專利名稱：微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種藥物分析技術(shù)，特別是用于豆制品黃水下腳料中提取的經(jīng)酶法水解的微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法。
背景技術(shù)：
豆制品黃水下腳料中提取的經(jīng)酶法水解的大豆異黃酮，其含大豆異黃酮苷元有效成分高，但色澤深黃、氣味濃烈，有強(qiáng)烈的異臭味，嚴(yán)重影響了其在保健食品和食品中作為功能型成分添加劑的應(yīng)用。目前對大豆及其產(chǎn)品的國家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于氣味鑒定項(xiàng)目均采用感官鑒定，如大豆的國標(biāo)中，“色澤、氣味、口味”項(xiàng)按GB 5492-85相關(guān)解釋執(zhí)行，其中氣味項(xiàng)為“1、取少量試樣，嘴對試樣呵氣，立即嗅辨氣味是否正常；2、將試樣放入密閉器皿內(nèi)，在60-70℃的溫水杯中保溫?cái)?shù)分鐘，取出，開蓋嗅辨氣味是否正常?！比藶橐蛩貥O大。文獻(xiàn)對大豆及其產(chǎn)品報(bào)道的異味研究多為對豆?jié){等副食品進(jìn)行，尚未見對大豆異黃酮類產(chǎn)品的類似報(bào)道。在大量文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，對頻繁提及的揮發(fā)性異味物質(zhì)如正己醛、苯甲醛和正己醇等，由豆制品廢水中提取得到的大豆異黃酮原料及其微膠囊制品進(jìn)行了色譜保留時(shí)間比對法定性，結(jié)果均否定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是把豆制品黃水下腳料中提取的經(jīng)酶法水解的大豆異黃酮，采用現(xiàn)代技術(shù)，對包接前后異味物質(zhì)進(jìn)行定性定量方法研究及建立，并以此法檢測比較包接工藝的有效性，以評價(jià)工藝以及控制產(chǎn)品質(zhì)量。對微囊化制備工藝進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，使經(jīng)微囊化制備后的產(chǎn)品有效地掩蓋異臭，除制成膠囊劑外，還可廣泛應(yīng)用于片劑、顆粒劑及作為功能性添加劑，在食品、飲料、營養(yǎng)保健食品等方面起到很好的作用，將大大提高應(yīng)用范圍和銷量。
科學(xué)評價(jià)包接的效果及嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，必須建立有代表性的異味物質(zhì)定量質(zhì)量控制方法，首先找到定性指標(biāo)性成分，經(jīng)氣相色譜頂空法對原料中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)于12min至17min之間3個(gè)峰適合作指標(biāo)性成分。見圖1。
進(jìn)一步查找合適的指標(biāo)性物質(zhì)，對原料進(jìn)行了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，確定12min至17min之間的15min峰為戊酸，16min峰為己酸，其他揮發(fā)性成分尚有乙酸乙酯、1-辛烯-3-甲醇、苯甲醛、2，4-二氯-1-甲基-酚、庚酸等。根據(jù)戊酸和己酸兩者的豐度，選擇己酸作指標(biāo)性成分，固體樣品頂空進(jìn)樣難以定量，重現(xiàn)性差，進(jìn)樣方式改為用乙醚作溶劑，將樣品中己酸成分充分溶解后，直接進(jìn)樣，并進(jìn)行系列研究和方法驗(yàn)證。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是解決微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定。從豆制品廢水中提取的經(jīng)酶法水解的大豆異黃酮，對產(chǎn)品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了氣相色譜分離，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，選擇己酸作為異味物質(zhì)的指標(biāo)性成分加以含量測定，對具有濃烈異味大豆異黃酮分子包接的工藝研究進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。
本發(fā)明測定方法包括如下步驟1)測定樣品微膠囊大豆異黃酮及其原料2)材料A.對照品己酸B.氣相色譜儀C.色譜柱固定相為氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷的毛細(xì)管柱3)測定方法A.對照品溶液的制備取對照品用乙醚配制成每1mL含5-50ug的溶液。
B.供試品溶液的制備(1)樣品供試品溶液的制備取樣品0.8～1.2g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，定量配制成每1mL含供試品80～120mg的溶液。
(2)原料供試品溶液的制備取原料0.8～1.2g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，定量配制成每1mL含供試品80～120mg的溶液。
