專利名稱：睪酮化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床血液檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用酶促化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)人血清中睪酮(Testosterone)含量的試劑盒。
背景技術(shù)：
睪酮是廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一種類固醇類激素，準(zhǔn)確測(cè)定其在生物體內(nèi)的含量，在判斷其生殖功能、正常生理指數(shù)及病理濃度而用于疾病的診斷方面有重要作用。男性體內(nèi)睪酮由睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，男性血清中的睪酮含量是證實(shí)可疑睪丸功能紊亂，證明雄性激素缺乏以及檢測(cè)睪酮代替治療最重要的檢測(cè)參數(shù)。女性體內(nèi)睪酮主要在卵巢中合成，也在腎上腺皮質(zhì)內(nèi)合成，女性血清中的睪酮含量用于確定女性雄激素過多癥。
目前對(duì)睪酮激素檢測(cè)，多是采用自60年代發(fā)展起來的放射免疫分析方法和80年代興起的酶聯(lián)免疫分析法。放射免疫分析法必須使用放射性標(biāo)記物，檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜，必需用專門的放射性探測(cè)器對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，對(duì)操作人員也存在有放射性污染與傷害，需要特殊的防護(hù)和去污設(shè)備。此外，因所使用放射性標(biāo)記物的放射性核素時(shí)刻都在發(fā)生衰變，特別是如常用的碘-125、碘-131和磷-32等半衰期短的核素，其保存時(shí)期不長(zhǎng)，也給臨床使用帶來了不便。酶聯(lián)免疫分析法雖然避免了放射免疫分析法的污染、繁瑣、保存期短等問題，但由于其檢測(cè)范圍窄、靈敏度低等缺點(diǎn)仍不能滿足臨床的需求。
常規(guī)的類固醇激素檢測(cè)所建立的免疫學(xué)方法，多是直接用抗該激素的抗體，即所謂的第一抗體對(duì)所用微孔板的板孔進(jìn)行包被。由于競(jìng)爭(zhēng)法要求限量包被，直接包被的效果孔間常存在有較明顯的差異，變異系數(shù)約為5-20％，直接影響測(cè)定的精密度(即重現(xiàn)性)；若包被過量又會(huì)降低試劑的靈敏度。
化學(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記方法的不同而分為直接標(biāo)記法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法兩種。其中，直接標(biāo)記法多采用的是吖啶酯或魯米諾直接標(biāo)記在抗原或抗體上用于檢測(cè)。由于其發(fā)光是閃爍光，不宜捕獲，適用于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器。本發(fā)明的設(shè)計(jì)是針對(duì)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，為其提供一種既可手工操作，又可用于某些全自動(dòng)檢測(cè)儀器的檢測(cè)試劑，因此，本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)的96孔微孔板為固相載體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮，催化發(fā)光底物發(fā)光作為示蹤信號(hào)用以檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用第二抗體預(yù)包被板的方式檢測(cè)睪酮用的化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)精密度、靈敏度和穩(wěn)定性較高，特異性和準(zhǔn)確性較好。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案睪酮(Testosterone)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，主要由包被第二抗體的不透明聚苯乙烯板、睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)品、抗睪酮抗體溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮溶液、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液組成。
包被第二抗體的不透明聚苯乙烯板為包被羊抗兔/鼠免疫球蛋白G抗體的不透明聚苯乙烯板；睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)品用去激素血清作為基質(zhì)，加入經(jīng)無水乙醇溶解的睪酮純品配制而成；抗睪酮抗體溶液用分析緩沖液作為基質(zhì)，加入一定濃度的兔抗睪酮多克隆抗體或鼠抗睪酮單克隆抗體配成；辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮溶液用分析緩沖液作為基質(zhì)，加入一定濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮；發(fā)光底物A液由高效發(fā)光劑、復(fù)合增強(qiáng)劑、氨基酸組成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶及穩(wěn)定劑組成。
分析緩沖液由0.05Mtris-HCl鹽溶液和1％牛血清白蛋白(BSA)組成，pH7.5；辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮使用時(shí)的工作濃度為1∶300000-500000；發(fā)光底物A液配方為luminol 0.15mM、羥基香豆素0.59mM、沒食子酸0.35mM、Tris-Hcl緩沖液0.2M，pH 9.4；發(fā)光底物B液配方為氨基酸氧化酶0.85mM、吐溫-200.8％(V/V)、DTPA 0.5mM、維生素C 0.12mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2M，pH 6.5。
