行特異結(jié)合，使可與輔助物質(zhì)特異結(jié)合的可結(jié)合標記物質(zhì)與輔助物質(zhì)結(jié)合受體或輔助物質(zhì)結(jié)合配體進行特異結(jié)合。
輔助物質(zhì)是可能結(jié)合標記物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)，可以優(yōu)選舉出異羥基異羥基毛地黃毒苷元，生物素，卵白素，熒光素等的抗原及其所述抗原的抗體。也可以是相對于生物素的卵白素那樣的生物學結(jié)合配體(partner)?？赡芙Y(jié)合的標記物質(zhì)是可能特異結(jié)合輔助物質(zhì)的上述標記物質(zhì)標記的物質(zhì)。
其次舉例說明利用本發(fā)明化學解析用裝置的生物化學解析的化學發(fā)光法。
對于利用本發(fā)明化學分析用裝置的化學發(fā)光法，首先是在有吸附性區(qū)域的生化分析裝置中的吸附性區(qū)域中結(jié)合配體或受體。生化分析裝置的吸附性區(qū)域，對于由有平均孔徑相對小的孔的層和有由平均孔徑相對大的孔的層構(gòu)成的場合，從平均孔徑相對小的孔的層側(cè)結(jié)合配體或受體。而且生化分析裝置的吸附性區(qū)域，對于由與配體或受體可能結(jié)合的官能基相對多的材料的層和所述官能基相對少的材料的層構(gòu)成的場合，從和配體或受體可能結(jié)合的官能基相對多的材料的層側(cè)結(jié)合配體或受體。將配體或受體滴加到吸附性區(qū)域后，通過紫外線照射等固定在吸附性區(qū)域。
因此從平均孔徑相對小的孔的層側(cè)或和從配體或受體可能結(jié)合的官能基相對多的材料的層側(cè)，通過結(jié)合配體或受體，配體或受體能夠在吸附性區(qū)域的平均孔徑相對小的孔的層或與配體或受體可能結(jié)合的官能基相對多的材料的層集中固定。
其次使在吸附性區(qū)域中結(jié)合的配體或受體特異結(jié)合標記受體或標記配體。在這種特異結(jié)合時，可以使用以橫切吸附性區(qū)域的方式使反應液強制流動的反應器，圖5是能夠使反應液強制流動的反應器的實施方式的示意剖面圖。
所述反應器由反應容器41、和溶液循環(huán)管42及泵43組成。反應器41內(nèi)放置生化分析裝置40，同時有防止液漏的具有封閉功能的生化分析裝置保持部44，反應器本體45由反應器上半部46和反應器下半部47組成，反應器上半部46可以從反應器本體45拆卸下來，生化分析裝置40可以通過拆卸反應器上半部46而安裝，反應器下半部47的底壁設置可以流通溶液的溶液流入口48，在反應器46的上部頂壁同樣設置可以流通溶液的溶液流出口49，流入口48和流出口49及溶液循環(huán)管42可以分別拆卸和安裝。在反應器中通過泵43將溶液從流入口48泵入反應器本體45，通過生化分析裝置40以后，從流出口49流出，通過溶液循環(huán)管線構(gòu)成循環(huán)。
在該反應器中安裝吸附性區(qū)域中結(jié)合配體或受體的生化分析裝置40，在反應器41內(nèi)加入添加了標記受體或標記配體的反應液，泵驅(qū)動反應液強制橫切吸附性區(qū)域流動，使標記受體或標記配體與在吸附性區(qū)域中結(jié)合的配體或受體能夠特異結(jié)合，配體或受體集中在生化分析裝置的吸附性區(qū)域一方的層側(cè)，可以使強制性流動的反應液向任何方向流動。
另外，對于圖5所示的反應器，泵驅(qū)動反應液向一個方向強制流動，例如使用壓油器和活塞代替泵可以使反應液在反應器內(nèi)往復流動，而且反應液僅僅從生化分析裝置的下部向上部(或者從上部向下部)通過，也可以使用反應液不循環(huán)類型的反應器。