C.柱溫采用程序升溫，初始溫度30-35℃，保持2-5min，以3-6℃·min-1升至55-65℃，以8-12℃·min-1升至95-105℃，以15-20℃·min-1升至220-250℃。
D.氫火焰離子化檢測器(FID)檢測器溫度220-260℃E.進(jìn)樣器溫度220-250℃F.理論塔板數(shù)按己酸峰計(jì)算≥400004).方法考察A.專屬性試驗(yàn)溶劑對己酸測定無影響；B.標(biāo)準(zhǔn)曲線及線形關(guān)系己酸濃度為1～50ug·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，研究結(jié)果1.0～50.0ug·mL-1，A＝-0.46+2197.28C r＝0.9999；C.重復(fù)性試驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤3％，研究結(jié)果RSD為1.6％，n＝6；D.回收率試驗(yàn)回收率為80％-120％，研究結(jié)果本法回收率為99.2％，RSD為1.6％；E.靈敏度試驗(yàn)最低檢測濃度≤1ug·mL-1，研究結(jié)果0.14ug·mL-1，方法靈敏。
為控制原料和體現(xiàn)微膠囊大豆異黃酮[制法]的合理性，本發(fā)明將氣相色譜法測定己酸含量作為微膠囊大豆異黃酮的[檢查]項(xiàng)目之一，并對其方法學(xué)進(jìn)行考察，方法如下一. 試驗(yàn)材料(一)己酸對照品含量大于98％(二)氣相色譜儀Agilent 6890N氣相色譜儀；Agilent7683自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent氣相色譜工作站。
(三)色譜柱Agilent DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.25μm)。
(四)溶劑乙醚為分析純二. 試驗(yàn)方法(一)對照品溶液制備1.對照品貯備液 精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
2.對照品溶液 精密量取對照品貯備液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為25ug·mL-1溶液，搖勻，即得。
(二)供試品溶液的制備1.樣品供試品溶液的制備取樣品約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
2.原料供試品溶液的制備取原料約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
(三) 色譜條件的選擇柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進(jìn)樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮?dú)?，流?.5mL·min-1，分流比5∶1。進(jìn)樣1μL。理論板數(shù)按己酸峰計(jì)算為400000。
三.方法學(xué)考察試驗(yàn)(一)專屬性試驗(yàn)取空白溶劑1μL，依法操作。由圖中可見乙醚在待測溶劑出峰處不干擾檢測。見附圖2。
(二)靈敏度試驗(yàn)以信噪比為3計(jì)，本法中己酸的最低檢測濃度為0.14ug·mL-1，方法靈敏。見附圖3。
(三)標(biāo)準(zhǔn)曲線及線形關(guān)系配置5種濃度的對照品溶液精密量取對照品貯備液各1.0mL分置于10、20、50、100mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度分別為50.0，25.0，10.0，5.00ug·mL-1；精密量取10.0ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度為1.0ug·mL-1，依次進(jìn)樣1uL，按上述色譜條件測定峰面積。以己酸峰面積A對己酸濃度C(ug·mL-1)作一回歸處理，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)A＝-0.4565+2197.28Cr＝0.9999n＝5結(jié)果表明己酸濃度為1.0～50.0ug·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見附圖4-附圖8。
(四)重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)的樣品6份，按樣品含量測定項(xiàng)方法連續(xù)測定，計(jì)算樣品中己酸的平均含量為194ug·g-1，RSD為1.6％。見附圖9-附圖14。
(五)回收率試驗(yàn)取已知含量的同一批號(hào)樣品約0.5g，精密稱定，加入對照品貯備液0.25ml，加入乙醚依法處理，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，測定，6份測得的平均回收率為99.2％，RSD為1.6％。
四.樣品中己酸含量測定取供試品溶液，進(jìn)樣1μl，測定。按所擬定的方法測定了3批樣品，結(jié)果分別為194、198、201ug·g-1。
產(chǎn)品含己酸含量限度不得大于250ug·g-1。
原料的己酸含量亦作了測定，結(jié)果為5472ug·g-1。
以己酸作為考察指標(biāo)，微膠囊的遮蔽率高于95％，進(jìn)一步說明了工藝的有效性。


