專利名稱：用于檢測sars抗原的免疫微球及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測SARS抗原的免疫微球及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
SARS(嚴(yán)重急性呼吸綜合癥)冠狀病毒是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，其引起的這種新型疾病發(fā)病快，傳播速度快，若不及時診斷治療，病死率非常高。
目前在科研和臨床上常用的檢測SARS抗原的檢測方法是酶聯(lián)免疫法(ELISA)。使用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測抗原，即將抗體包被酶標(biāo)板上，加小牛血清或脫脂奶封閉，再加待測血清后溫育1小時，經(jīng)反復(fù)沖洗后待測樣品，溫育1小時后再沖洗，再加酶標(biāo)的抗體，溫育，再沖洗多次后加顯色的底物。此法雖然敏感性和特異性很好，但是要完成全部試驗需要2小時以上。
以往的免疫微球法檢測抗原的方法是一種簡便，快速(僅1分鐘就可得到結(jié)果)敏感和特異的方法。但是采用的免疫乳膠試劑的制備方法，無論是物理或是化學(xué)方，得到的免疫微球均不是通過共價鍵結(jié)合，因此試劑不穩(wěn)定，受溫度和鹽濃度影響很容易出現(xiàn)假陽性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的檢測SARS抗原的酶聯(lián)免疫法不夠簡便、快速；而免疫微球法的免疫微球本身很不穩(wěn)定，容易造成假陽性實驗誤差的缺陷，從而提供一種既可以快速、簡便的檢測，又很穩(wěn)定的用于檢測SARS抗原的免疫微球。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測SARS抗原的免疫微球的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種用于檢測SARS抗原的免疫微球的用途。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供的用于檢測SARS(嚴(yán)重急性呼吸綜合癥)抗原的免疫微球，其為以聚苯乙烯微球為內(nèi)核，其表面的羧基通過多聚賴氨酸偶聯(lián)了抗SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白的抗體，所述的聚苯乙烯微球為表面直徑為200～900納米，其表面有羧基修飾。
本發(fā)明提供一種所述的用于檢測SARS抗原的免疫微球的制備方法，是采用化學(xué)偶聯(lián)法將抗SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白的抗體偶聯(lián)到微球，包括如下的步驟1)將聚苯乙烯微球15～20mg/ml，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸緩沖液，然后加入2～4mg/ml的碳二亞胺，于室溫反應(yīng)完全后，離心，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌，重懸于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液；所述的聚苯乙烯微球直徑為200～900納米，其表面有羧基修飾；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.2～2.4mg/ml的多聚賴氨酸，于室溫反應(yīng)完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸緩沖液，然后加入2～4mg/ml的碳二亞胺，于室溫反應(yīng)完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌，重懸于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液；3)用基因重組的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白免疫動物產(chǎn)生抗體，并進行純化；用基因重組的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白免疫動物(日本大白兔，購自北京試驗動物中心)的具體步驟是按抗原量為0.5mg/公斤體重，免疫動物日本大白兔，第一次免疫用上述抗原加等體積的完全福氏佐劑，二周后進行第二次免疫，第二次免疫用上述抗原加等體積的不完全福氏佐劑；以后每月加強一次免疫；第二次免疫后開始用免疫雙擴散法檢測抗體滴度，待抗體滴度達(dá)到1∶32時收集血清；采用蛋白A親和層析柱法純化抗體，得到多克隆抗體；采用常規(guī)的ELISA和WesternBlot鑒定得到的多克隆抗體；4)向步驟2)得到的混合液中加入步驟3)的作為多克隆抗體的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白0.2～2.4mg/ml，于室溫反應(yīng)完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液；加入50～200微升0.25M乙酰胺，于室溫反應(yīng)完全后，離心分出固體；5)重懸于1mg/ml牛血清(BSA)和0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液，于室溫反應(yīng)完全后，離心分出固體，得到偶聯(lián)了抗SARS冠狀病毒S、M、E和N蛋白抗體的用于檢測SARS抗原的免疫微球。
