專利名稱：檢測(cè)翻譯后修飾活性的方法及實(shí)施該方法的裝置系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定性檢測(cè)翻譯后修飾活性的方法，即檢測(cè)酶活性，所述酶活性通過(guò)形成特殊的基團(tuán)如磷酸基團(tuán)來(lái)修飾已經(jīng)合成的蛋白質(zhì)并改變其功能。
出現(xiàn)嚴(yán)重疾病如癌癥、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、心血管循環(huán)疾病、高血壓和中風(fēng)的原因是改變的蛋白質(zhì)活性。本發(fā)明提供了一種快速、高度靈敏且有效的用于檢測(cè)不同類型的翻譯后活性的方法。用本發(fā)明的方法和裝置系統(tǒng)，在生物學(xué)多檢測(cè)系統(tǒng)的領(lǐng)域中對(duì)于所需測(cè)試的高通量(Hochdurchsatz)作出了重要的貢獻(xiàn)。
在說(shuō)明現(xiàn)有技術(shù)的更詳細(xì)的實(shí)施方案之前，應(yīng)當(dāng)確認(rèn)下列事實(shí)作為開(kāi)場(chǎng)白用于快速檢測(cè)具有生物活性的分析物的系統(tǒng)和方法(特別是在小液體樣品中)具有高的醫(yī)學(xué)和制藥學(xué)意義以及環(huán)境保護(hù)意義。最全面和意義最重大的、對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)特別重要的細(xì)胞活性類別之一是在翻譯后修飾中起作用的活性。這些對(duì)于每個(gè)細(xì)胞為特征性的活性的結(jié)果是改變了經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的功能特性。蛋白質(zhì)或多肽的翻譯后修飾的主要機(jī)制是磷酸化、甲基化、異戊二烯化、遍在蛋白化和蛋白水解。不同的外部條件(刺激)，例如生長(zhǎng)因子的存在或病理狀態(tài)的發(fā)展如細(xì)胞周期的變化以及毒素的作用，可以短暫地改變多種細(xì)胞內(nèi)組分的翻譯后狀態(tài)。因此，快速開(kāi)發(fā)出特定翻譯后活性的特異且有效的抑制劑或激活劑是必需的。就這點(diǎn)而言，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的樣品和方法是重要的，這些樣品和方法使得能夠在多檢測(cè)系統(tǒng)(微陣列，生物芯片)中可靠而靈敏地檢測(cè)這些活性。
通過(guò)激酶和磷酸酶的蛋白質(zhì)的磷酸化-去磷酸化可作為翻譯后修飾的實(shí)例。激酶通過(guò)將磷酸基團(tuán)連接至氨基酸殘基(主要是絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)之上(磷酸化)來(lái)修飾蛋白質(zhì)。與此相反，蛋白磷酸酶去除這些磷酸基團(tuán)，因此反轉(zhuǎn)了磷酸化效果。蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的變化在活細(xì)胞中通過(guò)局部化和蛋白質(zhì)之間的分子相互作用調(diào)節(jié)著酶活性。細(xì)胞中激酶和磷酸酶活性之間的總平衡是在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，蛋白激酶和磷酸酶的作用屬于蛋白質(zhì)功能的最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。最新的對(duì)于疾病的認(rèn)識(shí)和分析指向蛋白激酶的遺傳檢測(cè)，其可指明超過(guò)400種特殊的疾病狀態(tài)，這些疾病狀態(tài)本身被認(rèn)為與改變的激酶活性相關(guān)。
