專利名稱：基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體涉及一種基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物的腸道不僅是一個(gè)重要的生理器官，也是一個(gè)包含許多微生物的復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)。腸道內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定的微生物群落有助于動(dòng)物增強(qiáng)抵抗外來有害細(xì)菌感染的能力，各種慢性與退行性疾病，如腸易激綜合癥、腸炎、風(fēng)濕和類風(fēng)濕病，以及強(qiáng)直性脊椎癥等均與腸道菌群的改變相關(guān)。一些藥物，尤其是一些中藥的作用常與腸道菌有密切的關(guān)系。目前已經(jīng)建立了一些研究腸道菌群變化的研究方法。一種常用的方法是用平板培養(yǎng)腸道菌并用生理生化的檢測(cè)方法來了解腸道菌群的變化，也是目前臨床上常用的檢測(cè)方法。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，一種技術(shù)是采用平板培養(yǎng)腸道菌并用生理生化指標(biāo)的檢測(cè)來了解腸道菌的組成及變化，雖然簡(jiǎn)單，但平板培養(yǎng)只適合于那些可被培養(yǎng)的微生物，大大少于腸道中實(shí)際存在的微生物的種類；而且生理生化反應(yīng)繁瑣且復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。另一種技術(shù)是基于16S rDNA的各種檢測(cè)手段的應(yīng)用。由于16S rDNA包含了相應(yīng)細(xì)菌種類的系統(tǒng)分類地位的信息，因此以16S rDNA為分析對(duì)象可以比較微生物群落的結(jié)構(gòu)組成。例如有人用通用引物對(duì)糞便腸道菌群總DNA進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，得到一系列rDNA序列信息來研究腸道菌的組成。又發(fā)現(xiàn)Suau A，Bonnet R，Sutren M，et al.Direct Analysis of GenesEncoding 16S rRNA from Complex Communities Reveals Many Novel MolecularSpecies within the Human Gut.Applied and Environmental Microbiology.1999，65(11)4799-4807(對(duì)人體腸道復(fù)雜微生物菌群的16S rRNA基因的直接分析發(fā)現(xiàn)了許多新的分子生物學(xué)種群。應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)。1999年，第65卷11期，4799-4807頁)。這種方法結(jié)果準(zhǔn)確，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，而且在一定程度上依賴于已建立的16S rDNA的文庫，對(duì)于要反映整個(gè)腸道菌群結(jié)構(gòu)變化來說并不是十分方便，不能做到較快地分析比較腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足和缺陷，提供一種基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法。使其可以不依靠平板培養(yǎng)以及16SrDNA的方法，快速、準(zhǔn)確地直接檢測(cè)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的變化，用腸桿菌基因間重復(fù)序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ERIC-PCR)技術(shù)，通過比較健康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、模型動(dòng)物和給藥治療后各階段的腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，即比較腸道菌群總基因組的ERIC-PCR圖譜，通過PCR產(chǎn)物電泳圖譜中條帶的變化來反映腸道菌群的變化，提供對(duì)藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的具體方法如下(1)建立與腸道菌群有關(guān)疾病的動(dòng)物脾虛證模型；(2)收集造模前后以及用藥治療后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便，并用DNA提取方法提取其中微生物的總基因組DNA；(3)用腸道菌基因間重復(fù)序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ERIC-PCR檢測(cè)；(4)對(duì)得到的造模前后、用藥治療后的ERIC指紋圖譜進(jìn)行比較，提供對(duì)藥物的篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)。
以下對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定塑造與腸道菌群有關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(小鼠、大鼠或其他)模型，收集新鮮的糞便樣品，用適合提取動(dòng)物糞便的總DNA提取方法提取DNA。
所述的提取DNA方法如下①將0.3～0.5g新鮮糞便樣品置于10ml離心管中，加入20倍體積(w/v)PBS液，充分均質(zhì)化后40g離心5min，取上清，沉淀中再加入等體積PBS液，40g離心5min，取上清，合并兩次上清以1000g離心5min，去上清。沉淀用5mlPBS洗滌，重懸后轉(zhuǎn)移入2ml離心管。
