專利名稱：評估器官功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及評估器官功能的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及可視地分析和/或定量地測定關(guān)于微觀解剖學(xué)定向(microanatomicalorientation)血管系統(tǒng)和/或排出途徑的多個(gè)指標(biāo)的方法。
背景技術(shù)：
盡管威斯康星大學(xué)溶液的使用已經(jīng)改善了肝臟移植的平均保存時(shí)間，但是原發(fā)性移植物無功能和最初的功能低下的發(fā)生仍在持續(xù)(1-3)。這種功能障礙的臨床發(fā)生率和產(chǎn)生的移植物存活損失取決于保存時(shí)間(1-4)。在延長的冷局部缺血之后的再灌注損傷是引起移植物衰竭的關(guān)鍵點(diǎn)。在保存期間，肝細(xì)胞膨脹并形成氣泡(6-8)。在再灌注時(shí)，在實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的這些變化被恢復(fù)，而不引起它們的不可逆損傷(6-8)。另一方面，竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞喪失了它們的生存力，枯否細(xì)胞被活化(6-10)。根據(jù)使用保存在UW溶液中的大鼠肝臟移植物的上述的研究，當(dāng)竇狀隙細(xì)胞出現(xiàn)變化時(shí)的臨界保存時(shí)間長于約16小時(shí)(6，7)。在這些移植物中，細(xì)胞受到損傷，引起血小板捕集(10)、纖維蛋白沉積(11)和白細(xì)胞邊緣化(margination)(12)。在保存較短時(shí)間的移植物中，據(jù)報(bào)道肝臟ATP含量在再灌注后很好地恢復(fù)，暗示實(shí)質(zhì)細(xì)胞是存活的(13，14)。
除了這些數(shù)據(jù)之外，還沒有仔細(xì)地調(diào)查肝細(xì)胞是否喪失它們的功能而不顯示出不可逆的損傷，然后干擾整體的移植物功能。盡管在上述研究(13-15)中測量了膽汁排出量、牛磺膽酸和溴磺基酞(bromosulfophtalein)的清除率，即使當(dāng)保存時(shí)間延長到18個(gè)小時(shí)，他們未能證明肝細(xì)胞中的這種功能改變(13)。除了這些研究之外，關(guān)于冷局部缺血后移植物排出膽汁成分的能力方面的改變，僅獲得了很少的信息。這些指標(biāo)包括肝細(xì)胞產(chǎn)生用于膽汁形成的滲透驅(qū)動(dòng)力、排出膽汁鹽或有機(jī)陰離子的能力；因而，谷胱甘肽和膽紅素的排出可以充當(dāng)檢測移植物中早期肝細(xì)胞變化的標(biāo)記。排出有機(jī)陰離子的能力可以確定移植物解毒生物異源物質(zhì)的效力和冷局部缺血后高膽紅素血癥的嚴(yán)重度，臨床移植中異體移植物功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)(2，16)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種評估器官功能的方法?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人繼續(xù)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
在嘗試測定冷局部缺血后移植物的這種能力時(shí)，我們在此檢驗(yàn)了與保存時(shí)間有關(guān)的膽汁樣品的成分方面的變化，顯示了作為肝細(xì)胞上的早期事件的、減少的谷胱甘肽和膽紅素的排出。這個(gè)事件被證明是廣譜抗藥性相關(guān)蛋白2(Mrp2)的細(xì)胞質(zhì)重定位的結(jié)果，蛋白2是一種用于有機(jī)陰離子的膽汁排出的ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。我們的結(jié)果表明，這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能被減弱了，而移植物明顯維持了它們的整體能量耗費(fèi)，沒有顯示任何顯著的肝細(xì)胞損傷。此外，這種肝細(xì)胞方面的變化的機(jī)制看起來涉及移植物中枯否細(xì)胞中的血栓烷合成，所述移植物處于相當(dāng)短時(shí)間的冷局部缺血條件下；即8小時(shí)。
本申請?zhí)峁┝艘韵掳l(fā)明(1)一種分析器官或組織損傷的方法，包括以下步驟(a)用染料標(biāo)記器官或組織；(b)獲得關(guān)于所述器官或組織的生物異源物質(zhì)代謝和/或細(xì)胞狀況的多個(gè)指標(biāo)；和(c)從所述指標(biāo)分析所述器官或組織損傷。
(2)(1)的方法，其中所述器官或組織是選自肝、腎、肺、胰腺和胃腸道的至少一種。
(3)(1)或(2)的方法，其中所述步驟(b)進(jìn)一步包括獲得血管系統(tǒng)和/或排出途徑的微觀解剖學(xué)定向的步驟。
(4)(1)到(3)中任一項(xiàng)的方法，其中所述分析可視地和/或定量地進(jìn)行。
(5)(1)到(4)中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞狀況是選自細(xì)胞生存力、細(xì)胞損傷、分子轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體功能的至少一種。
(6)一種評估藥物毒性的方法，包括以下步驟(a)用染料標(biāo)記器官或組織；(b)對所述器官或組織施用測試藥物；
(c)獲得關(guān)于所述器官或組織的生物異源物質(zhì)代謝和/或細(xì)胞狀況的多個(gè)指標(biāo)；(d)從所述指標(biāo)分析所述器官或組織損傷；和(e)評估所述藥物是否對所述器官或組織具有毒性。
(7)(6)的方法，其中所述器官或組織是選自肝、腎、肺、胰腺和胃腸道的至少一種。
(8)(6)或(7)的方法，其中所述步驟(b)進(jìn)一步包括獲得血管系統(tǒng)和/或排出途徑的微觀解剖學(xué)定向的步驟。
(9)(6)到(8)中任一項(xiàng)的方法，其中所述分析可視地和/或定量地進(jìn)行。
(10)權(quán)利要求6到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞狀況是選自由細(xì)胞生存力、細(xì)胞損傷、周圍細(xì)胞中的分子轉(zhuǎn)運(yùn)、生物活性化合物的產(chǎn)生、血流和組織氧化的至少一種。
附圖的簡要說明附