因?yàn)楫惓５牡鞍踪|(zhì)磷酸化是出現(xiàn)嚴(yán)重疾病如癌癥、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、心血管循環(huán)疾病、高血壓和中風(fēng)的原因，所以對(duì)于制藥工業(yè)來(lái)說(shuō)感興趣的是能夠抑制蛋白激酶的磷酸化活性的新型化合物。
為了開(kāi)發(fā)出新型的有效藥物，必需測(cè)試借助于組合化學(xué)合成的大量的化合物。為此目的，制藥工業(yè)需要使得能夠以高通量規(guī)格進(jìn)行所需的測(cè)試的新技術(shù)。
此外，還為了改善已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的藥物的作用，必需檢驗(yàn)這些藥物在多大程度上影響著蛋白激酶和磷酸酶的活性。例如環(huán)孢菌素是一種免疫系統(tǒng)抑制劑，沒(méi)有這種物質(zhì)就無(wú)法進(jìn)行器官移植。最近更新的研究才表明，該藥劑的作用機(jī)制是通過(guò)抑制蛋白質(zhì)磷酸酶PP2B而起作用的。
現(xiàn)有技術(shù)的詳細(xì)說(shuō)明本身已知的生物芯片技術(shù)是一種非常有效的方法，其對(duì)于醫(yī)學(xué)診斷和藥物開(kāi)發(fā)帶來(lái)了革命性的改變。使用基因芯片例如能夠在一次試驗(yàn)中容納腫瘤或其他組織的全部的轉(zhuǎn)錄樣本?；蛐酒拈_(kāi)發(fā)和制備已經(jīng)到了后期。改變的蛋白質(zhì)活性如上所述是嚴(yán)重疾病的原因，這種蛋白質(zhì)活性的變化是借助于基因芯片無(wú)法探查到的。因此需要開(kāi)發(fā)出有效的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(以多檢測(cè)規(guī)格快速評(píng)測(cè)改變的蛋白質(zhì)活性的方法)。由于蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的高度復(fù)雜性，這種技術(shù)目前只能有限地進(jìn)行使用。
國(guó)際上的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)當(dāng)前的激酶活性的檢測(cè)方法通?；谕ㄟ^(guò)在蛋白質(zhì)底物中嵌入放射性磷酸32P的測(cè)量。在使用這種方法時(shí)，必須對(duì)于細(xì)胞使用非常高劑量的放射活性，以便標(biāo)記整個(gè)的細(xì)胞內(nèi)ATP庫(kù)和確保目標(biāo)蛋白質(zhì)的放射活性標(biāo)記。為了檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)磷酸化，必須在將細(xì)胞與測(cè)試物質(zhì)進(jìn)行溫育之后裂解細(xì)胞并純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。該方法需要大量的細(xì)胞、長(zhǎng)的溫育時(shí)間和小心的處理操作，以避免錯(cuò)誤的磷酸化-去磷酸化結(jié)果。此外，這種方法還需要目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化。因?yàn)槟繕?biāo)蛋白質(zhì)的末端磷酸化可以是非常低水平的，所以該方法有著非常差的效率。對(duì)于環(huán)境和健康特別嚴(yán)重的是大量使用放射活性，而高劑量的放射活性對(duì)于在高通量試驗(yàn)中施行該方法是必需的。
用于測(cè)定激酶活性的其他可選的方法是基于磷酸化特異性抗體的方法，如ELISA和蛋白質(zhì)印跡法。這種方法的缺點(diǎn)在于，制備抗體以及區(qū)分蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化狀態(tài)是困難的和成本非常高的。
