專利名稱：G蛋白偶聯(lián)受體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)受體GPR39的功能特征，并涉及改變或 調(diào)節(jié)GPR39蛋白活性的化合物。具體地說，本發(fā)明涉及GPR39激動 劑或拮抗劑的篩選方法，以便鑒定調(diào)節(jié)胃腸動力的激動劑或拮抗劑， 并涉及這些化合物的治療用途。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及 GPR39與代謝穩(wěn)態(tài)的關聯(lián)，特別是與在GPR39敲除小鼠中觀察到的 膽固醇水平的關聯(lián)。本發(fā)明還涉及攜帶GPR39基因突變的轉(zhuǎn)基因動 物。
背景技術：
GTP結合蛋白(G蛋白)在配體(如激素和其它化學介導物)和G蛋 白偶聯(lián)受體(GPCR)的結合與胞內(nèi)效應物活化之間充當中間體。在配 體與GPCR結合時，受體的胞質(zhì)結構域經(jīng)歷構象變化，這種變化能 使受體與G蛋白相互作用，此相互作用又能活化胞內(nèi)中間體如腺苷 酸環(huán)化酶、磷脂酶C或離子通道。這樣的系統(tǒng)允許放大原始信號， 因為許多第二信使可響應單個配體在GPCR處的結合而產(chǎn)生。通過 該機制，細胞能夠感應其外部環(huán)境中的改變并對此改變有響應。
G蛋白偶聯(lián)受體形成了一個細胞質(zhì)膜內(nèi)在蛋白超家族，每個受 體都共有7個疏水跨膜結構域的相同特征，這些疏水跨膜結構域每 個都為20-30個氨基酸長，通過不同長度的親水氨基酸序列連接。所 述受體的氨基末端處于胞外，羧基末端存在于細胞的胞質(zhì)中。
GPCR廣泛存在于各種組織和細胞類型中，參與許多不同的生 理過程。它們由各種各樣的配體活化，所述配體例如為激素，諸如 促黃體生成激素、促卵泡激素、絨膜促性腺激素、促曱狀腺激素、
促腎上腺皮質(zhì)激素、胰高血糖素和血管加壓素；神經(jīng)遞質(zhì)，諸如5-HT、 乙酰膽堿(毒蕈堿AchR)、組胺、前列腺素、降4丐素、白三烯和Ca2+。 GPCR的廣泛分布和廣為不同的作用表明，GPCR可在多種病理病癥 中起重要作用。實際上，業(yè)已發(fā)現(xiàn)GPCR涉及與支氣管收縮、高血 壓、炎癥、激素紊亂、糖尿病、凋亡、傷害感受、神經(jīng)傳遞易化和 震顫疾病相關的疾病。
在G蛋白偶聯(lián)受體超家族中，其天然配體未知的推定GPCR稱 為"孤兒受體，，。業(yè)已證實，G蛋白偶聯(lián)受體是有價值的藥物l巴， 因為它們是約占50%的市售藥物的標靶。因此，正在評價許多孤兒 GPCR,以鑒定新的潛在耙。
鑒定GPR39的基礎是與生長激素促分泌素受體(GHS-R)與神經(jīng) 降壓素受體1和2 (NT-R1和NT-R2)的序列相似性(McKee等，1997)。 預測的453個氨基酸的GRP39蛋白包含GPCR特有的7個跨膜結構 域。通過GPR39與其它GPCR進行序列比較，McKee等(1997)發(fā)現(xiàn)， GPR39的蛋白序列與GSHR、 MTLR1 (促胃動素受體)和神經(jīng)降壓素 受體-1的蛋白序列分別有27%、 29%和32%相同。RNA印跡分析揭 示，GPR39具有廣泛的組織分布。在測試的大部分腦區(qū)域中檢測到 1.8-2 kb的一種雜交mRNA轉(zhuǎn)錄物。但是，除了該物質(zhì)以外，在幾 個外周組織如胃和小腸中以及在諸如胰腺、曱狀腺和結腸等組織中 觀察到3 kb長的替代轉(zhuǎn)錄物，此3-kb物質(zhì)是檢測到的唯一轉(zhuǎn)錄物 (McKee等，1997)。根據(jù)原位雜交中的熒光，McKee等人(199"將 GPR39基因作圖至2q21-q22。TM3中的酸性殘基對結構不相似的GHS 結合和活化GHS-R是必需的，該酸性殘基在GPR39中是保守的。
根據(jù)這些組織分布研究，已猜測GPR39涉及心血管疾病 (WO2001/081634和WO200機4279);癌癥，特別是腦癌，例如成 膠質(zhì)細胞瘤(W02001/036685和WO01042288);炎癥和神經(jīng)疾病(US 2003/232769和WO2004/004279)以及涉及胃腸和肝臟疾病 (WO2004/004279)。不過，在所提及的參考文獻中還沒有一個提供基
于GPR39的配體鑒定的功能特征。由于所述原因，目前的GPR39功 能解讀是有疑問的，需要進一步研究來確定GPR39的配體結合和功 能特性。
已知GPR39的廣泛組織分布和大部分G蛋白偶聯(lián)受體在廣泛不 同的細胞和生理過程中起重要作用的事實，人們應有興趣獲取對該 載體的正常生理作用的理解。
發(fā)明概述
如上所述，本發(fā)明涉及GPR39受體新功能的鑒定。如在下文的 實施例中所述，哺乳動物中的GPR39突變影響胃排空，表明GPR39 為胃腸動力調(diào)節(jié)中的關鍵要素。已知GPR39基因下調(diào)導致胃排空增 加的事實，預期GPR39表達的增加將減弱胃排空。該發(fā)現(xiàn)為通過調(diào) 節(jié)GPR39活性來調(diào)節(jié)胃腸動力的新治療方法提供了一條途徑。該發(fā) 現(xiàn)還為研究胃腸動力學和涉及胃腸動力障礙的疾病提供了新的模型
篩選方法。
除了以上所述之外，GPR39敲除小鼠的表型還揭示了該受體與 膽固醇代謝的關聯(lián)。下調(diào)GPR39基因?qū)е履懝檀妓缴?。因此?預期GPR39涉及具有過量膽固醇水平的病癥，例如代謝綜合征，包 括肥胖癥、糖尿病、肥胖相關性心血管疾病和青光眼。
因此，本發(fā)明的第一方面提供全部GPR39蛋白或部分GPR39 蛋白在化合物鑒定方法中的用途，所述化合物調(diào)節(jié)胃腸動力，或有 效預防和/或治療與胃腸動力障礙相關的病狀。又一方面，本發(fā)明提 供全部GPR39蛋白或部分GPR39蛋白在化合物鑒定方法中的用途， 所述化合物調(diào)節(jié)膽固醇形成，或有效預防和/或治療與過量膽固醇形 成相關的病狀。或者，本發(fā)明提供表達全部GPR39蛋白或部分GPR39 蛋白的細胞在該方法中的用途。在一個具體實施方案中，GPR39是 一種分離蛋白，其具有的氨基酸序列選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:
4、具有上述SEQ ID的蛋白的剪接變體和與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的氨基酸序列。
上文使用的部分GPR39蛋白意指包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的多肽的片段，所述片段的大小為至少10個氨基酸，例如至 少20、 30、 40、 50、 75、 100或150個或更多個氨基酸。這樣的片 段可分別來源于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的N-端區(qū)。含N-端 區(qū)的片段可用于重構受體的胞外部分，以提供受體結合位點。優(yōu)選 地，所述片段保留結合腺噤呤的能力。
本發(fā)明還提供編碼全部或部分的SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4 的多肽的分離核酸序列在化合物鑒定方法中的用途，所述化合物調(diào) 節(jié)胃腸動力，或有效預防和/或治療與胃腸動力障礙相關的病狀和與 高水平膽固醇相關的疾病，例如代謝綜合征，包括糖尿病和心血管 疾病。本發(fā)明方法中所使用的核酸序列意指包括由SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 3組成的分離的核酸序列，以及與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的核酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的核酸序列。
本發(fā)明的核酸還包括所含序列與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3 的核酸序列或其互補序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的核酸。優(yōu)選地，這些序列在受控以最 小化非特異性結合的條件下與對應核酸雜交。優(yōu)選地，最好為嚴格 至中等嚴格的雜交條件。例如，為檢測約80-90%相同的序列，適宜 的條件包括于42。C在0.25 M Na^HPC^ pH 7.2、 6.5% SDS、 10%硫酸 葡聚糖中過夜雜交，在0.1xSSC、 0.1%SDS中于55。C最終洗滌。為 檢測約90%以上相同的序列，適宜的條件包括于6S。C在0.25 M Na^HP04 pH 7.2、 6.5% SDS、 10%硫酸葡聚糖中過夜雜交，在0.1 x SSC、 0.1%SDS中于6(TC最終洗滌。
需要認識到的是，這樣的核酸不一定編碼"全長"多肽，因此
包括代表例如突變形式的GPR39基因的核酸，在突變形式的GPR39 基因中，編碼序列已通過產(chǎn)生終止密碼子的置換或移碼突變而過早 終止。這些核酸也是本發(fā)明的核酸。
本發(fā)明還提供為本發(fā)明多肽編碼核酸片段的核酸的用途。在一 個方面，本發(fā)明提供核酸引物，其基本上由本發(fā)明多肽編碼序列或 其互補序列的15-50核苷酸組成，例如由15-35、 18-35、 15-24、 18-30、 18-21或21-24個核苷酸組成。
從治療上講，本發(fā)明的核酸和多肽均可用于治療疾病。具體地 說，它們可用于治療其病狀與GPR39受體方面的作用相關的疾病， 特別是那些與預防和/或治療與胃腸動力障礙相關的病狀和與膽固醇 水平升高相關的疾病(例如代謝綜合征)相關的疾病。
又一方面，提供含所述核酸序列的載體，特別是含有與本發(fā)明 核酸序列有效連接的啟動子的表達載體。所述載體可由宿主細胞攜 帶，并在所述細胞中表達。在所述表達之后，所述細胞可用于本發(fā) 明的方法。
如上所述，提供鑒定化合物(下文亦稱藥劑)的測定方法是本發(fā)明 的一個目的，所述化合物結合本發(fā)明多肽或調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽的活性。 具體地說，設想這樣的化合物為任意大小的有機或無機原子集合體， 包括小分子(小于約2500道爾頓)或4交大分子，例如肽、多肽、完整 蛋白和多核苷酸，其中所述化合物可用于如上所述的治療方法。
由于本發(fā)明的發(fā)明人首先鑒定出為受體的GPR39是胃腸動力調(diào) 節(jié)中的關鍵要素，所以本發(fā)明揭示了在治療應用中使用GPR39本身 和/或激動或拮抗該受體的化合物的可能性。因此，本發(fā)明進一步擴 展至治療人或動物體的方法，所述方法包括GPR39激動劑或拮抗劑 的用途。特別是與延遲胃排空相關的疾病的治療方法，所述疾病例 如為胃輕癱術后腸梗阻、糖尿病性胃輕癱、機能性消化不良、迷走 神經(jīng)切斷術后胃輕癱、慢傳輸型便秘、便秘型IBS、混合型IBS和特 發(fā)性假性腸梗阻。所述方法包括給予人或動物治療活性劑量的GPR39