圖1顯示了經(jīng)歷了冷保存和隨后的再灌注的肝臟移植物的膽汁排出量的時(shí)間曲線?？招膱A圈表示來自非局部缺血對照肝臟的數(shù)據(jù)?？招牡?、陰影的和實(shí)心的方形表示來自分別暴露于8、16、24小時(shí)冷保存條件的移植物的數(shù)據(jù)。實(shí)心三角形表示來自48小時(shí)保存的移植物的數(shù)據(jù)。數(shù)值是5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。TC(+)和TC(-)在存在和不存在30μmol/L?；悄懰徕c的情況下收集的數(shù)據(jù)。R開始再灌注。注意到，膽汁鹽非依賴性和依賴性的排出量，在16小時(shí)保存的移植物中都下降了。*與來自對照的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。與來自16小時(shí)移植物的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。#與來自24小時(shí)移植物的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。
附圖2顯示了持續(xù)的冷局部缺血對膽汁成分的膽汁濃度的影響。膽汁成分的數(shù)據(jù)是在開始再灌注后20分鐘收集的。A膽汁鹽(圖表A)。B磷脂。C膽汁中還原谷胱甘肽(GSH)的濃度。D再灌注之前和20分鐘之后在對照和16小時(shí)保存的移植物中測量的GSH的肝臟含量。E膽汁中膽紅素(BR)-IXα的濃度。F再灌注之前和20分鐘之后在對照和16小時(shí)保存的移植物中測量的BR-IXα的肝臟含量。數(shù)值是5-7個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。*與來自對照肝臟的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。#與來自16小時(shí)組的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。與來自暴露于20分鐘再灌注的對照移植物的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。
附圖3顯示了冷局部缺血-再灌注的移植物中，在肝細(xì)胞羧基熒光素(CF)排入膽小管的動(dòng)力學(xué)方面的改變。A在消除丙磺舒之前(基礎(chǔ)加載)、10分鐘和25分鐘之后記錄的小管CF排出的代表圖。注意到，在24小時(shí)冷局部缺血-再灌注的移植物(箭頭)中，膽小管網(wǎng)絡(luò)的蜂巢模式的破裂。彩條表示用已知CF濃度校準(zhǔn)了的熒光強(qiáng)度。條30μm。B膽小管網(wǎng)絡(luò)的再灌注誘導(dǎo)的破裂方面的差異，是通過保存在冷局部缺血各個(gè)持續(xù)時(shí)間的移植物中CF填充的多邊形的密度判斷的。*與來自對照肝臟的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。C顯示了組當(dāng)中相差不大的CF加載的起始肝細(xì)胞CF濃度。數(shù)值是5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。
附圖4顯示了通過使羧基熒光素(CF)的膽小管排出可視化的Mrp2功能體內(nèi)定量分析。A顯示來自單獨(dú)肝細(xì)胞的染料排出的代表性系列圖片。上圖來自在存在1.5mM丙磺舒(PB(+))的情況下灌注的移植物的圖象。下圖來自消除丙磺舒(PB(-))后獲得的圖象。注意到，在細(xì)胞中時(shí)間依賴性的熒光減少，之后是在周圍的膽小管中染料的濃縮和消失。保留在細(xì)胞中的染料是應(yīng)當(dāng)注意的。B肝細(xì)胞CF熒光的衰減。用丙磺舒處理(實(shí)心圓圈)或不用丙磺舒處理(空心圓圈)的移植物中肝細(xì)胞CF濃度，相對于時(shí)間半對數(shù)性地標(biāo)繪，從而直線代表了指數(shù)曲線。插圖標(biāo)準(zhǔn)曲線表示了CF的濃度和8位灰度水平之間的關(guān)系。[CFapp]CF的表觀濃度。在小于3μmol/L的濃度下CF濃度與灰度水平線性相關(guān)(r2＝0.996，p＜0.05)。C來自肝細(xì)胞的CF排出的半衰期(T1/2)方面的差異。數(shù)值是每個(gè)組中5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。*與來自對照肝臟的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。EHBR從Eisai高膽紅素血癥大鼠分離的移植物。PB用1.5mM丙磺舒灌注的移植物。
附圖5顯示了在冷局部缺血-再灌注時(shí)肝臟移植物將羧基熒光素(CF)排入膽汁的能力方面的改變。A在暴露于變化的冷局部缺血持續(xù)時(shí)間的移植物中膽汁CF排出的時(shí)間差異?？招膱A圈在消除1.5mM丙磺舒—一種Mrp2抑制劑后立即灌注的對照移植物?？招暮完幱胺叫畏謩e經(jīng)歷了8小時(shí)和24小時(shí)冷保存，隨后在不存在丙磺舒的情況下再灌注的移植物。陰影圓圈在存在丙磺舒的情況下標(biāo)準(zhǔn)再灌注的移植物。實(shí)心圓圈從Eisai高膽紅素血癥大鼠分離的標(biāo)準(zhǔn)灌注的移植物。數(shù)值是5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。T0灌注液中消除丙磺舒的時(shí)間。插圖CF濃度和熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系。B在變化的再灌注持續(xù)時(shí)間收集的膽汁中相對CF濃度方面的改變，和枯否細(xì)胞(KC)的損耗的影響。左圖在對照(0小時(shí)，虛線)和8小時(shí)保存的肝臟移植物(8小時(shí)，實(shí)線)之間膽汁CF排出的衰減方面的差異。右圖通過靜脈注射脂質(zhì)體密封的二氯亞甲基二膦酸(LDD)耗盡KC的影響?？招膱A圈對照(0小時(shí)，虛線)?？招姆叫?小時(shí)保存的移植物(8小時(shí)，實(shí)線)。數(shù)據(jù)是來自4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的測量的平均值±SE。與對照肝臟中CF排除的衰減比較*P＜0.05。C在8小時(shí)冷保存的肝臟中通過LDD和/或用OKY-046(OKY)處理耗盡KC[KC(-)]對延長T1/2值的影響，OKY-046是一種血栓烷A2合酶的抑制劑。IM吲哚美辛。在保存和沖洗液中OKY和IM的濃度分別是240μmol/L和28μmol/L。注意到，在KC耗盡的移植物中OKY的抑制作用消失了。數(shù)值是5-6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。*與來自對照肝臟的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。與8小時(shí)保存的移植物中的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。