質(zhì)譜儀(MALDI和ESI)在15年前已經(jīng)用于測(cè)定經(jīng)蛋白水解的蛋白質(zhì)片段的一級(jí)結(jié)構(gòu)。理論上，該方法的質(zhì)量分辨率對(duì)于檢測(cè)具有80Da的質(zhì)量差異的磷酸化來(lái)說(shuō)是足夠的。然而，由于磷酸鍵的不穩(wěn)定性和其在測(cè)量方法過(guò)程期間從蛋白質(zhì)殘基上的快速分解，所以MALDI-MS只可能有條件地用于磷酸化檢測(cè)。磷酸化的質(zhì)譜儀檢測(cè)常常導(dǎo)致假陰性結(jié)果。此外，質(zhì)譜儀的成本是極高的。
從專利US 6,410,255中獲知一種使得能夠檢測(cè)激酶活性的方法。該方法涉及一種為發(fā)熒光基團(tuán)的傳感器，該發(fā)熒光基團(tuán)與一個(gè)激酶特異性部分和一個(gè)蛋白酶敏感性部分一起嵌入多肽中。蛋白質(zhì)的修飾導(dǎo)致改變的蛋白酶裂解位點(diǎn)的可接近性和發(fā)熒光基團(tuán)的分解。這借助于熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。除了激酶之外，該方法還需要存在蛋白酶，它們之間的相互作用可能導(dǎo)致假象。缺點(diǎn)是熒光顯微鏡的高成本和需要對(duì)目標(biāo)肽進(jìn)行熒光標(biāo)記。
除了迄今說(shuō)明的在檢測(cè)激酶和磷酸酶活性時(shí)的缺點(diǎn)以外，到目前為止可以總結(jié)性地強(qiáng)調(diào)指出，在具有成千種組分的小樣品體積中只有有限的快速檢測(cè)這種活性的可能性。
現(xiàn)在，還應(yīng)當(dāng)短時(shí)間地研究一下標(biāo)題為“Bio-Chip”的專利DE 10051 252 A1。該DE專利描述了一種定性和/或定量檢測(cè)分析物的方法，該分析物具有極化分子，特別是以分子形式溶解的生物分子。只要在測(cè)量室中存在有基質(zhì)，具有大量的各為一個(gè)電容器的小測(cè)量室(＜1mm)的傳感器有著一定的電容。如果將附加的材料以待檢測(cè)的分子的形式置于基質(zhì)上，那么該電容器的電容就會(huì)發(fā)生變化。該電容變化與分析物的濃度相關(guān)。當(dāng)將生物活性物質(zhì)引入測(cè)量室中時(shí)，會(huì)出現(xiàn)獲取準(zhǔn)確的測(cè)量數(shù)據(jù)的問(wèn)題。此外，用于采用相應(yīng)的測(cè)量電子學(xué)進(jìn)行評(píng)測(cè)的、具有彈簧接點(diǎn)的細(xì)小機(jī)械系統(tǒng)有時(shí)成為測(cè)量誤差的起因?？焖贉y(cè)量的合理可能性是不可能的。DE 100 51 252 A1的這一解決方案是用于測(cè)量蛋白質(zhì)結(jié)合的生物芯片(Bio-Chip)；而翻譯后修飾活性的檢測(cè)是不可能的。
因此，本發(fā)明的任務(wù)是提供一種測(cè)定翻譯后活性的自動(dòng)化方法，該方法是高度靈敏的和不復(fù)雜的，以及可能能夠用于所有激酶和磷酸酶活性。該方法應(yīng)當(dāng)不使用染料以及發(fā)熒光性或放射性物質(zhì)。
通過(guò)快速檢測(cè)翻譯后活性和成千種組分，將會(huì)對(duì)于藥物的研究和開(kāi)發(fā)、環(huán)境技術(shù)的基礎(chǔ)研究以及分子醫(yī)學(xué)診斷這些領(lǐng)域作出重要的貢獻(xiàn)。用相應(yīng)的裝置系統(tǒng)來(lái)實(shí)施該方法。
根據(jù)本發(fā)明這一任務(wù)可如下得以完成，即其中關(guān)于基本的想法可參閱權(quán)利要求1。本發(fā)明的其他布置可從權(quán)利要求2-9中獲知。
為了闡述本發(fā)明，進(jìn)一步的說(shuō)明是必需的。
該技術(shù)解決方案使得能夠在具有分析物或酶的液體樣品中快速和有效地檢測(cè)翻譯后活性，這基于各自所使用的傳感器的物理-化學(xué)特性的變化。液體樣品是來(lái)自細(xì)胞的樣品或具有測(cè)試物質(zhì)的樣品，向這些樣品中添加了酶。