②將轉(zhuǎn)入上述2ml離心管的沉淀1400g離心8～10min，去上清，加入裂解液I(150mM NaCl；100mM EDTA·Na2；pH8.0)300～500μl及溶菌酶100μl，冰浴30min后加入300～500μl裂解液II(100mM NaCl；500mM Tris-HCl；pH8.0)及100μl SDS，冰浴5min后再加等體積飽和酚，10000g離心8min，取上清，在上清中加入1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，10000g離心8min。
③取上清再加入1/10體積3M醋酸鈉及兩倍體積無水乙醇，沉淀2h以上，10000g離心15min，干燥沉淀。沉淀用100μl去離子無菌水溶解，加入4～5μl10％RNase，消化30min，再加入500μl去離子無菌水后重復(fù)氯仿∶異戊醇抽提步驟一次。加入1/10體積3M醋酸鈉及兩倍體積乙醇沉淀2h以上，離心并干燥沉淀，加100μl去離子無菌水溶解。
所述的步驟(3)是指選用報(bào)道的ERIC序列引物，即ERIC 15′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC 25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，并確定ERIC-PCR反應(yīng)的循環(huán)程序，ERIC-PCR的反應(yīng)體系為25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mMdNTP 0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2單位；循環(huán)程序?yàn)?4℃5min預(yù)變性后進(jìn)行94℃50s、48℃1min、72℃4min的35個(gè)循環(huán)，72℃保持8min，完成后，用1.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，紫外燈下照相，獲得DNA指紋圖譜。
所述的步驟(4)是指比較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各狀態(tài)下圖譜中DNA條帶的變化，即腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，選出與疾病相關(guān)的條帶作為標(biāo)準(zhǔn)，作為篩選評(píng)價(jià)待試藥物的依據(jù)。
本發(fā)明將ERIC-PCR技術(shù)應(yīng)用到藥物、尤其是中藥的藥效篩選與評(píng)價(jià)方面，建立與腸道菌群有關(guān)的疾病的動(dòng)物模型，不經(jīng)培養(yǎng)直接提取健康、模型等各階段小鼠糞便樣品總DNA，其中DNA分子的種類及相對(duì)比例反映了糞便樣品中腸道菌群種類數(shù)量及種群之間的相對(duì)比例，獲得的是腸道菌群的總體信息。不同狀態(tài)下糞便樣品DNA分子組成及相對(duì)數(shù)量不同，ERIC序列在不同基因組DNA分布及拷貝均不相同，這種差異可以反映在ERIC-PCR獲得的指紋圖譜中。經(jīng)擴(kuò)增后得到的ERIC圖譜中的每一種條帶可以是來自若干不同微生物的基因組DNA片段組成，條帶的數(shù)目反映微生物類群的多少，每一條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的多少，由此可以得到糞便中腸道菌的結(jié)構(gòu)信息。分析各種狀態(tài)下樣品的ERIC指紋圖譜可以知道疾病以及治療藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道菌的影響。
本發(fā)明的突出特點(diǎn)是快速且能比較全面地反映腸道菌的變化從糞便中直接提取腸道菌的總DNA并用ERIC-PCR直接進(jìn)行擴(kuò)增，較大程度地檢測(cè)藥物對(duì)腸道菌群的影響。所涉及的ERIC-PCR應(yīng)用到藥物篩選，尤其是篩選與腸道菌有關(guān)疾病的中藥中具有簡(jiǎn)便、快速、有效、靈敏的特點(diǎn)，可以同時(shí)分析多個(gè)樣品并對(duì)各個(gè)階段的腸道菌動(dòng)態(tài)變化，得到各個(gè)個(gè)體的脾虛信息，在對(duì)腸道菌DNA指紋圖譜的變化進(jìn)行分析后，找到與疾病有關(guān)的DNA條帶來作為篩選評(píng)價(jià)的依據(jù)。為篩選與腸道菌有關(guān)疾病的中藥提供了新的方法。


圖1健康小鼠腸道菌總DNA的ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果其中，1--12不同組別健康小鼠糞便腸道菌總DNA擴(kuò)增結(jié)果；M100bpmarker；NC陰性對(duì)照。
圖2利血平造模后小鼠糞便細(xì)菌總DNA的ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果其中，1--12不同組別利血平造模后小鼠糞便腸道菌總DNA擴(kuò)增結(jié)果；M100bp marker；NC陰性對(duì)照。
圖3利血平造脾虛模型組小鼠治療愈后糞便腸道菌總DNA的ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果M100bp marker；NC陰性對(duì)照組；1，2四君子低劑量組3，4四君子中劑量組；5，6四君子高劑量組；7，8理中湯低劑量組；9，10理中湯中劑量組；11，12理中湯高劑量組。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合發(fā)明內(nèi)容和附圖提供實(shí)施例目前已證實(shí)脾虛證涉及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)包括消化、內(nèi)分泌、免疫、植物神經(jīng)等系統(tǒng)功能的紊亂和失調(diào)。對(duì)脾虛證研究的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)目前約有70余種，其中包括淋巴細(xì)胞內(nèi)蛋白酪激酶(PTK)活力變化，胃粘膜環(huán)磷酸酰苷(cAMP)，G細(xì)胞(分泌胃泌素)，D細(xì)胞(分泌生長(zhǎng)抑素)胃粘膜的鋅、銅、線粒體Zn、Cu含量等。總體可以分為脾主運(yùn)化、脾主肌肉、脾虛與血液流變學(xué)改變、脾虛與神經(jīng)、內(nèi)分泌、微量元素的改變等五方面，其中與消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的關(guān)系最為密切，即脾虛往往伴隨著胃腸功能的紊亂，患者往往有慢性腹瀉的癥狀，同時(shí)導(dǎo)致腸道正常菌群平衡受到破壞。