受體拮抗劑，特別是包括使用本發(fā)明方法可筌定的GPR39拮抗劑的 用途。
提供與胃排空增加相關的疾病的治療方法也是本發(fā)明的 一 個目 的，所述疾病例如為傾倒綜合征或腸能動性增強，例如腹瀉、腹瀉 型BBS和混合型IBS，所述方法包括給予人或動物治療活性劑量的 GPR39受體激動劑，特別是包括使用本發(fā)明方法可鑒定的GPR39激 動劑的用途。
另外，基于所觀察到的下調(diào)GPR39受體對膽固醇穩(wěn)態(tài)的影響， 又一方面，本發(fā)明揭示了在針對膽固醇穩(wěn)態(tài)缺陷的治療應用中使用 GPR39本身和/或激動或拮抗該受體的化合物的可能性。因此，本發(fā) 明還擴展至治療人或動物體的方法，所述方法包括使用GPR39激動 劑或拮抗劑治療與膽固醇穩(wěn)態(tài)缺陷相關的疾病。具體地說，GPR39 激動劑用于治療與過量皮質(zhì)醇形成相關的疾病，例如代謝綜合征， 包括肥胖癥、糖尿病和心血管疾病，如與高水平膽固醇相關的動脈 粥樣硬化。
本文更詳細地描述了本發(fā)明的這些方面和其它方面。 序列描述
SEQ ID NO: 1是小鼠GPR39的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 2是小鼠GPR39的絲酸序列。
SEQ ID NO: 3是人GPR39的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 4是人GPR39的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 5是GPR39正向引物。
SEQ ID NO: 6是GPR39反向引物。
SEQ ID NO: 7是GPR39 4笨針序列。
SEQ ID NO: 8是人肥胖抑制素(obestatin)。
SEQ ID NO: 9是猴肥胖抑制素。
SEQ ID NO: 10是小鼠肥胖抑制素。
SEQ ID NO: SEQIDNO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
ll是大鼠肥胖抑制素。
12是沙鼠肥胖抑制素。
13是豬肥胖抑制素。
14是貓肥胖抑制素。
15是狗肥胖抑制素。
16是山羊肥胖抑制素。
17是綿羊肥胖抑制素。
18是牛肥胖抑制素。
19是肥胖抑制素的共有序列
附圖簡述
圖1A:來源于野生型小鼠的組織中的GPR39的實時定量逆轉(zhuǎn) 錄PCR。
圖1B:來源于野生型小鼠以及雜合和純合GPF39敲除小鼠的4 種不同組織中的GPR39的實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR。
圖2:GPCR39敲除小鼠對野生型小鼠的胃排空的半排空時間(~2) (A)和T^(B)的對比。
圖3:野生型小鼠(A)對GPCR39敲除小鼠(B)的糞粒推進對比。 計算在總結腸長度15W的劃分區(qū)(bin)中的糞粒分布，計數(shù)20分鐘時 間間隔內(nèi)由各個劃分區(qū)排出的糞粒數(shù)。
圖4:對于幼齡小鼠(17周，11 = 6)和老齡小鼠(56周，n-6),未 禁食小鼠(A)對禁食(19小時)小鼠(B)的累積食物攝取的比較。
圖5:顯示了 11個哺乳動物物種的前胃促生長素原(preproghrelin) 的氨基酸序列，其具有信號肽(斜體)、成熟胃促生長素(陰影)和側翼 的肥胖抑制素(下劃線)。代表推定的轉(zhuǎn)化酶切割位點的共有堿性殘基 用黑色背景上的白色字母表示。在共有序列中，完全保守的各個殘 基以大寫字母顯示。各個胃促生長素(ghrelin)基因的GenBank (gi)號 為37183224 (人)、34541890 (猴)、19224664 (小鼠)、11067387 (大鼠)、
27357900 (沙鼠)、47523230 (豬)、52782813 (貓)、50978704 (狗)、 52782814 (山羊)、57526202 (綿羊)和27806613 (牛)。
發(fā)明詳述 核酸
如本發(fā)明方法所使用的核酸包括DNA (基因組DNA和cDNA均 包括在內(nèi))和RNA。在本發(fā)明核酸包括RNA的情況下，所提及的在 所附序列表中顯示的序列，應被理解為指U替代T的等同RNA。
本發(fā)明的核酸可為單鏈或雙鏈的。本發(fā)明的單鏈核酸包括反義 核酸。因此，要理解的是，提及的SEQIDNO: 1或含SEQIDNO: 1 的序列或其片段包括互補序列，除非內(nèi)容明顯有矛盾。這同樣適用 于SEQIDNO:3。
一般來說，本發(fā)明的核酸作為分離物提供，以分離和/或純化形 式提供，或者不含或基本上不含與其天然結合的物質(zhì)，例如除了可 能有一個或多個用于表達的調(diào)節(jié)序列以外，不含或基本上不含在人 類基因組中側接所迷基因的核酸。核酸可為全合成的或部分合成的， 可包括基因組DNA、 cDNA或RNA。
本發(fā)明還提供為本發(fā)明多肽編碼核酸的片段的核酸。在一個方 面，本發(fā)明4是供核酸引物，其基本上由編碼本發(fā)明多肽的序列或其 互補序列的15-50個核苷酸組成,例如由15-35、 18-35、 15-24、 18-30、 18-21或21-24個核苦酸組成。
術語"基本上由……組成"是指不包含任何附加的5'或3'核酸 序列的核酸。但是，在本發(fā)明的另一方面，如上定義基本上由15-30 個核苷酸組成的本發(fā)明核酸可以3'末端但優(yōu)選5'末端連接至其天然 不連接的短(例如4-15個核苷酸，如4-10個核苷酸)附加序列。這樣 的附加序列優(yōu)選為含限制酶識別位點的接頭，以便于在本發(fā)明核酸 用作例如PCR引物時進行克隆。
本發(fā)明引物能夠與編碼本發(fā)明多肽的核酸選擇性雜交。所述"選
擇性的"是指對編碼其它嘌呤受體的序列是選擇性的，特別是對腺 噤呤受體以外的受體是選擇性的。序列選擇性雜交的能力可通過實 驗確定或計算得出。
例如， 一種計算引物Tm的方法參考了計算針對同源靶序列的 引物Tm的公式。該公式為Tm (°C) = 2 (A + T) + 4 (G + C)-5。這將 提供在3xSSC和0.1。/。SDS(其中SSC為0.15MNaCl、 0.015M々寧檬 酸鈉，pH 7)條件下的Tm。該公式一般適合于長度達約50個核苷酸 的引物。在本發(fā)明中，該公式可作為一種算法用于計算來源于本發(fā) 明多肽編碼序列的指定序列的引物的標稱Tm?？苫趯@些其它序 列的任意部分的最大匹配數(shù)，將此Tm與計算出來的人和大鼠GPCR 序列的Tm對比。
引物與靶序列雜交的適宜條件還可經(jīng)實驗測得。合適的實驗條 件包括在低嚴格雜交條件(例如6xSSC、 "。C)下候選引物與編碼本 發(fā)明多肽的核酸和編碼固體支持體上的其它腺噤呤受體的核酸均雜 交，于降低的SSC和/或升高的溫度洗滌，例如在0.2xSSC、 45'C下，
并逐漸升高雜交溫度，以測定允許引物與編碼本發(fā)明多肽的核酸雜 交但不與其它編碼嘌呤受體的核酸雜交的雜交條件。
本發(fā)明的核酸，尤其是引物，可攜帶顯示標記。合適的標記包 括放射性同位素(例如32P或35S)、熒光標記、酶標記或其它蛋白標記 (例如生物素)。這樣的標記可加入到本發(fā)明的多核苷酸或引物中，并 可通過自身已知的技術進行檢測。
本發(fā)明的引物可包含合成核酸，例如具有用于提升細胞中的核 酸穩(wěn)定性的修飾主鏈結構的核酸。本領域已知許多不同類型的針對 寡核苷酸的修飾。這些修飾包括曱基磷酸酯和硫代磷酸酯主鏈、在 分子的3'和/或5'末端加入吖啶或聚賴氨酸鏈。對本發(fā)明而言，需要 理解的是，本文描述的多核苷酸可以通過本領域可用的任何方法修 飾?？蓪嵤┻@樣的^"飾，以便增強本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)活性或有 效期限。
本發(fā)明范圍內(nèi)也包括基于本文描述的核酸序列的反義序列，優(yōu) 選為寡核香酸(尤其是穩(wěn)定的寡核苷酸)形式或核酶形式。
反義寡核普酸可設計用于與核酸、前mRNA或成熟mRNA的互 補序列雜交，干擾由給定靶DNA序列編碼的多肽的生產(chǎn)，使得其表 達被降4氐或完全阻止。核酶設計用于裂解由編碼GPR39 GPCR的本 發(fā)明核酸序列編碼的mRNA,針對GPR39 GPCR特異性的靶序列裂 解，即針對與其它GPCR序列不共有的序列裂解。反義序列的構建 及其應用描述于Peyman和Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol" 32:329-376, (1992),以 及Zamecnik和Stephenson, P.N.A.S， 75:280-284， (1974)。核酶的構建 及其應用描述于例長口 Gibson和Shillitoe, Molecular Biotechnology 7(2): 125-137, (1997)。
在一個實施方案中，可使用雙鏈(dsRNA) (Fire等，Nature 391: 806-811, 1998)或短干擾RNA (siRNA)序歹寸(Yu等，Proc Natl Acad Sci USA. 99:6047-52, 2002)，將本發(fā)明的RNA用于誘導RNA干擾 (RNAi)。 "RNAi"是dsRNA借助其i秀導互補mRNA的同源性依賴 性降解的過程。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子通過與本發(fā) 明的"有義"核糖核酸互補堿基配對進行雜交，形成雙鏈RNA。提 供dsRNA反義和有義核酸分子，它們對應于至少約20、 25、 50、 100、 250或500個核普酸或GPR39編碼鏈，或Y又對應于其一部分。在一 個替代實施方案中，siRNA長度為30個核苷酸以下，更優(yōu)選21-23 個核苷酸，具有特征性的2-3個核苷酸的3'突出端，該突出端通過核 糖核酸酶III剪切由較長dsRNA產(chǎn)生。參見例如Tuschl T. (Nat Biotechnol. 20:446-48, 2002)。
小RNA分子的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄可通過將siRNA模板克隆到RNA聚合 酶III (Pol m)轉(zhuǎn)錄單位中實現(xiàn)，所述轉(zhuǎn)錄單位一般編碼小核RNA (snRNA) U6或人RNA酶P RNA HI ?？墒褂脙煞N方法表達siRNA: 在一個實施方案中，組成siRNA雙鏈體的有義和反義鏈由單獨的啟
動子轉(zhuǎn)錄(Lee等，Nat. Biotechnol. 20， 500-505, 2002);在一個備選實 施方案中，siRNA以莖-環(huán)發(fā)夾RNA結構表達，所述發(fā)夾結構在胞 內(nèi)加工后產(chǎn)生siRNA (Brummelkamp等，Science 296:550-553, 2002) (在此引用作為參考)。
