專利名稱：急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心臟型脂肪酸結合蛋白(h-FABP)和血栓前體蛋白(TpP)的抗體對的制備，膠體金標記顯色的免疫層析反應技術和利用GPBB、h-FABP和TpP的抗體來早期診斷急性心肌梗死(AMI)的技術領域。尤其涉及一種急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板。
背景技術：
急性心肌梗死(曾稱為急性心肌梗塞，AMI)是冠心病發(fā)展到嚴重階段的一種類型，誘發(fā)急性心肌梗死的主要原因是因為心臟供血的冠狀動脈突然堵塞，從而導致由冠狀動脈供應的心肌發(fā)生變性壞死。急性心肌梗死發(fā)病后0-3小時是溶栓治療和介入手術治療的黃金時間，發(fā)病后超過6小時則上述治療效果不佳，因此，快速識別出早期急性心肌梗死(發(fā)病時間6小時內)患者并及時治療是提高其存活率的關鍵。目前急性心肌梗死(AMI)的診斷仍主要依靠持續(xù)心絞痛癥狀、心電圖心肌梗死演變經(jīng)過和血清心肌酶學動態(tài)改變。然而，我國約25％AMI病人無癥狀，約30％病例無典型心絞痛表現(xiàn)；心電圖診斷AMI的準確性平均約50％，具有確診意義的病理性Q波常在發(fā)病6～8小時以后才出現(xiàn)，因此，AMI早期心電圖確診率很低。在心肌壞死時血清心肌標志物及酶類的檢測方面，也存在著敏感性和特異性兩方面的問題，從被檢測物質本身來說，對早期AMI的診斷價值有限。如常用的血清酶活性(LDH、CPK、GOT等)發(fā)病8～10小時后才開始升高，且特異性低，已逐漸被大醫(yī)院淘汰，但基層醫(yī)院由于條件有限仍在使用這些指標，對早期急性心肌梗死診斷價值不大；而目前大醫(yī)院普遍采用的心肌標記物(肌鈣蛋白I、CK-MB、肌紅蛋白)的檢測對發(fā)病6小時以內的AMI患者的診斷率也較低，因為肌鈣蛋白I和CK-MB在AMI發(fā)病6小時左右才顯著升高，對發(fā)病6小時內的AMI診斷敏感性低；肌紅蛋白雖在AMI發(fā)病后2小時即升高，但特異性很差，在骨骼肌中的含量高于心肌中的含量。本發(fā)明(急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板)針對目前基層醫(yī)院和各級醫(yī)院的急診室缺乏快速篩選診斷早期AMI有效手段的局面，采用的設計思路為將三種可用于AMI早期診斷的心肌標志物(一種特異性高，二種對于極早期急性心肌梗死的敏感性高)與一種成熟的快速診斷技術結合起來，從而研制出一種新的AMI早期診斷試劑。本發(fā)明不僅避免了目前市場上的同類產(chǎn)品只能單獨檢測血液中的某個心梗指標的缺點，并且具備了更具高靈敏性和強特異性的指標。大量研究結果顯示該三種物質聯(lián)合診斷早期AMI的特異性、敏感性較高，明顯優(yōu)于肌鈣蛋白I、CK-MB、肌紅蛋白，俗稱“心三聯(lián)”。本發(fā)明必將逐步取代現(xiàn)有的“心三聯(lián)”而成為AMI早期篩選診斷的“新心三聯(lián)”。
三明治雙抗體技術是建立在單克隆抗體技術之上的生物技術領域較新的后抗體技術。雙抗體夾心法應用抗體對識別抗原的兩個位點來捕捉抗原，避免了抗體與抗原的同一位點的競爭結合，減少了抗原決定簇的空間位阻現(xiàn)象，所以較一般的抗原捕捉法更敏感，特異性更強，重復性更好，尤其適用于抗原含量很少的標本的檢測。本發(fā)明結合此技術開發(fā)的針對糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心臟型脂肪酸結合蛋白(h-FABP)和血栓前體蛋白(TpP)的抗體對，對早期檢測AMI病人血液中微量心梗指標(抗原)更突顯其重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心臟型脂肪酸結合蛋白(h-FABP)和血栓前體蛋白(TpP)的單克隆抗體對作為AMI早期診斷的生化指標，建立一種能在現(xiàn)場快速檢測的試劑板，本方法不需要任何的輔助儀器，檢測時間僅5-15分鐘，通過測定人血液中的GPBB、h-FABP和TpP的濃度，來早期診斷AMI，提高了AMI早期診斷的敏感性和特異性。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，包括膠體金標記的糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心臟型脂肪酸結合蛋白(h-FABP)和血栓前體蛋白(TpP)三種抗體及相應的三種未標記抗體，羊抗鼠IgG抗體，聚乙烯板、聚氯乙烯襯膜、濾膜、玻璃纖維紙、聚酯膜、免疫層析膜和吸水紙組成。所述抗GPBB、h-FABP和TpP的抗體為單克隆抗體對。
所述抗GPBB、h-FABP和TpP單克隆抗體分別用純化的抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾臟細胞，融合該脾臟細胞和小鼠的骨髓瘤細胞系，利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用ELISA方法鑒定分別抗GPBB、h-FABP和TpP的細胞株，進行三次克隆化后得到分泌高特異性的單克隆抗體的細胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體。