圖1原料頂空進(jìn)樣GC2空白溶劑圖譜圖3靈敏度試驗(yàn)圖譜圖4線性與回歸圖譜A分析結(jié)果表

圖5線性與回歸圖譜B分析結(jié)果表

圖6線性與回歸圖譜C分析結(jié)果表

圖7線性與回歸圖D分析結(jié)果表

圖8線性與回歸圖譜E分析結(jié)果表

圖9重復(fù)性試驗(yàn)A分析結(jié)果表

圖10重復(fù)性試驗(yàn)B分析結(jié)果表

圖11重復(fù)性試驗(yàn)C分析結(jié)果表

圖12重復(fù)性試驗(yàn)D分析結(jié)果表

圖13重復(fù)性試驗(yàn)E分析結(jié)果表

圖14重復(fù)性試驗(yàn)F分析結(jié)果表

微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法，對微囊化制備工藝進(jìn)行了有效的質(zhì)量控制，經(jīng)微囊化制備后的產(chǎn)品有效地掩蓋了異臭，除制成膠囊劑外，還可廣泛應(yīng)用在片劑、顆粒劑及作為功能性添加劑，在食品、飲料、營養(yǎng)保健品等方面起到很好的作用，大大提高了應(yīng)用范圍和銷量，具有較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。該指標(biāo)的建立，將有利于大豆異黃酮制劑的研究、生產(chǎn)、使用全過程的質(zhì)量控制，包括原料投料、中間體及最終的成品，因此具有深遠(yuǎn)的實(shí)際意義。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線形關(guān)系毛細(xì)管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進(jìn)樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮?dú)?，流?.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數(shù)按己酸峰計(jì)算應(yīng)不低于40000。
對照品貯備液制備 精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
配置5種濃度的對照品溶液精密量取對照品貯備液各1.0mL分置于10、20、50、100mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度分別為50.0，25.0，10.0，5.00ug·mL-1；精密量取10.0 ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度為1.0ug·mL-1，依次進(jìn)樣1uL，按上述色譜條件測定峰面積。以己酸峰面積A對己酸濃度C(ug·mL-1)作一回歸處理，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)A＝-0.4565+2197.28Cr＝0.9999n＝5結(jié)果表明己酸濃度為1.0～50.0ug·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
實(shí)施例2專屬性試驗(yàn)毛細(xì)管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進(jìn)樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮?dú)?，流?.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數(shù)按己酸峰計(jì)算應(yīng)不低于40000。
供試品溶液制備取微膠囊大豆異黃酮樣品約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
測定法取乙醚溶劑和供試品溶液分別進(jìn)樣1μL，注入氣相色譜儀，測定比較，乙醚在己酸出峰處不干擾檢測。
實(shí)施例3靈敏度試驗(yàn)毛細(xì)管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進(jìn)樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮?dú)?，流?.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數(shù)按己酸峰計(jì)算應(yīng)不低于40000。
對照品貯備液制備過且過精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
對照品溶液制備精密量取對照品貯備液各1.0mL分置于50mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度分別為10.0ug·mL-1；精密量取10.0ug·mL-1的己酸溶液1.0mL置10mL量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻，濃度為1.0ug·mL-1，進(jìn)樣1uL，按上述色譜條件測定，以信噪比為3計(jì)，算得己酸的最低檢測濃度為0.14ug·mL-1，方法靈敏。
實(shí)施例4微膠囊大豆異黃酮原料中己酸含量的測定毛細(xì)管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進(jìn)樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮?dú)?，流?.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數(shù)按己酸峰計(jì)算應(yīng)不低于40000。
對照品貯備液制備精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
對照品溶液制備取對照品貯備液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為25ug·mL-1溶液，搖勻，即得。
供試品溶液制備取微膠囊大豆異黃酮原料約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
測定法對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣1μL，注入氣相色譜儀，測定，即得。
實(shí)施例5微膠囊大豆異黃酮中己酸含量的測定毛細(xì)管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進(jìn)樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮?dú)?，流?.5mL·min-1，分流比5∶1。理論板數(shù)按己酸峰計(jì)算應(yīng)不低于40000。