dsRNA/siRNA最通常如下施用體外退火有義和反義RNA鏈， 然后給予生物體。在一個備選實施方案中，RNAi可如下實施施用 在同一溶液中的本發(fā)明有義和反義核酸，在施用前沒有退火，并甚 至可如下實施在非常接近的時間段內(nèi)施用在單獨的溶媒中的所述 核酸。另外提供編碼GPR39的片段、同源物、衍生物和類似物的核 酸分子或與GPR39核酸序列互補的反義核酸。
本發(fā)明的反義siRNA和核酶序列可導入到培養(yǎng)的哺乳動物細胞 系中，以例如通過引起該基因下調(diào)并觀察表型作用來研究GPR39 GPCR的功能，或研究本文描述的與GPR39 GPCR相關的蛋白的表 達和定位。在其中出現(xiàn)GPIG9 GPCR異常表達的細胞中，這樣的反 義siRNA和核酶序列可用于下調(diào)基因的表達。
本發(fā)明的GPCR的cDNA序列可使用標準PCR (聚合酶鏈式反 應)克隆技術進行克隆。這包括制作一對針對SEQIDNO: 1的相反鏈 上的5'和3'末端的引物，使所述引物與由哺乳動物皮層細胞獲得的 mRNA或cDNA接觸，在致使所需區(qū)域擴增的條件下進行聚合酶鏈 式反應，分離擴增片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上對反應混合物進行 純化)并回收擴增的DNA。所述引物可設計得包含合適的限制酶識別 位點，以便擴增的DNA可克隆到合適的克隆載體中。這同樣適用于 SEQIDNO: 3。
可以多種途徑獲得與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3序列并非 100%同源、但編碼SEQ ED NO: 2或SEQ ID NO: 4或本發(fā)明的其它 多肽的多核苷酸。
例如，可對SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3序列進4亍定點誘變。 這在以下情況下是有用的例如序列需要沉默密碼子改變，以優(yōu)化
對其中要表達多核苷酸序列的具體宿主細胞的密碼子選擇。也可以 有其它序列改變，以^更導入限制酶識別位點，或改變由多核苦酸編 碼的多肽的特性或功能?？梢杂衅渌兓?，以呈現(xiàn)為提供例如保守 置換所需要的特定密碼子改變。
本發(fā)明的核酸可在5'或3'末端包含附加序列。例如，合成或天 然的5'前導序列可以與編碼本發(fā)明多肽的核酸相連接。附加序列還可 包含本發(fā)明核酸在特定宿主細胞中轉(zhuǎn)錄所需要的5'或3'非翻譯區(qū)。
另外，可獲得其它動物、特別是哺乳動物(例如人或兔)、更特別 是靈長類動物(包括人)的GPR39同源物，并用于本發(fā)明方法。這樣 的序列可如下獲得制備或獲得cDNA文庫，所述cDNA文庫通過 將細胞或組織或基因組DNA文庫與其它動物物種分開而制備，并在 中等至高嚴格(例如0.03 M氯化鈉和0.03 M檸檬酸鈉，約5(TC至約 60。C)條件下用包含全部或部分的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的 探針探測此文庫。
本發(fā)明進一步擴展至分離的DNA序列，其含本發(fā)明多肽的編碼 序列，但其中所述編碼序列被分割為兩個或多個(優(yōu)選不超過5個， 例如4個或3個)外顯子。這樣的外顯子序列可為天然的并得自基因 組克隆，或者可為合成的。外顯子序列可用于構建含本發(fā)明多肽編 碼核酸的小基因序列，所述序列被一個或多個外顯子序列間隔開。
還可使用來源于任何真核來源的異源外顯子構建小基因。
多肽
用于本發(fā)明方法的分離的多肽是如上定義的那些為分離形式、 不含或基本上不含與其天然伴隨的物質(zhì)(例如與其 一起存在于細胞中 的其它多肽)的多肽。所述多肽當然可與稀釋劑或輔劑一起配制，實 際上仍是分離的一例如所述多肽如果用于包被免疫測定用微量滴定 板，則通常與明膠或其它載體混合。所述多肽可天然地或通過異源 真核細胞系統(tǒng)糖基化，或者它們可(例如通過在真核細胞中表達產(chǎn)生的情況下)為非糖基化的。多肽可磷酸化和/或乙?；?。
本發(fā)明的多肽還可為大致純化形式，在此情況下一般包含處于
制品中的多肽，其中所述制品中90%以上(例如95%、 98%或99%)的 多肽是本發(fā)明多肽。
本發(fā)明多肽例如可通過加入組氨酸殘基來修飾，以幫助其純化， 或者可通過加入信號序列來修飾，以促進其由細胞分泌。
與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4具有至少50% (例如60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98Q/。)序列同一性的多肽可為分別是SEQID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列變體、等位基因、衍生物或突 變體的多肽，也由本發(fā)明提供。例如，這樣的多肽可具有與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所給出序列不同的氨基酸序列，不同之處在于一 個或多個(例如1-20個，例如2、 3、 4或5至10個)氨基酸的添加、 置換、缺失和插入。
多肽序列的同 一性百分率可使用比較參比序列(例如本發(fā)明的 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4)和查詢序列的商品化算法來計算。其 它評測同 一性的細節(jié)見下文。
在測定出查詢序列與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的序列具 有至少50%、優(yōu)選至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%同一性 的情況下，所述序列是保留GPR39受體活性的多肽序列，這樣的序 列構成了本發(fā)明的組成部分。
例如可在通過由編碼核酸表達生產(chǎn)之后分離和/或純化本發(fā)明的 多肽(例如使用抗體)。所述分離的和/或純化的多肽可用于組合物配 制，所述組合物可包含至少一種附加組分，例如包含藥學上可接受 的賦形劑、溶媒或載體的藥物組合物。
本發(fā)明的多肽可用作免疫原，要不然就用于獲得特異性抗體。 抗體可用于純化和其它多肽操作、診斷篩選和治療范疇。
本發(fā)明的多肽可用于篩選結合或調(diào)節(jié)其活性或功能的分子。這 樣的分子可用于治療(有可能包括預防)范疇。
本發(fā)明的多肽或標記多肽或其片段還可固定至固相，例如免疫 測定孔或測試條的表面。
這樣的標記和/或固定化多肽(裝在合適容器中)可與合適的試 劑、對照、說明書等一起裝到試劑盒中。
該多肽和試劑盒可用于通過免疫測定法測定針對樣品中存在的 該多肽或其活性部分或片段的抗體的方法。
免疫測定方法在本領域眾所周知， 一般包括
(a) 提供一種包含抗所述蛋白的抗體可結合的表位的多肽；
(b) 將生物樣品與所述多肽在允許形成抗體-抗原復合物的條件 下溫育；和
(c) 測定是否形成含所述多肽的抗體-抗原復合物。 序列同一性
可使用對比參比序列和查詢序列的商品化算法計算核酸和多肽 序列的同 一性百分率。可使用以下程序(由美國國家生物技術信息中 心提供)測定同源性/同一性BLAST、 gapped BLAST、 BLASTN和 PSI-BLAST,它們可使用默認參數(shù)。
算法GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI)使用最大化匹 配數(shù)和最小化空位數(shù)的Needleman和Wunsch算法來比對兩個完整序 列。 一般來說，使用默認參數(shù)，空位創(chuàng)建罰分=12,空位延伸罰分 =4。
另 一種測定核酸序列或其部分和查詢序列之間的最佳全局匹配 的方法是使用基于Bmtlag等(Comp. App. Biosci., 6; 237-245 (1990)) 的算法的FASTDB計算機程序。該程序提供了全局序列比對。所述 全局序列比對的結果為同一性百分率。在DNA序列的FASTDB檢 索中用于計算同一性百分率的適宜參數(shù)為矩陣-Unitary、 k-tuple = 4、錯配罰分-1、連接罰分=30、隨機化組長度-0、截止分值=1、 空位罰分=5、空位大小罰分=0.05，單位比對長度(Window Size) = 500 或查詢序列的核苷酸堿基長度中較短的那 一個。計算氨基酸比對的
同一性和相似性百分率的適宜參數(shù)為矩陣-PAM 150、 k-tuple = 2、 錯配罰分=1、連接罰分=20、隨機化組長度=0、截止分值-1、空 位罰分=5、空位大小罰分=0.05,單位比對長度(Window Size) = 500 或查詢序列的核苦酸堿基長度中較短的那 一個。
載體
本發(fā)明的核酸序列可摻入到載體中，特別是表達載體。所述載 體可用于在相容宿主細胞中復制所述核酸。因此，在另一個實施方 案中，本發(fā)明提供一種如下制備本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明 的多核苷酸導入復制型載體中，將所述載體導入到相容宿主細胞中， 在引起載體復制的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。所述載體可從宿主細
胞回收。合適的宿主細胞連同表達載體一起描述于下文。
優(yōu)選地，載體中的本發(fā)明多核苷酸有效連接至能夠供宿主細胞
表達編碼序列使用的控制序列，即所述載體是一種表達載體。
術語"有效連接(的)"是指一種并列，所述組件在并列中所處的
關系允許其以其預期方式起作用。與編碼序列"有效連接，，的控制
序列的連接方式使得在與控制序列相適的條件下實現(xiàn)編碼序列的表達。
可選擇或構建合適的載體，其包含合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動 子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和 其它適宜序列。載體可為適宜的質(zhì)粒、病毒(例如噬菌體、噬菌?；?桿狀病毒)、粘粒、YAC、 BAC或PAC。載體包括基因治療載體，例 如基于腺病毒、腺相關病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如HIV或MLV)的載體 或曱病毒載體。
可提供具有復制起點、任選地具有用于表達所述多核苷酸的啟 動子和任選地具有所述啟動子的調(diào)節(jié)子的載體。所述載體可包含一 個或多個選擇標記基因，例如對于細菌質(zhì)粒包含氨千青霉素抗性基
因和對于哺乳動物載體包含新霉素抗性基因。載體可體外使用，例
如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞。所述載體還可適于體 內(nèi)使用，例如適用于基因治療方法。用于在各種不同宿主細胞中克 隆和表達多肽的系統(tǒng)眾所周知。合適的宿主細胞包括細菌、真核細 胞(諸如哺乳動物和酵母)以及桿狀病毒系統(tǒng)。本領域可用于表達異源 多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卯巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠 腎細胞、COS細胞等等。