抗GPBB、h-FABP和TpP單克隆抗體對的篩選，主要采用抑制法篩選高親和力的亞克隆，進而在克隆化和ELISA相加實驗結果的基礎上進行競爭抑制表位分析和親和力的測定，得到不同表位的單抗細胞株，進一步腹水生產(chǎn)并純化得到多量抗體，進行單株標記，采用ELISA直接法進行標記抗體的工作濃度滴定，然后采用ELISA競爭抑制法進行單標抗體表位測定，從而篩選出高效親和力的三明治抗體對。
將膠體金標記的抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體均勻噴灑于單位面積的聚酯膜上；將抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體對的另一抗體和羊抗鼠IgG抗體固定在單位面積的免疫層析膜上。
金標抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體的制備方法為分別取半徑為40nm的膠體金及相應的抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體，在pH 8.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加3％BSA作為穩(wěn)定劑，采用高速離心法除去未結合的單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-單克隆抗體復合物。
該檢測板水平面自下而上依次包括樣品吸收區(qū)，可溶解的金標抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體，三條固相化抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體，一條固相化羊抗鼠IgG抗體和吸水片區(qū)。
本發(fā)明所提供的急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，是以GPBB、h-FABP和TpP作為生化指標來早期診斷AMI。這包括制備上述GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體對的方法，以及利用膠體金標記抗體和免疫層析方法測定血液或血清中的GPBB、h-FABP和TpP的濃度，以診斷AMI。
本方法利用金標記抗GPBB、h-FABP和TpP單抗作為第一抗體，用來捕捉抗原；精確呈橫條狀分布于免疫層析膜上的抗GPBB、h-FABP和TpP單克隆抗體對的另一抗體用來識別抗原，通過顯示免疫層析膜上的條紋，來判定檢測樣品中的GPBB、h-FABP和TpP的含量，從而篩選和診斷AMI。
本檢測試劑板由聚乙烯板、聚氯乙烯襯膜、濾膜、玻璃纖維紙、聚酯膜、免疫層析膜、膠體金標記的抗GPBB、h-FABP和TpP單抗、未標記抗GPBB、h-FABP和TpP單抗、羊抗鼠IgG抗體和吸水紙組成。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有突出的優(yōu)點和實用性1、檢測敏感性高、特異性強在AMI發(fā)病早期階段(0～3小時)h-FABP的臨床靈敏度為91.4％，顯著高于CK-MB及其他指標；AMI的主要病理變化是血栓形成，血栓前體蛋白(TpP)是血凝過程中一個重要產(chǎn)物，血栓形成時升高，發(fā)病6小時內的AMI患者進行測定發(fā)現(xiàn)100％的患者TpP出現(xiàn)升高，而47％的患者CK-MB還在正常范圍。靈敏度高于CK-MB；糖原磷酸化酶(GP)的BB型分子量約為188kD，比MM、LL型大，在正常生理條件下以相同亞基組成的二聚體形式存在。研究結果表明GP三種同功酶分別由三個不同基因編碼，一級結構比較發(fā)現(xiàn)GPBB與GPMM、GPLL的同源性分別為83％和80％，但在C末端BB型比MM、LL型分別多出21個和16個氨基酸殘基。這就說明GPBB具有高度的心肌特異性結構。缺血早期GPBB釋放入血與GPBB在心肌能量代謝中起主要作用有關。研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死發(fā)作后2～3小時內，GPBB的敏感性最強，出現(xiàn)最早，增幅最高；無論心電圖有無病理性Q波，GPBB均升高。表一反應了AMI不同時間內各指標的濃度變化。
2、避免了目前市場上的同類產(chǎn)品只能單獨檢測血液中的某個心梗指標的缺點。
3、檢測快速檢測時間5-15分鐘，能夠滿足現(xiàn)場檢測的需要。
4、攜帶方便、操作簡便本發(fā)明改變了對AMI篩選和診斷必須由專業(yè)人員或專用儀器才能進行檢測的局限性。樣本可為全血、血清或血漿，即可直接用指血檢測，操作簡單快速。
5、本發(fā)明制備工藝簡單，成本低；檢測試紙板在常溫下即可保存，無需特殊設備和儀器。保存期可達兩年。