雖然以使用能夠使反應液橫切吸附性區(qū)域強制流動的反應器進行特異結(jié)合作為示例進行了說明，但是本發(fā)明生化分析裝置的使用不受此限制，將生化分析裝置和反應液加入到雜交袋中，使雜交袋振動，同時使標記受體或標記配體對流或擴散移動進行特異結(jié)合，即所謂的以振蕩方式進行。
但是對于生化分析裝置的吸附性區(qū)域，在將由有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層構(gòu)成的生化分析裝置，安裝在如上述那樣能夠使反應液橫切吸附性區(qū)域強制流動的反應器中進行反應，則在平均孔徑相對大的孔的層，反應液的壓力抵抗可能小，因此反應液的流動速度高，有希望提高反應效率。
在生化分析裝置的吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體，因為集中在生化分析裝置的吸附性區(qū)域的一面的層中，與在吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體特異結(jié)合的標記受體或標記配體，也在生化分析裝置的吸附性區(qū)域的一面的層集中結(jié)合。
對于安裝在反應容器中的生化分析裝置，為了除去與在多孔性吸附性區(qū)域被結(jié)合的配體或受體未特異結(jié)合的標記受體或標記配體，優(yōu)選將所謂的清洗液強制流過吸附性區(qū)域進行清洗。因為清洗液強制流過吸附性區(qū)域，能夠?qū)⑴c在多孔性吸附性區(qū)域被結(jié)合的配體或受體未特異結(jié)合的標記受體或標記配體有效地洗脫除去，能夠大大提高清洗效率。
對于上述清洗過程，也優(yōu)選以橫切吸附性區(qū)域的方式使下述的酶標記抗體強制流動并與標記受體或標記配體特異結(jié)合后，除去未特異結(jié)合的酶標記抗體。因此將未能與標記受體或標記配體特異結(jié)合的酶標記抗體有效地剝離除去，能夠大大提高清洗效率。
在吸附性區(qū)域所結(jié)合的配體或受體上特異結(jié)合的標記受體或標記配體與酶標記抗體結(jié)合之前，優(yōu)選以橫切吸附性區(qū)域的方式使針對酶標記抗體的封閉緩沖劑強制流動，封閉吸附性區(qū)域。通過封閉可以防止酶標記抗體不和標記受體或標記配體的抗原結(jié)合而直接結(jié)合在吸附性區(qū)域。
然后，以橫切吸附性區(qū)域的方式使酶標記抗體強制流動，與標記受體或標記配體特異結(jié)合。酶標記抗體是用酶標記針對標記受體或標記配體的抗體的標記物質(zhì)(在標記受體或標記配體是抗體時為抗原)。
酶標抗體與標記受體或標記配體特異結(jié)合后，在吸附性區(qū)域使清洗液強制流動，除去未與標記受體或標記抗體特異結(jié)合的酶標抗體。然后將化學發(fā)光基質(zhì)送入吸附性區(qū)域，使與標記受體或標記抗體特異結(jié)合的酶標抗體接觸。
通過化學發(fā)光基質(zhì)和酶的接觸，從各吸附性區(qū)域發(fā)生可見光波長區(qū)的化學發(fā)光，因此將其從生化學解析用單元的吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體集中的一側(cè)用光電檢出，可以得到生物化學分析用圖象的數(shù)據(jù)。由于標記物質(zhì)的信號不衰減，可以檢出測定標記受體或標記配體。
以下使用實施例具體說明本發(fā)明。
實施例實施例1在尺寸50mm×50mm，厚100μm的SUS304片材(基板材料片材)上，開孔徑0.3mm的圓形微孔，通過蝕刻形成間距0.45mm的2500個孔。