可選擇啟動子和其它表達調(diào)節(jié)信號，以與為其設計表達載體的 宿主細胞相適。例如，酵母啟動子包括釀酒酵母(S. ce^v/w'^) GAL4 和ADH啟動子、粟酒裂殖酵母(S. jrom&) nmtl和adh啟動子。哺乳 動物啟動子包括可響應重金屬如鎘而被誘導的金屬硫蛋白啟動子。 還可使用病毒啟動子，如SV40大T抗原啟動子或腺病毒啟動子。所 有這些啟動子在本領域都容易獲得。
所述載體可包含其它序列，例如驅(qū)動插入核酸表達的啟動子或 增強子、使所述多肽作為融合體生產(chǎn)的核酸序列和/或使在宿主細胞 中生產(chǎn)的多肽由細胞中分泌出來的分泌信號的編碼核酸。
用于生產(chǎn)基因治療用本發(fā)明多肽的載體包括攜帶本發(fā)明的小基 因序列的載體。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種治療與GPR39 GPCR及其活性表達不足相關的異常病癥的方法，所述方法包括使用 編碼GPR39 GPCR的多核普酸。特別是治療胃排空增力口(例如傾倒綜 ^sf正)或腸能動性增強(例如腹瀉、腹瀉型IBS和混合型IBS)的方法。 在基因治療中，本發(fā)明的多核苷酸用于通過受試者中的相關細胞實 現(xiàn)GPR39 GPCR的內(nèi)源性生產(chǎn)。例如，可工程化編碼GPR39 GPCR 的多核苷酸，以在如上提供的復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中表達。 然后，可分離逆轉(zhuǎn)錄病毒表達構建物，并導入到用含編碼本發(fā)明多 肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導的包裝細胞中，使得包裝細胞 現(xiàn)在生產(chǎn)含目標基因的感染性病毒顆粒。這些生產(chǎn)細胞可施用于受 試者，用于在體內(nèi)改造細胞和在體內(nèi)表達多肽。關于基因治療的綜
述,參見Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches,笫20章，載于Human Molecular Genetics, T. Strachan and A.P. Read， BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996)。
關于進一步的細節(jié),參見例如Molecular Cloning: a Laboratory Manual:笫2版，Sambrook等，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。許多用于操作核酸的已知技術和方案，例如在核酸構建物制 備、誘變、測序、將DNA導入細胞中并進行基因表達以及蛋白分析 中的技術和方案，詳述于Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編著，John Wiley & Sons, 1992。
載體可如上所述轉(zhuǎn)化入合適的宿主細胞中，以供本發(fā)明多肽表 達使用。因此，又一方面，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明多肽的方法， 該方法包括在供編碼多肽的編碼序列的載體表達的條件下培養(yǎng)如上 所述用表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞，并回收所表達的多肽。多 肽還可在體外系統(tǒng)中表達，例如網(wǎng)織紅細胞裂解物。
本發(fā)明的其它實施方案提供用本發(fā)明多核苷酸復制和表達用載 體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。選擇與所述載體相適應的細胞，其例如 可為細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。宿主細胞可在表達所述基 因的條件下培養(yǎng)，以便生產(chǎn)編碼多肽。如果所迷多肽偶聯(lián)合適的信 號前導肽表達，則其可由細胞中分泌到培養(yǎng)基中。在通過表達生產(chǎn) 之后，視情況可由宿主細胞和/或培養(yǎng)基中分離和/或純化出多肽，隨 后根據(jù)需要使用，例如用于配制可含一種或多種附加組分的組合物， 例如含一種或多種藥學上可接受的賦形劑、溶媒或載體的藥物組合 物。
本發(fā)明的多核苷酸還可以反義方向插入到上述載體中，以便供 反義RNA或核酶生產(chǎn)使用。
測定
本發(fā)明的 一個目的是提供一種用于鑒定調(diào)節(jié)胃腸動力和膽固醇
穩(wěn)態(tài)的化合物的測定，該測定包括提供本發(fā)明的全部或部分GPR39 受體蛋白，使所述蛋白與推定結合化合物接觸；測定所述化合物是 否能夠與所述蛋白相互作用。
在所述測定的一個實施方案中，受體或受體亞基可用于結合測 定。結合測定可為竟爭性的或非竟爭性的。此測定可提供大量化合 物的快速篩選，以測定哪種化合物(如果有的話)能夠結合所述多肽。 隨后，可用發(fā)現(xiàn)結合的那些化合物進行更詳細的測定，以進一步確 定這些化合物是否能用作本發(fā)明多肽的激動劑或拮抗劑。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于筌定調(diào)節(jié)胃腸動力和 膽固醇穩(wěn)態(tài)的化合物的方法，該方法包括
(i) 在適于結合的條件下，使表達本發(fā)明的全部或部分GPR39 受體蛋白的宿主細胞與所述化合物接觸，和
(ii) 檢測化合物與所述受體蛋白的結合。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于鑒定調(diào)節(jié)胃腸動力 的化合物的方法，該方法包括
(i) 在適于結合的條件下，使表達本發(fā)明的全部或部分GPR39 受體蛋白的宿主細胞的膜制備物與所述化合物接觸，和
(ii) 檢測化合物與所述受體蛋白的結合。
在再另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于鑒定調(diào)節(jié)胃腸動 力的化合物的方法，該方法包括一種竟爭性結合測定，其中
(i) 在有和沒有待測化合物的兩種情況下，使表達本發(fā)明的全部 或部分GPR39受體蛋白的宿主細胞與已知結合GPR39受體蛋白的化
合物4妄觸，和
(ii) 評價所述化合物對已知結合GPR39受體蛋白的化合物的結 合的影響。
在存在待測化合物的情況下，已知結合GPR39受體蛋白的化合 物的結合下降，說明所述化合物能結合GPR39受體蛋白。近期已鑒 定出GPR39受體蛋白的天然配體肥胖抑制素(Zhang, J.V.等，2004
Science,笫310巻；996-999)，其為與胃促生長素(ghrelin)來源于相
同激素原的另一種肽。在一個具體實施方案中，已知結合受體的化 合物包括肥胖抑制素，更特別是選自圖5公開的其中一種肥胖抑制 素序列，即選自SEQ ID NO: 8-19,更特別是SEQ ID NO: 8或SEQ ED NO: 10?；蛘?，本文使用的肥胖抑制素是指與SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 98% 或99%序列同一性的肽。
在一個替代實施方案中，用表達本發(fā)明的全部或部分GPR39受 體蛋白的宿主細胞膜制備物進行上述竟爭性結合測定。下面描述了 所述宿主細胞的制備方法及這些細胞的膜制備物的制備方法。
在一個具體實施方案中，前述結合測定中的GPR39受體蛋白是 一種分離蛋白，其具有的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、具有前述SEQ ID的蛋白的剪接變體以及與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的氨基酸序列。
上文使用的部分GPR39蛋白意指包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的多肽的片段，所述片段大小為至少10個氨基酸，例如至少 20、 30、 40、 50、 75、 100或150個或更多個氨基酸。這些片段可分 別來源于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的N端區(qū)。含此N端區(qū)的 片段可用于重構受體的胞外部分，以提供受體結合位點。優(yōu)選地， 所述片段保留結合已知結合GPR39受體蛋白的化合物的能力。
膜制備物
表達本發(fā)明受體蛋白的細胞膜用于某些類型的測定，包括但不 限于配體結合測定、GTP個S結合測定和其它測定。制備此細胞膜的 具體程序在某些情況下可由隨后測定的特性來決定，但通常包括收 獲全細胞和石皮碎細胞，例如通過在冰冷緩沖液(例如20mM Tris HCl、 ImM EDTA, pH 7.4,于4。C)中進行超聲處理。隨后通過j氐速離心清
除所獲粗細胞裂解物的細胞碎片，例如以200xg于4°C離心5分鐘。 最后使用高速離心步驟進行進一步的清除和膜富集，例如以40,000xg 于4'C離心20分鐘，獲得的膜沉淀通過在水冷緩沖液中懸浮并重復 高速離心步驟進行洗滌。最終洗滌過的膜沉淀重懸浮在測定緩沖液 中。蛋白濃度通過Bradford法(1976)測定，使用牛血清白蛋白作為標 準。所述膜可直接使用或冷凍待以后使用。
放射性標記配體結合測定
表達本發(fā)明受體的細胞可用于篩選所述受體的配體。可使用相 同測定薈定可用于各種治療目的的受體激動劑或受體拮抗劑。
通過將由表達受體的細胞所制備的膜用合適的緩沖液稀釋進行 放射性配體結合測定，所述緩沖液例如為含有2.1%牛血清白蛋白 (Sigma)、氺卩酶月太(0.005mg/ml， Boehringer Mannheim)和苯丁4中制素 (O.lmM， Sigma)作為蛋白酶抑制劑的50mM Tris緩沖液(pH = 7.4，于 (TC)。測定中的最終蛋白濃度通常在12-40iiig/ml之內(nèi)。
然后，在有或沒有竟爭性配體的情況下，將膜與放射性標記的 配體在總體積為250]ul的96孔孩i量滴定板中于水上保溫60分鐘。然 后使用Tomtec (Wallac)真空過濾裝置，經(jīng)0.5Q/o聚乙烯亞胺(PEI)預浸 泡的GF/B濾器過濾，將結合配體與游離配體分離。在加入Ready Safe (Beckman)閃爍液后，使用Trilux (Wallac)閃爍計數(shù)器(結合計數(shù)的計 數(shù)效率接近40%)定量測定結合放射性。另一方面，優(yōu)選可收集結合 配體，然后使用本領域眾所周知的程序分離配體與受體。數(shù)據(jù)用 GraphPad prism擬合為非線性曲線。