為了檢測(cè)翻譯后修飾活性而開(kāi)發(fā)出的傳感器由合成的蛋白質(zhì)片段或肽組成，這些蛋白質(zhì)片段或肽含有對(duì)于蛋白質(zhì)、激酶或其他酶的識(shí)別位點(diǎn)。與對(duì)于實(shí)施例所作的說(shuō)明相聯(lián)系可研究一下這種傳感器的示意性圖示?！白R(shí)別位點(diǎn)”存在于兩個(gè)氨基酸殘基基團(tuán)即部分1和部分2之間，這兩個(gè)基團(tuán)具有0-n的氨基酸殘基數(shù)目和一系列的帶電荷的殘基。如此設(shè)計(jì)傳感器，從而其具有有著特殊的分子靜電勢(shì)分布的三維(3-D)結(jié)構(gòu)和分子偶極矩μ。作為上述的翻譯后活性的結(jié)果，在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部改變一個(gè)修飾殘基。與之相應(yīng)地，靜電勢(shì)分布發(fā)生變化，并且出現(xiàn)傳感器偶極矩μ*。傳感器的偶極矩的變化用如在實(shí)施例中還會(huì)說(shuō)明的電學(xué)或光學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。
下面的表1顯示了能夠用于檢測(cè)蛋白激酶A(PKA)、蛋白磷酸酶2B(PP2B)、酪氨酸激酶(TK)、酪氨酸磷酸酶(TP)和蛋白激酶C(PKC)活性的傳感器的實(shí)例。
表1傳感器的一級(jí)結(jié)構(gòu)(粗體表示修飾殘基，斜體表示識(shí)別位點(diǎn))
具有希望的3D結(jié)構(gòu)的傳感器的形成通過(guò)借助于生物信息學(xué)方法的分子模擬來(lái)完成(例如在Swiss-Prot和PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋，用MOE或SYBYL優(yōu)化結(jié)構(gòu)，計(jì)算未修飾的和修飾的多肽的分子靜電勢(shì)和偶極矩)。對(duì)此可參閱Brandt，W.，Anders，A.和Vasilets，L.A.(2002)Predicted alterations in tertiary structure of the N terminusof the Na+/K+-ATPase α subunit caused by acidic replacement orPKC-mediated phosphorylation of Ser-23.Cell.Biochem.Biophys.3783-95。
例如未磷酸化的表1中的PKC-傳感器5(S5)的偶極矩為大約203D，其中絲氨酸的磷酸化導(dǎo)致該傳感器的偶極矩的方向改變并減小至144D。
至此可總結(jié)性地強(qiáng)調(diào)指出本發(fā)明基于根據(jù)傳感器的物理-化學(xué)特性的變化而在液體樣品中檢測(cè)翻譯后活性，而無(wú)需標(biāo)記目標(biāo)肽。作為用于檢測(cè)傳感器的偶極矩變化的實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)例，可以提及測(cè)量介電常數(shù)(介電常數(shù))、張弛電流、折射率、密度或偏振光的強(qiáng)度。
現(xiàn)在，將依賴于具有補(bǔ)充性提示的實(shí)施例進(jìn)行解釋本發(fā)明。
附

圖1-傳感器的示意圖2-用于借助于光學(xué)測(cè)量來(lái)檢測(cè)翻譯后活性的裝置的示意圖3-通過(guò)測(cè)量相對(duì)介電常數(shù)ε來(lái)檢測(cè)肽修飾4-借助于差異測(cè)量來(lái)檢測(cè)翻譯后修飾活性5-通過(guò)測(cè)量振蕩器的頻率偏移來(lái)檢測(cè)肽修飾圖1中，參考符號(hào)各具有以下含義1-一系列氨基酸殘基(部分1)2-一系列氨基酸殘基(部分2)3-銜接物4-結(jié)合位置5-固體X-修飾殘基圖2中，參考符號(hào)各具有以下含義6-光源7-偏振器8-測(cè)量室9-光分析器10-光檢測(cè)器P-偏振光圖3A中，參考符號(hào)各具有以下含義11-測(cè)量室圖4A中，參考符號(hào)各具有以下含義12-頻率發(fā)生器13-測(cè)量電容C1