本發(fā)明睪酮(Testosterone)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，由免疫反應(yīng)滴定微孔板和檢測(cè)試劑兩部分組成。其中的免疫反應(yīng)滴定微孔板采用標(biāo)準(zhǔn)的96孔的不透明聚苯乙烯白色微孔板；檢測(cè)試劑包括作為第一抗體的抗睪酮抗體、睪酮標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)睪酮、發(fā)光底物A和發(fā)光底物B等試劑。不透明聚苯乙烯白色微孔板為預(yù)先包被了第二抗體的微孔板，包被液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液，包被濃度為2-5ug/ml，包被量100ul/孔，0℃-4℃孵育過夜；棄去孔內(nèi)液體，用PBS-Tween洗液洗板孔兩次；用pH7.4PBS-1％BSA，150ul/孔封閉，室溫孵育3小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7.4PBS-2.5％蔗糖，150ul/孔保護(hù)；棄去孔內(nèi)液體，經(jīng)干燥后裝入隔潮的鋁箔袋中密封保存。
本發(fā)明中包被所用第二抗體，可用目前常規(guī)的方法自行制備，也可選用市購(gòu)的羊抗兔免疫球蛋白G或羊抗鼠免疫球蛋白G。提高所用第二抗體的純度有利于保證和提高測(cè)試效果。
檢測(cè)試劑中所用的兔抗睪酮多克隆抗體可以采用常規(guī)方法自行制備，如用睪酮-3-羧甲基-BSA作為抗原，對(duì)家兔進(jìn)行免疫，可獲得特異性強(qiáng)的抗血清。也可以采用市購(gòu)的成品。提高所用兔抗睪酮抗體的滴度可以提高檢測(cè)的特異性與準(zhǔn)確性。
檢測(cè)試劑中所用的鼠抗睪酮單克隆抗體，用睪酮-3-羧甲基-BSA作為抗原，采用常規(guī)的細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備。也可以采用市購(gòu)的成品。
檢測(cè)試劑中所用的酶標(biāo)睪酮，可采用混合酸酐法用辣根過氧化物對(duì)睪酮-3-羧甲基肟進(jìn)行標(biāo)記，此方法獲得的酶標(biāo)睪酮的工作濃度為1∶30萬-50萬。
本發(fā)明采用化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，利用辣根過氧化物酶催化發(fā)光底物，發(fā)光底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，可同時(shí)發(fā)射出光子，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器即可測(cè)量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測(cè)物質(zhì)的量成正比。由此可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。
化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)便、無放射性污染等特點(diǎn)，現(xiàn)已從實(shí)驗(yàn)室研究進(jìn)入常規(guī)臨床診斷應(yīng)用。
本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用操作程序如下(一)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1、確保操作環(huán)境在室溫(18-25℃)，取出試劑盒及待測(cè)樣品。將所有試劑及樣品恢復(fù)至室溫(約需30分鐘)；2、將恒溫箱或水浴鍋調(diào)至反應(yīng)溫度；3、將發(fā)光底物A、B液等比例混合至本次試驗(yàn)所需體積(每孔需50μl，可按照每條包被板(8孔)需混合后的發(fā)光底物0.5ml混合，依此類推)；(二)實(shí)驗(yàn)步驟1、取出一定量的包被孔編號(hào)，每孔分別加入25μl睪酮標(biāo)準(zhǔn)品或病人血清樣品；2、每孔分別加入抗睪酮抗體溶液50μl(綠色液體)；3、每孔分別加入酶標(biāo)睪酮50μl(紅色溶液)；4、在微量振蕩器上振蕩30秒使其充分混合均勻；5、貼封膜后，在室溫條件(18-25C)溫育60分鐘；6、甩去孔內(nèi)混合物，用工作濃度洗液洗滌微孔5次，每次沖洗后將水分甩盡，最后在吸水紙上拍干，切勿擦拭反應(yīng)孔內(nèi)壁；7、每孔加入混合后的底物50μl，室溫(18-25℃)反應(yīng)10分鐘；8、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)各孔的發(fā)光強(qiáng)度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出病人血清標(biāo)本中睪酮的含量。
本發(fā)明的上述檢測(cè)試劑盒按上述程序進(jìn)行測(cè)定所用時(shí)間很短，一批測(cè)定一般僅需一個(gè)多小時(shí)即可完成，方便快速。
如前所述，用抗睪酮特異性抗體直接包被時(shí)，固定在各板孔內(nèi)的抗體分子數(shù)量差異的變異系數(shù)較大，可達(dá)5-20％，是影響測(cè)量精密度的一個(gè)重要因素。本發(fā)明的預(yù)包被第二抗體采用的是過量包被，即使各孔中被吸附的第二抗體分子數(shù)有一定的差異，也影響不大。在后續(xù)的操作中只要各孔中加入的第一抗體溶液的體積相同，在孔壁上被固定的第一抗體的分子數(shù)量就基本相同，各空間的差異大大減小，實(shí)測(cè)表明其變異系數(shù)一般均＜5％。從而能顯著提高測(cè)定的精密度。與此同時(shí)，第二抗體價(jià)廉，價(jià)格較高的第一抗體的用量只需以第一抗體包被方法用量的3-4％，大大節(jié)約可這一種活性材料，大幅降低整個(gè)試劑盒的成本。
經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明上述化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑在用于睪酮含量測(cè)定時(shí)的方法學(xué)鑒定數(shù)據(jù)可達(dá)到如下指標(biāo)靈敏度-最小檢出量為0.1ng/ml；標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍-0-20ng/ml；精密度-分析內(nèi)精密度平均為5.53％(n＝10)，分析間精密度平均為9.65％(n＝10)，遠(yuǎn)高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，說明本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中具有很好的重復(fù)性；特異性-與不同類固醇激素的交叉反應(yīng)率為睪酮100％，二氫睪酮5.6％，雄酮0.1％，孕酮、雌二醇、雌三醇及皮質(zhì)醇均＜0.1％；準(zhǔn)確性-向血清中添加標(biāo)準(zhǔn)睪酮后的回收率為98-110％。