對照品貯備液制備精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
對照品溶液制備取對照品貯備液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為25ug·mL-1溶液，搖勻，即得。
供試品溶液制備取微膠囊大豆異黃酮樣品約1.0g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。
測定法對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣1μL，注入氣相色譜儀，測定，即得。
實(shí)施例6回收率試驗(yàn)毛細(xì)管柱DB-1701(14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷)；柱溫程序升溫，初始溫度32℃，保持3min，以4℃·min-1升至60℃，以10℃·min-1升至100℃，以18℃·min-1升至230℃。進(jìn)樣器溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣氮?dú)?，流?.5 mL·min-1，分流比5∶1。理論板數(shù)按己酸峰計(jì)算應(yīng)不低于40000。
對照品貯備液制備精密量取己酸對照溶劑27μL(約25mg)，置50mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為500ug·mL-1的溶液，搖勻，即得。
對照品溶液制備取對照品貯備液1.0mL置20mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，配制成濃度約為25ug·mL-1溶液，搖勻，即得。
供試品溶液制備取已知含量的同一批號(hào)樣品約0.5g，精密稱定，加入對照品貯備液0.25ml，加入乙醚依法處理，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，即得。共制備6份。
測定法對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣1μL，注入氣相色譜儀，測定，計(jì)算即得。
權(quán)利要求
1.一種微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法，其特征在于從豆制品廢水中提取的經(jīng)酶法水解的大豆異黃酮，對產(chǎn)品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行氣相色譜分離，用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，選擇己酸作為異味物質(zhì)的指標(biāo)性成分加以含量測定，對具有濃烈異味大豆異黃酮分子包接的工藝研究進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)測定樣品微膠囊大豆異黃酮及其原料2)材料A.對照品己酸B.氣相色譜儀C.色譜柱固定相為氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷的毛細(xì)管柱3)測定方法A.對照品溶液的制備取對照品用乙醚配制成每1mL含5-50ug的溶液。B.供試品溶液的制備(1)樣品供試品溶液的制備取樣品0.8～1.2g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，定量配制成每1mL含供試品80～120mg的溶液。(2)原料供試品溶液的制備取原料0.8～1.2g，精密稱定，置10mL量瓶中，加入乙醚，密閉瓶蓋，超聲處理2min，并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取1mL置25mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，定量配制成每1mL含供試品80～120mg的溶液。C.柱溫采用程序升溫，初始溫度30-35℃，保持2-5min，以3-6℃·min-1升至55-65℃，以8-12℃·min-1升至95-105℃，以15-20℃·min-1升至220-250℃。D.氫火焰離子化檢測器(FID)檢測器溫度220-260℃E.進(jìn)樣器溫度220-250℃F.理論塔板數(shù)按己酸峰計(jì)算≥400004).方法考察A.專屬性試驗(yàn)溶劑對己酸測定無影響；B.標(biāo)準(zhǔn)曲線及線形關(guān)系己酸濃度為1～50ug·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，研究結(jié)果1.0～50.0ug·mL-1，A＝-0.46+2197.28 C r＝0.9999；C.重復(fù)性試驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤3％，研究結(jié)果RSD為1.6％，n＝6；D.回收率試驗(yàn)回收率為80％-120％，研究結(jié)果本法回收率為99.2％，RSD為1.6％；E.靈敏度試驗(yàn)最低檢測濃度≤1ug·mL-1，研究結(jié)果0.14ug·mL-1，方法靈敏。
全文摘要
本發(fā)明是一種藥物分析技術(shù)，特別是用于微膠囊大豆異黃酮及其原料中己酸含量的測定方法。本發(fā)明從豆制品廢水中提取的經(jīng)酶法水解的大豆異黃酮，對產(chǎn)品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了氣相色譜分離，并采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，選擇了己酸作為異味物質(zhì)的指標(biāo)性成分加以含量測定，經(jīng)對具有濃烈異味大豆異黃酮微囊化制備工藝進(jìn)行了有效的質(zhì)量控制，而微囊化制備后的產(chǎn)品有效地掩蓋了異臭，除制成膠囊劑外，還可廣泛應(yīng)用在片劑、顆粒劑及作為功能性添加劑，在食品、飲料、營養(yǎng)保健品等方面起到很好的作用，大大提高了應(yīng)用范圍和銷量，具有較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)G01N30/54GK1928546SQ20061005308
公開日2007年3月14日 申請日期2006年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月23日
發(fā)明者姜麗霞, 徐世芳, 陳愛瑛 申請人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院