以此方式，可鑒定結合受體的激動劑或拮抗劑化合物，因為它 們抑制放射性標記配體結合表達所述受體的細胞的膜蛋白。非特異 性結合,皮定義為在對應于所用放射性配體的100 nM未標記肽存在下 膜蛋白保溫后保留的放射性量。在平衡飽和結合測定中，在濃度漸 增的標記化合物存在下，將用受體轉(zhuǎn)染的膜制備物或完整細胞進行保溫，以測定標記配體的結合親合性。未標記化合物的結合親合性 可在存在濃度可變的置換配體的情況下使用固定濃度的標記化合物 于平衡竟爭結合測定中測定。
在一個具體實施方案中，使用如上文定義的放射性標記肥胖抑 制素，進行上述放射性配體結合測定。肥胖抑制素的標記和受體結
合描述于Zhang, J.V.等，2004 Science,笫310巻；996-999。簡而言之 使用Iodogen (Pierce, Upland, IN)方法使肥胖抑制素捵化。將肽 (20貼)和lmCi [125I] Nal的混合物轉(zhuǎn)移至預包被Iodogen小瓶中，溫 育4分鐘。1251-標記肽加到Sep-Pak C18柱(Waters),然后用60%乙腈 /0.1。/。TFA洗脫。對于放射性配體結合測定，大鼠空腸或其它組織用 緩沖液A(20mMHepes、 5mMEDTA、 lmM 二硫蘇糖醇(DTT)、 10pM 脒基苯基曱基磺酰氟、5mg/L亮抑酶肽、lOOmM KC1, pH 7.5)洗滌， 切成小塊，使用機械勻漿器勻漿。勻漿物以l，OOO g離心5分鐘，上 清液于2。C以300，000 g離心1小時。沉淀(粗膜分離級分)用無KC1 的緩沖液A重懸浮，在液氮下快速冷凍，儲存于-8CTC直至使用。在 有或沒有1,000倍過量的未標記肥胖抑制素的情況下，將組織勻漿物 在含0.1%牛血清白蛋白的lOO(il磷酸緩沖鹽溶液中于室溫與不同濃 度的1251-肥胖抑制素溫育18小時。溫育后，將試管以10,000 g離心 10分鐘，用水冷PBS洗滌沉淀兩次，然后用丫-分光光度計定量測定 放射性。用總結合減去非特異性結合得出特異性結合。對于位移曲 線，將固定濃度的1251-肥胖抑制素單獨保溫或者與濃度漸增的肥胖抑 制素或其它肽一起保溫。
除了前述結合測定以外，本發(fā)明的目的還在于提供用于鑒定調(diào) 節(jié)胃腸動力的化合物的功能測定，其特征在于所述化合物能調(diào)節(jié)本 發(fā)明的GPR39受體蛋白的活性。這樣的測定包括以下步驟
(i) 使全部GPR39受體蛋白或部分GPR39受體蛋白與待測化合 物4妄觸，和
(ii) 測定GPR39受體蛋白的活性，其中在試^r化合物存在下
GPR39活性的改變，說明所迷化合物調(diào)節(jié)胃腸動力的能力。
假定觀察到GPR39與膽固醇穩(wěn)態(tài)的關聯(lián)，在鑒定結合和/或調(diào)節(jié) GPR39活性的化合物的所有公開實施方案中，所述測定可用于鑒定 可影響受試者的膽固醇穩(wěn)態(tài)的化合物，所述受試者包括人和溫血動 物。
調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽活性的化合物是指改變多肽活性以使多肽在有 所述化合物和沒有所述化合物時表現(xiàn)不同的化合物。影響調(diào)節(jié)的化 合物包括激動劑和拮抗劑。激動劑包括激活GPR39 GPCR功能的化 合物。反過來說，拮抗劑包括干擾GPR39 GPCR功能的化合物。通 常，觀察到的拮抗劑作用為阻斷激動劑誘導的受體活化，但對最近 已描述為組成型活性受體的GPR39而言，干擾GPR39 GPCR功能的 化合物還包括反向激動劑，即和該受體的激動劑 一樣結合同 一受體 結合位點但表現(xiàn)出相反藥理學效應的藥劑。拮抗劑包括竟爭性以及 非竟爭性拮抗劑。竟爭性拮抗劑(或竟爭性阻斷劑)作用于或接近于對
激動劑結合特異性的位點。非竟爭性拮抗劑或阻斷劑通過與激動劑 互作位點之外的位點相互作用而使受體功能失活。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定能夠增加胃排空和/或結 腸能動性的化合物的方法，所述方法包括
(i) 使表達全部GPR39受體蛋白或部分GPR39受體蛋白的宿主
細胞與待測化合物在允許所述受體蛋白活化的條件下接觸，和
(ii) 測定GPR39受體活性的任何增加，由此筌定為能夠增加胃
排空和/或結腸能動性的化合物的試驗化合物。
在再一個實施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定能夠降低胃排空和/
或結腸能動性的化合物的方法，所述方法包括
(i) 使表達全部GPR39受體蛋白或部分GPR39受體蛋白的宿主
細胞與待測化合物在允許所述受體蛋白活化的條件下接觸，和
(ii) 測定GPR39受體活性的任何降低，由此鑒定為能夠降低胃
排空和/或結腸能動性的化合物的試驗化合物。
再者，就上文提及的結合測定而言，上述活性測定還可用于鑒
定會調(diào)節(jié)膽固醇代謝的化合物。根據(jù)觀察到的表型，預期增加GPR39 活性的化合物會導致膽固醇水平降低，而降低GPR39活性的化合物 會導致膽固醇水平升高。在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供一種 鑒定能夠降低膽固醇水平的化合物的方法，所述方法包括
(i) 使表達全部GPR39受體蛋白或部分GPR39受體蛋白的宿主 細胞與待測化合物在允許所述受體蛋白活化的條件下接觸，和
(ii) 測定GPR39受體活性的任何增加，由此鑒定為能夠降低膽 固醇水平的化合物的試驗化合物。
所述化合物對GPR39活性的作用可為增加或降低由GPR39介 導的胞內(nèi)第二信使形成，所述笫二信使例如為胞內(nèi)4丐、cAMP或受體 基因產(chǎn)物。GPR39屬于稱為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的蛋白類型。GPCR 在結合配體時經(jīng)細胞膜傳輸信號。配體結合的GPCR活化由異三聚 化G蛋白介導的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導事件，例如活化腺苦酸環(huán)化酶途徑或 活化磷脂酶c-p途徑。評價前述胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導事件活化的測定一般來 說是本領域已知的，其中包括用于含嵌合配體可誘導轉(zhuǎn)錄因子的信 號轉(zhuǎn)導的細胞型測定、使用熒光強度分布分析的用于G蛋白偶聯(lián)受 體的結合測定、使用偶聯(lián)至發(fā)光團的環(huán)核苷酸的細胞信號轉(zhuǎn)導測定 或使用指示多重應答元件或cAMP應答元件的寺艮道分子測定檢測G 蛋白偶聯(lián)受體的應答。下面描述了幾種這樣的測定。
本發(fā)明還提供一種鑒定調(diào)節(jié)GPR39 GPCR基因的調(diào)節(jié)區(qū)的化合 物的生物測定。此測定使用能夠表達本發(fā)明多肽(優(yōu)選SEQ ID NO: 2 或SEQ ID NO: 4)的大鼠或人細胞進行。所述細胞與至少一種化合物 接觸，其中所述化合物調(diào)節(jié)所述調(diào)節(jié)區(qū)的能力是已知的。此后，監(jiān) 測所述細胞表達本發(fā)明核酸的情況。任選地，啟動子可以與寺艮道基 因相連接?？墒褂玫倪m宜報道基因包括例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、 螢光素酶基因等。
如本領域技術人員所理解的，鑒定調(diào)節(jié)受體(例如本發(fā)明多肽)活
性的化合物的生物測定方法一般需要與對照進行比較。 一類對照是 與接觸所述化合物的試驗細胞或試驗培養(yǎng)物大致相同地處理的細胞 或培養(yǎng)物，不同之處在于對照細胞或培養(yǎng)物不接觸所迷化合物。另 一類可使用的對照細胞或培養(yǎng)物是與轉(zhuǎn)染細胞相同的細胞或培養(yǎng)
物，例外之處是對照細胞或培養(yǎng)物不表達功能性GPR39 GPCR。因 此，在相同反應條件下，可對比轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞或培養(yǎng)物對相 同化合物的反應。
特別優(yōu)選的測定類型包括結合測定和功能測定，它們可如下實
施
結合測定
編碼本發(fā)明多肽的核酸在細胞系(包括哺乳動物HEK 293細胞、 CHO細胞和Sf9昆蟲細胞)中的過量表達可用于生產(chǎn)攜帶所述多肽(為 方便起見，在本章節(jié)中是指GPR39 GPCR)的膜制備物，用于配體結 合研究。這些膜制備物可用于常規(guī)濾膜結合測定(例如使用Brandel 濾膜測定設備)或高通量閃爍親近型結合測定(SPA和Cytostar-T Flashplate #支術；Amersham Pharmacia Biotech)， 以斗企測》文射寸生才示"i:己酉己 體的結合和結合位點的竟爭物對此放射配體的替換。放射性可用 Packard Topcount或相似的設備檢測，能夠由96、 3M、 1S36孩t量滴 定孔形式進行快速檢測。SPA/Cytostar-T技術尤其可按照高通量篩選 實施，因此該技術適合用作對能夠替換標準配體的化合物的篩選。
研究配體與GPR39 GPCR蛋白在近于天然狀況的環(huán)境中結合的 另 一種方法利用Biacore instrument (Malmqvist M., Biochem Soc Trans. 1999年2月；27(2):335-40)開發(fā)的表面等離子體共振作用。在膜制備 物或全細胞中的GPR39 GPCR能與Biacore的生物芯片相連接，并在 有和沒有化合物的情況下檢驗配體結合，以鑒定結合位點的竟爭物。
功能測定
因為GPR39 GPCR經(jīng)通常與GIRK (內(nèi)向整流鉀通道)相互作用 的Gi或Go (抑制型G蛋白)起作用，所以鉀離子流動應對這些受體的 活化有作用。這種離子流動可使用各種技術實時檢測，以測定特定 化合物的激動或拮抗作用。因此，在細胞系或例如爪蟾(Xem / w力卵 母細胞中表達的重組GPR39 GPCR受體可使用全細胞或單通道電生 理學分析來表征，以確定目標化合物的作用機制?？墒褂贸Ｒ?guī)電生 理學技術和目前處于研發(fā)中的新高通量方法(當它們變?yōu)榭捎脮r)，電 生理學篩選對GPIG9 GPCR有活性的化合物。
焚光一使用幾種離子敏感型熒光染料可檢測鈣和鈉流動，所述 染料包括fluo-3、 fluo-4、 fluo-5N、 fum red、綠鈉鹽、SBFI和包括 Molecular Probes在內(nèi)的供應商的其它類似探針。從而可使用熒光計 和焚光成像技術(包括用或不用激光共聚焦法的熒光顯^^鏡術，其組 合成像分析算法)實時表征由GPR39 GPCR引起的鈣和鈉流動。