實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明對(duì)人血清中的睪酮進(jìn)行測(cè)定，只需取少量樣品即可進(jìn)行，對(duì)被檢測(cè)者沒有任何傷害。本發(fā)明采用的第二抗體包被法顯著提高了測(cè)定的精密度，大幅減少了價(jià)格較高的第一抗體用量。同時(shí)由于本發(fā)明采用了化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測(cè)方法，在上述指標(biāo)中都優(yōu)于目前廣泛使用的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，同時(shí)也不存在放射免疫法的放射性污染、有效期短、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明為臨床提供了一種睪酮的更廉價(jià)、準(zhǔn)確、方便、快捷的方法，能夠更好地滿足臨床的需要。
具體實(shí)施例方式
睪酮(Testosterone)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，主要由(1)包被包被羊抗兔/鼠免疫球蛋白G抗體的不透明聚苯乙烯板，(2)用去激素血清作為基質(zhì)，加入經(jīng)無水乙醇溶解的睪酮純品配制而成的睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)品，(3)用分析緩沖液作為基質(zhì)，加入一定濃度的兔抗睪酮多克隆抗體或鼠抗睪酮單克隆抗體配成的抗睪酮抗體溶液，(4)用分析緩沖液作為基質(zhì)，加入一定濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮配成的辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮溶液，(5)發(fā)光底物A液和(5)發(fā)光底物B液組成。
分析緩沖液由0.05Mtris-HCl鹽溶液和1％牛血清白蛋白(BSA)組成，pH7.5；辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮使用時(shí)的工作濃度為1∶30萬；發(fā)光底物A液配方為luminol 0.15mM、羥基香豆素0.59mM、沒食子酸0.35mM、Tris-Hcl緩沖液0.2M，pH 9.4；發(fā)光底物B液配方為氨基酸氧化酶0.85mM、吐溫-20 0.8％(V/V)、DTPA 0.5mM、維生素C 0.12mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2M，pH 6.5。
權(quán)利要求
1.睪酮化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，主要由包被第二抗體的不透明聚苯乙烯板、睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)品、抗睪酮抗體溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮溶液、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液組成。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，包被第二抗體的不透明聚苯乙烯板為包被羊抗兔/鼠免疫球蛋白G抗體的不透明聚苯乙烯板；睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)品用去激素血清作為基質(zhì)，加入經(jīng)無水乙醇溶解的睪酮純品配制而成；抗睪酮抗體溶液用分析緩沖液作為基質(zhì)，加入一定濃度的兔抗睪酮多克隆抗體或鼠抗睪酮單克隆抗體配成；辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮溶液用分析緩沖液作為基質(zhì)，加入一定濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮；發(fā)光底物A液由高效發(fā)光劑、復(fù)合增強(qiáng)劑、氨基酸組成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶及穩(wěn)定劑組成。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，分析緩沖液由0.05Mtris-HCl鹽溶液和1％牛血清白蛋白(BSA)組成，pH7.5；辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮使用時(shí)的工作濃度為1∶300000-500000；發(fā)光底物A液配方為luminol 0.15mM、羥基香豆素0.59mM、沒食子酸0.35mM、Tris-Hcl緩沖液0.2M，pH 9.4；發(fā)光底物B液配方為氨基酸氧化酶0.85mM、吐溫-200.8％(V/V)、DTPA0.5mM、維生素C 0.12mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2M，pH 6.5。
全文摘要
睪酮(Testosterone)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，屬于臨床血液檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域。主要由包被第二抗體的不透明聚苯乙烯板、睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)品、抗睪酮抗體溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記睪酮溶液、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液組成。本發(fā)明檢測(cè)精密度、靈敏度和穩(wěn)定性較高，特異性和準(zhǔn)確性較好。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1924582SQ20051001794
公開日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者付光宇, 項(xiàng)立紅, 張泉, 李彬, 趙鵬, 馬建軍, 陳曉玲 申請(qǐng)人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司