所述的SARS冠狀病毒S蛋白的氨基酸序列為MetPheIlePheLeuLeuPheLeuThrLeuThrSerGlySerAspLeuAspArgCysThrThrPheAspAspValGlnAlaProAsnTyrThrGlnHisThrSerSerMetArgGlyValTyrTyrProAspGluIlePheArgSerAspThrLeuTyrLeuThrGlnAspLeuPheLeuProPheTyrSerAsnValThrGlyPheHisThrIleAsnHisThrPheAspAsnProValIleProPheLysAspGlyIleTyrPheAlaAlaThrGluLysSerAsnValValArgGlyTrpValPheGlySerThrMetAsnAsnLysSerGlnSerValIleIleIleAsnAsnSerThrAsnValValIleArgAlaCysAsnPheGluLeuCysAspAsnProPhePheAlaValSerLysProMetGlyThrGlnThrHisThrMetIlePheAspAsnAlaPheAsnCysThrPheGluTyrIleSerAspAlaPheSerLeuAspValSerGluLysSerGlyAsnPheLysHisLeuArgGluPheValPheLysAsnLysAspGlyPheLeuTyrValTyrLysGlyTyrGlnProIleAspValValArgAspLeuProSerGlyPheAsnThrLeuLysProIlePheLysLeuProLeuGlyIleAsnIleThrAsnPheArgAlaIleLeuThrAlaPheSerProAlaGlnAspThrTrpGlyThrSerAlaAlaAlaTyrPheValGlyTyrLeuLysProThrThrPheMetLeuLysTyrAspGluAsnGlyThrIleThrAspAlaValAspCysSerGlnAsnProLeuAlaGluLeuLysCysSerValLysSerPheGluIleAspLysGlyIleTyrGlnThrSerAsnPheArgValValProSerGlyAspValValArgPheProAsnIleThrAsnLeuCysProPheGlyGluValPheAsnAlaThrLysPheProSerValTyrAlaTrpGluArgLysLysIleSerAsnCysValAlaAspTyrSerValLeuTyrAsnSerThrPhePheSerThrPheLysCysTyrGlyValSerAlaThrLysLeuAsnAspLeuCysPheSerAsnValTyrAlaAspSerPheValValLysGlyAspAspValArgGlnIleAlaProGlyGlnThrGlyValIleAlaAspTyrAsnTyrLysLeuProAspAspPheMetGlyCysValLeuAlaTrpAsnThrArgAsnIleAspAlaThrSerThrGlyAsnTyrAsnTyrLysTyrArgTyrLeuArgHisGlyLysLeuArgProPheGluArgAspIleSerAsnValProPheSerProAspGlyLysProCysThrProProAlaLeuAsnCysTyrTrpProLeuAsnAspTyrGlyPheTyrThrThrThrGlyIleGlyTyrGlnProTyrArgValValValLeuSerPheGluLeuLeuAsnAlaProAlaThrValCysGlyProLysLeuSerThrAspLeuIleLysAsnGlnCysValAsnPheAsnPheAsnGlyLeuThrGlyThrGlyValLeuThrProSerSerLysArgPheGlnProPheGlnGlnPheGlyArgAspValSerAspPheThrAspSerValArgAspProLysThrSerGluIleLeuAspIleSerProCysSerPheGlyGlyValSerValIleThrProGlyThrAsnAlaSerSerGluValAlaValLeuTyrGlnAsp
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SerCysCysSerCysLeuLysGlyAlaCysSerCysGlySerCysCysLysPheAspGluAspAspSerGluPro ValLeuLysGly ValLysLeuHisTyr Thr所述的SARS冠狀病毒N蛋白的氨基酸序列為MetSerAspAsnGlyProGlnSerAsnGlnArgSerAlaProArgIleThrPheGlyGlyProThrAspSerThrAspAsnAsnGlnAsnGlyGlyArgAsnGlyAlaArgProLysGlnArgArgProGlnGlyLeuProAsnAsnThrAlaSerTrpPheThrAlaLeuThrGlnHisGlyLysGluGluLeuArgPheProArgGlyGlnGlyValProIleAsnThrAsnSerGlyProAspAspGlnIleGlyTyrTyrArgArgAlaThrArgArgValArgGlyGlyAspGlyLysMetLysGluLeuSerProArgTrpTyrPheTyrTyrLeuGlyThrGlyProGluAlaSerLeuProTyrGlyAlaAsnLysGluGlyIleValTrpValAlaThrGluGlyAlaLeuAsnThrProLysAspHisIleGlyThrArgAsn