另一種方法是高通量篩選測定，用于起影響鈣瞬變的激動劑或 調(diào)節(jié)劑作用的化合物。該測定基于稱為熒光成像讀板儀((FLIPR⑧)， Molecular Devices Corporation)的設備。其以其最常用配置激發(fā)并檢 測由熒光型染料發(fā)射的熒光。其使用氬離子激光于488 nm產(chǎn)生高能 激發(fā)的熒光團，使用一種光學系統(tǒng)快速掃描96/384孔板的整個底部， 并使用靈敏的冷卻CCD照相機捕獲發(fā)射的熒光。其還包含一種96/384 孔分液頭，允許設備將試劑溶液加到96/384孔板各孔中。FLIPR測 定設計用于在加入所述化合物之前、當中和之后同時地實時檢測全 部96/384孔的細胞群體的熒光信號。FLIPR測定可用于篩選和表征 對在細胞系中表達的重組GPR39 GPCR (例如大鼠或人GPR39 GPCR) 有功能活性的化合物。如下所述，為了確定受體的天然配體，使用 FLIPR測定4t測GPR39 GPCR轉(zhuǎn)染細胞中的鈣瞬變，以便檢測各種
底物對受體的活化。
環(huán)AMP (cAMP)測定一可在表達所述受體的細胞中測定受體介 導的對環(huán)AMP (cAMP)形成的刺激和抑制。用于cAMP測定的代表
性方法見下文。
在該方法中，使用DEAE-葡聚糖法用受體基因瞬時轉(zhuǎn)染COS-7 細胞，再接種到96孔位置。轉(zhuǎn)染后48小時，用補加10mM HEPES、 10mM葡萄糖和5mM茶堿的Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液(FES)洗滌細 胞兩次，并在相同緩沖液中于37°C、 5% C02下溫育20分鐘。加入 試驗化合物，細胞于37。C再溫育IO分鐘。然后吸出培養(yǎng)基，通過加 入100mMHCl終止反應。所述板于-20。C儲存2-5天。對于cAMP檢 測，解凍平板，每個孔中的cAMP含量通過cAMP閃爍親近測定 (Amersham Pharmacia Biotech)才企測。方文射'tK吏用microbeta Trilux i十 數(shù)器(Wallac)定量。
微量生理測定一因為細胞代謝錯綜復雜地參與廣泛的細胞事件 (包括多個信使途徑的受體活化)，所以使用細胞代謝的微量生理測定 可以提供對細胞活性的一般性測定，所述細胞活性起因于任何孤兒 受體的活化，與受體信號轉(zhuǎn)導途徑的特異性無關。
瞬時受體表達、細胞制備和4鼓量生理測定記錄的一般指引參見 Salon, J.A.和Cwicki, J.A., 1996。通常，收獲表達受體的細胞，并在 實驗前24小時以3xl05細胞"效量生理計傳感器接種在完全培養(yǎng)基 中。在記錄前16小時用無血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，以使分了類的 和不清楚的血清因子的非特異性代謝刺激減至最小。在實驗當天， 將細胞傳感器轉(zhuǎn)移入4敬生理計中，并使其在記錄培養(yǎng)基(低緩沖RPMI 1640， 無碳酸氬鹽、無血'清(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA),含0.1-1%無脂肪酸的BSA)中平衡，在此過程中建立基礎代謝 活性的基線測量值。
標準記錄方法規(guī)定流速100)ul/分鐘，總泵循環(huán)2分鐘，其中 含30秒流動中斷，在此過程中進行酸化率檢測。配體攻擊包括就在 進行頭遍攻擊率檢測之前接觸樣品1分20秒，之后是兩次額外泵循 環(huán)，共5分20秒樣品接觸。通常，初篩時藥物按10pM終濃度提供 給細胞。此外，患有心血管并發(fā)癥的個體可以是患有中風的個體。術語"中 風"涉及任何腦血管事件，其中，例如由于腦出血或腦動脈的血栓形 成，流向腦的小的或大的區(qū)域的血液被中斷。中風可能引起暫時的意
識喪失或麻痹。在這種情況下，中風被稱為"apoplectic stroke"。
個體可能顯示臨床癥狀(例如，呼吸困難、胸痛，參見以下的NYHA 分類法)，他們可能是無癥狀的。雖然本發(fā)明對于鑒定沒有顯示先存 的心血管疾病、風險或并發(fā)癥癥狀的風險患者特別有益，在其他集合 中它也是有用的，例如，來確認或監(jiān)視顯示心血管疾病癥狀的患者的 風險狀態(tài)。
術語"心血管風險"涉及發(fā)展心血管并發(fā)癥的風險。 本發(fā)明涉及由于施用抗炎藥物或Cox-2抑制劑，特別是NSAID、
甾族藥物或選擇性Cox-2抑制劑的結果發(fā)展的"心血管并發(fā)癥"。心血
管并發(fā)癥也稱為"心血管事件"。在下文中，僅僅或主要地，將使用術
語"心血管并發(fā)癥"。
術語"心血管并發(fā)癥，，是本領域的技術人員已知的。因而，根據(jù)本
發(fā)明的"心血管并發(fā)癥"涉及本領域的技術人員已知的任何類型的這種
心血管并發(fā)癥或心力衰竭(特別是急性心力衰竭)，特別地，該術語 是指與動脈血栓形成或動脈血栓形成的發(fā)展相關的并發(fā)癥。動脈血栓
形成可能引起冠狀動脈綜合征(例如，急性心肌梗塞或中風)，
特別地，"心血管并發(fā)癥"涉及動脈系統(tǒng)中的并發(fā)癥，例如ACS、
UAP、 MI、 ST提高的MI、非ST提高的MI或中風。
更特別地，"心血管并發(fā)癥"涉及MI、 ST提高的MI、非ST提高
的MI或中風。
心血管疾病的癥狀是本領域的技術人員已知的，可以包括，例如， 新的Q-波或束支阻滯、非致死性中風的病征、由水腫的發(fā)展或先存的 下肢水腫的惡化所暗示的心力衰竭的發(fā)作或惡化、聽診的羅音或肺充 血、動脈高壓的新近發(fā)作或先存的高動脈壓的惡化、以及靜脈血栓形 成。
心血管疾病的癥狀已經(jīng)才艮據(jù)New York Heart Association (NYHA)被分類入功能性分類系統(tǒng)。I類患者沒有心血管疾病的明 顯癥狀。身體活動不受限制，普通的身體活動不引起過度疲勞、心跳 或呼吸困難(呼吸急促)。II類的患者具有身體獲得的輕微限制。他
使用的那些載體或稀釋劑。載體或稀釋劑的選擇當然取決于提議的 給藥途徑，給藥途徑可取決于所述藥劑及其治療目的。制劑可便利 地以單位劑型提供，并可通過藥學領域眾所周知的任一種方法制備。 這樣的方法包括實現(xiàn)活性成分與由一種或多種助劑構成的載體結合
的步驟。 一般來說，所述制劑如下制備將活性成分與液體載體或
微細固體載體或這二者非常均勻地混合在一起，然后必要時使產(chǎn)物 成型。
對于固體組合物，可使用常規(guī)的無毒固體載體，包括例如藥用 級甘露醇、乳糖、纖維素、纖維素衍生物、淀粉、硬脂酸鎂、糖精 鈉、滑石粉、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。上述活性化合物可使用例 如作為載體的聚烷撐二醇、乙酰化甘油三酯等配制成栓劑?？墒┯?br>
的液體藥物組合物例如可通過對如上定義的活性化合物和可選的藥 用輔劑的載體溶液進行溶解、分配等來制備，所述載體例如為水、 葡萄糖鹽水溶液、甘油、乙醇等，由此制成溶液劑或混懸劑。如果 有需要的話，待施用的藥物組合物還可包含少量無毒輔助物質(zhì)，例
如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等，例如乙酸鈉、失水山梨醇單月桂 酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、失水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯 等。這些劑型的實際制備方法是本領域技術人員已知的或者是顯而 易見的；參見Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eastern, Pennsylvania,笫15版，1975。
在任何情況下，待施用的組合物或制劑都將含有一定量的活性 化合物，其量有效減輕待治療受試者的癥狀。
可制備含0.25-95%范圍內(nèi)的活性成分的劑型或組合物，由無毒 載體平;(釺組成。
對于口服給藥，通過摻入任一正常使用的賦形劑，例如藥用級 甘露醇、乳糖、纖維素、纖維素衍生物、交聯(lián)羧曱基纖維素鈉(sodium crosscarmellose)、淀粉、硬脂酸4美、糖精鈉、滑石粉、葡萄糖、蔗糖、 碳酸鎂等，制成藥學上可接受的無毒組合物。這樣的組合物采用溶
液劑、混懸劑、片劑、丸劑、膠嚢劑、散劑、緩釋制劑等形式。這
樣的組合物可包含1%-95%活性成分，更優(yōu)選為2-50%,最優(yōu)選為5-8%。
一般來說，胃腸外施用以皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射為特征。注 射劑可制備成常規(guī)形式，或者作為液體溶液劑或混懸劑、適于在注 射前用液體配制成溶液劑或混懸劑的固體形式，或者為乳劑。合適 的賦形劑例如為水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等。另外，如果有 需要的話，待施用的藥物組合物還可包含少量無毒助劑，例如潤濕 劑或乳化劑、pH緩沖劑等，例如乙酸鈉、失水山梨醇單月桂酸酯、 三乙醇胺油酸酯、三乙醇胺乙酸鈉等。
在此胃腸外組合物中包含的活性化合物的百分率高度依賴于其 具體特性以及化合物的活性和受試者要求。但是，在溶液劑中活性 成分的百分率為0.1%-10%是有益的，如果組合物為固體則活性成分 的百分率將會更高，隨后所述固體組合物稀釋至上述百分率。優(yōu)選 地，所述組合物的溶液中活性劑占0.2-2%。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于治療以下疾病的藥物 組合物胃排空延遲、與胃排空延遲相關的疾病(例如胃輕癱術后腸 梗阻、糖尿病性胃輕癱、機能性消化不良、迷走神經(jīng)切斷術后胃輕 癱和特發(fā)性假性腸梗阻)，所述組合物包含GPR39受體拮抗劑。
本發(fā)明的另 一個目的是一種用于治療以下疾病的藥物組合物 膽固醇水平升高、胃排空增加、與胃排空增加相關的疾病(例如傾倒 綜合征或腸能動性增強，例如腹瀉、腹瀉型IBS和混合型IBS),所 述組合物包含GPR39受體激動劑。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供GPR39拮抗劑在制備用于治療 與胃排空延遲相關的疾病的藥物中的用途。特別是用于治療胃輕癱 術后腸梗阻、糖尿病性胃輕癱、機能性消化不良、迷走神經(jīng)切斷術 后胃輕癱和特發(fā)性假性腸梗阻。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供
GPR3 9激動劑在制備用于治療與胃排空增加相關的疾病的藥物中的
用途。特別是用于治療傾倒綜合征、腹瀉、腹瀉型IBS和混合型IBS。 參考下面的實施例細節(jié)將更好地理解本發(fā)明，但本領域技術人 員容易意識到，這些實施例細節(jié)僅用于說明本發(fā)明，本發(fā)明在所附 權利要求書中更完整地描述。另外，在本申請全文中，引用了各種 出版物。這些出版物的公開內(nèi)容在此引用到本申請中作為參考，以 更全面地描述本發(fā)明所屬領域的現(xiàn)有技術水平。
實施例
下面的實施例用于說明本發(fā)明。才艮據(jù)這些實施例，本領域技術 人員會聯(lián)想到其它實施方案。
材料與方法 GPR39敲除小鼠