附圖6顯示了在暴露于8小時(shí)冷局部缺血和60分鐘再灌注(8小時(shí)/R)的肝臟移植物中Mrp2的細(xì)胞內(nèi)分布的破裂，枯否細(xì)胞(KC)耗盡步驟[KC(-)]或用OKY-046(OKY)處理的影響。A用抗丙烯醛單克隆抗體5F6對Mrp2的Western印跡分析和免測沉淀。M分子標(biāo)記。BMrp2分布的免疫熒光分析。左圖使用藻紅蛋白標(biāo)記的抗Mrp2單克隆抗體(M2III-6)的單著色。條30μm。右圖使用FITC標(biāo)記的ZO-1抗體和藻紅蛋白標(biāo)記的M2III-6抗體的雙免疫著色。條10μm。C.肝細(xì)胞的Mrp2定位的半定量分析。％I-Mrp2(cyt/bc)；對比在膽小管測量的那些，Mrp2相關(guān)的免疫反應(yīng)性的細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)度。數(shù)值是來自4個(gè)獨(dú)立肝臟的40-60個(gè)肝細(xì)胞/移植物中的測量的平均值±SE。*與來自對照肝臟的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。與從8hr/R-KC(+)組收集的數(shù)據(jù)比較P＜0.05。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
盡管枯否細(xì)胞(KC)已經(jīng)被認(rèn)為在冷局部缺血后肝細(xì)胞的損傷中起到?jīng)Q定性的作用，它們在非壞死性移植功能障礙中的作用仍是未知的。這項(xiàng)研究目的是闡明KC在冷局部缺血后肝臟移植物中所起的作用。用脂質(zhì)體密封的二氯亞甲基二膦酸處理或不處理的大鼠肝臟被保存在4℃的威斯康星大學(xué)溶液中8-24小時(shí)，在監(jiān)視膽汁排出量和成分的情況下再灌注，二氯亞甲基二膦酸是一種KC減耗劑。通過原位激光共焦微熒光自顯影評定肝細(xì)胞排出膽汁的能力。冷局部缺血-再灌注移植物在8小時(shí)降低了它們的膽汁排出量而沒有任何顯著的細(xì)胞損傷。這個(gè)事件與谷胱甘肽和膽紅素-IXα減弱的排除相符，暗示了這些有機(jī)陰離子的受抑制的轉(zhuǎn)運(yùn)。機(jī)制涉及廣譜抗藥性蛋白-2(Mrp2)的細(xì)胞內(nèi)重定位。羧基熒光素的膽汁排出的動(dòng)力學(xué)分析顯示了染料從肝細(xì)胞排出到膽小管中的顯著的延遲，所述羧基熒光素是經(jīng)由這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出的熒光探針。在8小時(shí)冷局部缺血移植物中，通過Mrp2從細(xì)胞質(zhì)重分配到小管膜，KC-耗盡治療顯著地減弱了這種由Mrp2介導(dǎo)的膽汁陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)方面的下降。此外，這些機(jī)制看起來涉及KC中的血栓烷A2合酶，因?yàn)樵贙C耗盡的移植物中，對于CF排出和Mrp2的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)在化，阻斷這種酶的改善的影響消失了?？傊?，這些結(jié)果表明，KC活化是非壞死性肝細(xì)胞功能障礙的重要決定因素，危害了冷局部缺血后移植物的解毒能力和有機(jī)陰離子代謝的穩(wěn)態(tài)。
在本說明書中，使用了一些縮寫B(tài)C，膽小管；BR-IXα，膽紅素-IXα；CF，5-羧基熒光素；CFDA，5-羧基熒光素雙醋酸鹽；EHBR，Eisai高膽紅素血癥大鼠；GSH，還原谷胱甘肽；KC，枯否細(xì)胞；LDD，脂質(zhì)體密封的二氯亞甲基二膦酸；Mrp2，廣譜抗藥性蛋白2；TXA2，血栓烷A2。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種分析器官或組織功能障礙和/或損傷的方法。所述方法包括以下步驟(a)用一種或兩種染料標(biāo)記所述器官或組織；(b)獲得表明細(xì)胞和/或器官功能的多個(gè)指標(biāo)，所述功能是關(guān)于分子轉(zhuǎn)運(yùn)和排出、生物異源物質(zhì)代謝和/或所述器官或組織的細(xì)胞狀況；和(c)從所述指標(biāo)分析所述器官或組織損傷。
在本發(fā)明中，器官或組織損傷是指壞死、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞質(zhì)膜的破裂。
為了在活體狀況下標(biāo)記器官或組織，可以采用使用染料(例如熒光染料、羅丹明或熒光素鹽或碘化丙錠)的常規(guī)方法。例如，這些染料可以采用對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靜脈注射或腹膜內(nèi)注射，或用受控的濃度血管內(nèi)灌注到肝臟、腎、胰腺、胃腸道或肺的分離的灌注器官制品，來加載。
多個(gè)指標(biāo)是指細(xì)胞生存力、線粒體膜電位、無氧的自由基、陰離子或陽離子的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞質(zhì)膜電位，和包括細(xì)胞凋亡或壞死的細(xì)胞死亡。多個(gè)指標(biāo)的實(shí)例包括，但不限于生物異源物質(zhì)代謝和細(xì)胞生存力。
生物異源物質(zhì)代謝是指在身體內(nèi)降解的任何類型的外源試劑或藥物的代謝和/或分解代謝。
細(xì)胞狀況是指活細(xì)胞的任何類型的功能狀態(tài)，包括分子轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周的分子轉(zhuǎn)運(yùn))、膜電位、線粒體功能、生物活性化合物的產(chǎn)生(生物活性物的產(chǎn)生)、血流和組織氧化、陰離子和陽離子的攝取和排出、和喪失了生存力，例如壞死或細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的狀態(tài)。細(xì)胞狀況的實(shí)例包括但不限于細(xì)胞生存力和細(xì)胞損傷。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語″胞和它們的包圍組織，例如微血管系統(tǒng)和細(xì)胞間隙，包括淋巴系統(tǒng)和/或結(jié)締組織(例如，肝臟中的膽小管系統(tǒng))之間的地理關(guān)系。因而，微觀解剖學(xué)定向的實(shí)施例包括但不限于肝臟中的膽小管網(wǎng)絡(luò)。
術(shù)語″動(dòng)脈、毛細(xì)血管和小靜脈。
術(shù)語″排放到細(xì)胞間隙中的途徑。
在本發(fā)明中，可以采用監(jiān)視整個(gè)器官的功能參數(shù)來可視地或定量地研究器官或組織損傷。術(shù)語″的定量信息的活體圖象。術(shù)語″的數(shù)值。整個(gè)器官功能參數(shù)包括但不限于膽汁排出量、膽汁成分例如膽汁酸、磷脂、膽固醇和碳酸氫鹽的測定。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種評估藥物毒性的方法。在本發(fā)明中，包括以下步驟(a)用染料標(biāo)記器官或組織；(b)對所述器官或組織施用測試藥物；(c)獲得關(guān)于所述器官或組織的生物異源物質(zhì)代謝和/或細(xì)胞狀況的多個(gè)指標(biāo)；和(d)從所述指標(biāo)分析所述器官或組織損傷；和(e)評估所述藥物是否對所述器官或組織具有毒性。