14-測(cè)量電容C215-差異增強(qiáng)器16-交流/直流轉(zhuǎn)換器(AC/DC轉(zhuǎn)換器)圖1是一個(gè)傳感器，其根據(jù)本發(fā)明為合成的多肽，并含有蛋白激酶或其他酶的“識(shí)別位點(diǎn)”。圖1A顯示了這樣的傳感器的示意圖。具有一個(gè)或多個(gè)修飾殘基X的“識(shí)別位點(diǎn)”存在于兩個(gè)氨基酸殘基基團(tuán)(部分1和部分2)之間，這兩個(gè)基團(tuán)具有一系列的帶電荷的殘基。部分1和2與識(shí)別位點(diǎn)一起如此構(gòu)建，從而導(dǎo)致具有有著特殊的分子靜電勢(shì)分布的三維(3-D)結(jié)構(gòu)。因此，該傳感器具有分子偶極矩μ。作為上述的翻譯后活性的結(jié)果，識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)的修飾殘基X轉(zhuǎn)變?yōu)樾揎棜埢鵛*。靜電勢(shì)分布和傳感器偶極矩μ*因而發(fā)生變化(圖1B)。傳感器的物理-化學(xué)特性的這些變化借助于電學(xué)或光學(xué)方法(見(jiàn)下文)進(jìn)行檢測(cè)。
在本發(fā)明的一個(gè)變化形式中，傳感器可以借助于柔韌的銜接物3和結(jié)合基團(tuán)(His-tag)而固定在用Ni-NTA樹(shù)脂涂覆的固體5上(圖1)，所述固體5為玻璃表面、塑料球或電介質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個(gè)變化形式中，可以直接在用電介質(zhì)涂覆的固體表面上合成傳感器。
在本發(fā)明的另外一個(gè)變化形式中，可以將傳感器以分子形式溶解在水中。
圖2顯示了用于使用該傳感器依據(jù)樣品的光學(xué)特性變化來(lái)檢測(cè)翻譯后活性的方法的示意圖。具有液體樣品的檢測(cè)室(測(cè)量室8)和傳感器位于偏振光 的光源和光分析器9之間。兩塊薄玻璃板在內(nèi)部用金涂層和電介質(zhì)覆蓋。它們用作接觸電極。所檢測(cè)的光的強(qiáng)度變化ΔI與cos2α成正比(α是偏振光 的旋轉(zhuǎn)角度)ΔI～cos2α (1)在電壓存在下，傳感器的偶極分子由于熱運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)排列。電場(chǎng)E引起偶極的部分對(duì)齊，因?yàn)槠渑c根據(jù)玻耳茲曼統(tǒng)計(jì)力求使得偶極定向隨機(jī)分布的分子的熱運(yùn)動(dòng)相互競(jìng)爭(zhēng)。在通常的測(cè)量條件，μE＜＜kT下，可以如下計(jì)算電場(chǎng)方向上的平均力矩 其中，μ是單個(gè)分子的偶極矩，μE是電場(chǎng)方向上的表觀平均偶極矩，E是電場(chǎng)強(qiáng)度，T是絕對(duì)溫度，k＝1.3807×1023JK-1。因?yàn)槠窆獾男D(zhuǎn)度數(shù)與具有傳感器的樣品的光活性成正比，而樣品的光活性另一方面與電場(chǎng)方向上的分子數(shù)目成正比，所以得到ΔI～cos2α～N＝μE/μ＝μE/3kT (3)如果由于翻譯后活性而引起分子偶極矩發(fā)生變化，那么這會(huì)導(dǎo)致所檢測(cè)的光強(qiáng)度的變化。
根據(jù)另一種用于檢測(cè)翻譯后活性的變化形式，測(cè)量具有傳感器的液體樣品的介電常數(shù)(介電常數(shù))。如從圖3A中所見(jiàn)的，樣品存在于用作電容器的檢測(cè)室(測(cè)量室11)中。通過(guò)在電容器平板之間引入極化電介質(zhì)而將真空中的電場(chǎng)強(qiáng)度E0減少P/ε0E＝E0-P/ε0(4)其中，E0＝E/ε，P為具有介電常數(shù)ε的電介質(zhì)的誘導(dǎo)的極化強(qiáng)度。
得到ε＝ε0+P/E(5)因?yàn)闃O化強(qiáng)度具有每個(gè)體積單位的偶極矩的含義，所以P與表觀平均偶極矩μE成正比，表觀平均偶極矩μE根據(jù)等式(2)為μE＝μ2E/3kT，由此得到εε＝ε0+μ2/kT (6)如果偶極矩由于翻譯后修飾而改變，那么這根據(jù)等式(6)就會(huì)導(dǎo)致介電常數(shù)的變化。