GPRC39敲除小鼠由Lexicon Genetics Inc獲得。通過用IRES LacZ/MCl-Neo報道基因/選擇盒替換GPR39基因笫一編碼外顯子的 編碼區(qū)，對GPR39可讀框進行-皮壞。動物保持在滿足所有比利時和 歐洲動物管理要求的SPF設施中。除非有不同指示，否則小鼠分群 關養(yǎng)在氣候受控的動物居住區(qū)中，12小時晝夜循環(huán)(晝于7:00 EST開 始)，自由獲取食物和水。采用足夠的措施使疼痛或不適最小化。所 有實驗都按照歐洲議會和理事會規(guī)定(European Communities Council Directives) (86/609/EEC)進行，并得到了地方倫理委員會的批準。
GPR39的實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析
使用實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析由野生型小鼠(腦、肝臟、脊髓、 胃、腎臟、脾臟、結腸、肺、心臟、食管、胰腺、回腸、空腸)和GPR39 敲除小鼠(肝臟、胃、空腸、結腸)解剖的不同組織的總RNA，以研 究GPR39的組織分布，并證實GPR39被敲除。使用隨機六聚體引物 和Superscript II RT (Invitrogen Life Technologies)對l.Omg總RNA進 行笫 一鏈cDNA合成。使用Taqman PCR試劑盒在ABIPrism 7000循
環(huán)儀(Applied Biosystems)上進行定量PCR。使用連續(xù)稀釋的cDNA 產(chǎn)生臨界循環(huán)數(shù)對(3-肌動蛋白濃度對數(shù)的標準曲線。下文收集了 RTQ 特異性引物對和探針。
RTQ引物和探針的小鼠MPA2選擇
GPR39一FW 5'-CCA CTC ACA AGG GAC TCA ACT G-3' (SEQ ID NO: 5) GPR39—REV 5'-TGG AGT TTC CAG GTT CAT CGT-3' (SEQ ID NO: 6) GPR39一Probe 5'-AAC CTC TCT CGC ACC CGC CA-3' [5' FAM〗[3' TAMRA] (SEQIDNO:7)。
樣品以 一 式三份進行實驗，結果僅在符合定量標準時才顯示。 不同小鼠組織中的表達水平以對小鼠(3-肌動蛋白標準化后的相對水平表示。
GPR39敲除小鼠中的P-半乳糖苷酶活性的染色
由在內(nèi)源小鼠GPR39啟動子調(diào)控下表達細菌(3-半乳糖苷酶基因 (LacZ)的純合GPR39敲除小鼠解剖出組織(胰腺、胃、回腸、空腸和 結腸)。按照已描述的方案(InvitroGen)對這些組織進行整封染色，接 著對組織進行石蠟包埋和制作切片。
表型分析 胃排空
一組6只野生型和6只純合雄性GPR39敲除小鼠關養(yǎng)在20-22 。C、 14小時-10小時晝夜循環(huán)的籠內(nèi)。標準商品化小鼠飼料(4352 Muracon G， Nutreco Belgium NV, Gent, Belgium) (4.5%脂肪、4%纖維 素、21%蛋白質(zhì)、1.404 kcal/g)可隨意獲取，直至測試前的晚上。在 下午4點，撤除食物，在笫二天的上午11點開始測試。將鐵絲網(wǎng)板 插入到籠的底部，以避免禁食過程中的嗜糞癖。除了測試期間以外， 自來水始終可自由獲取。
試驗餐
固體試驗餐由O.l g烘烤的炒蛋黃組成，摻雜O.Ol nCi "c-辛酸 鈉鹽(American Radiolabeled chemicals Inc, St Louis, MO， USA), 并與 0.1 g標準小鼠飼料混合。加入自來水，并混合形成均勻糊漿。在開 始試驗前的2周內(nèi)，每周兩次按固定時間程序訓練禁食小鼠(19小時) 自動吃無放射性標記的試驗餐。在該訓練后，大部分小鼠在60秒內(nèi) 吃完試驗餐。
呼吸測試方法CO二取樣
為6根氣密塑料管裝上進口閥，通過該閥門通入連續(xù)氣流(80% N2、 20%O2、 360ml/min),同時出氣流通入一個裝有002捕集器、四 甲基氫氧化銨(1.3mmo1) (Acros, Geel, Belgium)和pH指示劑百里酚舦 (0.006%)的小瓶內(nèi)。在所用取樣時間內(nèi)，沒有觀察到脫色，說明在實 驗過程中呼出的所有C02都被捕獲。管的尺寸(直徑50mm，長度 150mm)允許小鼠自由走動。每只小鼠都放置在氣密管中，在給予測 試餐之前取基線呼吸樣品(5分鐘)。打開管，給予小鼠食物，再關閉 管。在前半個小時每5分鐘進行取樣，在接下來的4小時當中每15 分鐘進行取樣。加入閃爍液，用P-計數(shù)器對樣品計數(shù)。
數(shù)據(jù)分析
使用最小平方分析，呼吸中排出的14C02通過兩個數(shù)學公式擬 合，以獲得最佳擬合曲線(Ghoos等，W93; Maes等，1994): 公式1: y = mkpe-kt(l -e — 公式2: y = atVct
y是每小時呼吸中"C02排出的百分率，t是以小時為單位的時 間；m、 k、 |3、 a、 b和c為回歸估計常凄t， m是時間無窮大時回收 的"C02總量。
由最佳擬合計算以下參數(shù)
-胃半排時間(、/2),排出14002總量的50%的時間。因此，11/2值
不僅包含胃半排空時間，而且包含胃處理后必須的時間，例如"c辛
酸的吸收和代it和呼吸中"(:02的排出。 公式1: t1/2 = (-l/k)*ln(l-2 —1/p) 公式2: t1/2 = 60*(b/c)
-遲滯期(t^)，由于胃將食物研磨成細顆粒需要時間而導致的胃 排空延遲。
公式l: tlag-ln(P)/k
/>式2: tlag = 60*gammainv(0.5; 1 + b; 1/c)
為了確保測出的14C02產(chǎn)量沒有由擬合的數(shù)學曲線逸出太多，將 測量值與數(shù)學擬合為理論曲線的值相關聯(lián)。如果相關系數(shù)小于0.95 (r幼.95),則數(shù)學擬合被認為是不可接受的，數(shù)據(jù)排除在分析之外。
胃分泌
使用一組6只野生型(WT)和6只純合GPR39敲除(GPR 39 —一) 雌性小鼠研究胃分泌。
使用異氟烷麻醉小鼠。在麻醉下利用縫線(vicryl 4-0， Ethicon)閉 合幽門，然后縫合腹腔。將動物單獨地再放入其籠內(nèi)達4小時。4小 時后處死幽門閉合小鼠，剛好在賁門之上閉合食管。由腹腔中取出 胃。稱重胃，打開取出胃分泌物。檢測胃分泌物，然后用5ml水稀 釋(Water Molecular Biology Grade, Eppendorf)。用pH電極(pH 597, Profi Lab)測pH。
數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)用平均值士SD表示。使用非參數(shù)Wilcoxon檢驗比較野生 型(WT)和GPR39-「小鼠之間的小鼠胃重量和胃分泌物。首先測水 (5ml)的pH，然后加入到胃分泌物中，再測pH。計算出水的pH和含 胃分泌物的溶液的pH之間的差值，然后對lml溶液進行報告，接 著使用非參數(shù)Wilcoxon檢驗對比兩個組之間的pH差。
糞粒推進力
使用一組6只野生型(WT)和6只純合GPR39敲除(GPR 39 — 雄性小鼠研究糞粒推進力。
利用C02使小鼠窒息，接著斷頭。切下由盲腸到直腸的結腸， 清除粘連組織。將組織轉(zhuǎn)移至含100ml Krebs-Henseleit溶液的玻璃燒 杯，用95% 02和5% C02吹氣，保持于37。C。在開始實驗之前，測 量結腸長度。計數(shù)結腸中的糞粒，并測出它們到盲腸的距離。然后 記錄20分鐘內(nèi)各個糞粒排出的時間。
數(shù)據(jù)分析
通過將各個糞粒相對于結腸長度的位置分區(qū)，測定t-0和20分 鐘時結腸長度內(nèi)糞粒的分布(結腸長度15%的劃分區(qū)0%-15%，〉 15%-30%、 >30%-45%、 〉60%-75%、 〉 75%-90%和 > 卯％-100%, 其中0%代表直腸，100。/。代表IC瓣)?？疾炜偨Y腸長度15%的劃分區(qū)， 在20分鐘時間段內(nèi)計數(shù)各個劃分區(qū)中的糞粒數(shù)和由各個劃分區(qū)排出 的糞粒數(shù)。使用雙邊符號檢驗進行統(tǒng)計學分析。
小鼠4于為試驗
使用一組14只野生型和14只純合雄性GPR39敲除小鼠以及12 只野生型和12只純合雌性GPR39敲除小鼠進行兩種行為試驗開放 場域試驗(Open Field Test)(—種評價運動能力的行業(yè)內(nèi)已知方法)和 高架零迷宮(Elevated Zero Maze)(—種評價焦慮相關行為的行業(yè)內(nèi)已 知方法)。
在正常晝/夜周期的白晝階段中進行開放場域試驗(OFT)。每只 小鼠在自動化開放場域系統(tǒng)中進行30分鐘的測試訓練。記錄在水平 和垂直方格中的走動。在此訓練當中，記錄以下參數(shù)活動持續(xù)時 間、移動次數(shù)、總移動距離、在中心移動的距離、在邊緣移動的距 離、在中心移動的相對距離、在中心耗費的時間、在邊緣耗費的時
間、在中心^^費的相對時間、在中心移動的距離對在邊緣移動的距 離、在中心耗費的時間對在邊緣耗費的時間、直立次數(shù)和直立持續(xù)
時間。單因素ANOVA用作所得結果的統(tǒng)計學分析。
高架零迷宮(o-迷宮)在正常晝/夜周期的白晝階段中進行。每只
小鼠在高架零迷宮中進行5分鐘的測試訓練。在此訓練當中，記錄 以下參數(shù)在封閉臂和開放臂中的活動時間、在封閉臂和開放臂中 耗費的相對時間、總移動距離、在封閉臂和開放臂中的移動距離。 單因素ANOVA用作所得結果的統(tǒng)計學分析。
呼吸率
使一組6只野生型和6只純合雄性GPR39敲除小鼠適應AIN-93G 嚙齒動物純化祠料(Dyets, Inc., USA),然后將它們放入代謝籠內(nèi)。在 與代謝籠(參見下文)相同的條件下，將小鼠單獨關養(yǎng)在2型籠內(nèi)最少 l周，之后檢測。在連續(xù)2天內(nèi)，所有小鼠都在受控的溫度(28.8。C)、 濕度(55-60%)和光照(12:12小時晝/夜周期，晝于06:00開始)下單獨 關養(yǎng)在代謝籠內(nèi)。動物自由獲取嚙齒動物祠料和水。測定以下參數(shù)， 用平均值表示呼吸商(RER)、 V02和產(chǎn)熱。
血液分析
在隨意獲取標準飼料后剝奪食物12小時，然后測定6月齡雄性 和雌性GPR39一-小鼠對GPR39"+同窩出生小鼠中的血漿膽固醇和甘 油三酯水平。使用同 一供應商的試劑和試驗方法，利用Hitachi Modular 隨才踏取分4斤4義(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)測定月旦固醇和 甘油三酯水平并求出平均值。
食物攝取
在上午10點開始，于6小時當中，在隨意喂飼和禁食的年幼(17 周)和年長(56周)GPR39 —一小鼠對GPRS9+"同窩出生小鼠(每組i^6) 中進行累積食物攝取分析。將每只小鼠放到單獨的籠內(nèi)，置于暗室
中(除非另有說明)，小鼠在籠內(nèi)接受預稱重量的食物。通過在30分 鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時和6小時時扣除沒吃的 食物測出累積食物攝取。