在本發(fā)明中，藥物毒性是指試劑或藥物對活細(xì)胞的任何類型的有害作用，包括已知酶或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。藥物的實(shí)例包括但不限于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑(例如，作為mrp2的抑制劑的丙磺舒、環(huán)孢素、阿霉素、順鉑、甲腈咪胍，等等)。
詞語″某些指標(biāo)來分析器官或組織損傷，可以評估藥物毒性。例如，當(dāng)任何ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能指標(biāo)變化時(shí)，評估為該藥物(例如，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)對所述器官或組織有毒性。當(dāng)所述指標(biāo)保持穩(wěn)定時(shí)，評估為該藥物(例如，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)對所述器官或組織沒有毒性。
本發(fā)明提供了證據(jù)，證據(jù)肝細(xì)胞進(jìn)行有機(jī)陰離子的Mrp2依賴性排出的減弱的能力，是顯示移植物功能障礙的早期事件的原因，所述移植物功能障礙由器官或細(xì)胞損傷，例如冷局部缺血和隨后的短時(shí)間再灌注所引起。在肝細(xì)胞上的這種變化是細(xì)微的和非壞死性的，但嚴(yán)重到足以引起整個(gè)移植物水平上谷胱甘肽和膽紅素的細(xì)胞生產(chǎn)和排出之間的不平衡。冷局部缺血的持續(xù)時(shí)間延長直到16小時(shí)，誘導(dǎo)了以膽小管的擴(kuò)張和消失為特征的膽小管功能障礙，而如果冷保存的持續(xù)時(shí)間不超過8小時(shí)，它們的多邊形網(wǎng)絡(luò)保持原樣。對我們的知識而言，這種暴露于相對短時(shí)間冷局部缺血的肝細(xì)胞的非壞死性功能障礙，是否是由包括KC的竇狀隙細(xì)胞的缺血后反應(yīng)所介導(dǎo)的，還是未知的。如在此所顯示的，經(jīng)由Mrp2的排出有機(jī)陰離子的降低的能力通過耗盡KC被完全地恢復(fù)，表明這種竇狀隙細(xì)胞涉及功能障礙的機(jī)制。
在8小時(shí)冷局部缺血后的移植物重Mrp2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)的損傷，是由這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的細(xì)胞質(zhì)重定位所引起的，但是既不是由膽小管網(wǎng)絡(luò)的破裂，也不是由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白本身的氧化修飾所引起的；這與我們的上述觀察結(jié)果相一致，所述觀察結(jié)果是8小時(shí)冷局部缺血和再灌注在肝臟移植物中沒有顯示任何顯著的氧化應(yīng)力(14)。cAMP是膽小管分選Mrp2的決定因子(32，40，41)，cAMP中的改變在KC介導(dǎo)的功能障礙中不太可能起到作用，因?yàn)椴还苁欠翊嬖贙C其含量沒有不同。ATP的肝細(xì)胞含量是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的另一個(gè)決定因素，但可能起到很小的作用，即使起到作用，在機(jī)制方面，因?yàn)樵诮?jīng)歷了8小時(shí)冷局部缺血的KC耗盡的和對照移植物之間，任何差異都是顯著的。由于在正常肝臟中KC耗盡不改變Mrp2排出有機(jī)陰離子的能力，在移植物中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的這種改變看來是由KC的反應(yīng)所引起，除非移植物經(jīng)歷了冷局部缺血-再灌注這種反應(yīng)不會(huì)被觸發(fā)。盡管詳細(xì)的機(jī)制仍是未知的，當(dāng)前的結(jié)果表明涉及TXA2合酶，這是一種與TX有關(guān)的酶，TX是從KC釋放的前列腺素類化合物的主要類別(37，38)。在KC耗盡的移植物中酶抑制劑的阻礙效果被完全消除了，這種觀察結(jié)果使我們想到，KC構(gòu)成了TX的主要來源，TX觸發(fā)了Mrp2進(jìn)入肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)在化。盡管TXA2被認(rèn)為對各種類型的細(xì)胞發(fā)揮了強(qiáng)烈的生物學(xué)作用，上述研究提供了一種證據(jù)，TXA2的相對穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2，能夠激活非溶酶體蛋白酶，從而觸發(fā)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞的水泡形成(42)。因而，KC衍生的TX影響肝細(xì)胞功能的進(jìn)一步的機(jī)制是必需的。
根據(jù)用受控量的CF預(yù)加載的移植物新開發(fā)的染色排阻分析方法顯示，Mrp2的重定位在肝細(xì)胞水平發(fā)生，因襲整個(gè)移植物功能的顯著退化。如附圖3中所見，8小時(shí)的保存顯著地降低了膽汁的谷胱甘肽排出，而沒有顯示組織含量方面的任何變化，如果有的話。因?yàn)檫@種有機(jī)陰離子充當(dāng)了產(chǎn)生不依賴膽汁酸的膽汁形成的滲透驅(qū)動(dòng)力的主要物質(zhì)，在膽汁中它的減少會(huì)引起排出量方面的下降。這種觀點(diǎn)也與我們的觀察結(jié)果相符，8小時(shí)保存的移植物顯示了排出量的明顯減少。
關(guān)于這點(diǎn)，在移植物中BR-IXα的內(nèi)源產(chǎn)生和膽汁排出之間的不平衡在當(dāng)前的研究中是非常令人感興趣的。如附圖2所示，在灌注的20分鐘內(nèi)對照肝臟可以排出約75％的內(nèi)源BR-IXα到膽汁中，與我們的上述研究相符(24)。另一方面，膽汁色素的這種快速消除在16小時(shí)冷局部缺血性移植物中沒有發(fā)生。根據(jù)BR-IXα的膽汁濃度判斷(附圖2F)，色素的絕對量升高了，但與非冷局部缺血的對照移植物相比決沒有減少。由于釋放到循環(huán)中的BR-IXα的量可以忽略(數(shù)據(jù)未顯示)，這些結(jié)果表明，冷局部缺血的移植物在最初的20分鐘再灌注期間，比根據(jù)將色素排入膽汁的能力所預(yù)期的那些，合成了更多量的色素。這種觀點(diǎn)與我們的觀察結(jié)果很好地一致，移植物誘導(dǎo)了血紅素加氧酶-1，血紅素降解的壓力誘導(dǎo)酶(43)。從冷局部缺血后的移植物的抗氧化應(yīng)力反應(yīng)來看，這個(gè)事件具有病理生理學(xué)的重要性。近來我們報(bào)道了，低劑量的膽紅素可以改善氧化應(yīng)力，從而保護(hù)冷局部缺血后的肝臟移植物，盡管它的過度劑量是明顯有害的(31，43)。在暴露于冷局部缺血的移植物中，再灌注會(huì)引起兩個(gè)重要的事件，關(guān)鍵性地支配肝臟的膽紅素代謝；提高血紅素降解和經(jīng)由Mrp2的BR-IXα延遲因而，這兩個(gè)事件的組合作用會(huì)引起這種抗氧化劑積累到足以保護(hù)肝細(xì)胞，而在再灌注的后期它們的延續(xù)效果引起肝細(xì)胞的損傷和高膽紅素血癥。