然后，使用ALDRICH社制的聚合度不同的尼龍66(以下稱為低聚合度和高聚合度尼龍66)作為填充材料填充吸附性區(qū)域，準備高聚合度尼龍66和低聚合度尼龍66各10g溶解在甲酸52g中的兩種溶液，溶解高聚合度尼龍66得到溶液黏度是6.25Pa·s，溶解低聚合度尼龍66的溶液黏度是0.94Pa·s。在每85g上述兩種溶液的各中添加15g水，在清潔的玻璃板上首先將低聚合度的尼龍66按照潮濕厚度均勻流延，然后再將高聚合度尼龍66按照潮濕厚度均勻流延，低聚合度的尼龍66濕厚度是300μm，高聚合度尼龍66的濕厚度是100μm，合計濕厚度是400μm。
在甲酸和水的比例為45∶55的甲酸水溶液中浸漬，形成細孔后干燥，根據(jù)膜斷面的電子顯微鏡觀察，由低聚合度尼龍66溶液形成較大細孔(1μm)的層，由高聚合度尼龍66溶液形成較小細孔(0.4μm)的層(以下稱為細孔層)，重層結(jié)構(gòu)的膜厚度為180μm。
在上述基板的一面涂覆黏合劑，將進入基板孔內(nèi)部的黏合劑吸引除去以后，干燥，然后在涂覆了黏合劑的面上壓入貼合上述兩層結(jié)構(gòu)的吸附性區(qū)域結(jié)構(gòu)材料，壓入使用壓延機(壓片側(cè)的輥筒溫度是150℃，另一面的輥筒溫度是50℃)，壓力是100kPa/cm。
將熱變性的濃度25ng/μl的單鏈pBR328-DNA溶液(羅氏公司制造)從上述制造的生化分析裝置的吸附性區(qū)域的細孔層側(cè)每10nl滴下，之后用紫外線照射(254nm，33mJ/cm2)，固定單鏈pBR328-DNA。
將磷酸二氫鈉(無水)71g溶解在滅菌的純水800ml中，加入磷酸3-4ml調(diào)整pH達到7.2，加入無菌純水到1000ml，制成1M的磷酸緩沖液，向制成的磷酸緩沖液50ml和滅菌純水43ml中加入十二烷基硫酸鈉7g，一邊加熱一邊攪拌溶解，加入200μl的0.5MEDTA，調(diào)制雜交溶液。
將異羥基毛地黃毒苷元(DIG)標記的濃度為5ng/μl的pBR328-DNA溶液(羅氏公司制造)用TE緩沖液(ニツポンジ-ン社制造10mM Tris-HCl和1mMEDTA混合溶液)稀釋，將用DIG標記的pBR328-DNA溶液熱變性做成單鏈后，通過上述雜交溶液稀釋調(diào)制含有DIG標記pBR328-DNA的雜交反應液，使?jié)舛葹?0pg/ml。
將上述生化分析裝置放入雜交袋中，向袋內(nèi)加入雜交反應液10ml，于68℃振蕩18小時進行雜交反應，雜交反應后，向袋中加入清洗液，將生化分析裝置清洗。
將清洗緩沖液(羅氏公司制造)用滅菌純水稀釋到1/10濃度配制化學發(fā)光用清洗液，向放入袋內(nèi)的生化分析裝置提供清洗液，振蕩5分鐘，使用由滅菌純水稀釋到濃度1/10的馬來酸緩沖液(羅氏公司制造)將封閉緩沖液(羅氏公司制造)稀釋到1/10濃度后，用聚醚砜制造的過濾器(φ＝0.2μm)過濾作為封閉劑，棄去清洗液后將封閉劑加入袋中，振蕩1小時，進行封閉反應。
然后將反式-異羥基毛地黃毒苷元-AP-復合體(羅氏公司制造堿性磷酸酯酶標記的異羥基毛地黃毒苷元抗體)用聚偏氟乙烯制造的過濾器(φ＝0.2μm)離心過濾，使用上述封閉劑稀釋成濃度0.075U/ml，調(diào)制酶標記抗體溶液，向棄去封閉劑后的袋內(nèi)加入5ml，振蕩1小時進行抗原抗體反應。
抗原抗體反應完成后，向袋中加入上述化學發(fā)光用的清洗液，清洗生化分析裝置，取下生化分析裝置，使和含有作為化學發(fā)光基質(zhì)的CDP-star(CDP-star，備用，羅氏公司制造)溶液接觸，將從生化分析裝置的吸附性區(qū)域放出的化學發(fā)光從生化分析裝置的細孔層側(cè)使用冷卻CDD照相機(LAS1000富士膠片株式會社制造)進行光電檢出，得到數(shù)字信號。