如果將傳感器分子(s)溶解在水(w)或其他溶劑中，必須注意這些溶劑的摩爾極化強(qiáng)度P＝Pw·xW+PS·xS(7)其中，xS是傳感器的摩爾份數(shù)，xS＝nS/(nw+nS)，和xW是水的摩爾份數(shù)，xW＝nW/(nw+nS)。
圖3B顯示了對(duì)于兩個(gè)合成的模擬肽S1和S2(表1)的介電常數(shù)變化的例子。
將溶解在水中的多肽(S1)或(S2)作為電介質(zhì)放置在測(cè)量電容器(測(cè)量室11)的電極板之間，見(jiàn)圖3A。多肽ELDVPIPGRFDRRVSVAAD(S1)是催化絲氨酸磷酸化的蛋白激酶A的特異性底物。多肽ELDVPIPGRFDRRVpSvAAD(S2)的絲氨酸的去磷酸化由磷酸酶PP2B來(lái)進(jìn)行。未磷酸化的多肽(S1)的介電常數(shù)ε3為76，而磷酸化的多肽(S2)的介電常數(shù)減小為70。因此，這種方法使得能夠檢測(cè)酶的活性。
為了通過(guò)測(cè)量相對(duì)介電常數(shù)ε而在試驗(yàn)中檢測(cè)肽修飾，還要補(bǔ)充在測(cè)量電容器的電極板之間直接引入4μl各具有多肽S1(未磷酸化的)或S2(磷酸化的)(表1)的樣品，其以1.14mM的濃度溶解在H2O中。介電常數(shù)ε的測(cè)量在t＝23℃的溫度下進(jìn)行。在本實(shí)施例中，最小的樣品體積不應(yīng)位于4μm之下。蛋白質(zhì)濃度必須位于毫摩爾范圍之內(nèi)，這一濃度范圍限制了這些測(cè)量方法用于生物芯片的應(yīng)用。
為了能夠?qū)⑦@些測(cè)量方法用于生物芯片，開(kāi)發(fā)出了差異電容測(cè)量，此測(cè)量將樣品體積減小至0.5μl以下，以及將蛋白質(zhì)濃度減少至10-5M。圖4A和4B顯示了這種差異測(cè)量的結(jié)果。特別有利的是位于ms范圍內(nèi)的這種電測(cè)量的高時(shí)間分辨率，這取決于樣品引入的速度。因此，這些方法使得不僅能夠在小液體樣品中檢測(cè)修飾活性，而且能夠記錄其動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
關(guān)于用于差異測(cè)量的裝置的結(jié)構(gòu)可參見(jiàn)圖4A。該測(cè)量裝置由頻率發(fā)生器12，整合入芯片板(Chip-Platte)中的測(cè)量電容13、14，增強(qiáng)器15和交流/直流轉(zhuǎn)換器(AC/DC轉(zhuǎn)換器)16構(gòu)成。與測(cè)量電容13和14的電容的差異成正比的輸出信號(hào)的幅度借助于AC/DC轉(zhuǎn)換器而轉(zhuǎn)變成直流電壓差異ΔU。這一直流電壓差異ΔU通過(guò)記錄儀而被記錄下來(lái)(見(jiàn)圖4B和4C)，或者借助于模擬/數(shù)字轉(zhuǎn)換器接入數(shù)字評(píng)測(cè)系統(tǒng)中。
圖4B顯示了使用用于蛋白激酶A活性的傳感器(ELDVPIPGRFDRRVSVAAD(S1))和用于磷酸酶PP2B活性的傳感器(ELDVPIPGRFDRRVpSVAAD(S2))的差異測(cè)量。
圖4C顯示了使用用于酪氨酸激酶活性的的傳感器(EIYETDYYD(S3))和用于酪氨酸磷酸酶活性的傳感器(EIpYETDpYpYD(S4))的差異測(cè)量。
所有的傳感器都是以20μM的濃度溶解在H2O中，并且涂覆在測(cè)量電容器C1 13或C2 14中(見(jiàn)圖例)。樣品體積為0.5μl。所有的測(cè)量均在室溫下進(jìn)行。
根據(jù)用于檢測(cè)翻譯后活性的本發(fā)明的另一種變化形式，將溶解在水中的多肽(S1)或(S2)作為底物裝入測(cè)量室中，該測(cè)量室具有電感L和電容C，并用作振蕩器(圖5)。振蕩器的頻率ω由ω＝1/LC確定，其可以高精確度(10-5)測(cè)量。當(dāng)樣品含有磷酸化的多肽S2而不是未磷酸化的多肽S1時(shí)，可看到頻率的明顯減小(圖5)。