ProAsnAsnAsnAlaAlaThrValLeuGlnLeuProGlnGlyThrThrLeuProLysGlyPheTyrAlaGluGlySerArgGlyGlySerGlnAlaSerSerArgSerSerSerArgSerArgGlyAsnSerArgAsnSerThrProGlySerSerArgGlyAsnSerProAlaArgMetAlaSerGlyGlyGlyGluThrAlaLeuAlaLeuLeuLeuLeuAspArgLeuAsnGlnLeuGluSerLysValSerGlyLysGlyGlnGlnGlnGlnGlyGlnThrValThrLysLysSerAlaAlaGluAlaSerLysLysProArgGlnLysArgThrAlaThrLysGlnTyrAsnValThrGlnAlaPheGlyArgArgGlyProGluGlnThrGlnGlyAsnPheGlyAspGlnAspLeuIleArgGlnGlyThrAspTyrLysHisTrpProGlnIleAlaGlnPheAlaProSerAlaSerAlaPhePheGlyMetSerArgIleGlyMetGluValThrProSerGlyThrTrpLeuThrTyrHisGlyAlaIleLysLeuAspAspLysAspProGlnPheLysAspAsnValIleLeuLeuAsnLysHislleAspAlaTyrLysThrPheProProThrGluProLysLysAspLysLysLysLysThrAspGluAlaGlnProLeuProGlnArgGlnLysLysGlnProThrValThrLeuLeuProAlaAlaAspMetAspAspPheSerArg GlnLeuGlnAsnSer MetSerGlyAlaSer AlaAspSerThrGln Ala所述的SARS冠狀病毒M蛋白的氨基酸序列為MetAlaAspAsnGlyThrIleThrValGluGluLeuLysGlnLeuLeuGluGlnTrpAsnLeuValIleGlyPheLeuPheLeuAlaTrpIleMetLeuLeuGlnPheAlaTyrSerAsnArgAsnArgPheLeuTyrIleIleLysLeuValPheLeuTrpLeuLeuTrpProValThrLeuAlaCysPheValLeuAlaAlaValTyrArgIleAsnTrpValThrGlyGlyIleAla
IleAlaMetAlaCysIleValGlyLeuMetTrpLeuSerTyrPheValAlaSerPheArgLeuPheAlaArgThrArgSerMetTrpSerPheAsnProGluThrAsnIleLeuLeuAsnValProLeuArgGlyThrIleValThrArgProLeuMetGluSerGluLeuValIleGlyAlaValIleIleArgGlyHisLeuArgMetAlaGlyHisSerLeuGlyArgCysAspIleLysAspLeuProLysGluIleThrValAlaThrSerArgThrLeuSerTyrTyrLysLeuGlyAlaSerGlnArgValGlyThrAspSerGlyPheAlaAlaTyrAsnArgTyrArgIleGlyAsnTyrLysLeu AsnThrAspHisAla GlySerAsnAspAsn IleAlaLeuLeuVal Gln所述的SARS冠狀病毒E蛋白的氨基酸序列為MetTyrSerPheValSerGluGluThrGlyThrLeuIleValAsnSerValLeuLeuPheLeuAlaPheValValPheLeuLeuValThrLeuAlaIleLeuThrAlaLeuArgLeuCysAlaTyrCysCysAsnIleValAsnValSerLeuValLysProThrValTyrValTyrSerArgValLysAsnLeu AsnSerSerGluGly ValProAspLeuLeu Val本發(fā)明提供的用于檢測SARS抗原的免疫微球的用途，該免疫微球作為檢測試劑檢測SARS抗原。
本發(fā)明提供的用于檢測SARS抗原的免疫微球，可以作為檢測試劑檢測SARS抗原，其檢測方法如下將被測血清樣品滴在潔凈的玻片或透明塑料片上，加入本發(fā)明提供的用于檢測SARS抗原的免疫微球，其中，用竹簽、牙簽、塑料棒或其他物體攪拌，將待測樣品和免疫微球混勻并呈圓斑狀。
在黑色背景下，用肉眼或在顯微鏡下直接觀察凝集反應(yīng)，并用下列符號記錄結(jié)果(-)無肉眼可見凝集顆粒；(+)肉眼可見細(xì)的凝集顆粒，背景混濁；(++)肉眼可見大的凝集顆粒，背景稍混濁；(+++)肉眼可見大而清晰凝集顆粒，背景清楚；(++++)肉眼可見大而清晰的凝集塊，背景清楚。
也可進行半定量測定抗體滴度，將被測血清倍比稀釋，按上法測定，以稀釋度為抗體滴度。
SARS病是一種嚴(yán)重的傳染性極強的烈性傳染病，需要快速、準(zhǔn)確地進行診斷。本發(fā)明提供的用于檢測SARS(嚴(yán)重急性呼吸綜合癥)抗原的免疫微球是將基因重組的SARS冠狀病毒S，N，M，E蛋白免疫兔子產(chǎn)生的抗體經(jīng)過純化后，把抗體通過化學(xué)方法偶聯(lián)到聚苯乙烯微球上，該免疫微球與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為第一，準(zhǔn)確性高。因為使用的基因工程重組抗原，其純度達(dá)到99％，為此，避免了PCR診斷試劑盒的假陽性的缺點；第二，快速。整個檢測過程僅需要數(shù)分鐘，避免了酶聯(lián)免疫診斷試劑盒需要數(shù)小時的費時的缺點；第三，經(jīng)濟實用。檢測不需要任何儀器設(shè)備，適合廣大基層衛(wèi)生防疫單位使用。
總之，該免疫微球能夠快速檢測血清抗SARS抗原，且敏感性和特異性均好。


圖1為免疫微球檢測SARS抗體左(陰性)，右(陽性)；圖2為免疫前、后兔血清與SARS CoV的基因重組蛋白免疫微球反應(yīng)(40X)；其中A.免疫前兔血清；B.免疫后兔血清；圖3為正常人和病人血清與SARS CoV基因重組蛋白免疫微球反應(yīng)；其中A.正常人血清(10X)；B.SARS病人血清(強反應(yīng)(10X)；C.SARS病人血清(強反應(yīng)40X)；D.SARS病人血清(1∶200稀釋40X)。
具體實施例方式