實施例2除了生化分析裝置的吸附性區(qū)域形成為低聚合度的尼龍66溶液濕厚度是200μm，高聚合度尼龍66溶液的濕厚度是200μm，合計濕厚度是400μm以外，和實施例1同樣進行化學發(fā)光，得到數(shù)字信號。
實施例3除了生化分析裝置的吸附性區(qū)域形成為低聚合度的尼龍66溶液的濕厚度是100μm，高聚合度尼龍66溶液的濕厚度是300μm，合計濕厚度是400μm以外，和實施例1同樣進行化學發(fā)光，得到數(shù)字信號。
實施例4將DIG標記的濃度為5ng/μl的pBR328-DNA溶液用TE緩沖液稀釋，將用DIG標記的pBR328-DNA溶液熱變性后形成單鏈，用實施例1制作的雜交溶液稀釋到濃度1pg/ml，調(diào)制含有DIG標記pBR328-DNA的雜交反應液。
將在吸附性區(qū)域中固定了單鏈鏈pBR328-DNA的實施例2制作的生化分析裝置放入如圖5的反應器中，向反應器中加入雜交反應液4ml，驅(qū)動泵并于68℃雜交18小時，雜交反應后驅(qū)動泵清洗生化分析裝置的吸附性區(qū)域。
將實施例1配制的化學發(fā)光用清洗液加入放入了生化分析裝置的反應器內(nèi)，驅(qū)動泵工作5分鐘，將生化分析裝置中的吸附性區(qū)域置換為化學發(fā)光用清洗液，向棄去了清洗液后的反應器內(nèi)加入實施例1制作的封閉劑，驅(qū)動泵工作10分鐘，用封閉劑置換生化分析裝置的吸附性區(qū)域的所有部分后，停止泵，靜置50分鐘。
將5ml實施例1制作的酶標記抗體溶液加入到棄去了封閉劑后的反應器內(nèi)，驅(qū)動泵1分鐘，用酶標抗體溶液置換生化分析裝置的吸附性區(qū)域的所有部分后，停止泵，靜置1小時。
抗原抗體反應完成后，向反應容器中加入上述清洗緩沖液，驅(qū)動泵清洗生化分析裝置。然后通過泵驅(qū)動使作為化學發(fā)光基質(zhì)的CDP-star(CDP-star，備用羅氏公司制造)與生化分析裝置的吸附性區(qū)域接觸，將從生化分析裝置的吸附性區(qū)域放出的化學發(fā)光從細孔層側(cè)使用冷卻CDD照相機(LAS1000富士膠片株式會社制)進行光電檢出，得到數(shù)字信號。
比較例1除了將實施例1中所用的高聚合度尼龍66以與實施例1同樣的方式制成溶液，在清潔的玻璃板上流延至潮濕厚度400μm，由此構(gòu)成吸附性區(qū)域以外，和實施例1同樣制造生化分析裝置，和實施例1同樣進行化學發(fā)光，得到數(shù)字信號。
比較例2除了將實施例1中所用的低聚合度尼龍66以與實施例1同樣的方式制成溶液，在清潔的玻璃板上流延至潮濕厚度400μm，構(gòu)成吸附性區(qū)域以外，和實施例1同樣制造生化分析裝置，和實施例1同樣進行化學發(fā)光，得到數(shù)字信號。
比較例3使用比較例1制作的生化分析裝置，和實施例4一樣地使用圖5所示的反應器進行化學發(fā)光，得到數(shù)字信號。
對于實施例1-3和比較例1和2的生化分析裝置，將信號，噪音的發(fā)光量和S/N列于表1。
表1

從表1可以看出，和吸附性區(qū)域由相同大小的細孔構(gòu)成的比較例相比，對于吸附性區(qū)域由有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層構(gòu)成的本發(fā)明生化分析裝置，在任何場合下，其檢出的數(shù)字信號大、噪音小。對于實施例的生化分析裝置，在吸附性區(qū)域固定的pBR328-DNA(配體或受體)，集中在細孔層(具有平均孔徑相對小的孔的層)，因為特異結(jié)合的DIG標記pBR328-DNA(受體或配體)也集中在細孔層，將DIG標記pBR328-DNA中結(jié)合的堿性磷酸酯酶標記異羥基毛地黃毒苷元抗體接觸CPD-star而得到的化學發(fā)光，也在細孔層上集中，由于從細孔層側(cè)對此進行檢出，所以信號不衰減，可以得到好的檢出結(jié)果。