對(duì)于脾虛證的治療，中醫(yī)已有了很長(zhǎng)時(shí)間的探索，對(duì)各種類型的脾虛證有很多有效的治療方法，其中四君子湯和理中湯是應(yīng)用范圍最廣、效果最好的兩種復(fù)方中藥。四君子合劑處方源于宋代《太平惠民和劑局方》之四君子湯，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草(炙)等藥物組成，為中醫(yī)臨床治療“氣虛證”的代表方。理中湯來源于《傷寒論》，能溫中祛寒，健脾補(bǔ)氣，由黨參、干姜、甘草(炙)、白術(shù)等藥物組成?？梢灾纹⑽赶\(yùn)無力、腹?jié)M痞悶或腹痛瀉稀便、苔白膩濕潤(rùn)、脈沉無力等癥。
本實(shí)施例利用利血平塑造昆明種小鼠的脾虛證動(dòng)物模型，并用傳統(tǒng)的脾虛證治療藥物四君子湯及理中湯分為高中低三個(gè)劑量組對(duì)脾虛模型小鼠進(jìn)行治療，收集各階段的小鼠新鮮糞便，利用前面所述的方法提取糞便中腸道菌群的總DNA，用ERIC-PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到在不同狀態(tài)下的DNA指紋圖譜，比較分析圖譜上的DNA條帶的變化。具體步驟如下1.建立脾虛證小鼠模型。利用利血平塑造昆明種小鼠脾虛模型每日利血平0.3mg/kg腹腔注射，對(duì)照組每日腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)11天；治療利用傳統(tǒng)的治療脾虛藥物四君子湯及理中湯分為高中低三個(gè)劑量組分別對(duì)脾虛小鼠進(jìn)行治療。
2.收集造模前后及用藥治療前后小鼠的新鮮糞便，提取其中的微生物總DNA。
具體方法如下①將0.3新鮮糞便樣品置于10ml離心管中，加入6mlPBS液，充分均質(zhì)化后40g離心5min，取上清，沉淀中再加入等體積PBS液，40g離心5min，取上清，合并兩次上清以1000g離心5min，去上清，沉淀用5mlPBS洗滌，重懸后轉(zhuǎn)移入2ml離心管；②將轉(zhuǎn)入上述2ml離心管的沉淀1400g離心8～10min，去上清，加入裂解液I 300μl及溶菌酶100μl，冰浴30min后加入300μl裂解液II及100μl SDS，冰浴5min后再加等體積飽和酚，10000g離心8min，取上清，在上清中加入1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿∶異戊醇為24∶1，10000g離心8min；③取上清再加入50ml 3M醋酸鈉及兩倍體積無水乙醇，沉淀2h，10000g離心15min，干燥沉淀。沉淀用100μl去離子無菌水溶解，加入4μl 10％RNase，消化30min，再加入500μl去離子無菌水后重復(fù)氯仿∶異戊醇抽提步驟一次，加入50ml3M醋酸鈉及兩倍體積乙醇沉淀2h，離心并干燥沉淀，加100μl去離子無菌水溶解。
3.用ERIC-PCR對(duì)微生物基因組總DNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下ERIC-PCR的反應(yīng)體系為25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mM dNTP0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+ 2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2單位；循環(huán)程序?yàn)?4℃5min預(yù)變性后進(jìn)行94℃ 50s、48℃ 1min、72℃ 4min的35個(gè)循環(huán)，72℃保持8min4.對(duì)得到的造模前后、用藥治療后的ERIC指紋圖譜進(jìn)行比較，提供對(duì)藥物的篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)。
5.結(jié)果用所述方法對(duì)不同的健康小鼠個(gè)體糞便總DNA進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果(圖1)，2800bp、1500bp、900bp、600bp以及300bp的五條條帶分別存在于不同的健康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體中，表明這五個(gè)條帶可能來源于某些與健康相關(guān)的常態(tài)菌；對(duì)利血平造模后的脾虛小鼠不同個(gè)體糞便總DNA進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果(圖2)顯示，上述的五條條帶中，2800bp和600bp的條帶發(fā)生了消失，說明某些菌群已經(jīng)發(fā)生了變化。在用治療藥物對(duì)利血平組的脾虛小鼠進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)，消失的2800bp與600bp條帶基本恢復(fù)。以上說明兩種治療藥物對(duì)利血平造脾虛模型小鼠有明顯的治療作用，并且四君子湯治療組中劑量組的治療效果較好，而理中湯高劑量組的效果較好。
上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明了運(yùn)用本文所述的方法可以較好地對(duì)于與腸道菌群有關(guān)的藥物，尤其是脾虛治療中藥進(jìn)行篩選。