AMI不同時間內各指標的濃度變化(表一)



下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
圖1AMI早期診斷三合一檢測試劑板平面結構區(qū)域圖。
圖2AMI早期診斷三合一檢測試劑板縱切面結構圖。
圖3AMI早期診斷三合一檢測試劑板中免疫層析膜平面圖。
圖中1、樣品吸收區(qū)；2、金標單抗區(qū)；3、固相化抗體區(qū)；4、吸水區(qū)；5、底板和一層PVC片材；6、免疫層析膜，6a為固相化抗GPBB單抗、6b為固相化抗h-FABP單抗、6c為固相化抗TpP單抗、6d為固相化羊抗鼠IgG抗體；7、金標單抗復合物的聚酯膜，7a為金標GPBB單抗復合物、7b為金標h-FABP單抗復合物、7c為金標TpP單抗復合物；8、樣品吸收區(qū)，8a為一層玻璃纖維紙、8b為一層濾膜；9、一層濾紙組成的吸水區(qū)。
具體實施例方式實施例一AMI早期診斷三合一檢測試劑板的生產(chǎn)方法1、GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體對的制備用純化的GPBB、h-FABP和TpP作為抗原分別免疫BALB/c小鼠，間隔21天免疫第二次，以后每間隔10天免疫一次，共免疫3-4次，然后取出免疫小鼠的脾臟細胞，用PEG將該脾臟細胞與小鼠的骨髓瘤細胞系F/0進行融合，利用HAT選擇性培養(yǎng)基在96孔細胞培養(yǎng)板上篩選雜交瘤細胞，用ELISA方法鑒定分別抗GPBB、h-FABP和TpP的細胞株，進行三次克隆化后得到穩(wěn)定分泌高特異性單克隆抗體的細胞株，在相同抗原包被板上采用ELISA抑制法，即參照組中加入細胞培養(yǎng)上清，在抑制組加入細胞培養(yǎng)上清和抗原混合物，比較兩組OD值差異從而篩選出高親和力的亞克隆。然后在間接ELISA實驗上進行相加法表位分析，即參照組中分別加入兩個單株細胞培養(yǎng)上清，測定組中同時加入兩株細胞培養(yǎng)上清，比較兩組OD值(A1、A2和A1+2)，通過下面公式計算AI=[2A1+2A1+A2-1]×100%]]>在比較計算結果的基礎上進行表位分析和親和力的測定，AI值小于50％為相加陰性，即兩細胞株分泌的抗體識別抗原的表位相同，AI值大于50％為相加陽性，表示兩細胞株之間無競爭，即兩細胞株分泌的抗體識別抗原的兩個不同的表位，從而初步得到針對抗原不同表位的單抗細胞株。進一步將得到的單抗細胞株分別注射入小鼠腹腔進行腹水生產(chǎn)，利用Protein A-Sepharose親和層析柱純化腹水得到多量單克隆抗體，用HRP酶對純化的抗體進行單株標記，用ELISA直接法進行標記抗體的工作濃度滴定，然后用ELISA競爭抑制法在參照組中加入酶標抗體，在測定組中加入酶標抗體和未標記待測抗體混合物，比較兩組OD值，參照組OD值大于測定組OD值的表示存在競爭抑制，視為兩抗體識別抗原的表位相同。反之，兩抗體不存在競爭抑制時視為兩抗體識別抗原的表位不同，從而最終篩選得到高效親和力的三明治抗體對。
2、膠體金標記抗GPBB、h-FABP和TpP單克隆抗體的方法分別取半徑為40nm的膠體金及相應的抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體，在pH8.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加3％BSA作為穩(wěn)定劑，BSA為牛血清白蛋白。采用高速離心法除去未結合的單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-單克隆抗體復合物。
3、將金標復合物噴涂于聚酯膜上用聚乙二醇洗滌膠體金-單克隆抗體復合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用緩沖液溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上，烘干。
4、免疫層析膜的包被用純化的抗GPBB、h-FABP和TpP單克隆抗體對中的另一單抗溶液和羊抗鼠IgG抗體溶液用噴涂設備于硝酸素纖維膜上劃線，線的長度為3mm，每條線在3mm寬的硝酸素纖維膜上的滴加量為5-7ng。四種抗體由下至上分別為GPBB、h-FABP、TpP和羊抗鼠IgG抗體，每條線間隔3mm。包被好的免疫層析膜用3％BSA溶液進行封閉。
5、試劑板裝備塑料聚乙烯板作為支撐載體，上面粘有一層聚氯乙烯片材作為襯膜，由下至上由一層濾膜和一層玻璃纖維組成的樣品吸收區(qū)，其次是三層吸附了膠體金-單抗復合物的聚酯膜。然后是硝酸纖維膜，最上一層是吸水層，由一層濾紙組成，外面用特制膠帶包封。
實施例二AMI早期診斷三合一檢測試劑板的使用方法1、對全血的檢測用滴管取指血100ul滴入檢測板的孔中，5-15分鐘觀察結果。出現(xiàn)兩條或多條帶時為陽性。只有一條帶時為陰性。一條帶都無時表示檢測板失效。
2、對血清、血漿的檢測用滴管取離心好的血清、血漿100ul垂直滴入檢測板的孔中，5-15分鐘觀察結果。出現(xiàn)兩條或多條帶時為陽性。只有一條帶時為陰性。一條帶都無時表示檢測板失效。
