專利名稱：食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)關(guān)于致病性弧菌的檢測方法還是傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測方法，尚不夠完善，每種檢測方法僅能檢測一種致病性弧菌，而國外的傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以單一或少數(shù)目標(biāo)菌為目的設(shè)計的程序。因此，幾乎每檢測一種致病性弧菌都需配制不同的培養(yǎng)基和試劑，耗時又耗力。在分子生物學(xué)檢測方法方面，F(xiàn)DA2004標(biāo)準(zhǔn)仍是以檢測一種致病性弧菌為目的設(shè)計PCR程序，檢測不同的弧菌需要不同的反應(yīng)條件。國內(nèi)的檢測人員設(shè)計PCR檢測方法時也是以毒力基因為待擴增序列，而且關(guān)注的大都是O1型和O139型霍亂弧菌與副溶血弧菌，PCR方法檢測創(chuàng)傷弧菌的報道只有2000年有過1例，擬態(tài)弧菌、至今仍未見到過。
除了常見的霍亂弧菌和副溶血弧菌外，許多國家已開始關(guān)注其它致病性弧菌在食物中的存在。目前，由于在水產(chǎn)品檢測中經(jīng)常是一份樣品同時檢測幾種致病性弧菌，因此，有必要研究一種方法，可同時檢測多個致病性弧菌。這樣，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測速度，減少工作量和檢測成本，以適應(yīng)加入WTO后的新的形勢需求，與國際方法接軌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其優(yōu)點在于可同時檢測以上三種致病性弧菌，在不影響檢出率的條件下加快檢測速度，減少工作量和檢測成本。
本發(fā)明所提供的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于其檢測步驟為待檢測的樣品經(jīng)二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，最后用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，最后經(jīng)過譜圖分析即可得出檢測結(jié)果。
本發(fā)明所提供的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，采用霍亂弧菌的膠原酶基因(vcc，AE004243)、擬態(tài)弧菌的溶血素基因(vmh，VMU68271)和副溶血弧菌的不耐熱溶血毒素基因(tlh)為一組檢測霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌和副溶血弧菌(三重PCR)，檢測出霍亂弧菌后再以vcc、霍亂腸毒素基因(ctx，AF516349)為一組確定霍亂弧菌是否具有霍亂腸毒素基因(V.c二重PCR)。其優(yōu)點在于可同時檢測以上三種致病性弧菌，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測速度，減少工作量和檢測成本。


圖1為本發(fā)明的流程圖。
圖2為本發(fā)明的引物序列表圖。
圖3為本發(fā)明的V.c、V.m和V.p三重PCR檢測結(jié)果示意圖。
圖4為本發(fā)明的V.c.的二重PCR檢測結(jié)果示意圖。
圖5為本發(fā)明兩份實施例的PCR檢測結(jié)果圖。
其中，圖3中，1從上到下三個條帶依次為副溶血弧菌產(chǎn)生的450bp的條帶、擬態(tài)弧菌產(chǎn)生的243bp的條帶和霍亂弧菌產(chǎn)生的155bp的條帶；2霍亂弧菌產(chǎn)生的155bp的條帶；3擬態(tài)弧菌產(chǎn)生的243bp的條帶；4副溶血弧菌產(chǎn)生的450bp的條帶；5陰性對照；6Marker(100bp-1000bp)。
圖4中，1非O1/非O139群霍亂弧菌產(chǎn)生的155bp的條帶；2從上到下依次為O1/O139群霍亂弧菌產(chǎn)生的708bp的條帶和155bp的條帶；3溶藻弧菌沒有產(chǎn)生條帶；4陰性對照；5Marker(100bp-1000bp)。
圖5中，1第一份甲魚蛋，2第二份甲魚蛋，3第三份甲魚蛋，4第四份甲魚蛋，5第一份墨魚，6第二份墨魚，7第三份墨魚，8霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌和副溶血弧菌，9陰性對照，10100bp Marker。
具體實施例方式
本發(fā)明所提供的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于其檢測步驟為待檢測的樣品經(jīng)二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，最后經(jīng)過譜圖分析即可得出檢測結(jié)果。
所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步驟為在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3％的NaCl堿性蛋白胨水的滅菌容器內(nèi)，在37℃±3℃條件下培養(yǎng)4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步驟為吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內(nèi)，在37℃±3℃條件下培養(yǎng)4h～15h。
所述的水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為取培養(yǎng)的菌液加入離心管中，以13000rpm離心1min，棄上清液，然后加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻后，96-100℃水浴10min，12000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20℃環(huán)境下儲存?zhèn)溆谩?br> 所述的PCR反應(yīng)為先做三重PCR反應(yīng)，檢出霍亂弧菌后再做V.c二重PCR反應(yīng)。其中，三重PCR反應(yīng)反應(yīng)體系為H2O12.3μl，Buffer2.6μl，dNTP0.5μl，引物Pn(0.4*6)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，總體積為20μl，所述的V.c二重PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系為H2O12.5μl，Buffer2.6μl，dNTP0.5μl，Pvcc(0.4*2)μl，Pctx(0.7*2)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，總體積為20μl。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性1min，60℃退火1min，72℃復(fù)性1min循環(huán)35次，最后72℃延伸7min。
所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為PCR反應(yīng)結(jié)束后以98V電壓2.5％凝膠電泳90min。