權(quán)利要求
1.一種基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法，其特征在于，具體如下(1)建立與腸道菌群有關(guān)疾病的動(dòng)物脾虛證模型；(2)收集造模前后以及用藥治療后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便，并用DNA提取方法提取其中微生物的總基因組DNA；(3)用腸道菌基因間重復(fù)序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ERIC-PCR檢測(cè)；(4)對(duì)得到的造模前后、用藥治療后的ERIC指紋圖譜進(jìn)行比較，提供對(duì)藥物的篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法，其特征是，所述的DNA提取方法，具體如下①將0.3～0.5g新鮮糞便樣品置于10ml離心管中，加入20倍體積(w/v)PBS液，充分均質(zhì)化后40g離心5min，取上清，沉淀中再加入等體積PBS液，40g離心5min，取上清，合并兩次上清以1000g離心5min，去上清，沉淀用5mlPBS洗滌，重懸后轉(zhuǎn)移入2ml離心管；②將轉(zhuǎn)入上述2ml離心管的沉淀1400g離心8～10min，去上清，加入裂解液I 300～500μl及溶菌酶100μl，冰浴30min后加入300～500μl裂解液II及100μlSDS，冰浴5min后再加等體積飽和酚，10000g離心8min，取上清，在上清中加入1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿∶異戊醇為24∶1，10000g離心8min；③取上清再加入1/10體積3M醋酸鈉及兩倍體積無水乙醇，沉淀2h以上，10000g離心15min，干燥沉淀。沉淀用100μl去離子無菌水溶解，加入4～5μl10％RNase，消化30min，再加入500μl去離子無菌水后重復(fù)氯仿異戊醇抽提步驟一次，加入1/10體積3M醋酸鈉及兩倍體積乙醇沉淀2h以上，離心并干燥沉淀，加100μl去離子無菌水溶解。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法，其特征是，所述的裂解液I，是指150mM NaCl；100mM EDTA·Na2；pH8.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法，其特征是，所述的裂解液II，是指100mM NaCl；500mM Tris-HCl；pH8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法，其特征是，所述的步驟(3)是指選用報(bào)道的ERIC序列引物，即ERIC15′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，并確定ERIC-PCR反應(yīng)的循環(huán)程序，ERIC-PCR的反應(yīng)體系為25μl，其中含DNA模板50～100ng、10mM dNTP 0.5μl、引物各25pmol，25mMMg2+2μl，10×Buffer 2.5μl和Taq酶1～2單位；循環(huán)程序?yàn)?4℃5min預(yù)變性后進(jìn)行94℃ 50s、48℃ 1min、72℃4min的35個(gè)循環(huán)，72℃保持8min，完成后，用1.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，紫外燈下照相，獲得DNA指紋圖譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法，其特征是，所述的步驟(4)是指比較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各狀態(tài)下圖譜中DNA條帶的變化，即腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，選出與疾病相關(guān)的條帶作為標(biāo)準(zhǔn)，作為篩選評(píng)價(jià)待試藥物的依據(jù)。
全文摘要
一種基于分子標(biāo)記的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)方法，具體如下建立與腸道菌群相關(guān)疾病的動(dòng)物脾虛證模型；收集造模前后以及用藥治療后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便，并用DNA提取方法提取其中微生物的總基因組DNA；用腸桿菌基因間重復(fù)序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ERIC－PCR)檢測(cè)；對(duì)得到的造模前后、用藥治療后的ERIC指紋圖譜進(jìn)行比較，提供對(duì)藥物的篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)。本發(fā)明的突出特點(diǎn)是快速且能比較全面地反映腸道菌的變化，本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、快速、有效、靈敏的特點(diǎn)，可以同時(shí)分析多個(gè)樣品并對(duì)各個(gè)階段的腸道菌動(dòng)態(tài)變化，在對(duì)腸道菌群總DNA指紋圖譜的變化進(jìn)行分析后，找到與疾病有關(guān)的DNA條帶來作為篩選評(píng)價(jià)的依據(jù)。為篩選與腸道菌有關(guān)疾病的藥物，尤其是脾虛治療中藥提供了新的方法。
文檔編號(hào)G01N21/31GK1603796SQ200410067810
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月4日
發(fā)明者李曉波, 孔靜, 吳春福 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)