另外，與pBR328-DNA在整個吸附性區(qū)域分散結(jié)合的比較例的生化分析裝置相比，實施例1-3的生化分析裝置在基板下形成吸附性區(qū)域的層連續(xù)，從通過基板下的層的某孔向鄰近的孔傳播信號，但是由于吸附性區(qū)域固定的pBR328-DNA集中結(jié)合在細孔層，因此能夠抑制在該孔間傳播的信號量，減小其噪音。
對于實施例4和比較例3的生化分析裝置，將信號，噪音的發(fā)光量和S/N列于表2。
表2

對于實施例4和比較例3，同樣是使用圖5所示的反應器，使反應液強制橫切吸附性區(qū)域流動，進行化學發(fā)光，但此時，如表2所示，和吸附性區(qū)域由相同大小的細孔構(gòu)成的比較例相比，由有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層構(gòu)成的本發(fā)明生化分析裝置，其檢出的數(shù)字信號大，噪音小。
另外，在本實施例中，顯示了具有由有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層構(gòu)成的吸附性區(qū)域的生化分析裝置，但是由與在吸附性區(qū)域結(jié)合的配體或受體可能結(jié)合的官能基相對較多的材料構(gòu)成的層和官能基相對較少的材料構(gòu)成的層構(gòu)成的吸附性區(qū)域生化分析裝置，也可以得到同樣的效果。
權(quán)利要求
1.一種生化分析裝置，由有多個孔的基板和在所述多個孔內(nèi)填充形成吸附性區(qū)域的多孔性吸附性材料構(gòu)成，其特征是，上述吸附性區(qū)域具備有平均孔徑相對小的孔的層和有平均孔徑相對大的孔的層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生化分析裝置，其特征是，在上述基板的一面上，形成上述吸附性區(qū)域的上述層連續(xù)，并設置對從通過上述基板下的層的某孔傳向該孔鄰近的孔的信號進行吸收的信號吸收層。
3.一種生化分析裝置，由有多個孔的基板和在所述多個孔內(nèi)填充形成吸附性區(qū)域的多孔性吸附性材料構(gòu)成，其特征是，上述吸附性區(qū)域具備由與結(jié)合于該吸附性區(qū)域的配體或受體結(jié)合的官能基相對多的材料構(gòu)成的層和由上述官能基相對少的材料構(gòu)成的層。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生化分析裝置，其特征是，在上述基板的一面上，形成上述吸附性區(qū)域的上述層連續(xù)，并設置對從通過上述基板下的層的某孔傳向該孔鄰近的孔的信號進行吸收的信號吸收層。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生化分析裝置，能夠抑制來自受體或配體的信號衰減。該裝置由有多個孔(3)的基板(2)，在該多個孔(3)內(nèi)填充形成吸附性區(qū)域(4)的多孔性吸附性材料構(gòu)成，該生化分析裝置(1)的吸附性區(qū)域(4)具備有平均孔徑相對小的孔的層(4a)和有平均孔徑相對大的孔的層(4b)。
文檔編號G01N35/00GK1696703SQ20041005954
公開日2005年11月16日 申請日期2004年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月11日
發(fā)明者中嶌賢二, 嘉藤彰史 申請人:富士膠片株式會社