所述的染色為在溴化乙錠溶液中染色20min。
所述的譜圖分析包括陽性對照和陰性對照，對于譜圖中是否有相應(yīng)特征位置條帶的出現(xiàn)，即可判別被檢測對象中是否有霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的存在。
以下結(jié)合具體實施例子說明實施例一墨魚的檢測1.無菌操作，取25g面包蝦樣品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌容器內(nèi)，37℃±1℃條件下培養(yǎng)4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內(nèi)，37℃±1℃條件下培養(yǎng)4h～15h。
3.移液槍吸取1.5ml培養(yǎng)的菌液，加入1.5ml離心管中13000rpm離心1min，棄上清。
4.加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻，100℃水浴10min。
5.12000rpm離心5min，取上清作為DNA模板，-20℃?zhèn)溆谩?br> 6.加樣，做PCR7.取10μl PCR反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析譜圖實施例二甲魚蛋的檢測1.無菌操作，取25g文蛤樣品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌容器內(nèi)，37℃±1℃條件下培養(yǎng)4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內(nèi)，37℃±1℃條件下培養(yǎng)4h～15h。
3.移液槍吸取1.5ml培養(yǎng)的菌液，加入1.5ml離心管中13000rpm離心1min，棄上清。
4.加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻，100℃水浴10min。
5.12000rpm離心5min，取上清作為DNA模板，-20℃?zhèn)溆谩?br> 6.加樣，做PCR7.取10μl PCR反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析譜圖針對上述兩個實施例的譜圖分析根據(jù)圖5可見，在四份甲魚蛋中，只有第三份產(chǎn)生了155bp的特征條帶，說明第三份含霍亂弧菌，三份墨魚全部產(chǎn)生了450bp的特征條帶，說明三份墨魚中全部含有副溶血弧菌。
權(quán)利要求
1.一種食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于其檢測步驟為待檢測的樣品經(jīng)二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，最后經(jīng)過譜圖分析即可得出檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步驟為在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3％的NaCl堿性蛋白胨水的滅菌容器內(nèi)，在37℃±3℃條件下培養(yǎng)4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步驟為吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內(nèi)，在37℃±3℃條件下培養(yǎng)4h～15h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為取培養(yǎng)的菌液加入離心管中，以13000rpm離心1min，棄上清液，然后加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻后，96-100℃水浴10min，12000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20℃環(huán)境下儲存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)為先做三重PCR反應(yīng)，檢出霍亂弧菌后再做V.c二重PCR反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的三重PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系為H2O12.3μl，Buffer2.6μl，dNTP0.5μl，引物Pn(0.4*6)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，總體積為20μl，所述的V.c二重PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系為H2O12.5μl，Buffer2.6μl，dNTP0.5μl，Pvcc(0.4*2)μl，Pctx(0.7*2)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，總體積為20μl。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性1min，60℃退火1min，72℃復(fù)性1min循環(huán)35次，最后72℃延伸7min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為PCR反應(yīng)結(jié)束后以98V電壓2.5％凝膠電泳90min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的染色為在溴化乙錠溶液中染色20min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的譜圖分析包括陽性對照和陰性對照，對于譜圖中是否有相應(yīng)特征位置條帶的出現(xiàn)，即可判別被檢測對象中是否有霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的存在。
全文摘要
一種食品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的PCR檢測方法，其特征在于其檢測步驟為待檢測的樣品經(jīng)二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，最后用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，最后經(jīng)過譜圖分析即可得出檢測結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點在于可同時檢測食品中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測速度，減少工作量和檢測成本。
文檔編號G01N21/84GK1967234SQ20061006856
公開日2007年5月23日 申請日期2006年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月26日
發(fā)明者黃曉蓉, 鄭晶, 陳彬, 呂海滄 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心