權利要求
1.一種急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，包括膠體金標記的糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心臟型脂肪酸結合蛋白(h-FABP)和血栓前體蛋白(TpP)三種抗體及相應的三種未標記抗體，羊抗鼠IgG抗體，聚乙烯板、聚氯乙烯襯膜、濾膜、玻璃纖維紙、聚酯膜、免疫層析膜和吸水紙組成。
2.如權利要求1所述的急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，其特征在于所述抗GPBB、h-FABP和TpP的抗體為單克隆抗體對。
3.如權利要求2所述的急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，其特征在于所述抗GPBB、h-FABP和TpP單克隆抗體分別用純化的抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾臟細胞，融合該脾臟細胞和小鼠的骨髓瘤細胞系，利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用ELISA方法鑒定分別抗GPBB、h-FABP和TpP的細胞株，進行三次克隆化后得到分泌高特異性的單克隆抗體的細胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體。
4.如權利要求3所述的急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，其特征在于抗GPBB、h-FABP和TpP單克隆抗體對的篩選，主要采用抑制法篩選高親和力的亞克隆，進而在多次克隆化和ELISA相加實驗結果的基礎上進行競爭抑制表位分析和親和力的測定，得到不同表位的單抗細胞株，進一步腹水生產(chǎn)并純化得到多量抗體，進行單株標記，采用ELISA直接法進行標記抗體的工作濃度滴定，然后采用ELISA競爭抑制法進行單標抗體表位測定，從而篩選出高效親和力的三明治抗體對。
5.如權利要求1所述的急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，其特征在于將膠體金標記的抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體均勻噴灑于單位面積的聚酯膜上；將抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體對的另一抗體和羊抗鼠IgG抗體固定在單位面積的免疫層析膜上。
6.如權利要求5所述的急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，其特征在于金標抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體的制備方法為分別取半徑為40nm的膠體金及相應的抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體，在pH8.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加3％BSA作為穩(wěn)定劑，采用高速離心法除去未結合的單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金—單克隆抗體復合物。
7.如權利要求1所述的急性心肌梗死早期診斷三合一檢測試劑板，其特征在于該檢測板水平面自下而上依次包括樣品吸收區(qū)，可溶解的金標抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體，三條固相化抗GPBB、h-FABP和TpP的單克隆抗體，一條固相化羊抗鼠IgG抗體和吸水片區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種急性心肌梗死(AMI)早期診斷三合一檢測試劑板，屬于早期診斷急性心肌梗死的技術領域。本發(fā)明利用糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心臟型脂肪酸結合蛋白(h－FABP)和血栓前體蛋白(TpP)作為AMI早期診斷的生化指標，在一步法檢測條或檢測板上分別固定膠體金標記的三種針對不同抗原的抗體以及固相化的三種未標記的抗體，以達到一次性檢測三種心梗指標的目的。本發(fā)明提供的試劑板簡便、快速，不需儀器設備，僅用肉眼即可判讀結果，適合在任何場所檢測，且每份試劑均為單獨包裝，可存放于室溫下，便于保存。本發(fā)明檢測靈敏性高，特異性強，能夠在AMI發(fā)病早期即開始檢測，適合AMI早期篩選和診斷。
文檔編號G01N21/31GK1866017SQ20051001871
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月16日 優(yōu)先權日2005年5月16日
發(fā)明者錢金紅, 廖園園 申請人:艾博(武漢)生物技術有限公司