專利名稱：用于癌癥診斷和治療的差異性表達的腫瘤特異性多肽的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用于癌癥的診斷、預后和治療的試劑和方法。具體地，本發(fā)明涉及使用編碼跨膜超家族成員6(TM4SF6)、突觸泡蛋白樣蛋白(SYPL)、stomatin樣2(STOML2)、Ras-相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白(RAGA)、核苷酸敏感的氯離子通道1A(CLNS1A)、朊病毒蛋白(p27-30)(PRNP)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β2-樣1(GNB2L1)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白4(GNG4)、整合膜蛋白2B(ITM2B)、整合膜蛋白1(ITM1)、跨膜9超家族成員2(TM9SF2)、鴉片受體樣1蛋白(OPRL1)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP4)、人腎小球上皮蛋白1(GLEPP1)、toll樣受體3(TLR3)、和/或透明帶糖蛋白3A(ZP3)的核酸和氨基酸序列用于早期和晚期非類固醇特異性癌癥的診斷、癌癥預后、以及篩選調(diào)節(jié)所述蛋白的基因表達和/或生物學活性的治療劑。本發(fā)明進一步涉及設計的用于抑制所述蛋白的基因表達和/或生物學活性的生物技術(shù)，包括使用這里所述的篩選試驗中所鑒定的試劑、反義多核苷酸序列的載體遞送以及所述蛋白的靶向抗體。在具體實施方案中，蛋白是人來源的蛋白。
背景技術(shù)：
盡管改善了對某種類型非類固醇依賴性癌的治療，但是在世界范圍內(nèi)癌癥仍然是死亡的最主要原因。疾病的早期檢測常常極大地提高了完全緩解的機會，因而使其成為關(guān)于適當?shù)脑\斷和治療工具研發(fā)研究的選擇焦點區(qū)。全球的診斷公司在研發(fā)這種早期診斷工具中投入了它們的大量研究基金，主要集中在實體瘤形成前的癌癥檢測。此外，為了提供在腫瘤的外科手術(shù)治療后監(jiān)測患者中癌癥任何蹤跡(例如，以原發(fā)腫瘤的殘余組織的形式或者由于轉(zhuǎn)移所致的繼發(fā)腫瘤的形式)的方法，這些公司也在研發(fā)用于術(shù)后檢驗的檢測工具。后者使醫(yī)師能夠制訂適當?shù)闹委煼桨溉缁煟匝a充手術(shù)治療。
為了檢測患者中的癌癥，必需在癌癥部位內(nèi)出現(xiàn)大量非類固醇癌細胞以便使醫(yī)生作出有效的診斷。實際上，事實并非這樣。在癌癥部位的物理檢查期間，如果可檢測到的非類固醇依賴性癌細胞的數(shù)量太少則會限制檢測。此外，如果癌癥部位可能不易被直接的目測法發(fā)現(xiàn)，那么會使得醫(yī)生沒有辦法作出清楚的診斷。在產(chǎn)生潛在的繼發(fā)腫瘤的情況中，不可能預測腫瘤可能將在哪里發(fā)生，因而使得通過目測法檢測繼發(fā)腫瘤變得很困難。為了克服這些問題，已研發(fā)了基于在患有或?qū)a(chǎn)生癌細胞的患者中檢測癌癥相關(guān)蛋白的靈敏性診斷試驗，并且當前可以買到。這種診斷試驗的實例包括鑒定人原發(fā)性肝癌的甲胎蛋白和畸胎瘤(IZOTOP，Hungary)、使用癌胚抗原檢測胃腸癌(Abbot/Roche，Switzerland)、檢測滋養(yǎng)層和胚細胞的絨毛膜促性腺激素(IZOTOP，Hungary；BioCheck Inc.，CA)以及用于檢測前列腺癌的前列腺酸性磷酸酶或者前列腺特異性抗原。盡管正在使用這些標記檢測各種癌癥，但是這些標記的缺點是它們能檢測晚期的而不是早期的癌癥。
此外，許多可買到的檢測僅能應用于非常窄范圍的非類固醇依賴性癌，意味著這種檢測常常不能檢測其它類型的癌。此外，這些檢測應用范圍窄意味著為了這些診斷目的其可能必需對一個患者進行多次檢驗。多次檢驗是昂貴的，并且許多檢測方法之一可能產(chǎn)生假陽性檢驗結(jié)果的風險很高。因此，需要一次診斷性檢驗，其不僅能檢測到患者體內(nèi)的少量癌細胞而且能檢測各種非類固醇依賴性癌如胃腸癌中的這些癌細胞。
理想的標記將是標記物在各種轉(zhuǎn)化細胞中遺傳表達，以及特異性的并可普遍地應用于癌癥檢測的目的。另外，其應當是免疫原性的以允許產(chǎn)生抗體，其可用于診斷和治療。理想標記的另一個期望特性是其位于轉(zhuǎn)化細胞的質(zhì)膜，這樣至少多肽的一部分易受潛在的診斷或治療性分子影響。
迄今為止，不存在有效的癥狀前的臨床表征或表明對非類固醇依賴性癌敏感的生物標記，因此使得早期檢測在疾病的醫(yī)療管理中變得高度優(yōu)先。由于當前的治療策略對癌癥早期的治愈率高于晚期癌癥的治愈率，因此通過早期檢測可提高患者的生存率。為了這個原因，對早期致癌組織特異的分子標記的鑒定將有助于發(fā)生癌癥的診斷以及預后的監(jiān)控。此外，這種分子標記也可用于篩選分子或化合物文庫，用于研發(fā)有效治療劑的目的，當在癌癥產(chǎn)生的早期施用時，該治療劑將提供抗惡性疾病的有效治療。
本發(fā)明通過提供用于非類固醇依賴性癌的診斷、預后和/或治療的腫瘤特異性多核苷酸和多肽著手解決這些問題。此外，使用這些多肽和相應的多核苷酸序列篩選改變它們生物學活性和/或基因表達的試劑，用于鑒定和研發(fā)治療非類固醇依賴性癌治療劑的目的。本發(fā)明提供免疫原性膜蛋白突觸泡蛋白樣蛋白(SYPL)、stomatin樣2(STOML2)、Ras-相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白(RAGA)、核苷酸敏感的氯離子通道1A(CLNS1A)、朊病毒蛋白(p27-30)(PRNP)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β2-樣1(GNB2L1)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白4(GNG4)、整合膜蛋白2B(ITM2B)、整合膜蛋白1(ITM1)、跨膜9超家族成員2(TM9SF2)、跨膜超家族成員6(TM4SF6)、鴉片受體樣1蛋白(OPRL1)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP4)、人腎小球上皮蛋白1(GLEPP1)、toll樣受體3(TLR3)、和/或透明帶糖蛋白3A(ZP3)、編碼所述蛋白、衍生物和/或其片段的核苷酸(分別是X68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM_021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777)和氨基酸序列(分別是CAA48279、AAF091421、AAH06433、CAA62902、AAA19664、AAH00214、AAC50204、NP_068839、P46977、AAB38973、ACC64257、AAA84913、BAA32468、AAA82892、AAC34134)。
盡管不知道在象例如分化、細胞生長或凋亡的癌癥相關(guān)過程中是否包括所述免疫原性膜蛋白，但是令人驚奇地發(fā)現(xiàn)它們在轉(zhuǎn)化細胞的膜上高度表達。因此，所述免疫原性膜蛋白允許轉(zhuǎn)化細胞的特異性鑒定和靶向。
發(fā)明概述通常地，本發(fā)明涉及使用選自跨膜超家族成員6(TM4SF6)、突觸泡蛋白樣蛋白(SYPL)、stomatin樣2(STOML2)、Ras-相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白(RagA)、核苷酸敏感的氯離子通道1A(CLNS1A)、朊病毒蛋白(p27-30)(PRNP)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β2-樣1(GNB2L1)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白4(GNG4)、整合膜蛋白2B(ITM2B)、整合膜蛋白1(ITM1)、跨膜9超家族成員2(TM9SF2)、鴉片受體樣1蛋白(OPRL1)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP4)、人腎小球上皮蛋白1(GLEPP1)、toll樣受體3(TLR3)、和/或透明帶糖蛋白3A(ZP3)的免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列、(分別是X68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM_021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777)基因、所編碼蛋白的氨基酸序列(分別是CAA48279、AAF091421、AAH06433、CAA62902、AAA19664、AAH00214、AAC50204、NP_068839、P46977、AAB38973、ACC64257、AAA84913、BAA32468、AAA82892、AAC34134)、衍生物或其片段，用于非類固醇依賴性癌的診斷、預后和治療。在具體實施方案中，特定的蛋白是人來源的蛋白。
本發(fā)明提供篩選治療非類固醇依賴性癌的治療劑的方法，其中非類固醇依賴性癌由至少一種選自M4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽的免疫原性膜蛋白和/或其片段的異常表達和/或生物活性改變所致。
具體地，本發(fā)明涉及一種篩選試驗分子或化合物文庫以鑒定至少一種特異性調(diào)節(jié)所述至少一種編碼免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列表達的治療性分子或化合物的方法，包括在允許特異性結(jié)合和/或相互作用的條件下，將在所述免疫原性膜基因的啟動子控制下的報告分子構(gòu)建體與試驗分子或化合物，或者試驗分子或化合物的文庫接觸，以及檢測報告分子構(gòu)建體的表達水平(也見表1)。相對于對照，表達水平的改變表明具有潛在的治療活性。
表1.在發(fā)生腫瘤的組織上調(diào)的編碼膜蛋白基因的列表
本發(fā)明也涉及篩選試驗分子或化合物的文庫，鑒定至少一種特異性結(jié)合和/或與所述至少一種免疫原性膜蛋白(也見表1)相互作用的治療性分子或化合物的方法，包括在允許特異性結(jié)合和/或相互作用的條件下，將所述至少一種免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段與試驗分子或化合物，或者試驗分子或化合物的文庫接觸，以及檢測特異性結(jié)合和/或相互作用的水平。相對于對照，結(jié)合和/或相互作用水平的改變表明具有潛在的治療活性。
分子或化合物的文庫優(yōu)選地選自DNA和/或RNA分子、肽、激動劑、拮抗劑、抗體，優(yōu)選單克隆抗體、免疫球蛋白、小分子以及藥物試劑。
也提供用于治療在哺乳動物，優(yōu)選人受試者中，由于所述至少一種免疫原性膜多肽的異常表達和/或生物活性所致的非類固醇依賴性癌的方法包括提供一種包括經(jīng)鑒定結(jié)合和/或與所述至少一種免疫原性膜蛋白相互作用或者調(diào)整特定蛋白表達水平(mRNA水平)的治療劑的組合物，以及向哺乳動物受試者施用治療有效量的所述組合物。該組合物可進一步含有藥學可接受的載體。
本發(fā)明提供一種可供選擇的方法，用于治療由于編碼所述至少一種免疫原性膜多肽的多核苷酸序列的異常表達所致的非類固醇依賴性癌，包括向人受試者施用治療有效量的與編碼所述至少一種免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列互補的反義多核苷酸序列。
可選擇地，本發(fā)明所提供的治療由于所述至少一種免疫原性膜多肽的異常生物活性所致的非類固醇依賴性癌的方法包括，向人受試者施用治療有效量的對所述至少一種免疫原性膜多肽或其片段特異的抗體。
本發(fā)明的另一方面是調(diào)節(jié)靶細胞的增殖、分化和/或細胞遷移的方法，包括向所述靶細胞施用在本發(fā)明篩選方法中鑒定的試驗分子或化合物。優(yōu)選地，所述靶細胞是腫瘤細胞。
本發(fā)明的一個實施方案提供一種測定受試者是否有產(chǎn)生由所述至少一種免疫原性膜多肽的異常表達和/或生物活性所致的非類固醇依賴性癌的風險或者患該病的方法，包括測量受試者的細胞樣品中編碼所述至少一種免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列水平和/或所述蛋白本身水平的方法。在同一實施方案中，本發(fā)明提供一種試劑盒，帶有基于上述方法如何使用該試劑盒的說明。
附圖描述

圖1.發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中上調(diào)的基因的熱圖(heat map)。
橫行是點在所用cDNA微陣列上的單個序列，縱列是單個樣品。基質(zhì)中的每個正方形代表單個序列的表達水平。在微陣列上可用一個以上序列表示單個基因。在所述15個實驗內(nèi)所示基因至少30％上調(diào)1.5倍以上。染成紅色的正方形表示所述基因在相應的實驗中上調(diào)，而綠色則表示下調(diào)。黑色表示在所示實驗中沒有調(diào)整或者沒有所述序列的數(shù)據(jù)?；蝤B嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白γ4、整合膜蛋白1、朊病毒蛋白(p27-30)、Stomatin樣2和突觸泡蛋白樣蛋白在所用cDNA微陣列上用兩個點表示，因此這些基因顯示兩組數(shù)據(jù)。
圖2通過TM4SF6的Q-PCR診斷結(jié)腸直腸癌用隨機六聚體一式三份逆轉(zhuǎn)錄配對的非腫瘤(藍色)和腫瘤(紅色)樣品的總RNA，然后使用TM4SF6特異性引物通過實時定量PCR擴增。使用Applied Biosystems′ABI PRISM 7000序列檢測系統(tǒng)和SybrGreen作為熒光染料，進行擴增和檢測。在每個樣品中將TM4SF6的表達對18S rRNA進行標準化。最后，計算每個腫瘤對在相應非腫瘤組織中表達的表達倍數(shù)(頂部)。為了比較，顯示對應的微陣列結(jié)果(底部)。
圖3用兩種不同siRNAs對TM4SF6的有效敲除細胞用50nM(DLD1和HelaS3)或25nM(SW480)所示的siRNAs轉(zhuǎn)染兩次或三次并在第一次脂質(zhì)轉(zhuǎn)染后4天收獲。提取RNA并使用特異性引物進行定量PCR(Q-PCR)。使用18S或肌動蛋白進行標準化。每個柱是至少兩份Q-PCR反應的均值。
圖4純化流分的SDS-PAGE根據(jù)在實施例5中所描述的方法克隆并純化TM4SF6的EC2環(huán)。流分通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，凝膠用染色考馬斯藍染色。泳道1第一次電泳的流分2，泳道2第一次電泳的流分3，泳道3第二次電泳的流分3，泳道4來源S流分28，泳道5分子量標準(從底部到頂部的大小10、15、25、35、45、55、70、100、130、180kDa)。