為了通過(guò)測(cè)量振蕩器的頻率偏移來(lái)檢測(cè)肽修飾，在試驗(yàn)中如下進(jìn)行操作將裝有150μ1具有未磷酸化的多肽S1或磷酸化的多肽S2的樣品(在H2O中的濃度為1.14mM)的小管作為核心放置在振蕩器的感應(yīng)線圈中。頻率f在溫度t＝22℃時(shí)測(cè)得，f0＝5342.9kHz。
肽修飾還可以通過(guò)測(cè)量折射率來(lái)確定。根據(jù)磁學(xué)的麥克斯韋(Maxwell’schen)理論，在相對(duì)介電常數(shù)和于相同頻率下測(cè)得的折射率n之間存在如下關(guān)系ε＝ε/ε0＝n2。這使得能夠通過(guò)折射率的變化來(lái)檢測(cè)由翻譯后活性引起的分子偶極矩的變化n＝(1+μ2/kTε0)1/2(8)由于來(lái)自細(xì)胞或生物體的液體樣品是非常復(fù)雜的，和具有許多蛋白質(zhì)和更小極化分子，因此這導(dǎo)致此類樣品的上述物理-化學(xué)特性的很大的可變性。為了在復(fù)雜的液體樣品中檢測(cè)翻譯后活性，重要的是實(shí)施差異測(cè)量。介電常數(shù)、折射率和光強(qiáng)度例如可以作為具有和沒(méi)有傳感器的樣品或者在用傳感器溫育之前和之后的樣品之間的差異而進(jìn)行檢測(cè)。
總結(jié)上述用于檢測(cè)翻譯后修飾活性的方法使得能夠用松開(kāi)的或固定的傳感器或者蛋白質(zhì)片段，在使用前面說(shuō)明的裝置系統(tǒng)的情況下，在溶液中檢測(cè)蛋白激酶活性和磷酸酶活性。
由于處于經(jīng)修飾的和未經(jīng)修飾的狀態(tài)下具有不同的分子偶極矩，因此通過(guò)翻譯后修飾活性的差異電容測(cè)量能夠?qū)悠敷w積減小至0.5μl以下，以及將傳感器多肽濃度減少至10-5M。因此，所述方法使得能夠在最小的樣品體積中測(cè)定幾種修飾活性，并記錄其動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
開(kāi)發(fā)出的用于差異電容測(cè)量的電子系統(tǒng)使得能夠以有效的、不復(fù)雜的、快速的和低成本的方式檢測(cè)翻譯后修飾活性。
本發(fā)明的應(yīng)用范圍涉及制藥工業(yè)(大規(guī)模和中等規(guī)模的企業(yè))、醫(yī)學(xué)診斷和基礎(chǔ)研究，以及涉及生物技術(shù)企業(yè)，其具有下列目標(biāo)·改善和優(yōu)化用于新合成的和已經(jīng)存在的化合物的高通量測(cè)試系列·在臨床前研究工作中研究它們對(duì)于蛋白激酶活性和磷酸酶活性的抑制作用。
需要強(qiáng)調(diào)的本發(fā)明方法的特點(diǎn)為·可能能夠測(cè)量幾種翻譯后修飾活性的動(dòng)力學(xué)·達(dá)到了測(cè)量非常不穩(wěn)定的修飾作用如組氨酸和精氨酸氨基酸殘基的磷酸化的前提條件。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)翻譯后修飾活性的方法，其特征在于，制備蛋白質(zhì)片段或多肽作為傳感器，所述蛋白質(zhì)片段或多肽由含有一系列帶電荷的殘基的氨基酸殘基(部分1和2)以及包含一個(gè)或多個(gè)修飾殘基(X)的識(shí)別位點(diǎn)組成，并具有分子靜電勢(shì)分布，其中以偶極矩來(lái)測(cè)量靜電勢(shì)分布，向傳感器添加酶，重新測(cè)量偶極矩，靜電勢(shì)的變化以及由此產(chǎn)生的偶極矩的變化就是翻譯后修飾活性的證明。