實施例1制備偶聯(lián)了SARS冠狀病毒S蛋白免疫兔子產(chǎn)生的抗體的用于檢測SARS抗原的免疫微球1.SARS冠狀病毒S蛋白抗原的制備用RT-PCR方法擴增SARS冠狀病毒S的基因片段，將該基因片段經(jīng)測序證實基因序列正確無誤后，再將其克隆到表達(dá)載體如原核表達(dá)載體pQE30，酵母表達(dá)載體pPICZαA，然后進行表達(dá)和蛋白純化。
2、SARS冠狀病毒S蛋白抗原的鑒定抗原純化后，必須通過以下試驗鑒定
(1)抗原蛋白含量測定取抗原1毫升用分光光度計測其蛋白含量，在其260nm和280nm處分別測OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可計算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；(2)蛋白純度測定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白電泳即SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示為一條帶。
(3)酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶標(biāo)微孔板，置4度20小時后，棄去抗原包被液，加入5％小牛血清以封閉未被抗原包被的部分，置37度1小時，經(jīng)PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后，加陽性病人血清，置37度2小時，經(jīng)PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后加入最適工作濃度HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 200微升，置室溫2小時后，分別用PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌各3次，加入反應(yīng)底物200微升，再495nm測定吸光度。
(4)對照實驗用免疫微球10微升加入10微升抗體陽性血清和陰性血清，混勻后，陽性血清有凝集顆粒，陰性血清則無凝集。
3、多克隆抗體的制備用純化的S蛋白作為抗原分別免疫大白兔?？乖繛?.5mg/公斤體重，第一次免疫用抗原加等體積的完全福氏佐劑，二周后進行第二次免疫，抗原加等體積的不完全福氏佐劑。以后每月加強一次免疫。第二次免疫後開始用免疫雙擴散法檢測抗體滴度，待抗體滴度達(dá)到1∶32時收集血清。采用蛋白A親和層析柱法純化抗體。
4、多克隆抗體的鑒定采用常規(guī)ELISA和Western Blot鑒定多克隆抗體。
5、微球的制備1)將直徑為200納米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下?lián)u動4小時，以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚賴氨酸，置室溫上下?lián)u動12小時，用0.5M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下?lián)u動4小時；用0.5M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入步驟3制得的抗SARS冠狀病毒S蛋白的抗體0.2mg/ml，置室溫上下?lián)u動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液；加入50微升0.25M乙酰胺封閉多聚賴氨酸上未被抗體結(jié)合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室溫上下?lián)u動30分，以13000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液，置室溫上下?lián)u動30分，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗原的、偶聯(lián)了作為抗體的SARS冠狀病毒S蛋白的免疫微球。
將此用于檢測SARS抗體的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
實施例2偶聯(lián)了SARS冠狀病毒N蛋白多克隆抗體的免疫微球的制備1、SARS冠狀病毒N蛋白抗原的制備用RT-PCR方法擴增SARS冠狀病毒N的基因片段，將該基因片段經(jīng)測序證實基因序列正確無誤后，再將其克隆到表達(dá)載體如原核表達(dá)載體pQE30，酵母表達(dá)載體pPICZαA，然后進行表達(dá)和蛋白純化。
2.抗原的鑒定抗原純化后，必須通過以下試驗鑒定(1)抗原蛋白含量測定取抗原1毫升用分光光度計測其蛋白含量，在其260nm和280nm處分別測OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可計算抗原的蛋白含量。
(2)蛋白純度測定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白電泳即SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示為一條帶。
(3)酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶標(biāo)微孔板，置4度20小時后，棄去抗原包被液，加入5％小牛血清以封閉未被抗原包被的部分，置37度1小時，經(jīng)PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后，加陽性病人血清，置37度2小時，經(jīng)PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后加入最適工作濃度HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 200微升，置室溫2小時后，分別用PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌各3次，加入反應(yīng)底物200微升，再495nm測定吸光度。