圖5使用TM4SF6抗體的免疫組化。
使用實施例6中所描述的方法進行免疫組化。TM4SF6抗體清楚地區(qū)分正常的結(jié)腸組織(圖5B，左上)和形成腫瘤的結(jié)腸細胞(圖5B，右下)。正常組織顯示不染色，而癌細胞是陽性的。該染色在不同患者的結(jié)腸癌樣品中也是明顯的(圖5B)。也在黑素瘤細胞中觀察到TM4SF6的表達(圖5C)。
發(fā)明詳述應當理解的是本發(fā)明不限于所描述的具體的材料和方法或者裝置，由于這些都可能變化。也應當理解的是這里所使用的術(shù)語僅是用于描述具體實施方案的目的，并不用于限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求限定。
也應當注意到如這里和在所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式的“a”、“an”和“the”包括復數(shù)參考，除非上下文清楚地要求其它含義。因此，例如，當提及“宿主細胞”時包括許多這種宿主細胞，當提及“抗體”時是指本領域技術(shù)人員已知的一個或多個抗體及其衍生物等。
除非有其它定義，這里所使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本領域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管可使用與這里所具體描述的那些類似的任何材料和方法，或者裝置去實踐或檢驗本發(fā)明，但是下面描述優(yōu)選的裝置、材料和方法。引用這里所提到的所有出版物是為了描述的是和公開在出版物中所報道的細胞系、方案、試劑和載體的目的，其可連同本發(fā)明一起使用。這些文獻均不對本發(fā)明因優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)而應被授權(quán)造成影響。
定義術(shù)語“衍生物”指多肽序列、多核苷酸序列或反義多核苷酸序列的修飾物。多肽通過化學方法修飾，并保留根據(jù)本發(fā)明的免疫原性膜蛋白(見表1)的生物學活性。此外，這種修飾可能也導致特定多肽生物學活性的抑制。多肽的衍生物與編碼所述免疫原性膜蛋白(見表1)的氨基酸序列至少60％相同或相似。優(yōu)選的衍生物與編碼根據(jù)本發(fā)明的免疫原性膜蛋白(見表1)的氨基酸序列至少65％、70％，甚至更優(yōu)選地至少80％、85％、90％、95％或98％相同或相似。
在具體優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用整個氨基酸序列與所述免疫原性膜蛋白(見表1)的氨基酸序列至少65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％同源、相似或相同的衍生物。
在“衍生物”的定義下也包括由于一個或多個核苷酸取代、添加或缺失而不同的經(jīng)過修飾的多核苷酸序列，如等位變體；因此也將包括由于遺傳密碼的簡并性而與編碼SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽(見表1)的多核苷酸序列不同的序列。
可以理解地，可能在特定多肽的幾個位點中以相同或不同程度存在相同類型的修飾。而且，特定多肽可包括許多類型的修飾。修飾可發(fā)生在多肽的任何位置，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基末端。修飾包括，例如，乙酰化、?；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、γ羧基化、形成GPI錨、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂質(zhì)附著、硫酸化、谷氨酸殘基的γ羧基化、羥基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、轉(zhuǎn)移-RNA介導的向蛋白添加氨基酸、如精氨?；约氨樵诘鞍谆?。見，例如，PROTEINS--STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freemanand Company，New York(1993)和Wold，F(xiàn).，Posttranslational ProteinModificationsPerspectives and Prospects，pgs.1-12 inPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson編，Academic Press，New York(1983)；多肽可以是分支的或者環(huán)形的，有或沒有分支。環(huán)形的、分支的和分支的環(huán)形多肽可能是由于翻譯后的自然加工所致，也可能是通過完全合成的方法制備的。
衍生物也指多肽或其片段與賦予另外屬性的化學基團或分子，例如PEG、熒光基團、放射基團、發(fā)光或發(fā)磷光的基團的偶聯(lián)物，與酶、標簽、碳水化合物側(cè)鏈等的偶聯(lián)物。
術(shù)語“片段”指包括至少5個連續(xù)氨基酸殘基的多肽序列的一部分，優(yōu)選地保留根據(jù)本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的生物學活性，或者指那些多核苷酸序列，當其被翻譯時產(chǎn)生保留所述膜蛋白的某些功能特性，例如抗原性或者結(jié)構(gòu)域特征的多肽。
術(shù)語“生物學活性”可與術(shù)語“生物學上的活性”、“生物活性”、“活性”交替使用，相應于本發(fā)明的目的，意思是由根據(jù)本發(fā)明的免疫原性膜蛋白(無論以其天然的還是變性的構(gòu)象)、衍生物或其片段直接地或間接地執(zhí)行的免疫原性/抗原性或效應物功能。效應物的功能包括磷酸化作用(激酶活性)或其它分子的活化、分化的誘導、有絲分裂或生長促進活性、信號轉(zhuǎn)導、免疫調(diào)節(jié)、DNA調(diào)控功能等，無論是目前已知的還是固有的?？乖怨δ馨ň哂心芘c抗體交叉反應，引起抗天然存在的或變性的根據(jù)本發(fā)明的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段的表位或抗原位點。因此，這種蛋白的生物學活性可能是其作為靶細胞的信號途徑中的銜接蛋白起作用。例如，這種信號途徑可調(diào)節(jié)這種細胞的細胞分化、增殖和/或遷移。根據(jù)本發(fā)明的靶細胞可以是上皮細胞或癌細胞。
短語“核苷酸序列”、“寡核苷酸序列”或“多核苷酸序列”指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。這些短語也指基因組或合成來源的DNA或RNA，其可以是單鏈或雙鏈的并且可代表有義或反義鏈，指肽多核苷酸序列(PNA)，或者指任何DNA樣或RNA樣材料。
公知地，在個體的基因組內(nèi)特定多肽的基因可能以單拷貝或多拷貝存在。這種重復基因可能是相同的或者可能具有某種修飾，包括核苷酸取代、添加或缺失，所有這些仍然編碼基本上具有相同生物學活性的多肽。短語“編碼根據(jù)本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列”可能因此指特定個體內(nèi)的一個或多個基因。此外，在個體生物體之間核苷酸序列上可能存某種差異，這被稱作等位基因。這種等位基因差異可能或者可能不導致所編碼多肽的氨基酸序列的差異，而仍然編碼具有相同生物學活性的蛋白。
術(shù)語“非類固醇依賴性癌”指由上皮細胞來源所引起的癌癥，可包括，但不限于，乳腺癌、肺癌、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、皮膚癌，特別是黑素瘤和/或其它癌。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，癌癥可能是處于不同階段的癌，例如癌前期的、早期的和/或晚期癌癥。癌癥也可能是處于分級中不同程度的癌癥，其中分級指癌癥進展的組織學分化的程度。癌癥分期和分級的準則對于本領域技術(shù)人員來說是已知的，并且描述于美國癌癥聯(lián)合委員會的“癌癥分期手冊”中。也包括在本發(fā)明的上下文中，上皮癌可以指上皮來源的瘤。
術(shù)語“胃腸癌”指與特定受試者的胃腸道有關(guān)的癌癥狀態(tài)。在本發(fā)明的上下文中，胃腸癌包括，但不限于食管癌、胃癌、小腸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌以及膽道癌。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，胃腸癌可能處于不同階段以及分級的不同程度(見美國癌癥聯(lián)合委員會的“癌癥分期手冊”)。
術(shù)語“瘤”可與短語“上皮的急性和慢性炎癥”交替使用并且指任何新的和異常的生長，特別是組織的新生長，其中該生長不受控制并且進行性生長。
術(shù)語“生物樣品”和“試驗樣品”指從任何特定受試者中分離的所有生物液、排泄物、組織和細胞。在本發(fā)明的上下文中，這種樣品包括，但不限于，血液、血清、血漿、乳頭抽吸物、尿液、精液、精液、精漿、前列腺液、排泄物、眼淚、唾液、汗液、活檢、腹水、腦脊液、乳汁、淋巴或組織提取物樣品。
這里所使用的短語“試驗分子或化合物的文庫”包括含有DNA分子、肽、激動劑、拮抗劑、單克隆抗體、免疫球蛋白和/或藥劑的文庫。這些可能包括新的或已經(jīng)已知的分子或化合物。此外，這里所使用的術(shù)語“單克隆抗體”和“免疫球蛋白”包括片段或其衍生物。
“細胞”、“宿主細胞”、“靶細胞”或“重組宿主細胞”在這里是可交替使用的術(shù)語，指已轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細胞，或者能夠通過外源多核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。應當理解的是這些術(shù)語不僅指特定的受試者細胞，而且也指這種細胞的后代或潛在的后代。因為由于突變或環(huán)境影響，可能在隨后的子代中發(fā)生某些修飾，因此這種后代實際上可能不與親代細胞完全相同，但是仍然包含在這里所用術(shù)語的范圍內(nèi)。
“遞送復合物”意思是靶向的方法(例如，導致反義多核苷酸序列、蛋白、多肽或者肽與靶細胞表面具有更高結(jié)合親和力和/或增加靶細胞的細胞攝入的分子)。靶向方法的實例包括固醇(例如，膽固醇)、脂質(zhì)(例如，陽離子脂質(zhì)、病毒體或脂質(zhì)體)、病毒(例如，腺病毒、腺伴隨病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)。優(yōu)選的復合物是在體內(nèi)足夠穩(wěn)定以避免在被靶細胞內(nèi)化前顯著解偶聯(lián)。然而，該復合物在細胞內(nèi)在適當?shù)臈l件下可被裂解，這樣多核苷酸、蛋白、多肽或肽可以以有功能的形式被釋放。
這里術(shù)語“報告分子構(gòu)建體”包括與其它序列符合讀框連接的靶基因，以提供其產(chǎn)物很容易測定的編碼單元。報告基因的實例包括，但不限于，β半乳糖苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、增強的綠色熒光蛋白(EGFP)、Ds-紅熒光蛋白、遠紅熒光蛋白(Hc-紅)、分泌的堿性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、新霉素等。
“反義多核苷酸序列”指由至少約10個核苷酸構(gòu)成的反義分子或抗基因劑。在某些實施方案中，反義多核苷酸序列由至少5、18、20、25、30、35、40或50個核苷酸構(gòu)成。反義多核苷酸序列與mRNA的5′非翻譯(UTR)區(qū)(直到并包括AUG翻譯起始密碼子)、3′UTR或者特定多核苷酸的非編碼區(qū)互補。反義多核苷酸序列與編碼特定多肽的多核苷酸序列的結(jié)合在表達所述mRNA的宿主細胞中有效改變所述mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，反義多核苷酸序列可以是線性的、環(huán)形的或者形成三螺旋并且與編碼根據(jù)本發(fā)明的免疫原性膜蛋白(見表1)的多核苷酸序列互補。此外，反義多核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈核酸(例如，嗎啉、PNAs或RNAi)以及包括a)至少一個選自下述的修飾的堿基部分，即5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mainnosylqueosine、5′-甲氧基羥甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2，6-二氨基嘌呤；和/或至少一個修飾的糖部分，所述修飾的糖部分選自包括但不限于，阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖，或者缺乏戊糖部分和/或至少一個選自下述的修飾的磷酸主鏈，即硫代磷酸酯(phosphorothioate)、硫代氨基磷酰胺酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酰胺酸酯(phosphoamidate)、二氨基磷酸酰胺酯(phosphodiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、formacetal或其類似物，以及α-DNA、2′-O-甲基RNA、嗎啉主鏈、通過肽鍵連接的重復的N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元(肽核酸；PNAs)或者鎖定核酸(LNAs)。作為一種可選擇的方法，本發(fā)明中也包括使用RNA干擾(RNAi)抑制已知功能的特定蛋白的表達。使用由核糖核酸酶III裂解更長dsRNAs所產(chǎn)生的小干擾RNAs(siRNAs)封閉翻譯，優(yōu)選地siRNAs長度在20-25個核苷酸之間。此外，本發(fā)明也包括使用RNA Lassos抑制已知功能的特定蛋白的翻譯。