KC充當(dāng)了類二十烷酸的強(qiáng)力產(chǎn)生者，而肝細(xì)胞和在它們的膜上表達(dá)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分別幫助了它們的降解和排除(38，39)。另一方面，在冷局部缺血后的移植物中，抗氧化劑有機(jī)陰離子，例如谷胱甘肽和膽紅素，為它們向膽汁的排出共用Mrp。因而，在KC介導(dǎo)的類二十烷酸合成和從肝細(xì)胞中除去它們之間的平衡可以決定抗氧化陰離子在周圍肝細(xì)胞中的重新分配，從而支配肝臟移植的功能結(jié)果。倘若谷胱甘肽和BR-IXα的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間動(dòng)力學(xué)的定量信息是可以獲得的，來檢測KC產(chǎn)生的血栓烷是否能充當(dāng)針對隨后的移植物氧化應(yīng)力的早期警報(bào)機(jī)制，KC介導(dǎo)的對Mrp介導(dǎo)的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)的改變值得進(jìn)一步研究。
實(shí)施例在下文中，參考以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例的限制。
材料和方法動(dòng)物制備在此描述的實(shí)驗(yàn)方案是經(jīng)Keio醫(yī)科大學(xué)的動(dòng)物關(guān)照委員會(huì)提供的我們的制度原則批準(zhǔn)的。雄性Wistar大鼠(220-260g，CLEAJapan，Tokyo)和Eisai高膽紅素血癥大鼠(EHBR)(220-260g，Sankyo Inc.，Tokyo)容許自由取得實(shí)驗(yàn)室食物和飲用水，在實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)被禁食。這些大鼠的肝臟在體外用充氧的Krebs-Henseleit緩沖液作為基線灌注液進(jìn)行灌注(17，18)，保存在4℃威斯康星大學(xué)溶液中持續(xù)希望的時(shí)長(14)。必要時(shí)，在根據(jù)我們的上述研究制備用于冷保存的體外肝臟灌注物之前24小時(shí)，靜脈注射脂質(zhì)體密封的二氯亞甲基二膦酸(LDD)預(yù)先處理大鼠(14，19)。如先前描述的，通過免疫組織化學(xué)判斷，這個(gè)步驟幾乎完全地消除了枯否細(xì)胞(20)。冷保存之后，用40ml的乳酸鹽Ringer溶液的轉(zhuǎn)運(yùn)注射劑輕輕地沖洗移植物，用含有或不含30μmol/L牛磺膽酸鈉的充氧的緩沖液，以單程的模式恒流(32mL/min)灌注(14，21)。對于某些實(shí)驗(yàn)，以期望的濃度向UW溶液以及沖洗溶液中添加OKY-046或吲哚美辛(IM)，OKY-046是血栓烷A2(TXA2)合酶的抑制劑，吲哚美辛是環(huán)加氧酶的抑制劑(22)。
膽汁和組織成分確定用膽汁樣品測定總膽汁鹽、磷脂、還原谷胱甘肽(GSH)和膽紅素-IXα(BR-IXα))的濃度(23，24)。通過使用24G7的酶聯(lián)免疫吸附測定測定BR-IXα(24)。這個(gè)單克隆抗體可以識別BR-IXα，BR-IXα是特別地經(jīng)由較早描述的HO反應(yīng)產(chǎn)生的末端血紅素降解產(chǎn)物(24，25)。按較早的描述測定乳酸脫氫酶(LDH)的活性(17)。在肝臟移植物中的腺苷三磷酸(ATP)通過在其他地方描述的熒光素/熒光素酶法測定(14，21)。移植物中的環(huán)AMP通過酶聯(lián)免疫吸附分析測定(BiotrakTM系統(tǒng)，Amersham Biosciences，Buckinghamshire)。
羧基熒光素的膽汁排出率的分析羧基熒光素(CF)是通過Mrp2從各種細(xì)胞排出的有機(jī)陰離子(26，27)。這個(gè)染料的酯前體，CF雙醋酸鹽(CFDA)，在存在1.5mmol/L丙磺舒的情況下以50nmol/L轉(zhuǎn)運(yùn)地加載到肝臟上，丙磺舒是Mrp2的強(qiáng)力抑制劑(26，28)。這個(gè)試劑可以進(jìn)入肝細(xì)胞，通過酯酶被水解成CF，以排到膽汁中(14，17，29)。在CFDA加載10分鐘后，用無丙磺舒的緩沖液灌注肝臟以觸發(fā)CF排出到膽汁中。在冷局部缺血組中，保存的移植物在存在丙磺舒的情況下用含有緩沖液的CFDA加載10分鐘，之后除去丙磺舒，隨后再灌注50分鐘。從這些制備物收集的膽汁樣品進(jìn)行深度冷凍，直到使用96孔多通道熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光測量。在440nm的上照明之下進(jìn)行測量，產(chǎn)生510nm熒光的染料的等消光波長不受樣品pH值的干擾(26)。樣品中CF濃度用已知濃度的溶于磷酸鹽緩沖鹽水的CF進(jìn)行標(biāo)定。如稍后在結(jié)果中所見的，CF濃度似乎隨時(shí)間指數(shù)地下降。根據(jù)這個(gè)假定，膽汁CF的生命期被確定為指數(shù)式衰減的T1/2。因而，該方法對于加載到灌注的肝臟上的CF的初始量不敏感。
肝細(xì)胞CF排出的原位可視化使用上述方案用CF加載的肝臟移植物通過早先描述的活體激光共焦微熒光自顯影進(jìn)行觀察(14，20，30)。如稍后在結(jié)果中所見的，CF在存在丙磺舒的情況下被顯著地加載到肝細(xì)胞中。在除去試劑時(shí)，染料立即被肝細(xì)胞排出，排到膽小管(BC)中，顯示出蜂巢網(wǎng)絡(luò)，最終從實(shí)質(zhì)中消失。為了檢測染料排出是否取決于Mrp2的功能，一些移植物用含有1.5mmol/L丙磺舒的緩沖液再灌注。激光共焦微熒光自顯影通過裝備有加強(qiáng)CCD攝像機(jī)(C5810，Hamamatsu Photonics)和多孔激光共焦處理器(CSU-10，YokogawaElectric Co.)的反型顯微鏡(Diaphot 300，Nikon/Sankei))捕捉。所有的微熒光圖象都數(shù)字化處理為8位灰度水平圖象。為了校準(zhǔn)熒光強(qiáng)度，在試管內(nèi)制備已知的濃度的CF，在同樣的照相機(jī)光學(xué)參數(shù)下捕獲圖象。使用數(shù)字圖象處理器通過可變的方格(2×2μm2)測量肝細(xì)胞中的灰度水平(18，31)。在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析目標(biāo)顯微鏡視野中的至少10個(gè)不同肝細(xì)胞。假定在肝臟表面測量的熒光強(qiáng)度與在溶液中測量的相一致，使用標(biāo)定線將灰度水平轉(zhuǎn)變?yōu)橹庇^的CF濃度，稱為CFapp。