(4)對照實驗用免疫微球10微升加入10微升抗體陽性血清和陰性血清，混勻后，陽性血清有凝集顆粒，陰性血清則無凝集。多克隆抗體的制備
3、用純化的N蛋白作為抗原分別免疫動物(動物可以是大白兔、山羊和雞)。抗原量為0.5mg/公斤體重，第一次免疫用抗原加等體積的完全福氏佐劑，二周后進行第二次免疫，抗原加等體積的不完全佐劑。以后每月加強一次免疫。第二次免疫後開始用免疫雙擴散法檢測抗體滴度，待抗體滴度達(dá)到1∶32時收集血清。采用蛋白A親和層析柱法純化抗體。
4.多克隆抗體的鑒定采用常規(guī)ELISA和Western Blot鑒定多克隆抗體。
5.微球的制備1)將直徑為200納米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下?lián)u動4小時，以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚賴氨酸，置室溫上下?lián)u動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下?lián)u動4小時；用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入抗SARS冠狀病毒N蛋白的抗體0.2mg/ml，置室溫上下?lián)u動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液；加入50微升0.25M乙酰胺封閉多聚賴氨酸上未被抗體結(jié)合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室溫上下?lián)u動30分，以13000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液，置室溫上下?lián)u動30分，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗原的、偶聯(lián)了作為抗體的SARS冠狀病毒N蛋白的免疫微球。
將此用于檢測SARS抗體的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
實施例3偶聯(lián)了SARS冠狀病毒M蛋白多克隆抗體的免疫微球的制備1、SARS冠狀病毒M蛋白抗原的制備用RT-PCR方法擴增SARS冠狀病毒M的基因片段，將該基因片段經(jīng)測序證實基因序列正確無誤后，再將其克隆到表達(dá)載體如原核表達(dá)載體pQE30，酵母表達(dá)載體pPICZαA，然后進行表達(dá)和蛋白純化。
2、抗原的鑒定抗原純化后，必須通過以下試驗鑒定(1)抗原蛋白含量測定取抗原1毫升用分光光度計測其蛋白含量，在其260nm和280nm處分別測OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可計算抗原的蛋白含量。
(2)蛋白純度測定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白電泳即SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示為一條帶。
(3)酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶標(biāo)微孔板，置4度20小時后，棄去抗原包被液，加入5％小牛血清以封閉未被抗原包被的部分，置37度1小時，經(jīng)PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后，加陽性病人血清，置37度2小時，經(jīng)PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后加入最適工作濃度HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 200微升，置室溫2小時后，分別用PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌各3次，加入反應(yīng)底物200微升，再495nm測定吸光度。
(4)對照實驗用免疫微球10微升加入10微升抗體陽性血清和陰性血清，混勻后，陽性血清有凝集顆粒，陰性血清則無凝集。多克隆抗體的制備3、用純化的M蛋白作為抗原分別免疫動物(動物可以是大白兔、山羊和雞)?？乖繛?.5mg/公斤體重，第一次免疫用抗原加等體積的完全福氏佐劑，二周后進行第二次免疫，抗原加等體積的不完全佐劑。以后每月加強一次免疫。第二次免疫後開始用免疫雙擴散法檢測抗體滴度，待抗體滴度達(dá)到1∶32時收集血清。采用蛋白A親和層析柱法純化抗體。
4、多克隆抗體的鑒定采用常規(guī)ELISA和Western Blot鑒定多克隆抗體。