在一個實施方案中，術(shù)語“拮抗劑”指當結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的免疫原性膜蛋白時，降低這種多肽的生物學活性的分子或化合物。這種拮抗劑可能與蛋白的配體結(jié)合區(qū)相互作用，因而避免配體誘導的蛋白活化。拮抗劑也可以通過在空間上阻礙關(guān)鍵的蛋白-蛋白相互作用位點，例如，二聚化區(qū)、支架區(qū)，抑制上述蛋白中的任何一種與其它分子之間的相互作用。此外，拮抗劑可以通過與特定多核苷酸的調(diào)控區(qū)相互作用，降低和/或抑制編碼所述免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列的表達。可選擇地，拮抗劑可以是抑制或降低位于SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3蛋白下游蛋白的表達或生物學活性，或者與所述蛋白相互作用的分子或化合物。拮抗劑也可以是降低上述蛋白中任何一種的生物學或免疫學活性效應的量或持續(xù)時間的分子或化合物。拮抗劑可包括蛋白、多核苷酸序列、碳水化合物、抗體或其片段，或者任何發(fā)揮這些效應的其它分子。
術(shù)語“腫瘤細胞”或“腫瘤組織”分別指經(jīng)歷顯著細胞改變(轉(zhuǎn)化)的細胞或組織。這種細胞改變顯示為通過從特異性對照機制中逃脫、生長潛能增加、細胞表面改變、核型異常、形態(tài)學和生物化學偏離正常以及賦予能侵入、轉(zhuǎn)移和殺傷的其它屬性。
術(shù)語“抗體”指基本上由免疫球蛋白基因或其片段編碼的多肽，其結(jié)合并識別特異性抗原。例如，抗體作為完整的免疫球蛋白或者作為由肽酶消化產(chǎn)生的許多充分表征的片段存在。在本發(fā)明的上下文內(nèi)包括通過修飾整個抗體或使用重組DNA方法合成所產(chǎn)生的抗體片段。在蛋白和其它生物活性分子的異種群內(nèi)，抗體將在適當?shù)慕Y(jié)合條件下與其特異性抗原或其片段相互作用。在本發(fā)明的上下文中，在本發(fā)明范圍內(nèi)所用的抗體優(yōu)選地結(jié)合SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3蛋白。也包括抗體偶聯(lián)物，其中將抗體或其片段結(jié)合賦予抗體另外性質(zhì)的化學基團或分子。
篩選療法本發(fā)明提供篩選治療以至少一種免疫原性膜蛋白的異常表達和/或生物學活性為特征的非類固醇依賴性癌的治療劑的方法，其中該免疫原性膜蛋白選自SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3、或ZP3多肽和/其片段。
該方法鑒定候選物、試驗分子或化合物，或者試劑(例如，肽、肽模擬物、小分子或其它藥物)，其降低和/或抑制多肽、衍生物或其片段的生物學活性，或者具有抑制效應，例如抑制編碼所述多肽的多核苷酸序列的表達。
在多核苷酸水平上，這種方法包括例如a.在允許特異性結(jié)合和/或相互作用的條件下，使在所述免疫原性膜蛋白啟動子控制下的報告分子構(gòu)建體與試驗分子或化合物，或者試驗分子或化合物的文庫接觸；和b.檢測報告分子構(gòu)建體的表達水平，其中相對于對照，表達水平的改變表明具有潛在的治療活性。
通?；虻膯幼游挥谄鹗济艽a子的上游并且很容易使用公知的算法，如那些在網(wǎng)上由歐洲生物信息學協(xié)會提供的算法進行鑒定。
可通過現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法測量表達水平，例如，放射性或其它標簽的摻入、如果報告分子是酶的酶促活性或者定量PCR。已知的報告分子包括例如，β半乳糖苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、增強的綠色熒光蛋白(EGFP)、Ds-紅熒光蛋白、遠紅熒光蛋白(Hc-紅)、分泌的堿性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、新霉素等。
在蛋白水平上，這種方法例如包括a.在允許特異性結(jié)合和/或相互作用的條件下，將所述的至少一種免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段與試驗分子或化合物、或者試驗分子或化合物的文庫接觸；和b.檢測特異性結(jié)合和/或相互作用的水平，其中相對于對照，相互作用水平的改變表明具有潛在的治療活性。
在一個實施方案中，多肽具有至少一種本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的生物學活性?？赏ㄟ^各種方法鑒定能直接或間接與這種多肽、衍生物或其片段相互作用的蛋白或肽。例如，可使用基于各種結(jié)合試驗的方法鑒定這種分子(見參考文獻酵母雙雜交Bemis等(1995)MethodsCell Biol.46，139-151，F(xiàn)ields和Sternglanz(1994)Trends Genet.10，286-292，Topcu和Borden(2000)Pharm.Res.17，1049-1055；酵母三雜交Zhang等(1999)Methods Enzymol.306，93-113；GST降低如在Palmer等(1998)EMBO J.17，5037-5047；以及噬菌體展示如在Scott and Smith(1990)Science 249，386-390)。
在優(yōu)選的實施方案中，TM4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或者ZP3多肽的生物學活性是調(diào)節(jié)特異性靶細胞，例如上皮細胞或癌細胞的細胞分化、增殖和/或遷移。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供篩選能結(jié)合、相互作用或者調(diào)節(jié)所述至少一種免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段的生物活性形式的試驗分子或化合物的試驗。可使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種組合文庫方法中的任何一種獲得根據(jù)本發(fā)明的試驗化合物，所述文庫包括生物文庫、恰當可尋址的平行固相或液相文庫、需要去褶合的合成文庫法、“一珠一化合物”文庫法以及使用親和層析選擇的合成文庫法。生物文庫方法限于肽文庫，而其它四種方法可用于肽、非肽寡聚體或化合物的小分子文庫(Bindseil等(2001)Drug Discov.Today 6，840-847；Grabley等(2000)Ernst Schering Res.Found.Workshop.pp.217-252；Houghten等(2000)Drug Discov.Today 5，276-285；Rader，C.(2001)Drug Discov.Today 6，36-43)。
可在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)分子文庫合成方法的實例，例如參見DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6909-6913；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，11422-11426；Gallop等(1994)J.Med.Chem.37，1233-1251；Gordon等(1994)J.Med.Chem.37，1385-1401。
化合物文庫可呈現(xiàn)在溶液中(例如，Houghten(1992)Biotechniques13，412-421)、或在珠(Lam等(1991)Nature 354，82-84)、芯片(Fodor等(1993)Nature 364，555-556)、細菌(1993年6月公開的美國專利No.5,223,409)、孢子[美國專利Nos.5,571,698(在1996年11月公開)；5,403,484(在1995年4月公開)；以及5,223,409(在1993年6月公開)]、質(zhì)粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，1865-1869)或者噬菌體(Scott和Smith(1990)Science.249，386-390；Devlin等(1990)Science.249，404-406；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-6382；Felici等(1991)J.Mol.Biol.222，301-310)上。
在優(yōu)選的實施方案中，試驗分子或化合物的文庫選自DNA和/或RNA分子、肽、激動劑、拮抗劑、單克隆抗體、免疫球蛋白、小分子藥物、藥物試劑、和片段和/或它們的組合。
根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明方法中鑒定的試驗分子或化合物優(yōu)選地證明能抑制本發(fā)明的至少一種免疫原性膜蛋白的基因表達和/或生物學活性。
在一個實施方案中，試驗是基于細胞的試驗，其中細胞表達有生物學活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段。將所表達的多肽與試驗分子或化合物接觸，測定試驗分子或化合物結(jié)合或與多肽相互作用的能力。該細胞例如，可以是真核細胞，例如但不限于酵母細胞、無脊椎動物細胞(例如，線蟲(C.Elegan))、昆蟲細胞、硬骨魚細胞、兩棲動物細胞或者哺乳動物來源的細胞。測定試驗分子或化合物結(jié)合或與多肽相互作用的能力可通過，例如，將試驗分子或化合物與放射性同位素(例如，125I、35S、14C或3H)或者酶促(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶)標簽偶聯(lián)，這樣可通過檢測復合物中的標記分子或化合物測定試驗分子或化合物與生物活性多肽、衍生物或其片段的結(jié)合或相互作用。標記和檢測試驗分子或化合物與膜結(jié)合的或膜相關(guān)蛋白相互作用的方法是本領域技術(shù)人員公知的。
在優(yōu)選的實施方案中，該試驗包括將表達本發(fā)明的有生物學活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段的細胞與結(jié)合或與所述免疫原性膜蛋白相互作用的已知分子或化合物接觸以形成試驗混合物，將該試驗混合物與試驗分子或化合物接觸，以及測定試驗分子或化合物結(jié)合、或與特定多肽相互作用的能力，其中測定試驗分子或化合物結(jié)合、或與特定多肽相互作用的能力與對照進行比較。試驗分子或化合物結(jié)合、或與本發(fā)明的特定免疫原性膜蛋白相互作用能力的測定是基于試驗分子或化合物和已知的靶分子或化合物對特定多肽的競爭性結(jié)合/抑制動力學。檢測兩個分子對同一靶的競爭性結(jié)合，或者相互作用的方法是本領域技術(shù)人員公知的。
在另一個實施方案中，該試驗是基于細胞的試驗，包括將表達本發(fā)明的有生物學活性的膜蛋白、衍生物或其片段的細胞與試驗分子或化合物接觸，以及測定試驗分子或化合物抑制特定多肽的生物學活性的能力。這可以通過例如，測定所述膜蛋白是否繼續(xù)結(jié)合或與已知的靶分子相互作用、或者是否已經(jīng)取消特異性細胞功能(例如離子通道)來完成。例如，靶分子可以是便于細胞外信號轉(zhuǎn)導的信號轉(zhuǎn)導途徑中的元件、具有催化活性的第二細胞間蛋白、調(diào)控特定基因轉(zhuǎn)錄的蛋白、或者啟動蛋白翻譯的蛋白。測定有生物學活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段結(jié)合或與靶分子相互作用的能力，可通過測定靶分子的活性來完成。例如，可通過檢測靶的細胞第二信使[例如，細胞內(nèi)的Ca2+、二酰甘油和肌醇三磷酸IP3)]的誘導、檢測靶對適當?shù)孜锏拇呋?酶促活性、檢測與編碼可檢測標記的多核苷酸可操作地連接的報告基因的誘導(通過可能對特定多肽反應的調(diào)節(jié)元件)，例如，β-半乳糖苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、增強的綠色熒光蛋白(EGFP)、Ds-紅色熒光蛋白、遠紅熒光蛋白(Hc-紅)、分泌的堿性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、新霉素等，或者檢測細胞反應，例如，細胞分化、增殖或遷移，測定靶分子的活性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的試驗是無細胞試驗，包括將本發(fā)明的具有生物學活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段與試驗分子或化合物接觸，以及測定試驗分子或化合物與所述多肽中的任何一種結(jié)合或相互作用的能力。如上所述可直接地或間接地測定試驗分子或化合物與特定多肽的結(jié)合或相互作用。在優(yōu)選的實施方案中，該試驗包括將所述多肽中的任何一種與已知與特定的免疫原性膜蛋白結(jié)合或相互作用的靶分子或化合物接觸，以形成試驗混合物。將該試驗混合物與試驗分子或化合物接觸，試驗分子或化合物與該多肽相互作用能力的測定是基于試驗分子或化合物和已知分子或化合物對所述多肽的競爭性結(jié)合/抑制動力學。檢測兩個分子對同一靶的競爭性結(jié)合或相互作用的方法是本領域人員公知的，其中該靶是免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段。
在另一個實施方案中，試驗是無細胞試驗，包括將所述有生物學活性的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段與試驗分子或化合物接觸，以及測定試驗分子或化合物抑制所述多肽活性的能力。可通過例如，通過上述測定直接結(jié)合方法中的任何一種測定多肽結(jié)合靶分子的能力，測定試驗分子或化合物抑制特定多肽活性的能力。在可選擇的實施方案中，可通過測定所述多肽進一步調(diào)節(jié)靶分子的能力，測定試驗分子或化合物調(diào)節(jié)所述多肽活性的能力。
在本發(fā)明的上述試驗方法的實施方案中，可期望固定本發(fā)明的免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段，或者其靶分子以便于從蛋白的一種或兩種非復合型中分離復合型的，以及適應試驗的自動化。可在適于含有反應物的任何容器中完成試驗分子或化合物與所述免疫原性膜蛋白的結(jié)合、或者在存在和缺乏候選化合物時特定免疫原性膜蛋白與靶分子的相互作用。這種容器的實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個實施方案中，可提供融合蛋白，其添加了允許蛋白中的一種或兩者結(jié)合到基質(zhì)上的區(qū)域。例如，可將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白吸附到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Sigma Chemical；St.Louis，MO)或者谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后將試驗分子或化合物和未吸附的靶蛋白或生物活性免疫膜蛋白、衍生物或其片段結(jié)合。然后將該混合物在有助于形成復合物的條件下孵育(例如，在鹽和pH的生理條件)。孵育后，洗滌珠或微量滴定板孔以除去任何未結(jié)合的成分，直接地或間接地測量復合物形成，例如，根據(jù)上所述方法?？蛇x擇地，可將復合物從基質(zhì)中分離，可使用標準技術(shù)測定所述多肽的結(jié)合或活性的水平。