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，氨基酸殘基(部分1和2)具有0-n的殘基數(shù)目和含有一系列的帶電荷的殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，具有一個(gè)或多個(gè)修飾殘基(X)的識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)識(shí)別基團(tuán)，該基團(tuán)使得能夠只通過(guò)特異的蛋白激酶或磷酸酶來(lái)進(jìn)行修飾基團(tuán)的轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，氨基酸殘基(部分1和2)與識(shí)別位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)修飾殘基(X)一起表現(xiàn)出具有制造者預(yù)先規(guī)定的分子靜電勢(shì)分布和分子偶極矩的3D結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的方法，其特征在于，合成的蛋白質(zhì)片段或者溶解在溶液中，或者放置在固體(5)上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，通過(guò)將靜電勢(shì)分布換算成其他的物理測(cè)量單位并以此表示，和以改變的其他物理測(cè)量單位的尺度測(cè)量或記錄靜電勢(shì)變化，來(lái)測(cè)量由于翻譯后修飾活性而引起的蛋白質(zhì)片段的分子靜電勢(shì)分布的變化。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和6的方法，其特征在于，基于差異電容測(cè)量，通過(guò)以ΔU測(cè)量或記錄變化來(lái)測(cè)定翻譯后修飾活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、6和7的裝置系統(tǒng)，其特征在于，適合于提供差異測(cè)量結(jié)果的測(cè)量設(shè)備作為該測(cè)定變化差異的裝置系統(tǒng)的組成部分，并任選地在該設(shè)備后串聯(lián)差異增強(qiáng)器(15)和隨后設(shè)置交流/直流轉(zhuǎn)換器(16)。
9.實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1、6、7和8的方法的裝置系統(tǒng)，其特征在于，將在修飾活性的結(jié)果中出現(xiàn)的變化通過(guò)本身已知的構(gòu)件轉(zhuǎn)化成模擬的物理測(cè)量結(jié)果，和考慮到數(shù)字評(píng)測(cè)在這些構(gòu)件后串聯(lián)一個(gè)模擬/數(shù)字轉(zhuǎn)換器。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在來(lái)自生物體細(xì)胞或具有測(cè)試化學(xué)藥品的小液體樣品中定性檢測(cè)翻譯后修飾活性的方法。作為翻譯后修飾的實(shí)例，可提及通過(guò)激酶和磷酸酶的蛋白質(zhì)的磷酸化－去磷酸化。所述方法的特征在于，合成蛋白質(zhì)片段或多肽作為傳感器。所述蛋白質(zhì)片段或多肽由含有帶電荷的氨基酸殘基的部分1和2以及具有一個(gè)或多個(gè)修飾殘基(X)的識(shí)別位點(diǎn)組成。因此，該傳感器具有特殊的靜電勢(shì)分布和偶極矩。通過(guò)添加酶來(lái)進(jìn)行傳感器的修飾，這與分子的靜電勢(shì)分布的偏移以及偶極矩的變化是相關(guān)的。電勢(shì)偏移是翻譯后修飾活性的一個(gè)證據(jù)。建議可以使用多種不同的裝置系統(tǒng)來(lái)實(shí)際施行該方法。本發(fā)明提供了一種快速、高度靈敏且有效的用于檢測(cè)不同類型的翻譯后活性的方法，該方法特別適合用于生物學(xué)多檢測(cè)系統(tǒng)(生物芯片和高通量篩選)的領(lǐng)域，和特別是用于藥物開(kāi)發(fā)、醫(yī)學(xué)診斷、基礎(chǔ)研究和環(huán)境保護(hù)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1768268SQ200480008623
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日
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