我們還進(jìn)行了形態(tài)測定來檢查BC網(wǎng)絡(luò)中的結(jié)構(gòu)變化作為肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)。如稍后在結(jié)果中所見的，功能正常的肝細(xì)胞以圍繞BC的多邊形CF填充為特征，而那些損傷的肝細(xì)胞通過圍繞BC網(wǎng)絡(luò)的部分消失來判斷。計(jì)算目標(biāo)區(qū)域中這種由CF填充的完整BC圍繞的完整肝細(xì)胞的數(shù)目。對于這種評估，在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析約0.05mm2的肝臟表面。
亞細(xì)胞Mrp2分配的免疫組織化學(xué)分析為了評估移植物的肝細(xì)胞中的Mrp2，根據(jù)上述研究，固定肝臟樣品，切片，用單克隆抗體M2III-6著色(32)。通過藻紅蛋白共軛的抗鼠IgG使切片上的抗原可視化，如在別處描述的通過激光共焦微熒光自顯影在488nm觀察(20，30)。為了檢測BC定位和Mrp2肝細(xì)胞內(nèi)在化，用針對ZO-1，在肝細(xì)胞連接點(diǎn)上表達(dá)的另一個(gè)標(biāo)記物的單克隆抗體對切面進(jìn)行雙免疫著色(33)。為了以半定量方式測定蛋白分配方面的變化，將Mrp2的單著色的微熒光圖象轉(zhuǎn)化為單色8位圖象(14)。在單個(gè)肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)和小管區(qū)都測量灰度水平(1-256)。在單個(gè)細(xì)胞上為每個(gè)區(qū)域選擇至少5個(gè)不同部位來計(jì)算細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)度相對相應(yīng)的小管強(qiáng)度的相對值。在4個(gè)不同移植物中的40-60個(gè)肝細(xì)胞中進(jìn)行這種測量，來構(gòu)建Mrp2相關(guān)的免疫反應(yīng)性的細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)度的百分比的直方圖，定義為％I-Mrp2(cyt/bc)。這個(gè)指標(biāo)的升高說明Mrp2內(nèi)在化方面的增加。在對照移植物和那些暴露于冷局部缺血的、有或沒有KC耗盡步驟、存在或不存在TXA2合酶抑制劑的移植物之間，比較直方圖。
為了檢查各組之間整個(gè)肝臟移植物中Mrp2表達(dá)方面的差異，用相同的單克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析。我們還通過用抗體M2III-6將蛋白免疫沉淀，接著用抗丙烯醛單克隆抗體(5F6)進(jìn)行Western分析，研究了Mrp2的氧化修飾方面的改變(34，35)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過就ANOVA和Fischer’s多重比較測試來確定不同實(shí)驗(yàn)組之中數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P＜0.05被認(rèn)為是顯著的。
結(jié)果在肝臟移植物中膽汁排出量的保存時(shí)間依賴性的降低為了測試肝臟移植物的生存力，測量靜脈的灌注液中乳酸脫氫酶的釋放，作為細(xì)胞溶解作用的指標(biāo)。如表1中所見，暴露于冷局部缺血少于24小時(shí)的移植物沒有顯示出乳酸脫氫酶的任何顯著的升高。
表1.冷保存的持續(xù)時(shí)間對于移植物的靜脈灌注液中LDH釋放的影響

數(shù)據(jù)表示的是在開始時(shí)(0分鐘)和開始再灌注60分鐘后(0-24小時(shí)；n＝5，48小時(shí)；n＝3)對移植物的測量的平均值±SE(mIU/min/g肝臟)。*與其他組的數(shù)值相比P＜0.05。
在48小時(shí)，乳酸脫氫酶的釋放在開始和60分鐘再灌注的結(jié)尾變得明顯的，顯示了在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下，在暴露少于24小時(shí)的冷局部缺血移植物中壞死性細(xì)胞死亡是不可檢測的。附圖1說明了在經(jīng)歷不同時(shí)長的冷局部缺血的移植物中膽汁排出量與再灌注時(shí)間有關(guān)的時(shí)間曲線。如在表盤A中可見，其中添加了?；悄懰徕c，暴露于8小時(shí)缺血的移植物升高了它們的排出量達(dá)到可與30分鐘的對照相比的水平，但在開始再灌注后50-60分鐘降低了。在暴露于延長的冷局部缺血16-48小時(shí)的移植物中，這種排出量的降低變得更加明顯。附圖1的表盤B顯示了在灌注液中不存在?；悄懰徕c的情況下監(jiān)視的膽汁恢復(fù)的時(shí)間曲線。可見，冷局部缺血處理長于16小時(shí)的組別顯示了排出量方面的顯著降低。
在冷局部缺血后的肝臟中谷胱甘肽和膽紅素的膽汁排出方面的改變經(jīng)歷了16和24小時(shí)冷局部缺血的移植物中膽汁流動(dòng)方面的顯著下降的觀察結(jié)果使我們確定膽汁成分是膽汁淤積變化的原因。附圖2說明了在開始再灌注后20分鐘測量的膽汁成分的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)作為冷局部缺血的保存時(shí)間的函數(shù)來繪制。可見，在任何長度的保存時(shí)間中膽汁鹽的濃度沒有展現(xiàn)出任何顯著降低，而在暴露于8到24小時(shí)冷局部缺血的組中，磷脂在濃度和流量方面都顯示了顯著的降低(附圖2A和2B)?？紤]到磷脂主要是從肝細(xì)胞排到膽區(qū)室中的，這些數(shù)據(jù)表明在保存長于8小時(shí)的移植物中肝細(xì)胞功能障礙的存在。