也可在本發(fā)明的篩選試驗中使用將蛋白固定在基質(zhì)上的其它技術(shù)。例如，可利用生物素和鏈霉抗生物素的偶聯(lián)固定本發(fā)明的有生物學活性的免疫膜蛋白、衍生物或其片段，或者其靶分子。
在另一個實施方案中，在下述方法中鑒定所述免疫原性膜蛋白表達的抑制劑，該方法中將細胞與候選分子或化合物接觸以及測定細胞內(nèi)選定mRNA或蛋白[即，mRNA，或多核苷酸對應的蛋白，或有生物學活性的多肽]的表達。在優(yōu)選的實施方案中，細胞是動物細胞。甚至更優(yōu)選地，細胞可來自昆蟲、魚、兩棲動物、小鼠、大鼠或人。將在存在候選分子或化合物時所選mRNA或蛋白的表達水平與在缺乏候選分子或化合物時所選mRNA或蛋白的表達水平進行比較。然后可基于這種比較，將候選分子或化合物鑒定為本發(fā)明的特定免疫原性膜蛋白表達的抑制劑。例如，當存在候選分子或化合物時所選mRNA或蛋白的表達比其缺乏時低(統(tǒng)計學上顯著低)，那么該候選分子或化合物被鑒定為所選mRNA或蛋白的表達抑制劑。可通過這里所描述的方法測定細胞內(nèi)所選mRNA或蛋白表達的水平。
在本發(fā)明的上下文中認為在上述試驗中鑒定的那些試驗分子或化合物是本發(fā)明免疫原性膜蛋白的特異性治療劑。
在另一個實施方案中，也可通過使用報告分子試驗鑒定所述治療劑，其中在存在或缺乏試驗分子或化合物時，測量在編碼本發(fā)明免疫原性膜蛋白基因的啟動子控制下報告分子構(gòu)建體的表達水平?？赏ㄟ^用各自的cDNA篩選基因組文庫，分離編碼所述免疫原性膜蛋白基因的啟動子；優(yōu)選地含有cDNA的5′端。然后將所述啟動子的一部分，典型地長20到約500個堿基對克隆到質(zhì)粒中報告基因的上游，例如，β-半乳糖苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、增強的綠色熒光蛋白(EGFP)、Ds-紅色熒光蛋白、遠紅熒光蛋白(Hc-紅)、分泌的堿性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、新霉素。然后將該報告分子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到細胞中，例如，哺乳動物細胞。將轉(zhuǎn)染的細胞分配到多孔平板的孔內(nèi)，向孔內(nèi)添加不同濃度的試驗分子或化合物。孵育幾個小時后，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法測定報告分子構(gòu)建體的表達水平。報告分子構(gòu)建體在與試驗分子或化合物孵育的轉(zhuǎn)染細胞中的表達水平相對于在不與試驗分子或化合物孵育的轉(zhuǎn)染細胞中的差異將表明，試驗分子或化合物能夠調(diào)節(jié)編碼所述免疫原性膜蛋白基因的表達，因此是一種治療劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可使用所述治療劑治療非類固醇依賴性癌，并可應用于需要這種治療的任何患者，包括例如哺乳動物如狗、貓、母牛、馬、兔以及靈長類動物。但是最優(yōu)選地，需要這種治療的患者是人。
本發(fā)明也包括抑制編碼所述至少一種免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列，以調(diào)節(jié)靶細胞的增殖和/或分化或細胞死亡的方法，包括提供一種包括通過本發(fā)明方法鑒定的治療劑的組合物和使治療有效量的所述組合物與所述靶細胞接觸。
已知與本發(fā)明的所述免疫膜蛋白結(jié)合/相互作用的分子可通過重組法(即，如果分子是具有氨基酸性質(zhì)的分子)、化學法(即，核酸、化學化合物)對于抗體可通過生物合成法生產(chǎn)。
本發(fā)明進一步涉及通過上述篩選試驗鑒定的新試劑及其在治療非類固醇依賴性癌中的用途。
治療非類固醇依賴性癌在本發(fā)明的一個實施方案中，可用通過本發(fā)明方法鑒定的治療劑治療由于本發(fā)明免疫原性膜蛋白的異?；虮磉_和/或生物學活性所致的非類固醇依賴性癌。特定多核苷酸(見表1)的異?；虮磉_可導致有生物學活性的免疫原性膜蛋白的水平發(fā)生改變。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，作為異?；虮磉_的結(jié)果，所述膜蛋白水平增加可導致特定受試者內(nèi)異常的細胞增殖、細胞分化、細胞遷移、腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移。可通過施用本發(fā)明的治療劑治療鑒定為具有非類固醇依賴性癌或異常細胞增殖、細胞分化、細胞遷移、腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移的患者，其中已證明該治療劑降低其相應基因的表達水平或者抑制所述免疫原性膜蛋白的生物學活性。
本發(fā)明也提供預防腫瘤形成和/或發(fā)展的方法。例如，腫瘤的發(fā)生可在出現(xiàn)，如瘤前病變，例如，增生、化生和發(fā)育不良等病變之前。如本發(fā)明的上下文中所述，可在上皮組織中發(fā)現(xiàn)這種病變。因此，本發(fā)明提供抑制這種病變形成腫瘤病變的方法，包括向具有瘤前病變的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的所述免疫原性膜蛋白。
本發(fā)明的這個方面涉及在哺乳動物中誘導免疫反應的方法，包括向哺乳動物接種本發(fā)明的膜蛋白、或其片段，足以產(chǎn)生抗體和/或T細胞免疫反應以使受試者的免疫系統(tǒng)能夠?qū)鼓[瘤疾病。本發(fā)明的另一個方面涉及在哺乳動物中誘導免疫反應的方法，其包括通過載體遞送免疫原性膜蛋白，指導所述蛋白在體內(nèi)的表達以誘導這種免疫反應產(chǎn)生抗體以保護受試者不患這種疾病。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種免疫/疫苗制劑(組合物)，當引入到哺乳動物宿主中時，其在該哺乳動物中誘導對受體多肽的免疫反應，其中該組合物包括本發(fā)明的免疫原性膜蛋白或其基因。該疫苗制劑可進一步包括適當?shù)妮d體。由于膜蛋白可在胃中被分解，因此優(yōu)選地通過非腸道途徑(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)等途徑注射)施用。適于非腸道給藥的制劑包括水性的和非水性的無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖液、制菌劑和賦予制劑與受者的血液等張的溶質(zhì)；水性的和非水性的無菌懸液其可包括懸浮劑或增稠劑。制劑可存在于單位劑量或多劑量容器內(nèi)，例如，密封的安瓿和小瓶，也可在冷凍干燥條件中貯藏，使用前僅需要立即添加無菌液體載體即可。疫苗制劑也可包括提高制劑免疫原性的輔料系統(tǒng)，如水包油(oil-in water)系統(tǒng)和現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它系統(tǒng)。劑量將取決于疫苗的特異性活性并且可通過常規(guī)試驗很容易地測定。
在本發(fā)明的上下文中，治療劑量的所述本發(fā)明的治療性的免疫原性膜蛋白的將有效地抑制瘤前病變發(fā)展成腫瘤病變，且副作用最小。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及至少一種所述免疫原性膜蛋白、片段、衍生物或其同系物，或者含有和/或表達至少一種述免疫原性膜蛋白、或片段、衍生物或其同系物的細胞在制備免疫受試者的藥物組合物中的用途。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供抑制上皮細胞增殖、分化或遷移的方法，包括使上皮細胞顯示異常高增殖率、異常分化和/或遷移的組織，如在腫瘤發(fā)生期間的組織與本發(fā)明的治療劑接觸。預期通過在本發(fā)明試驗中鑒定的特定治療劑的抗增殖、抗分化和/或抗遷移效應抑制非類固醇依賴性癌的發(fā)展。
在本發(fā)明的上下文內(nèi)，異常增殖、分化或遷移的細胞是存在于乳腺、肺、食管、胃、小腸、結(jié)腸、直腸、胰腺、肝、膽囊、膽管、前列腺、卵巢、子宮頸和子宮內(nèi)膜組織的上皮細胞。
可用于治療由本發(fā)明所述的免疫原性膜蛋白的異常表達所致的非類固醇依賴癌的方法是，例如，使用反義、siRNA、和/或三螺旋分子在多核苷酸水平上抑制基因表達，或者使用在由本發(fā)明提供的各種篩選方法中鑒定的治療劑。此外，根據(jù)本發(fā)明也可使用對特定多肽特異的抗體治療非類固醇依賴性癌。這種抗體能特異性結(jié)合本發(fā)明的免疫原性膜蛋白并且對本發(fā)明多肽的親和力基本上高于它們對現(xiàn)有技術(shù)中其它相關(guān)多肽的親和力。
可以向受試者施用治療有效劑量的鑒定為降低/抑制所述免疫原性膜蛋白的治療劑以治療非類固醇依賴性癌。
本發(fā)明也提供包括通過本發(fā)明方法鑒定的治療劑的藥物組合物。最初鑒定的治療劑可通過現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法對其活性、毒性、穩(wěn)定性、副作用或者物理和/或化學特性等進一步優(yōu)化。因此，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可含有由本發(fā)明方法所鑒定的試劑的片段、衍生物或同系物。
肽，如免疫原性膜蛋白的可溶型，以及激動劑和拮抗劑、肽、抗體或小分子可聯(lián)合適當?shù)乃帉W載體進行配制。這種制劑包括治療有效量的多肽或化合物，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限于，鹽、緩沖鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇及它們的組合。制劑應當適合于給藥方式，其最優(yōu)化在本領域技術(shù)人員中是公知的。本發(fā)明進一步涉及藥物包裝和試劑盒，包括填充一種或多種本發(fā)明上述組合物成分的一種或多種容器。
本發(fā)明的多肽和其它化合物可單獨或聯(lián)合其它化合物使用，如治療性化合物。藥物組合物全身給藥的優(yōu)選形式包括注射，典型地通過靜脈內(nèi)注射?？墒褂闷渌緩?，如皮下、肌肉內(nèi)、或者腹膜內(nèi)。全身給藥的可選擇的方法包括經(jīng)粘膜和經(jīng)皮給藥，使用滲透劑如膽汁鹽或梭鏈孢酸或者其它去污劑。另外，如果適當?shù)刂苽涑赡c溶的或膠囊包裹的制劑，那么口服給藥也是可能的。這些化合物的施用也可以是局部的和/或局限化的，以油膏、糊劑、凝膠等的形式。
需要的劑量范圍取決于分子的選擇、給藥途徑、制劑的性質(zhì)、受試者的情況以及主治醫(yī)師的判斷。然而，適當?shù)膭┝渴窃诨颊呙抗矬w重0.1-100μg的范圍。然而，鑒于可得化合物的種類和各種給藥途徑效率的差異，預期所需的劑量變化很大。例如，預計口服給藥將需要比通過靜脈注射給藥更高的劑量?？墒褂脴藴实慕?jīng)驗途徑調(diào)整這些劑量水平中的差異以進行最優(yōu)化，這在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。
也可在受試者中內(nèi)源性地產(chǎn)生治療中所使用的多肽，如上所述在治療形式中常常稱作“基因治療”。因此，例如，可用多核苷酸，如DNA或RNA改造受試者的細胞以便先體外后體內(nèi)編碼多肽，例如，通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體。然后將細胞引入到受試者內(nèi)。
因此，本發(fā)明也提供根據(jù)本發(fā)明方法鑒定的治療劑、或衍生物或其同系物，或者含有和/或表達所述治療劑或衍生物或其同系物的遞送復合物在制備用于治療非類固醇依賴性癌的藥物組合物的用途。
診斷學本發(fā)明的另一個方面涉及測定生物樣品(例如，血液、血清、細胞、組織)中本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的表達，或者編碼所述膜蛋白的多核苷酸的診斷試驗，測定個體是否患有非類固醇依賴性癌，或者是否有發(fā)展成由于這種免疫原性膜蛋白的異常表達或生物學活性所致的非類固醇依賴性癌的風險。本發(fā)明也提供確定個體是否有發(fā)展成非類固醇依賴性癌風險的預后(或預言性)試驗。例如，可分析生物樣品中的基因表達水平，以確定生物樣品中是否可能存在與標準相比水平增加的特定蛋白。這種試驗可用于預后或預測的目的，因而可在形成非類固醇依賴性癌前對個體進行預防性地治療。
一種檢測生物樣品中是否存在或缺乏本發(fā)明的免疫原性膜蛋白或者編碼其的多核苷酸的方法，包括從試驗受試者中獲得生物樣品以及將生物樣品與能檢測特定多肽或多核苷酸(例如，mRNA、基因組DNA)的化合物或試劑接觸，這樣可直接標記是否存在特定的多肽或多核苷酸。實例包括使用熒光標記的二抗檢測一抗，以及用生物素末端標記DNA探針，這樣其可用熒光標記的鏈霉抗生物素進行檢測。即，可使用本發(fā)明的檢測方法在體外以及在體內(nèi)檢測生物樣品中的mRNA、蛋白或基因組DNA。例如，體外檢測mRNA的技術(shù)包括，但不限于，Northern雜交、原位雜交、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR，見下面的實施例)或者差異顯示。體外檢測免疫原性膜蛋白的技術(shù)包括，但不限于，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)、Western印跡、免疫沉淀法、免疫熒光或者使用對所述膜蛋白或其片段特異性抗體的組織陣列分析(蛋白表達譜)。體外檢測基因組DNA的技術(shù)包括Southern雜交。此外，體內(nèi)檢測所述免疫原性膜蛋白的技術(shù)包括向受試者引入針對特定多肽或其片段的標記抗體。
在一個實施方案中，生物樣品含有來自試驗受試者的蛋白分子?？蛇x擇地，生物樣品含有試驗受試者的mRNA分子或者試驗受試者的基因組DNA分子。優(yōu)選的生物樣品包括，但不限于，通過常規(guī)方法從受試者中分離的血液、血清、血漿、乳頭抽吸物、尿、精液、精液、精漿、前列腺液、排泄物、淚液、唾液、汗液、活檢、腹水、腦脊液、乳汁、淋巴或者組織提取物樣品。