5、微球的制備1)將直徑為200納米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下?lián)u動4小時，以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚賴氨酸，置室溫上下?lián)u動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下?lián)u動4小時；用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入抗SARS冠狀病毒M蛋白的抗體0.2mg/ml，置室溫上下?lián)u動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液；加入50微升0.25M乙酰胺封閉多聚賴氨酸上未被抗體結(jié)合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室溫上下?lián)u動30分，以13000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液，置室溫上下?lián)u動30分，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗原的、偶聯(lián)了作為抗體的SARS冠狀病毒M蛋白的免疫微球。
將此用于檢測SARS抗原的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
實施例4偶聯(lián)了SARS冠狀病毒E蛋白多克隆抗體的免疫微球的制備1、SARS冠狀病毒E蛋白抗原的制備用RT-PCR方法擴增SARS冠狀病毒E的基因片段，將該基因片段經(jīng)測序證實基因序列正確無誤后，再將其克隆到表達(dá)載體如原核表達(dá)載體pQE30，酵母表達(dá)載體pPICZαA，然后進行表達(dá)和蛋白純化。
2、抗原的鑒定抗原純化后，必須通過以下試驗鑒定(1)抗原蛋白含量測定取抗原1毫升用分光光度計測其蛋白含量，在其260nm和280nm處分別測OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可計算抗原的蛋白含量。
(2)蛋白純度測定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白電泳即SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示為一條帶。
(3)酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶標(biāo)微孔板，置4度20小時后，棄去抗原包被液，加入5％小牛血清以封閉未被抗原包被的部分，置37度1小時，經(jīng)PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后，加陽性病人血清，置37度2小時，經(jīng)PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后加入最適工作濃度HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 200微升，置室溫2小時后，分別用PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌各3次，加入反應(yīng)底物200微升，再495nm測定吸光度。
(4)對照實驗用免疫微球10微升加入10微升抗體陽性血清和陰性血清，混勻后，陽性血清有凝集顆粒，陰性血清則無凝集。多克隆抗體的制備3、用純化的E蛋白作為抗原分別免疫動物(動物可以是大白兔、山羊和雞)。抗原量為0.5mg/公斤體重，第一次免疫用抗原加等體積的完全福氏佐劑，二周后進行第二次免疫，抗原加等體積的不完全佐劑。以后每月加強一次免疫。第二次免疫後開始用免疫雙擴散法檢測抗體滴度，待抗體滴度達(dá)到1∶32時收集血清。采用蛋白A親和層析柱法純化抗體。
4、多克隆抗體的鑒定采用常規(guī)ELISA和Western Blot鑒定多克隆抗體。
5、微球的制備1)將直徑為200納米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下?lián)u動4小時，以12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚賴氨酸，置室溫上下?lián)u動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下?lián)u動4小時；用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入抗SARS冠狀病毒E蛋白的抗體0.2mg/ml，置室溫上下?lián)u動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液；加入50微升0.25M乙酰胺封閉多聚賴氨酸上未被抗體結(jié)合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室溫上下?lián)u動30分，以13000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液，置室溫上下?lián)u動30分，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗原的、偶聯(lián)了作為抗體的SARS冠狀病毒E蛋白的免疫微球。
將此用于檢測SARS抗原的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
實施例5、用本發(fā)明提供的免疫微球檢測試劑檢測(SARS)抗原用免疫微球檢測試劑檢測(SARS)抗原的方法1、操作方法(1)將被測血清10微升滴在潔凈的玻片或透明所料片上，加5微升免疫微球檢測試劑，用竹簽混勻呈直徑1厘米的圓斑。
(2)在黑色背景下觀察凝集反應(yīng)。
(3)半定量測定，將被測血清倍比稀釋，按上法測定，以稀釋度為抗原滴度。
2、結(jié)果判定(1)肉眼判定(-)無肉眼可見凝集顆粒。
(+)肉眼可見細(xì)的凝集顆粒，背景混濁。
(++)肉眼可見大的凝集顆粒，背景稍混濁。
(+++)肉眼可見大而清晰凝集顆粒，背景清楚。
(++++)肉眼可見大而清晰的凝集塊，背景清楚。
也可按半定量法表示抗原滴度。
觀察結(jié)果見圖1；(2)顯微鏡下判定40倍下觀察，陰性可見均勻的微球顆粒，陽性可見微球顆粒凝集呈塊，見圖2.和圖3。