結果
GPR39的實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析
在來源于野生型小鼠的多個小鼠組織中進行的GPR39實時定量 逆轉(zhuǎn)錄PCR分析顯示出廣泛的組織分布(圖1A)。在來源于野生型小 鼠以及雜合和純合GPR39敲除小鼠的4種不同組織(肝臟、胃、空腸、 結腸)中進行的GPR39實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR證實，在GPR39敲除小 鼠中不存在GPR39轉(zhuǎn)錄物。在雜合小鼠中獲得中間水平(圖1B)。
GPR39敲除小鼠中的P-半乳糖苷酶活性的染色
檢測胰腺的外分泌部分(胰島)和內(nèi)分泌部分、位于幽門粘膜腺組 織上部區(qū)域的壁細胞和胃體中頸粘液細胞、小腸和結腸中的腸細胞 以及神經(jīng)支配腸肌肉層的神經(jīng)元中的GPR39表達。
胃排空
與野生型小鼠相比，GPCR 39敲除小鼠中固體食物的胃排空明 顯加速。實際上，GPCR39敲除小鼠中的半排空時間(、2)(48.5士2分 鐘，n-6)與野生型小鼠(89.9土6分鐘，n-6)相比顯著降低(圖2A)。 GPCR 39敲除小鼠的T^相對于野生型小鼠也顯著降低(22.5 ± 1.3分 鐘對39.2 ±3.4分鐘，n = 6)，證實GPCR 39敲除小鼠中固體食物的 胃排空加速(圖2B)。這些結果是以3天間隔在每組6只小鼠中進行 的3次連續(xù)試驗的平均值。
胃分泌
在WT和GPR39-卜小鼠之間沒有觀察到小鼠體重的顯著差異(分 別為30.4±6.6 g對26.9±4.0 g)。測量了兩個組之間的胃重量趨勢
(WT: 978土262mg對GPR39 -/-1395 士343mg; P = 0.0547)。
與野生型小鼠相比，GPR39 -/-小鼠中的胃分泌物(jjL)顯著增加 (分別為638 ±336|ul對225士170pl; P = 0.0242)。 GPR39 -/-中水pH 和胃分泌物溶液pH之間的pH下降顯著小于WT (分別為0.9 ± 0.2對 1.1 ±0.2; P = 0.0374)。這些數(shù)據(jù)表明，GPR39受體的缺失誘發(fā)胃分 泌物顯著增加，但這種增加不是緣于酸分泌的增加。
糞粒推進力
結果表明，在實驗開始時結腸內(nèi)的糞粒分布在GPR39-/-和WT 之間沒有差異(根據(jù)雙邊符號檢驗p = 0.5637;藍色條，在黑白顯示時 呈黑色)(圖3)。 WT和GPR39 -/-均排出最接近直腸的糞粒(總長度的 0-30%);大部分位于遠側的糞粒(長度的30-75%)由GPR39 —^動物的 結腸排出，但沒有由WT動物排出(p-0.0253;黃色條，在黑白顯示 時呈白色)(圖3)。這些結果表明，GPR39-動物結腸的糞粒排出更 有效。
小鼠4于為試驗
因為觀察到的胃排空差異可能被GPR39敲除小鼠的一般活動或 情緒狀態(tài)的差異所混淆，所以我們進行現(xiàn)有的神經(jīng)學檢查 一開放場 域試驗(OFT)和零迷宮試驗(O-迷宮)。
開放場域試驗
在雌性GPR39敲除小鼠和野生型同窩出生小鼠之間沒有觀察到 運動能力差異。因此，觀察到的胃排空差異不是緣于雌性GPR39敲 除小鼠一般活動增加的假象。沒有觀察到移動持續(xù)時間、移動次數(shù)、 總移動距離、總移動時間、在中心移動的距離、在邊緣移動的距離、 在中心移動的相對距離、在中心耗費的時間、在邊緣^^費的時間、 在中心耗費的相對時間、在中心移動的距離對在邊緣移動的距離、
在中心耗費的時間對在邊緣耗費的時間、速度、直立次數(shù)和直立持
續(xù)時間的顯著差異。在對比雄性GPR39敲除小鼠和野生型同窩出生 小鼠時，沒有觀察到可混淆觀察到的胃排空差異的一般活動增加。 即使有的話，也是在雄性GPR39敲除小鼠中觀察到小但顯著的一般 活動下降，以雄性GPR39敲除小鼠與野生型對照相比總移動時間和 總移動距離顯著下降為證(ANOVA, p<0.001)。另外，與野生型同 窩出生小鼠相比，GPR39敲除小鼠中的中心移動距離、中心移動相 對距離以及中心對邊緣距離顯著降低。后述差異可能緣于運動能力 下降，或者，可反映出致焦慮表型。因此，進行O-迷宮試驗。
零迷宮試驗
在O-迷宮中，GPR39敲除小鼠既沒有表現(xiàn)出致焦慮表型，也沒 有表現(xiàn)出抗焦慮表型。在封閉臂對開放臂中耗費的相對時間以及在 封閉臂對開放臂中的相對移動距離在GPR39敲除小鼠和野生型對照 小鼠中是相似的。因此，GPR39敲除小鼠中胃排空速率增加不是緣 于針對焦慮誘發(fā)條件的反應改變。
呼吸率
在兩個記錄日當中，沒有觀察到雄性GPR39敲除小鼠和野生型 同窩出生小鼠之間的呼吸率差異。因此，觀察到的胃排空差異不是 緣于雌性GPR39敲除小鼠呼吸率的假象。野生型和GPR39敲除小鼠 的呼吸商都保持在1.0左右，V02連同產(chǎn)熱不隨任一個基因型而變。
血液分析
在隨意獲取標準銅料后剝奪食物12小時，然后收集6月齡雄性 和雌性GPR39-"小鼠對GPR39"同窩出生小鼠的血液化學數(shù)據(jù)。和 GPR39+"雄性(107.3 士".8)和雌性(83.5 ±24.2)同窩出生小鼠相比,雄 性(142.2 士29.0)和雌性(118.7 ± 16.2) GPR39一—小鼠的膽固醇水平(以 mg/dl為單位的平均值土SD)均顯著增力口(對于雄性和雌性分別為p<0.05和p<0.001)。和GPR39+"雄性(123.9士20.8)和雌性(71.4士12.0) 同窩出生小鼠相比，雄性(162.5 ± 14,7)和雌性(84.6 ± 7.2) GPR39 —小 鼠的甘油三酯水平(平均值士SD,單位為mg/dl)呈現(xiàn)出增加，但差異 沒有達到顯著程度。
食物攝取
在GPR39敲除小鼠中，在開始實驗之前自由獲取食物的小鼠(17 周，n = 6)中的累積食物攝取與野生型小鼠相比沒有顯著(P - 0.47)差 異。在較年長的小鼠中得到相同觀察結果(56周，n = 6, P-0.78)。 相反，在禁食小鼠(19小時)中，GPR39小鼠中的累積食物攝取顯著(P 〈O.OOOl)低于野生型小鼠。此效果在較年長小鼠(56周)中甚至更明 顯。實際上，在6小時后，和年齡匹配的野生型小鼠相比，年幼GPR39 小鼠的累積食物攝取降低0.62 g，年長GPR39小鼠的累積食物攝取 降低1.25 g。
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權利要求
1.一種鑒定調(diào)節(jié)胃腸動力和/或膽固醇代謝的化合物的方法，所述方法包括使用全部GPR39受體蛋白或部分GPR39受體蛋白。
2. 權利要求l的方法，其中所述GPR39受體蛋白選自SEQEDNO: 2、 SEQEDNO:4、具有前述SEQ ID的蛋白的剪接變體，以及與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的氨基酸序列。
3. 權利要求1的方法，其中部分GPR39受體蛋白由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的多肽的至少10個氨基酸的片段組成。
4. 一種用于鑒定調(diào)節(jié)胃腸動力和/或膽固醇代謝的化合物的方 法，所述方法包括(i) 使表達全部GPR39蛋白或部分GPR39蛋白的宿主細胞與所 述化合物接觸，和(ii) 檢測所述化合物與所述受體蛋白的結合。
5. —種用于鑒定調(diào)節(jié)胃腸動力和/或膽固醇代謝的化合物的方 法，所述方法包括(i) 使表達全部GPR39蛋白或部分GPR39蛋白的宿主細胞的膜 制備物與所述化合物接觸，和(ii) 檢測所述化合物與所述受體蛋白的結合。
6. 權利要求4或5的方法，其中所述化合物與GPR39受體蛋白 的結合利用與待測化合物直接或間接結合的標記來^r測，或者以包 含與標記竟爭物竟爭的測定來檢測。
7. 權利要求6的方法，其中所述標記竟爭物是標記的肥胖抑制素。
8. —種鑒定調(diào)節(jié)胃腸動力和膽固醇代謝的化合物的方法，所述 方法包括(i)使全部GPR39蛋白受體或部分GPR39蛋白受體與待測化合 物4妄觸，和(ii)測定GPR39受體蛋白的活性，其中在所述化合物存在下的 活性變化，說明所述化合物調(diào)節(jié)胃腸動力的能力。
9. 權利要求8的方法，其中在步驟i)中，所述化合物與表ii^又 利要求2或3所限定的全部GPR39蛋白或部分GPR39蛋白的宿主細 胞接觸。
10. 權利要求8或9的方法，其中用對胞內(nèi)信使的調(diào)節(jié)來測定所 述GPR39受體蛋白的活性。
11. 權利要求10的方法，其中所述胞內(nèi)笫二信使是cAMP、鉤 或報道基因產(chǎn)物。
12. 分離的核酸序列在權利要求1-11中任一項的方法中的用 途，所述核酸序列選自(i) 編碼全部或部分的SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4多肽的核 酸序列，(ii) 由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3組成的核酸序列；或(iii) 與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的核酸序列具有至少80% 序列同一性的核酸序列。
13. 包含權利要求12限定的核酸序列的載體在權利要求1、 4、 5、 8或9中任一項的方法中的用途。
14. 包含權利要求12限定的核酸序列或包含權利要求13限定的 載體的宿主細胞在權利要求1、 4、 5、 8或9中任一項的方法中的用 途。
15. —種藥物組合物，其用于治療人或動物的胃排空延遲和結腸 蠕動延遲并且包含GPR39受體拮抗劑。
16. —種藥物組合物，其用于治療人或動物的胃排空增加和結腸 蠕動增加并且包含GPR39受體激動劑。
17. GPR39拮抗劑在制備用于治療與胃排空延遲和結腸蠕動延遲 相關的疾病的藥物中的用途。
18. GPR39激動劑在制備用于治療與胃排空增加和結腸蠕動增加 相關的疾病的藥物中的用途。
19. 一種藥物組合物，其用于治療人或動物的膽固醇水平升高并 且包含GPR39受體激動劑。
20. GPR39激動劑在制備用于治療與膽固醇水平升高相關的疾病 的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)受體GPR39的功能特征，并涉及改變或調(diào)節(jié)GPR39蛋白活性的化合物。具體地說，本發(fā)明涉及GPR39激動劑或拮抗劑的篩選方法，以便鑒定能夠調(diào)節(jié)胃腸動力和/或膽固醇代謝的化合物，并涉及這些化合物的治療用途。本發(fā)明還涉及攜帶GPR39基因突變的轉(zhuǎn)基因動物。
文檔編號G01N33/68GK101107529SQ200580047118
公開日2008年1月16日 申請日期2005年11月30日 優(yōu)先權日2004年12月1日
發(fā)明者B·C·J·-C·莫羅克斯, B·考利, D·W·E·莫查爾斯, I·I·T·德波特爾, T·L·H·皮特斯 申請人:詹森藥業(yè)有限公司