在另一個實施方案中，該方法進一步包括從對照受試者中獲得對照生物樣品，將該對照樣品與能檢測所述多肽、或mRNA或編碼所述多肽的基因組DNA的化合物或試劑接觸，結(jié)果可在生物樣品中檢測是否存在多肽、或mRNA或者編碼所述多肽的基因組DNA，以及將對照樣品中存在的所述多肽或mRNA或編碼所述多肽的基因組DNA與試驗樣品中存在的多肽或mRNA或者編碼所述多肽的基因組DNA進行比較。
在另一個實施方案中，使用編碼所述免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列作為產(chǎn)生用于在其它細胞類型中鑒定和/或克隆免疫原性膜蛋白同系物的探針和引物的模板，例如其它組織的同系物，以及其它哺乳動物生物體的同系物。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用包括基本上純化的寡核苷酸的探針/引物，其中寡核苷酸包括在嚴緊條件下與編碼所述免疫原性膜蛋白的正義或反義序列的至少約15個，優(yōu)選約25個，更優(yōu)選地約40、50或75個連續(xù)的核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)。例如，可在PCR反應中使用基于編碼所述膜蛋白的多核苷酸序列的引物用以克隆同系物，例如特異性等位基因。優(yōu)選地在不與其它基因顯著同源的區(qū)域中選擇這種引物。同樣地，可使用基于所述序列的探針檢測編碼相同或同源蛋白的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列。在優(yōu)選的實施方案中，探針進一步包括附著其上并可被檢測的標記基團，例如，標記基團選自放射性同位素、熒光化合物、酶和酶的輔因子。
此外，這種探針也可用作診斷試驗試劑盒的一部分，用于鑒定過量表達本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的細胞或組織，如通過測量患者細胞樣品中編碼特定多肽的多核苷酸序列的水平；例如，檢測mRNA水平。簡要地說，可從所述基因(見表1)中產(chǎn)生特異性核苷酸探針，便于組織學篩選完整組織和組織樣品中是否存在免疫原性膜蛋白。可使用針對本發(fā)明免疫原性膜蛋白的mRNAs或者針對基因組序列的探針，用于預測性和治療性的評價，其中特定多肽的表達或存在表現(xiàn)為，例如組織內(nèi)不需要的細胞生長、異常分化或細胞遷移的激活。聯(lián)合使用這里所述的免疫測定，寡核苷酸探針可有助于便于測定基于與所述免疫原性膜蛋白的表達相關(guān)癌癥的分子。測定受試者是否有發(fā)展成由本發(fā)明免疫原性膜蛋白的異常表達(過表達)和/或生物學活性所致或起作用的非類固醇依賴性癌風險的試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選的實施方案中，該方法可用于確定受試者是否有發(fā)展成非類固醇依賴性癌的風險。在同一實施方案中，本發(fā)明提供附帶基于上述方法如何使用試劑盒說明的試劑盒。
反義多核苷酸序列本發(fā)明的另一個方面涉及“反義”治療。如這里所使用的，“反義”治療指施用或原位產(chǎn)生反義多核苷酸序列或其衍生物，其在細胞環(huán)境中與細胞mRNA和/或編碼本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的基因組DNA特異性雜交(例如，結(jié)合)以至于，例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯抑制該蛋白的表達。結(jié)合可通過典型的堿基對互補性，或者，例如，在結(jié)合DNA雙螺旋的情況中，通過在雙螺旋大溝中的特異性相互作用。總的來說，“反義”治療指通常在現(xiàn)有技術(shù)中所使用的技術(shù)范圍，并且包括依賴反義多核苷酸序列特異性結(jié)合其靶多核苷酸序列的任何治療。
可遞送本發(fā)明的反義構(gòu)建體，例如，作為表達質(zhì)粒，當在細胞中轉(zhuǎn)錄時其產(chǎn)生與編碼本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的細胞mRNA的至少獨特部分互補的RNA?？蛇x擇地，反義構(gòu)建體是先體外后體內(nèi)產(chǎn)生的核酸分子，并且當引入細胞時其通過與所述膜蛋白基因的mRNA和/或基因組序列雜交導致表達的抑制。優(yōu)選地修飾這種反義多核苷酸序列使得它們抗內(nèi)源核酸酶，例如，核酸外切酶和/或核酸內(nèi)切酶，因而在體內(nèi)穩(wěn)定。用作反義多核苷酸序列的分子選自，但不限于DNA的二氨基磷酰胺酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)和甲基膦酸酯類似物(Froehler等(1988)NucleicAcids Res.16，4831-4839；Hyrup和Nielsen(1996)Bioorg.Med.Chem.4，5-23；Sarin等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，7448-7451；Stein等(1988)Nucleic Acids Res.16，3209-3221；Summerton J.(1999)Biochim.Biophys.Acta 1489，141-158；Summerton和Weller(1997)Antisense polynucleotide sequences Drug Dev.7，187-195；Orum和Wengel(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.3，239-243；Wahlestedt等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，5633-5638)。另外，在Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6553-6556；Summerton和Weller(1997)Antisense polynucleotide sequences Drug Dev.7，187-195；Froehler等(1988)Nucleic Acids Res.16，4831-4839中已綜述了構(gòu)建可用于“反義”治療的反義多核苷酸序列的一般方法。
反義方法包括設計與編碼本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的mRNA互補的寡核苷酸(DNA或RNA，或者其衍生物)。反義多核苷酸序列將結(jié)合本發(fā)明所述免疫原性膜蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄本并阻止翻譯。盡管優(yōu)選，但是不需要絕對的互補性。與RNA的一部分“互補”的序列，如這里所指的，意思是具有足夠的互補性以至于能與RNA雜交，形成穩(wěn)定雙螺旋的序列；在雙鏈反義多核苷酸序列的情況中，可能因而檢驗雙螺旋DNA的單鏈，或者可能分析三螺旋形成。雜交的能力將既依賴互補性的程度也依賴反義多核苷酸序列的長度。通常，雜交的多核苷酸序列越長，其可能含有的與RNA錯配的堿基就越多，仍然能形成穩(wěn)定的雙螺旋(或三螺旋，可能根據(jù)情況而定)。本領域技術(shù)人員通過使用標準方法確定雜交復合物的解鏈溫度，能確定可接受的錯配程度。
與mRNA的5′端，例如，5′UTR向上并包括AUG翻譯起始密碼子互補的反義多核苷酸序列，將在抑制翻譯上最有效。然而，最近已經(jīng)證明與mRNAs的3′UTR互補的序列在抑制mRNAs的翻譯上也有效(Wagner，R.(1994)Nature 372，333-335)。因此，在反義方法中可使用與編碼本發(fā)明的所述免疫原性膜蛋白基因的5′UTR、3′UTR或非編碼區(qū)互補的反義多核苷酸序列以抑制內(nèi)源性mRNA的翻譯。與mRNA的5′UTR互補的反義多核苷酸序列應當包括AUG起始密碼子的補體(例如，-20到+20核苷酸)。與mRNA編碼區(qū)互補的反義多核苷酸序列是欠有效的翻譯抑制劑，但是根據(jù)本發(fā)明可以使用。無論是設計成與編碼所述至少一種本發(fā)明的免疫原性膜蛋白mRNA的5′、3′或非編碼區(qū)雜交，反義多核苷酸序列應當至少長10個核苷酸，優(yōu)選地長度從15到約50個核苷酸范圍的多核苷酸序列。在某個實施方案中，反義多核苷酸序列長至少15個核苷酸、至少18個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25該核苷酸、至少30個核苷酸、至少35個核苷酸、至少40個核苷酸或者至少50個核苷酸。
不管如何選擇靶序列，優(yōu)選首先進行體外研究以定量反義多核苷酸序列抑制基因表達的能力。優(yōu)選這些研究利用區(qū)分反義多核苷酸序列的反義基因抑制和非特異性生物效應的對照。也優(yōu)選這些研究將靶RNA或蛋白的水平與內(nèi)對照RNA或蛋白的水平進行比較。另外，可以預見將使用反義多核苷酸序列所獲得的結(jié)果與使用對照序列所獲得的那些結(jié)果進行比較。優(yōu)選地對照寡核苷酸序列的長度與試驗反義多核苷酸序列大致相同并且應當具有相似的核苷酸組成、分子量和解鏈溫度。然而，這些參數(shù)間的不同不足以阻止與靶序列的特異性雜交。這些序列可是有義的、反義的或者混和的。
反義多核苷酸序列可以DNA或RNA，或者嵌合混合物、或者其衍生物、單鏈的或雙鏈的、或者形成三螺旋的寡核苷酸?？稍趬A基部分、糖部分或者磷酸主鏈上修飾反義多核苷酸序列，例如，改善分子的穩(wěn)定性、雜交等。反義多核苷酸序列可包括其它附加基團如肽(例如，用于體內(nèi)靶向宿主細胞受體)、或者便于跨細胞膜轉(zhuǎn)運的試劑(見Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6553-6556；Lemaitre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，648-652；于1988年12月公開的PCT公開No.WO 88/09810)或者穿過血腦屏障轉(zhuǎn)運的試劑(見1989年11月公開的PCT公開No.WO 89/10134)、雜交引發(fā)裂解劑(vander Krol等(1988)Biotechniques 6，958-976)或者嵌入劑(Zon，G.(1988)Pharm.Res.5，539-549)。為了這個目的，可將反義多核苷酸序列與其它分子結(jié)合，例如，肽、雜交引發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運劑、引發(fā)裂解劑等。例如，在2001年五月公開的Morcos等美國專利No.6,228,392和Morcos，P.A.(2001)Genesis 30，94-102中描述了使用乙氧基聚氮丙啶(EPEI)的便于嗎啉轉(zhuǎn)運的特殊給藥系統(tǒng)。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所使用的反義多核苷酸分子選自RNAi、嗎啉、PNAs、形成三螺旋的寡核苷酸、雙鏈和單鏈的多核苷酸序列。
反義多核苷酸序列可包括至少一種修飾的堿基部分，其選自下組包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mainnosylqueosine、5′-甲氧基羥甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2，6-二氨基嘌呤。
反義多核苷酸序列也可包括至少一種修飾的糖部分，其選自包括，但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，缺乏戊糖部分的反義多核苷酸序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，反義多核苷酸序列包括至少一種修飾的磷酸主鏈，其選自硫代磷酸酯(Stein和Cohen(1989)在OligonucleotidesAntisense Inhibitorsof Gene Expression.pp.97-117，J.Cohen編輯(Boca Raton，F(xiàn)LCRCPress，Inc.))、硫代磷酸酯、硫代氨基磷酰胺酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯(Froehler等(1988)NucleicAcids Res.16，4831-4839)、二氨基磷酰胺酸酯、甲基膦酸酯(Miller，P.(1989)在OligonucleotidesAntisense Inhibitors of GeneExpression，pp.85-92)、烷基磷酸三酯(Miller，P.(1989)在OligonucleotidesAntisense Inhibitors of Gene Expression.pp.82-85)、formacetal或其類似物，以及α-DNA(Rayner等(1989)在OligonucleotidesAntisense Inhibitors of Gene Expression，pp.119-136，J.Cohen編(Boca Raton，F(xiàn)LCRC Press，Inc.))，2′-O-甲基RNA(Shibahara等(1989)Nucleic Acids Res.17，239-252)、嗎啉主鏈(Summerton和Weller(1997)Antisense polynucleotide sequencesDrug Dev.7，187-195)、通過肽鍵連接的重復的N-(2-氨乙基)-甘氨酸單位(肽核酸；PNAs)(Hanvey等(1992)Science 258，1481-1485；Nielsen等(1993)Anticancer Drug Des.8，53-63；Nielsen，P.E.(2000)Curr.Opin.Mol.Ther.2，282-287)、或者閉鎖核酸(LNAs)(Kumar等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8，2219-2222；Petersen等(2000)J.Mol.Recognit.13，44-53)。
本發(fā)明的反義多核苷酸可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的標準方法合成。作為實例，可通過Stein等(1988)Nucleic Acids Res.16，3209-3021)的方法合成硫代磷酸酯寡聚體，可通過使用可控多孔玻璃多聚體支持物制備甲基膦酸酯寡聚體(Sarin等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，7448-7451)?？赏ㄟ^Summerton和Weller，美國專利Nos.5,217,866(于1993年6月公開)和5,185,444(1993年2月)等的方法合成嗎啉寡聚體。