我們接下來在監(jiān)視GSH的組織含量的情況下檢查了GSH的膽汁排出(附圖2C)。在8小時(shí)GSH方面的膽汁濃度顯著地降低了，隨冷保存時(shí)間的延長而下降。然后我們檢查了GSH的肝臟含量如在附圖2D中所見，在再灌注前和再灌注20分鐘后肝臟GSH含量沒有變化。在保存了16小時(shí)的移植物中，作為使用含GSH的威斯康星大學(xué)溶液的結(jié)果，該含量表面上提高了。然而，在20分鐘再灌注時(shí)，在從循環(huán)中除去GSH時(shí)，該含量被快速地壓抑到對照水平，顯示了16小時(shí)冷局部缺血后的20分鐘再灌注沒有改變移植物中的基礎(chǔ)GSH含量。這些結(jié)果表明，只要保存時(shí)間短于16小時(shí)，在冷局部缺血后的肝臟中膽汁GSH排出方面的下降是由其向膽汁的轉(zhuǎn)運(yùn)所引起，而不是由其在移植物中的減少所引起。由于GSH是經(jīng)由Mrp2排出的，我們接下來檢查了BR-IXα的膽汁濃度方面的變化，BR-IXα是由同樣的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出的膽汁色素。如在附圖2F中所見，在8小時(shí)缺血組中在最初的20分鐘再灌注中BR-IXα的膽汁濃度顯著地升高了，在16小時(shí)保存的組中達(dá)到最大。最后，在經(jīng)歷了24小時(shí)冷局部缺血的移植物中，BR-IXα的初始濃度突然地降低了。附圖2F說明了移植物將內(nèi)源BR-IXα清除到膽汁中的能力。如在對照移植物中所見，這中膽汁色素的肝臟含量在最初的20分鐘灌注中顯著地降低了。另一方面，在16小時(shí)處理的移植物中相同持續(xù)時(shí)間的再灌注沒有引起這種下降。這些結(jié)果表明，16小時(shí)移植物產(chǎn)生BR-IXα的能力重新超過了它們將該色素排入膽汁的能力。
通過羧基熒光素排阻對Mrp2功能的全局和局部評定在GSH和BR-IXα的膽汁排出方面的改變提供了這樣的可能性，Mrp2從肝細(xì)胞中清除這些有機(jī)陰離子的能力在暴露于延長的冷局部缺血的移植物中被削弱了。然而，由于在各組之間谷胱甘肽和BR-IXα的初始量不同，對這些內(nèi)源陰離子的膽汁排出的測量不能容許我們對移植物的有機(jī)陰離子排出能力進(jìn)行公平的比較。為了克服了這個(gè)困難，用CF加載移植物，CF是一種外源有機(jī)陰離子，檢查它從肝細(xì)胞到膽汁的清除。如在附圖3A的左表盤所見，肝細(xì)胞的CF加載看來在暴露于不同的時(shí)長(0-24小時(shí))的冷局部缺血的移植物之中是可比較的。這在附圖3C中通過熒光強(qiáng)度測量被確認(rèn)，顯示了肝細(xì)胞是存活的。這同樣與顯示了不顯著的LDH釋放的結(jié)果相一致(表1)。丙磺舒是Mrp2的抑制劑，在除去丙磺舒后被立即加載到肝細(xì)胞中的CF，被快速地排到膽小管中，10分鐘內(nèi)在小葉上形成了蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)(附圖3A中中間的欄)。在25分鐘(右欄)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微小的熒光是可檢測的，如果有的話。在經(jīng)歷了冷局部缺血再灌注的移植物中，出現(xiàn)了膽汁CF排出方面的兩個(gè)主要變化根據(jù)在25分鐘基礎(chǔ)熒光的升高判斷的肝細(xì)胞染料排阻的延遲，和在10分鐘收集的顯微照片中顯示的膽小管網(wǎng)絡(luò)的消失和變形。在暴露于延長的冷局部缺血24小時(shí)的移植物中，這些變化變得明顯(附圖3A中的底端行)。
在10分鐘捕獲的這些微熒光圖象中對膽小管的部位的仔細(xì)掃描顯示了小管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)方面最小的、但可察覺的變化。如在附圖3B中所見，完全地被CF填充的BC圍繞的肝細(xì)胞的數(shù)目隨冷局部缺血持續(xù)時(shí)間的升高而降低。在保存了16小時(shí)的移植物中這種多角形的減少變得很明顯。由于在0到24小時(shí)之間的缺血持續(xù)時(shí)間內(nèi)，加載到肝細(xì)胞中的初始CF是可比較的，BC中的形態(tài)變化看來最初在16小時(shí)冷局部缺血時(shí)出現(xiàn)。換句話說，暴露于8小時(shí)冷局部缺血的移植物沒有展現(xiàn)出BC網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)學(xué)方面任何顯著的變化。
通過監(jiān)視移植物的肝細(xì)胞中熒光方面的時(shí)序變化，以定量的方式進(jìn)一步檢查CF排阻的延遲(附圖4A)?？梢姡?dāng)不斷地灌注丙磺舒時(shí)，染料留在細(xì)胞中，展現(xiàn)出輕微的下降而沒有顯示小管的排出。如在附圖4B中標(biāo)繪的，在肝細(xì)胞測量的灰度水平允許我們確定從干細(xì)胞排出的CF的T1/2。附圖4C說明了各組之間的T1/2值。在不存在丙磺舒的情況下，T1/2大約為6分鐘，而在存在丙磺舒的情況下，衰減實(shí)質(zhì)上被降低了，表明對Mrp2轉(zhuǎn)運(yùn)的接近完全的抑制?？梢?，8小時(shí)冷局部缺血的移植物排出CF的T1/2顯著地更高，范圍介乎對照值和在EHBR的肝臟中測量的值之間。可以推測，在這個(gè)突變物種中與丙磺舒處理的組相比更小的T1/2值是由于經(jīng)由Mrp3將染料代償性排出到竇狀隙間隔的結(jié)果(36)。
在8小時(shí)冷局部缺血的移植物中KC耗盡對膽汁CF排出的影響然后，我們嘗試評估8小時(shí)冷局部缺血的移植物整體上排出CF的能力。為此，測定染料排出的T1/2值(附圖5)。在除去丙磺舒(附圖5A中T0)后，膽汁中的CF濃度短暫地升高丙逐漸地回到基礎(chǔ)水平。在存在丙磺舒的情況下(陰影的圓圈)，或在分離自EHBR的移植物中(實(shí)心圓圈)都沒有觀察到這種短暫升高，表明Mrp2與膽汁CF排出有關(guān)。當(dāng)在保存8小時(shí)和16小時(shí)的整個(gè)肝臟移植物中分析CF排出時(shí)，衰減似乎比對照中的更慢。使用從8小時(shí)缺血移植物中收集的數(shù)據(jù)，根據(jù)再灌注時(shí)間標(biāo)繪膽汁樣品中CF濃度對比峰值(10分鐘)的對數(shù)值(附圖5B)。然后比較用KC耗盡和不用KC耗盡處理的移植物之間的染料排阻的T1/2值?？梢?，在未用LDD(KC(+))處理的肝臟中，與對照相比，8小時(shí)冷局部缺血展現(xiàn)了延長的T1/2值。在KC耗盡的移植物中，在兩個(gè)組別之間的T1/2方面的這種差異完全消失。應(yīng)注意的是，在非冷局部缺血的對照肝臟中，KC耗盡步驟本身不改變T1/2值，表明僅當(dāng)移植物經(jīng)歷了冷局部缺血-再灌注時(shí)KC耗盡的改善效果才變得明顯。
為了揭示這樣的機(jī)制，即在8小時(shí)冷局部缺血的移植物中的KC通過mrp2導(dǎo)致延長的CF排出，我們檢查了與血栓烷的關(guān)聯(lián)，血栓烷是在冷局部缺血條件后從活化的KC釋放的主要前列腺素類化合物(37，38)。為此，檢查OKY-046的影響，OKY-046是TXA2合酶的抑制劑。如在附圖5C中所見，以240μmol/L將這個(gè)試劑應(yīng)用到保存器和沖洗液中幾乎完全地消除了CF排出的T1/2值的增加。因?yàn)門XA2合酶抑制劑可能提高花生四烯酸合成其他前列腺素類化合物(例如PGE2和PGF2α)的可用性，我們檢查了吲哚美辛(IM)是否可以減小或增加T1/2值，吲哚美辛是抑制通過環(huán)加氧酶途徑，包括TX產(chǎn)生的所有前列腺素類化合物的抑制劑。如所示，這種抑制劑也幾乎完全地減弱了延長的T1/2值。此外，當(dāng)KC被耗盡時(shí)OKY-046對8小時(shí)冷局部缺血移植物的影響消失了，表明與TX的關(guān)聯(lián)是KC依賴性的。