FPI04185-sequence listSEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院動物研究所<120>用于檢測SARS抗原的免疫微球及其制備方法和用途<130>FPI04185<150>CN 200410003420.1<151>2004-02-25<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1255<212>PRT<213>corona virus<400>1Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 210Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
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<400>4Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser1 5 10 15Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala20 25 30Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn35 40 45Val Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn50 55 60Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val65 70 7權(quán)利要求
1.一種用于檢測SARS抗原的免疫微球，其為以聚苯乙烯微球為內(nèi)核，其表面的羧基通過多聚賴氨酸偶聯(lián)了抗SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白的抗體，所述的聚苯乙烯微球為表面直徑為200～900納米，其表面有羧基修飾。
2.一種權(quán)利要求1所述的用于檢測SARS抗原的免疫微球的制備方法，是采用化學(xué)偶聯(lián)法將抗SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白的抗體偶聯(lián)到微球，包括如下的步驟1)將聚苯乙烯微球15～20mg/ml，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸緩沖液，然后加入2～4mg/ml的碳二亞胺，于室溫反應(yīng)完全后，離心，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌，重懸于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液；所述的聚苯乙烯微球直徑為200～900納米，其表面有羧基修飾；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.2～2.4mg/ml的多聚賴氨酸，于室溫反應(yīng)完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸緩沖液，然后加入2～4mg/ml的碳二亞胺，于室溫反應(yīng)完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌，重懸于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液；3)用基因重組的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白免疫動物產(chǎn)生抗體，并進行純化；4)向步驟2)得到的混合液中加入步驟3)的抗SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白的抗體0.2～2.4mg/ml，于室溫反應(yīng)完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液；加入50～200微升0.25M乙酰胺，于室溫反應(yīng)完全后，離心分出固體；5)重懸于1mg/ml牛血清(BSA)和0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液，于室溫反應(yīng)完全后，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗原的免疫微球。
3.一種權(quán)利要求1所述的用于檢測SARS抗原的免疫微球的用途，該免疫微球作為檢測試劑檢測SARS抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測SARS抗原的免疫微球試劑及其制備方法和用途。該免疫微球是以表面有羧基修飾的聚苯乙烯微球為內(nèi)核，其表面的羧基通過多聚賴氨酸化學(xué)偶聯(lián)了抗SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白的抗體。該免疫微球可以作為檢測試劑檢測SARS抗原。本發(fā)明提供的用于檢測SARS抗原的免疫微球與現(xiàn)有技術(shù)相比，其敏感性和特異性好，準(zhǔn)確性高，避免了PCR診斷試劑盒的假陽性的缺點；整個檢測過程快速；檢測不需要任何儀器設(shè)備，經(jīng)濟實用，適合廣大基層衛(wèi)生防疫單位使用。
文檔編號G01N33/544GK1661371SQ20041007014
公開日2005年8月31日 申請日期2004年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者陳佺, 楊建國, 朱玉山, 顧瑩, 邢娟, 金海京, 王曉惠 申請人:中國科學(xué)院動物研究所