此外，使用RNA干擾(RNAi)改變本發(fā)明免疫原性膜蛋白的翻譯后表達也在本發(fā)明的范圍內(nèi)(Boutla等(2001)Curr.Biol.11，1776-1780；Moss，E.G.(2001)Curr.Biol.11，R772-R775；Bernstein等(2001)RNA 7，1509-1521)。RNAi是一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方法，由在序列上與所沉默的基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)。序列特異性信使RNA降解的介質(zhì)是由核糖核酸酶III裂解較長dsRNAs所產(chǎn)生的小干擾RNAs(siRNAs)。通常，siRNAs的長度在20-25個核苷酸之間(Elbashir等(2001)Nature 411，494-498)。
形成三螺旋的寡核苷酸以修飾編碼本發(fā)明的免疫原性膜蛋白基因的表達也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。使用三螺旋結(jié)構(gòu)抑制雙螺旋足以對聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或者調(diào)控分子的結(jié)合開放的能力。已文在獻中描述了最近使用三螺旋DNA的治療進展(Gee，J.E.等(1994)在Huber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and Immunologic Approaches，F(xiàn)uturaPublishing Co.，Mt.Kisco，N.Y.)。
此外，本發(fā)明也包括使用環(huán)形RNA(即，RNA套索)抑制已知功能的特異性蛋白的翻譯。
本發(fā)明上述實施方案的優(yōu)選的反義多核苷酸序列包括沉默(RNAi)反義多核苷酸、嗎啉寡聚體(Summerton和Weller(1999)Antisense polynucleotide sequences Drug Dev.7，187-195)、肽核酸(PNAs)(Egholm等(1992)J.Am.Chem.Soc.114，1895-1897)和/或閉鎖核酸(LNAs)(Kumar等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8，2219-2222；Petersen等(2000)J.Mol.Recognit.13，44-53)。
在具體實施方案中，將反義多核苷酸序列遞送到在體內(nèi)表達本發(fā)明免疫原性膜蛋白的細胞中。已研發(fā)了許多方法用于將反義DNA或RNA遞送到細胞中；例如，可將反義分子直接注射到組織部位，或者可全身施用設計成靶向期望細胞的修飾的反義多核苷酸序列，例如，與靶細胞表面上的受體或所表達的抗原特異性結(jié)合的肽或抗體反義連接。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，從病毒載體中表達反義多核苷酸序列。適當載體的實例是，但不限于，痘苗病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或它們的組合。
反義多核苷酸序列也可包含在遞送復合物中，如例如，固醇、脂質(zhì)、病毒等。細胞也可作為遞送復合物。本發(fā)明因此提供治療特征為表達所述至少一種免疫原性膜蛋白或其片段的非類固醇依賴性癌的方法，包括分離細胞、使所述細胞與本發(fā)明的反義分子接觸以及向患非類固醇依賴性癌的受試者遞送所述細胞的步驟。
也可使用本發(fā)明的反義分子或表達和/或含有所述反義分子的細胞制備治療非類固醇依賴性癌的藥物組合物。優(yōu)選地所述細胞來自被治療的受試者。
探針和引物在本發(fā)明的上下文中，編碼本發(fā)明的人免疫原性膜蛋白(見表1)的多核苷酸序列將進一步允許產(chǎn)生用于在其它細胞類型中鑒定和/或克隆同系物的探針和引物，例如，其它組織的同系物以及其它哺乳動物的免疫原性膜蛋白同系物。
用作探針的優(yōu)選的多核苷酸序列，根據(jù)本發(fā)明的方法，包括具有編碼本發(fā)明的免疫原性膜蛋白(見表1)或其片段的多核苷酸序列中至少約15、至少約30、優(yōu)選地至少約50、更優(yōu)選地至少約100、甚至更優(yōu)選地至少約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，多核苷酸序列的一部分與所述膜蛋白基因的完整編碼序列的任何片段一致?？蛇x擇地，該部分可以是編碼人免疫膜蛋白保守基序或區(qū)域的特異性多核苷酸序列，例如，細胞外域?？蛇x擇地，該部分可以是位于編碼人免疫原性膜蛋白保守基序的多核苷酸序列之間的多核苷酸序列。
本發(fā)明進一步涉及用作探針/引物的多核苷酸序列分子(即，非編碼的多核苷酸序列分子)，其可包括至少約15、18、20、25、30、40、50、100、125、150或200個核苷酸或堿基對。其它優(yōu)選的多核苷酸序列包括各自cDNAs的至少約300、至少約350、至少約400、至少約450、至少約500或者至少約600個核苷酸。在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸序列與編碼本發(fā)明的免疫原性膜蛋白(見表1)的多核苷酸序列的5′部分一致。
在本發(fā)明中也使用能與編碼所述膜蛋白的多核苷酸序列雜交，特別是，在各種嚴緊條件下與表1中所示的那些序列及其片段雜交的多核苷酸序列。促進多核苷酸序列雜交的條件是本領域技術(shù)人員已知的(見Current Protocols in Molecular Biology(1989，John Wiley &Sons，N.Y.6.3.1-6.3.6；Jowett，T.(2001)Methods 23，345-358)。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明也提供包括基本上純化的寡核苷酸的探針/引物，其中寡核苷酸包括在嚴緊條件下與編碼免疫原性膜蛋白(見表1)，或其天然存在的突變體的多核苷酸序列的正義或反義序列的至少約15、優(yōu)選地約30、更優(yōu)選地約500、100或者200個連續(xù)核苷酸雜交的多核苷酸序列區(qū)域。例如，可在PCR反應中使用基于特定多核苷酸序列的引物以克隆同系物。優(yōu)選地在不與其它基因顯著同源的區(qū)域中選擇這種引物。同樣地，可使用基于編碼受試者膜蛋白的多核苷酸序列的探針檢測編碼相同或同源蛋白的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列。在優(yōu)選的實施方案中，探針進一步包括附著其上并可被檢測的標記基團，例如，標記基團選自放射性同位素、熒光化合物、酶和酶的輔因子。
這種探針也可作為診斷試驗試劑盒的一部分，用于鑒定過量表達本發(fā)明免疫原性膜蛋白的細胞或組織，如通過測量患者細胞樣品中各自多核苷酸序列(見表1)的水平；例如，檢測mRNA水平?？墒褂冕槍κ茉囌叨嗪塑账嵝蛄谢蜥槍κ茉囌呋蚪M序列的探針，用以對改變的基因表達水平進行預測性和治療性評價，其可表現(xiàn)在例如，組織的不需要的細胞生長或異常分化。用于確定受試者是否有發(fā)展成由編碼本發(fā)明免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列過量表達所致的非類固醇依賴性癌風險的試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該試劑盒可包括對編碼所述膜蛋白的特定多核苷酸序列特異的探針/引物、反應液和如何使用試劑盒的說明。
載體可使用含有編碼拮抗性多肽、肽的多核苷酸序列或者本發(fā)明免疫原性膜蛋白或多核苷酸序列的反義多核苷酸序列，并可操作地與至少一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列相連的表達載體實施本發(fā)明。調(diào)控序列是本領域技術(shù)人員公知的，并且特異性地選取以抑制內(nèi)源性免疫原性膜蛋白的表達和/或生物學活性。在Rodriguez和Chamberlin編輯(1982)PromotersStructure and function.NY.Praeger；Khoury和Gruss(1983)Cell 33，313-314中描述了這些調(diào)控序列。在一個實施方案中，表達載體包括編碼用于抑制免疫原性膜蛋白基因表達目的的反義多核苷酸序列的多核苷酸序列。在另一個實施方案中，表達載體含有編碼可用于抑制所述免疫原性膜蛋白的生物學活性的多肽或肽的多核苷酸序列。這種表達載體可作為基因治療方案的一部分。因此，本發(fā)明另一個方面的特色是用于取消所述免疫原性膜蛋白生物學活性(例如，上皮或癌細胞的分化)的拮抗性多肽、肽或反義多核苷酸序列體內(nèi)、體外、或者先體外后體內(nèi)轉(zhuǎn)染和表達的表達載體。這可能是期望的，例如，當?shù)鞍椎奶烊恍瓦^量表達時；或者遞送改變組織分化(例如，抑制癌細胞的細胞轉(zhuǎn)化、分化或增殖)的蛋白型。
除了病毒轉(zhuǎn)移法，也可使用非病毒法使拮抗性肽或多肽在動物的組織中表達?；蜣D(zhuǎn)移的絕大多數(shù)非病毒法依賴于哺乳動物細胞所使用的攝取和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運高分子的正常機制。在優(yōu)選的實施方案中，非病毒靶向方法依賴于靶細胞攝取拮抗性肽或多肽編碼基因的內(nèi)吞途徑。這種類型的示范性的靶向方法包括源自脂質(zhì)體的系統(tǒng)、聚賴氨酸偶合物以及人工病毒包膜。
抗體可使用常規(guī)方案，通過向動物，優(yōu)選地非人，施用多肽或帶有表位的片段、類似物或細胞，獲得產(chǎn)生抗本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的抗體，抗體可以是任何同種型(IgG、IgA、IgM、IgE等)?？贵w片段可通過現(xiàn)有技術(shù)中的公知常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)，如用某種蛋白酶的消化。因此，該術(shù)語包括抗體分子的蛋白酶剪切或重組制備部分的片段，其能選擇性地與某種蛋白反應。這種蛋白水解的和/或重組片段的非限制性實例包括Fab、F(ab′).sub.2、Fab′、Fv以及含有通過肽接頭連接的V[L]和/或V[H]區(qū)的單鏈抗體(scFv)。scFv′s可共價或非共價連接形成具有兩個或多個結(jié)合位點的抗體。本發(fā)明包括多克隆抗體、單克隆抗體或者抗體的其它純化制品和重組抗體。
為了制備單克隆抗體，可使用提供由連續(xù)細胞系培養(yǎng)物生產(chǎn)抗體的任何技術(shù)。實例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)、三瘤體(trioma)技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，Immunology Today(1983)472)和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
也可將生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(例如，在美國專利No.4,946,778中所描述的方法)進行修改以生產(chǎn)抗本發(fā)明多肽的單鏈抗體。同樣地，可使用轉(zhuǎn)基因小鼠，或者包括哺乳動物的其它生物表達人源化的抗體。
本發(fā)明的抗體可以是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或者具有更多特異性。針對本發(fā)明的免疫原性膜蛋白并可用于癌癥檢測的抗體可用單獨的抗體檢測，或者可用相同的抗體檢測?？蛇x擇地，多特異性抗體可顯示對同一蛋白上不同表位具有不同的特異性。在本發(fā)明中也包括結(jié)合多肽分子的抗體，其中該多肽分子由一個或多個與本發(fā)明的免疫原性膜蛋白的序列互補或雜交的核酸序列編碼或者由一個或多個與編碼所述膜蛋白的核酸序列互補或雜交的序列編碼。
可用于癌癥檢測的本發(fā)明的抗體可進一步用作與其結(jié)合的多肽分子活性的激動劑或拮抗劑，因而可用作癌癥治療或預防的治療性分子。抗體不一定要單獨使用，可與其它多肽融合，包括抗體多肽序列N或C末端的異種多肽。例如，可將在本發(fā)明中有用的抗體與可檢測的標記融合以便于當結(jié)合靶多肽時檢測抗體。本領域技術(shù)人員已知可檢測地標記抗體多肽的方法。
為了生產(chǎn)本發(fā)明中有用的抗體，可通過注射本發(fā)明候選基因的蛋白產(chǎn)物(或者保留免疫原性性質(zhì)的任何部分、片段或其寡核苷酸)免疫各種宿主包括山羊、兔子、大鼠、小鼠等。視宿主物種而定，可使用各種佐劑以提高免疫反應。這種佐劑包括但不限于弗氏佐劑、礦物凝膠如氫氧化鋁、以及表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍蛋白以及二硝基酚。BCG(bacilliCalmette-Guerin)和小棒桿菌都是潛在有用的人用佐劑。
可用現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法制備多克隆抗血清或單克隆抗體?？捎帽景l(fā)明免疫原性膜蛋白、片段、衍生物的免疫原性型或其變體型免疫哺乳動物如小鼠、倉鼠或兔。對這種分子賦予免疫原性的技術(shù)包括與載體偶聯(lián)或者現(xiàn)有技術(shù)中的其它公知技術(shù)。例如，可在存在上述佐劑時施用免疫原性分子?？赏ㄟ^檢測血漿或血清中的抗體滴定監(jiān)控免疫?？墒褂脴藴拭庖邷y定步驟，用免疫原作為抗原來評價抗體的水平和特異性。免疫后，可獲得抗血清，如果期望的話，從血清中分離多克隆抗體。
嵌合抗體，即，結(jié)合非人動物可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體分子，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。嵌合抗體分子包括，例如，小鼠、大鼠或其它物種抗體的抗原結(jié)合區(qū)，和人恒定區(qū)?？墒褂脴藴史椒ㄖ苽浜凶R別本發(fā)明免疫原性膜蛋白的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體(見，例如Morrison等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851；Takeda等，1985，Nature 314452；美國專利No.4,816,567；美國專利No.4,816,397)。