8小時(shí)冷局部缺血的Mrp2細(xì)胞內(nèi)重定位和其由KC耗盡的衰減因?yàn)橐阎趦?nèi)毒素處理的肝臟中KC下調(diào)節(jié)Mrp2(39)，我們檢查了這種變化是否被牽涉到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能障礙的機(jī)制之中。如Western印跡分析所示，在8小時(shí)冷局部缺血的移植物中(附圖6A)以及24小時(shí)缺血的移植物中(數(shù)據(jù)未顯示)Mrp2蛋白的量不變。我們還檢查了蛋白本身是否由于缺血后的氧化損傷被氧化性地修飾。然而，根據(jù)使用抗丙烯醛抗體的免測沉淀法判斷，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化。然后，檢查了在8小時(shí)冷局部缺血的移植物中該蛋白的肝細(xì)胞定位是否被改變。如在附圖6B中所示，在8小時(shí)缺血-再灌注的移植物重，其在BC中的定位被顯著地降低了，而在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的背景熒光升高了。如在下方的表盤重所示，用ZO-1(綠色)的雙免疫著色揭示了，Mrp2(紅色)在BC中的共定位被顯著地破壞，而其在細(xì)胞質(zhì)中的強(qiáng)度升高，表明了蛋白的內(nèi)在化。在用KC耗盡或用OXY-046處理的移植物中這種變化被減弱了。而內(nèi)在化指標(biāo)的％I-Mrp2(cyt/bc)值顯示了，8小時(shí)的冷局部缺血-再灌注顯著地增強(qiáng)了Mrp2內(nèi)在化，用KC耗盡處理或用TXA2合酶的阻斷處理改善了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膽小管重定位。
我們測定了8小時(shí)冷局部缺血-再灌注后在KC(+)和KC(-)移植物中ATP和cAMP的肝臟含量差異，但在兩個(gè)組別中沒有任何顯著的意義(分別是ATP含量3.4±0.9 vs 2.9±1.1μmol/g肝臟，和cAMP含量8.9±1.0 vs 9.2±0.5pmol/g肝臟)。這些結(jié)果表明通過KC耗盡的這種ATP結(jié)合蛋白的細(xì)胞內(nèi)恢復(fù)的改善不是由ATP和cAMP的組織含量的改變引起的。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明對于恢復(fù)臨床前試劑是有用的，所述臨床前試劑早先因?yàn)槠淦鞴俣拘员环艞?。總的說來，在常規(guī)的臨床化學(xué)中顯示肝臟毒性的化合物的毒性的詳細(xì)機(jī)制很大程度上仍是未知的。如果通過本發(fā)明的方法詳細(xì)檢查這樣的化合物，發(fā)現(xiàn)僅阻斷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能而不影響細(xì)胞生存力，對于應(yīng)用于臨床用途對化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行微小修改將是有效的。(2)將當(dāng)前方法應(yīng)用于植入了人類癌細(xì)胞的免疫缺陷大鼠，容許我們檢查任何類型的藥物遞送的特異性和腫瘤細(xì)胞體內(nèi)聚集或到完整組織的積累。這種應(yīng)用對于檢查體外植入的癌癥中抗癌試劑的遞送和消除是極為有用的，因?yàn)檗D(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如mrp2的功能是腫瘤抗藥性的重要決定因素。用于篩選潛在的抗癌和抗血栓形成劑的潛力的臨床試驗(yàn)的應(yīng)用。
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為了各種目的，所有的文獻(xiàn)在此通過引用被合并。
權(quán)利要求
1.一種分析器官或組織損傷的方法，包括以下步驟(a)用染料標(biāo)記器官或組織；(b)獲得關(guān)于所述器官或組織的生物異源物質(zhì)代謝和/或細(xì)胞狀況的多個(gè)指標(biāo)；和(c)從所述指標(biāo)分析所述器官或組織損傷。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述器官或組織是選自肝、腎、肺、胰腺和胃腸道的至少一種。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述步驟(b)進(jìn)一步包括獲得血管系統(tǒng)和/或排出途徑的微觀解剖學(xué)定向的步驟。
4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的方法，其中所述分析可視地和/或定量地進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞狀況是選自細(xì)胞生存力、細(xì)胞損傷、分子轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體功能的至少一種。
6.一種評估藥物毒性的方法，包括以下步驟(a)用染料標(biāo)記器官或組織；(b)對所述器官或組織施用測試藥物；(c)獲得關(guān)于所述器官或組織的生物異源物質(zhì)代謝和/或細(xì)胞狀況的多個(gè)指標(biāo)；和(d)從所述指標(biāo)分析所述器官或組織損傷；和(e)評估所述藥物是否對所述器官或組織具有毒性。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述器官或組織是選自肝、腎、肺、胰腺和胃腸道的至少一種。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述步驟(b)進(jìn)一步包括獲得血管系統(tǒng)和/或排出途徑的微觀解剖學(xué)定向的步驟。
9.權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)的方法，其中所述分析可視地和/或定量地進(jìn)行。
10.權(quán)利要求6到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞狀況是選自細(xì)胞生存力、細(xì)胞損傷、周圍細(xì)胞中的分子轉(zhuǎn)運(yùn)、生物活性化合物的產(chǎn)生、血流和組織氧化的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分析器官或組織損傷的方法，包括以下步驟(a)用染料標(biāo)記所述器官或組織；(b)獲得關(guān)于所述器官或組織的生物異源物質(zhì)代謝和/或細(xì)胞狀況的多個(gè)指標(biāo)；和(c)從所述指標(biāo)分析所述器官或組織損傷。
文檔編號G01N33/50GK1859927SQ20048002829
公開日2006年11月8日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者末松誠 申請人:株式會(huì)社奧西珍尼克斯