可在文獻中發(fā)現(xiàn)將分子標簽與結(jié)合的化合物，如抗體共價連接的廣泛指導，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，(AcademicPress，New York，1996)等。在本發(fā)明的一個方面，將一個或多個分子標簽直接或間接附著到結(jié)合化合物上的常用反應基團。常用的反應基團包括胺、硫醇、羰化物、羥基、醛、酮等，可通過可買到的交聯(lián)劑與分子標簽結(jié)合，例如，Hermanson(上面所引用的)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products，Ninth Edition(Molecular Probes，Eugene，Oreg.，2002)。
如在現(xiàn)有技術(shù)中公知的，抗體也可與選自包括色素原、催化劑、酶、熒光團、化學發(fā)光分子、生物素和放射性同位素的標簽偶聯(lián)。在美國專利No.4,366,241、美國專利No.4,843,000和美國專利No.4,849,338中公開了大量適于用作標簽的酶，這些專利中的每一個在此引作參考。可在本發(fā)明中使用的合適的酶標記包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等。酶標記可單獨使用或聯(lián)合溶液中的第二種酶使用。優(yōu)選地用于治療性目的，將抗體與細胞毒性部分偶聯(lián)。
熒光團可選自包括熒光素異硫氰酸(FITC)、四甲基羅丹明異硫氰酸(TRITC)、別藻藍蛋白(APC)、德克薩斯紅(TR)、Cy5或R-藻紅蛋白(RPE)的基團。可在，例如美國專利No.4,520,110和美國專利No.4,542,104中發(fā)現(xiàn)有用熒光團的實例，其在這此引入作為參考。
與一個或多個前體藥物偶聯(lián)的抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。“前體藥物”指藥物分子的藥學上無活性的衍生物，其需要在體內(nèi)轉(zhuǎn)化以釋放活性藥物。典型地，設計前體藥物以克服將限制藥物臨床應用的，與親本藥物分子相關(guān)的基于藥學和/或藥物動力學的問題。
也可將本發(fā)明的抗體與光敏劑偶聯(lián)，其反過來提供對用某種波長光治療的靈敏度。
得到FDA批準的第一個光敏劑是Photofrin，由加拿大QLT PhotoTherapeutics生產(chǎn)。另一種廣泛研究的光敏劑是氨基乙酰丙酸。在臨床試驗中其它分子是SnET2，其是作為Purlytin由Pharmacia/Upjohn生產(chǎn)的二氯卟酚光敏劑。另一種分子是作為Foscan由ScotiaPharmaceuticals生產(chǎn)的mTHPC，其是metatetrahydroxyphenylchlorin。已通過使用光敏劑Verteporfin，一種血卟啉衍生物，抑制斑點退化。Stewart和同事(Radiother Oncol 1998；48233)以及Dougherty和同事(J Natl Cancer Inst 1998；90889)已綜述了這些光敏劑和作為光敏劑的幾種其它分子。
可使用上述抗體分離或鑒定表達多肽的克隆或者通過層析純化多肽。優(yōu)選地，也可使用抗本發(fā)明多肽的抗體治療或診斷腫瘤病。
通過下列實施例進一步舉例說明本發(fā)明，其不應當被解釋為以任何方式限制。所有所引用的參考(包括文獻參考、授權(quán)的專利、公開的專利申請)的內(nèi)容，如在整個本申請中所引用的，均引入作為參考。除非有其它說明，本發(fā)明的實施將使用細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分子生物學、轉(zhuǎn)基因生物學、微生物學、重組DNA以及免疫學的常規(guī)技術(shù)，這些對于本領域技術(shù)人員來說都是已知的。這些技術(shù)已在文獻中充分說明。
實施例實施例1.從結(jié)腸組織中分離RNA以及cDNA的標記法為了診斷和治療各種類型的非類固醇依賴性癌，特別是那些源自上皮細胞的致瘤性轉(zhuǎn)化的癌，疾病特異性分子標記的鑒定就極其重要。在腫瘤組織和那些從健康個體中分離的組織之間，成功鑒定基于分子差異的先決條件在于從健康的和發(fā)生腫瘤的組織中分離的上皮細胞中差異性調(diào)控基因的對比轉(zhuǎn)錄分析。
對于這個目的，從處于疾病不同階段的結(jié)腸癌患者中收集組織樣品，連同從遠位點采集的健康結(jié)腸組織(樣品集)。在Cottbus(Carl-Thiem-Klinikum Cottbus，Chirurgische Klinik，03048 Cottbus，Germany)、Magdeburg(Otto-von-Guericke-Klinik，Leipziger Strasse44，39120 Magdeburg，Germany)和Erlangen(Friedrich-Alexander-Universitat，Chirurgische Klinik，91023 Erlangen，Germany)的醫(yī)院中，從不同年齡的男性和女性患者中收集組織樣品。
根據(jù)在專利W098/43091“上皮細胞異常的診斷”中所描述的方法分離上皮細胞。
最初通過與RNAlaterTM(Ambion，UK)在冰上孵育15分鐘制備組織樣品。孵育后，使用解剖刀降低組織樣品的大小(約1mm)并用300μM的鋼網(wǎng)機械分離。分離后，將細胞用50ml 1X PBS、50mlRNAlaterTM(Ambion，UK)，以及0.8mM苯脒、3mM EDTA、5mg/100ml Leupeptin和2mM Pefabloc(洗滌緩沖液)洗滌，在4℃以300g離心10分鐘并在4ml洗滌緩沖液中懸浮。為了從周圍細胞中分離上皮細胞，將細胞懸液與和磁珠共價連接的上皮細胞特異性的抗體(抗BerEP4)接觸。更具體地，將細胞懸液與80μl抗BerEP4 Dynabead(Deutsche Dynal GmbH，Germany)混合并在洗滌緩沖液中在2-8℃孵育30分鐘。使用磁鐵(Deutsche Dynal GmbH，Germany)收集結(jié)合Dynabead的上皮細胞、在冰上分成等份并貯藏在-80℃。
根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用RNAeasy(Qiagen，Germany)分離總RNA。使用RNA 6000 Nano Lab Chips(Agilent，Palo Alto)和Agilent′s2100 Bioanalyzer系統(tǒng)確定RNA的質(zhì)量。使用cDNA標記和清除的LabelStarTM試劑盒(Qiagen，Germany)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，將來自每種組織樣品的10μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生花菁(Cy-3)和花菁(Cy-5)標記的cDNA靶并制備用于微陣列。
為了鑒定哪種基因在腫瘤對健康組織樣品中差異性表達，使用含有表達12000個以上人序列的微陣列(人-1cDNA微陣列，AgilentTechnologies，USA)分析每種樣品集。將從非腫瘤組織中分離的Cy-3標記的上皮細胞cDNAs與從腫瘤組織中分離的Cy-5標記的上皮細胞cDNAs混合，并在65℃與微陣列過夜雜交(根據(jù)生產(chǎn)商的說明，人-1cDNA微陣列試劑盒，Agilent Technologies，USA)。進行所有雜交作為熒光逆轉(zhuǎn)對。雜交后，洗滌微陣列以除去任何未結(jié)合的分子，隨后使用Agilent Technologies的雙激光微陣列掃描儀(AgilentTechnologies，USA)掃描與它們互補序列雜交的cDNAs。隨后，使用Agilent Technologies的Feature Extraction軟件(Version A6.1.1)將各種芯片特征的位置(點)與微陣列上注釋的編碼序列聯(lián)系起來。為了提供關(guān)于其各自編碼序列在腫瘤和健康組織中表達水平的信息，也可使用該軟件計算單個芯片特征的信號強度(圖1)。提取特征后，使用Rosetta Resolver系統(tǒng)(Rosetta Inpharmatics.Kirkland，WA)進行數(shù)據(jù)分析。
實施例2.使用Rosetta Resolver(Rosetta Inpharmatics.Kirkland，WA)進行數(shù)據(jù)分析使用Rosetta Resolver平臺(Rosetta Inpharmatics.Kirkland，WA)研究編碼血漿膜蛋白或血漿膜相關(guān)蛋白基因的表達。使用公眾可獲得的LocusLink數(shù)據(jù)庫(NCBI)，可將所有編碼所提取的已知血漿膜蛋白或血漿膜相關(guān)蛋白基因的基因名稱和數(shù)據(jù)庫鑒定物定位到它們在人-1cDNA微陣列(Agilent Technologies，USA)上經(jīng)鑒定的相應的特征。在研究期間，在所使用的cDNA微陣列上存在1480個在LocusLink(NCBI)中登記的已知血漿膜蛋白或相關(guān)蛋白的1147個編碼序列。在Rosetta Resolver(Agilent Technologies，USA)內(nèi)在生物集中結(jié)合這些1147個基因并且在15個結(jié)腸樣品(腫瘤和健康樣品)中分析它們的表達?；谒^察到的差異性基因表達，鑒定特別感興趣的蛋白編碼基因，其中在正常對腫瘤組織中基因表達的差異(倍數(shù)改變)至少1.5倍。此外，也考慮顯示關(guān)于基因表達測量具有極大可信度的蛋白編碼基因。使用評估特定測量總誤差的特異性誤差模型(通過Rosetta Resolver完成)測量可信度。該特異性誤差模型解釋隨機誤差以及任何未被解釋的系統(tǒng)誤差，并且計算特定無效(統(tǒng)計學的)假設的P值，可信度的測量值。僅選擇滿足上述標準(P值為0.01)的那些基因，以及在30％或更多所研究的患者中發(fā)現(xiàn)差異表達的那些基因(表1)。
實施例3.用于診斷目的的患者中差異性基因表達的檢測可通過實時定量RT(反轉(zhuǎn)錄)-PCR(聚合酶鏈反應)(參考)分析本發(fā)明蛋白的免疫原性膜蛋白的表達模式。簡要地，使用隨機六聚體將感興趣組織的最少20個腫瘤和非腫瘤對(分離的上皮細胞)以及3-4個不同細胞系(試驗內(nèi)變異的對照)的總RNA一式三份進行反轉(zhuǎn)錄，然后在存在SYBR綠I時，使用感興趣序列的特異性引物對，通過實時定量PCR進行平行擴增。使用Applied Biosystems′PrimerExpress 2.0軟件設計這些引物；它們應當跨越內(nèi)含子以避免檢測到污染的DNA，并且不應當與如進行BLAST搜索所檢測到的人基因組的任何其它序列互補。使用28S rRNA作為內(nèi)參考對數(shù)據(jù)進行標準化(校正樣品與樣品由于吸移所致的差異等)。擴增以及當SYBR綠插入到最近擴增的序列的雙鏈內(nèi)時，使用ABI Prism 7000序列檢測系統(tǒng)和Applied Biosystems的相關(guān)軟件(v.1.0)常規(guī)進行所產(chǎn)生的熒光信號的實時檢測和分析。每個樣品的值通常表示為Ct(閾值周期)值，即，在這個周期中，一旦背景信號固定，首先檢測某種閾值上的熒光信號。適當標準曲線的每個Ct值(通過從總RNA樣品的一系列已知稀釋物中擴增靶和參考基因所獲得的量與Ct值的圖)的外推將提供特定復制的樣品中所述免疫原性膜蛋白基因和參考基因的相對量，而[均值±SD]靶基因/[均值±SD]參考基因的比將使該特定樣品內(nèi)特定靶的量標準化，使得可在樣品之間進行比較。因此，一旦標準化，將每個腫瘤中的特定靶(編碼所述免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列)的量與相應的非腫瘤樣品中同一靶的量進行比較，看其在特定樣品中是否過量或低量表達，或者其表達是否不改變(見表2)。最后，對所有樣品中特定靶表達的分析將提供關(guān)于在某種腫瘤類型中其是否全面或部分(和以何種頻率)過(或低)表達的信息。
表2與非癌性疾病相比，在患結(jié)腸直腸癌的同一患者的腫瘤組織(T)與正常組織(NT)中免疫原性膜蛋白的差異表達。當與正常組織標準化時，表達水平表示為表達倍數(shù)。
所有癌癥病例經(jīng)過鑒定，至少一種本發(fā)明的免疫原性膜蛋白在腫瘤組織中的表達比在正常組織中至少高兩倍。圖2顯示基于TM4SF6表達的診斷結(jié)果。
實施例4.蛋白表達的反義抑制為了降低過量表達所述蛋白的細胞的致瘤性潛在性，可特異性下調(diào)本發(fā)明的所述免疫原性膜蛋白的基因表達。這種最近研發(fā)的和廣泛應用的技術(shù)使用短的(21bp)合成的雙鏈RNA雙螺旋(沉默子RNA，siRNA)，其與靶基因mRNA的編碼序列互補并引發(fā)特異性mRNA降解。使用siRNA轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞系內(nèi)，已經(jīng)“敲除”了許多哺乳動物的基因，并且已經(jīng)描述了所得的表型。
簡要地，對于上述蛋白基因(SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3和ZP3)中的每一種，在它們相應mRNAs上的不同位置設計3到5個siRNA，使用Dharmacon“siDESIGN Center”軟件以及人Unigene中的另外的BlastN2以便將離靶(off-target)同源性降到最低。合成的siRNAs購自Dharmacon或MWG biotech。將不同的人類腫瘤細胞系一式三份用每種siRNA 50nM連續(xù)轉(zhuǎn)染(使用Lipofectamine 2000，Invitrogen)三天，在基因敲除的第一次轉(zhuǎn)染后的第4天進行分析。通過定量RT-PCR，或者如果可獲得抗特定蛋白的抗體則通過Western印跡進行基因敲除的分析。
圖3顯示通過RT-PCR定量的，用TM4SF6特異的siRNAs，SF1和SF2敲除的結(jié)果。
在有效的基因敲除與細胞增殖降低一致的那些情況中，可進行進一步的表型分析，例如，用于分析凋亡的染色(Annexin V)、細胞周期分析(使用RNA酶處理和碘化丙錠染色)以及代謝活性測定(WST-1，Roche)。可選擇地，為了從試驗中排除非轉(zhuǎn)染的細胞，這些分析將用相應的siRNA表達質(zhì)粒(Ambion的pSilencer或者GenScript的pRNA)在G418(新霉素)選擇下進行。編碼本發(fā)明的免疫原性膜蛋白基因的表達抑制將增加凋亡、細胞周期停止和/或代謝活性降低。
表4能抑制本發(fā)明的免疫原性膜蛋白表達的治療性siRNA分子。
實施例5.本發(fā)明免疫原性膜蛋白特異性抗體的鑒定至少部分基于前面實施例中所描述的結(jié)果，治療劑將與所述免疫原性膜蛋白相互作用并因此能夠用于治療非類固醇依賴性癌。將特異性抗體作為與特定分子相互作用的試劑廣泛使用。
通過在大腸桿菌中表達編碼TM4SF6的基因片段制備所述蛋白的可溶性的結(jié)合片段。
TM4SF6的EC2環(huán)的克隆使用pfu聚合酶以及引物EC2-a(ggatccagacatgagattaagaac)和EC2-b(aagcttattctgactctataatgg)從基因TM4SF6的已證實序列的克隆中擴增感興趣的DNA序列。使用TA克隆策略將PCR產(chǎn)物亞克隆到載體pCR2.1內(nèi)。使用限制性酶Bam HI(在引物EC2-a中)和Hind III(在引物EC2-b中)將感興趣的DNA序列克隆到Qiagen的細菌表達質(zhì)粒PQE-30中，產(chǎn)生表達質(zhì)粒pQE-415-EC2。序列證實后，將載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)內(nèi)。
TM4SF6表達在30℃在LB-NZ培養(yǎng)基(5g NaCl、5g酵母提取物、10g NZ胺)中培養(yǎng)BL21(Amp.)中的pQE-415-EC2過夜培養(yǎng)物，第二天早上接種450ml LB-NZ(在1L燒瓶內(nèi))(到OD600為0.05-0.1)，在37℃培養(yǎng)到OD600為0.5-0.6。
將培養(yǎng)物用5mM(終濃度)IPTG誘導；5-6小時后收獲細胞，在3個試管內(nèi)分成3等份，用20mM磷酸緩沖液pH 8洗滌并在-80℃貯藏用于進一步使用。
制備細胞提取物將細胞解凍并添加30ml 20mM磷酸緩沖液pH 8；添加溶菌酶到終濃度為1mg/ml，將混合物在冰上輕輕搖動孵育30分鐘，隨后添加尿素到終濃度為5M。將DNA通過超聲破裂并使用MLA-80超速離心機轉(zhuǎn)子將提取物在25,000rpm離心30分鐘。
使用AKTA FPLC的柱層析第一次電泳將上清液加樣到Sigma的Ni-瓊脂糖柱后，將柱用5倍柱體積的100％緩沖液A1(20mM磷酸緩沖液pH 8、200mM NaCl、5M Harnstoff)洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液B1(20mM磷酸緩沖液pH 8、200NaCl、5M Harnstoff、1M咪唑)洗滌。將蛋白用100％緩沖液B1洗脫。
第二次電泳對于再層析，用緩沖液A2(20mM磷酸緩沖液pH6.3、250mM NaCl)1∶10稀釋感興趣的流分。將新的Ni-瓊脂糖柱用10倍柱體積的0-30％梯度的緩沖液B2(20mM磷酸緩沖液pH 6.3、250mM NaCl、1M咪唑)洗滌。將蛋白用100％緩沖液B2洗脫。
使用資源S的層析將第二次電泳中的感興趣的流分在緩沖液A3(20mM MES，pH 6)中1∶20稀釋并加樣到1ml Respurce S柱上。將蛋白在30分鐘內(nèi)(流速1ml/分)用0-100％梯度的緩沖液B3(20mMMES、500mM NaCl，pH 6)洗脫。
圖4顯示用考馬斯藍染色的純化流分的SDS-PAGE。
另外，用根據(jù)表5的跨越某種區(qū)域的合成肽免疫兔
表5用于免疫兔的肽
KLH偶聯(lián)將100mg匙孔血藍蛋白(KLH)溶于2ml水中并對2L 0.1M磷酸鈉pH 7.8過夜透析。這將除去任何污染的硫醇或氨基化合物。在微離心機中全速離心10分鐘除去聚集物。
對于-NH2偶聯(lián)，向一半KLH中添加5mg肽，隨后添加戊二醛到0.1％終濃度，如果必要的話使用NaOH將pH調(diào)整到7.8。在4℃，輕輕旋轉(zhuǎn)孵育8-12小時。
添加很少的一撮NaBH4后，將混合物在4℃孵育8-12小時。
對于-SH偶聯(lián)，將另一等份KLH加熱到室溫。添加1/9體積溶于DMSO的100mg/ml碘乙酸N-羥基琥珀酰胺酯(Sigma)。在室溫下放置10分鐘后，KLH將開始變得輕微混濁。將其在用0.1M磷酸鈉pH 7.8平衡的P-10柱上純化。通過顏色匯集含有KLH的流分，添加5mg肽并在4℃輕輕旋轉(zhuǎn)孵育至少8小時。
在第0、14和28天用450-600μg偶聯(lián)KLH的肽免疫兔子，初次注射用完全弗氏佐劑，強化注射用不完全佐劑。
抗體的純化根據(jù)生產(chǎn)商的說明，將各自肽與AF-Amino Toyopearl 650M偶聯(lián)，并在PBS中用于批層析，隨后用PBS洗滌5次。
特異性結(jié)合基質(zhì)的抗體用100mM甘氨酸pH 2.5洗脫。
將純化的抗體在-20℃貯藏在PBS/0.01％疊氮鈉/1％BSA/50％甘油中。
實施例6組織切片的免疫組化免疫組化是一種現(xiàn)有技術(shù)中公知的體外診斷方法。使用下列方案對石蠟包埋的組織切片進行TM4SF6染色，使用EP03-415抗體。
Pre-預孵 TBS/0.1％Triton-X-100(30分鐘)；rtPOX-抑制 3％H2O2(10分鐘)抑制 SEA-封閉(10分鐘)一抗孵育 在TBS中1∶200稀釋/10％SEA封閉(30分鐘)洗滌 TBS/0.05％Tween 20(3×10分鐘)；rt二抗和顯色 En Vision，POD(DAKO)；30分鐘；rtDAB；5分鐘；rt圖5顯示患結(jié)腸癌和黑素瘤患者的免疫組化結(jié)果。染色模式允許區(qū)分健康的、非轉(zhuǎn)化的組織和癌細胞。因此，可對活檢和/或手術(shù)樣品進行免疫組化用于診斷目的。
權(quán)利要求
1.篩選治療非類固醇依賴性癌治療劑的方法，其中非類固醇依賴性癌的特征是至少一種選自TM4SF6、SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽和/或其片段的免疫原性膜蛋白的異常表達和/或生物學活性發(fā)生改變。
2.權(quán)利要求1的方法，包括a.在允許特異性結(jié)合和/或相互作用的條件下，使在所述免疫原性膜蛋白啟動子控制下的報告分子構(gòu)建體與試驗分子或化合物、或者試驗分子或化合物的文庫接觸；b.檢測報告分子構(gòu)建體的表達水平，其中相對于對照，表達水平的改變表明具有潛在的治療活性。
3.權(quán)利要求1的方法，包括a.在使特異性結(jié)合和/或相互作用的條件下，使所述至少一種免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段與試驗分子或化合物、或者試驗分子或化合物的文庫接觸；b.檢測特異性結(jié)合和/或相互作用的水平，其中相對于對照，相互作用水平的改變表明具有潛在的治療活性。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項的方法，其中治療劑抑制所述至少一種免疫原性膜蛋白的表達和/或生物學活性。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項的方法，其中試驗分子或化合物的文庫選自DNA和/或RNA分子、肽、激動劑、拮抗劑、單克隆抗體、免疫球蛋白、小分子藥物、藥劑及它們的組合。
6.一種藥物組合物，包括由權(quán)利要求1-5中任何一項方法鑒定的治療劑、或片段、衍生物或其同系物。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，進一步包括藥學上可接受的載體。
8.通過權(quán)利要求1-5中任何一項鑒定的治療劑、或衍生物或其同系物、或者含有和/或表達所述治療劑或衍生物或其同系物的遞送復合物在制備治療非類固醇依賴性癌的藥物組合物中的用途。
9.一種抑制編碼所示至少一種免疫原性膜蛋白的多核苷酸序列的方法，用于調(diào)節(jié)靶細胞的增殖和/或分化或細胞死亡的目的，包括a.提供權(quán)利要求6-8中任何一項的組合物，或者包括通過權(quán)利要求1-5中任何一項方法鑒定的治療劑的組合物，和b.將治療有效量的(a)的組合物與所述靶細胞接觸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述靶細胞是腫瘤細胞。
11.一種治療由所述至少一種免疫原性膜蛋白的異常表達和/或生物學活性改變所致的非類固醇依賴性癌的方法，包括向受試者施用治療有效量的權(quán)利要求6-8中任何一項的藥物組合物，或者通過權(quán)利要求1-5中任何一項方法鑒定的治療劑。
12.權(quán)利要求9-11中任何一項的方法，其中治療劑是與所述至少一種免疫原性膜蛋白或其片段互補的反義多核苷酸序列。
13.權(quán)利要求10-12中任何一項的方法，其中所述反義多核苷酸序列的結(jié)合有效地改變編碼所述至少一種免疫原性膜蛋白或其片段的mRNA在表達所述mRNA的宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄或翻譯。
14.權(quán)利要求10-13中任何一項的方法，其中從病毒載體中表達反義多核苷酸序列。
15.權(quán)利要求14的方法，其中病毒雜體是痘苗病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或它們的組合。
16.權(quán)利要求18的任何一項的方法，其中反義多核苷酸序列位于遞送復合物內(nèi)。
17.權(quán)利要求19的方法，其中遞送復合物是固醇、脂質(zhì)、病毒。
18.一種治療以表達所述至少一種免疫原性膜蛋白或其片段為特征的非類固醇依賴性癌的方法，包括下列步驟a.分離細胞b.使所述細胞與權(quán)利要求12-17中所定義的反義分子接觸，和c.向患非類固醇依賴性癌的患者施用所述的細胞。
19.如在權(quán)利要求12-17中所定義的反義分子或者表達和/或含有所述反義分子的細胞在制備治療非類固醇依賴性癌的藥物組合物中的用途。
20.權(quán)利要求18的方法或權(quán)利要求19的用途，其中所述細胞來自治療的受試者。
21.至少一種所述的免疫原性膜蛋白、片段、衍生物或其同系物，或者含有和/或表達至少一種所述免疫原性膜蛋白、或片段、衍生物或其同系物的細胞在制備用于接種受試者的藥物組合物中的用途。
22.篩選特異性結(jié)合編碼所述至少一種免疫原性膜多肽的多核苷酸或者結(jié)合至少一種免疫原性膜多肽的試劑的方法，包括a.在使特異性結(jié)合和/或相互作用的條件下，使所述至少一種免疫原性膜蛋白、衍生物或其片段與試驗分子或化合物、或者試驗分子或化合物的文庫接觸；b.檢測特異性結(jié)合和/或相互作用的水平。
23.權(quán)利要求22的方法，其中試驗分子或化合物文庫選自DNA和/或RNA分子、肽、激動劑、拮抗劑、單克隆抗體、免疫球蛋白、小分子、藥劑及它們的組合。
24.一種特異性結(jié)合編碼所述至少一種免疫原性膜多肽的多核苷酸或者結(jié)合所述至少一種免疫原性膜多肽的試劑。
25.權(quán)利要求24的試劑，其是抗體，優(yōu)選地是單克隆抗體。
26.權(quán)利要求24的試劑或權(quán)利要求25的抗體，包括另外的部分。
27.權(quán)利要求24-26中任何一項的試劑或抗體在制備用于非類固醇依賴性癌的治療、診斷或顯現(xiàn)的藥物組合物中的用途。
28.權(quán)利要求1-27中任何一項的用途、方法、試劑或藥物組合物，其中非類固醇依賴性癌是乳腺癌、肺癌、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、皮膚癌和/或上皮組織引起的其它癌。
29.權(quán)利要求28的用途、方法、試劑或藥物組合物，其中非類固醇依賴性癌是皮膚癌，特別是黑素瘤或結(jié)腸直腸癌。
30.一種確定受試者是否有發(fā)展成非類固醇依賴性癌的風險或者患有該病的方法，包括a.測定所述受試者的樣品中編碼所述至少一種免疫原性膜多肽的多核苷酸的量或所述免疫原性膜多肽的量，和b.將所述多核苷酸或多肽的量與代表健康受試者的對照量進行比較。
31.一種鑒定受試者是否有發(fā)展成非類固醇依賴性癌的風險或者患該病的試劑盒，其中非類固醇依賴性癌由編碼SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽的多核苷酸序列的異常表達所致，試劑盒包括測量所述受試者的細胞樣品中編碼SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3的多核苷酸序列(分別是X68194、AF190167、BC006433、X91788、M13667、BC000214、U31382、NM 021999、L38961、U81006、AF043906、U30185、AB011540、U20489、U88879、X56777)水平的方法以及使用該試劑盒的說明。
32.一種鑒定受試者是否有發(fā)展成非類固醇依賴性癌的風險或患該病的試劑盒，其中非類固醇依賴性癌由SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽的生物學活性改變所致，該試劑盒包括測量所述受試者的細胞樣品中SYPL、STOML2、RAGA、CLNS1A、PRNP、GNB2L1、GNG4、ITM2B、ITM1、TM9SF2、TM4SF6、OPRL1、LRP4、GLEPP1、TLR3或ZP3多肽水平的方法以及使用該試劑盒的說明。
33.權(quán)利要求1-30中任何一項的藥物組合物、方法、用途或試劑盒，其中所述至少一種免疫原性膜蛋白是人源的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于癌癥的診斷、預測和治療的試劑和方法。具體地，本發(fā)明涉及使用編碼跨膜超家族成員6(TM4SF6)、突觸泡蛋白樣蛋白(SYPL)、stomatin樣2(STOML2)、Ras－相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白(RAGA)、核苷酸敏感的氯離子通道1A(CLNS1A)、朊病毒蛋白(p27－30)(PRNP)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β2－樣1(GNB2L1)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白4(GNG4)、整合膜蛋白2B(ITM2B)、整合膜蛋白1(ITM1)、跨膜9超家族成員2(TM9SF2)、鴉片受體樣1蛋白(OPRL1)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP4)、人腎小球上皮蛋白1(GLEPP1)、toll樣受體3(TLR3)、和/或透明帶糖蛋白3A(ZP3)的核酸和氨基酸序列用于早期和晚期非類固醇特異性癌診斷、癌癥預后、以及用于篩選調(diào)節(jié)所述蛋白的基因表達和/或生物學活性的治療劑。本發(fā)明進一步涉及設計的用于抑制所述蛋白的基因表達和/或生物學活性的生物技術(shù)，包括使用在這里所述的篩選試驗中鑒定的試劑、反義多核苷酸序列的載體遞送以及所述蛋白的靶向抗體。在具體實施方案中，蛋白是人來源的蛋白。
文檔編號G01N33/68GK1902326SQ200480034085
公開日2007年1月24日 申請日期2004年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者T·布施曼, N·－K·福蒂亞迪斯, M·福赫斯, S·黑姆, T·伊利尼亞, S·拉默, J·莫伊爾, K·羅特曼－科西克, V·塞伯特, S·T·佩雷斯, K·斯戴荘斯基 申請人:根馬布股份公司