專利名稱：檢測自身免疫疾病相關(guān)抗體譜的微陣列－酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗可提取性核抗原(ENA)抗體譜微陣列(Array)-酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒，特別是用于檢測選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，混合性結(jié)締組織病(MCTD)、干燥綜合癥(SS)、系統(tǒng)性硬皮病(PSS)、多發(fā)性肌炎或皮肌炎(PM/DM)、和類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的系統(tǒng)性自身免疫疾病之特征性抗體的ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性自身免疫性疾病指風濕病中屬于彌漫性結(jié)締組織的一類疾病，主要包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、混合性結(jié)締組織病(MCTD)、干燥綜合癥(SS)、系統(tǒng)性硬皮病(PSS)、多發(fā)性肌炎或皮肌炎(PM/DM)和類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等。
根據(jù)目前病理學和臨床醫(yī)學的發(fā)展水平，上述系統(tǒng)性自身免疫性疾病普遍存在著發(fā)病原因不明、病情嚴重、診斷困難等共同特征，迫切需要提供有效的診斷方法，以便及時治療。
已知自身抗體是系統(tǒng)性自身免疫性疾病的重要標志。每種系統(tǒng)性自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗體譜。病人血液中存在高效價自身抗體是系統(tǒng)性自身免疫性疾病的特點之一，也是臨床確診系統(tǒng)性自身免疫性疾病的重要標志之一。自身抗體檢測在診斷系統(tǒng)性自身免疫性疾病、判斷疾病的活動程度、觀察治療效果、指導(dǎo)臨床用藥及預(yù)后評估等具有重要的臨床意義。隨著對自身抗體的了解越來越深入，臨床應(yīng)用越來越廣泛，免疫學技術(shù)進一步提高，自身抗體檢測已是臨床免疫檢測的一項重要的實驗室指標。
目前臨床上常用的對獲自患者的樣品進行自身抗體的檢測的方法主要包括自身抗體檢測方法有免疫雙擴散法(DoubleImmunodifusion Assay，DID)、間接免疫熒光法(IndirectImmunoFluorescence Assay，IIF)、免疫印跡法(Western Blot，WB)和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay，ELISA)等。
免疫雙擴散法(DID)是經(jīng)典的實驗方法。其不用很多的特殊儀器，價格低廉，特異性高。但其操作費時費力，需要用肉眼來觀察沉淀環(huán)，結(jié)果靈敏度低，判斷不客觀，對實驗室技術(shù)人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗要求較高，不同操作人員甚至是同一操作人員不同次操作結(jié)果的一致性較差。
間接免疫熒光分析法(IIF)是檢測自身抗體的常用技術(shù)。其實驗基質(zhì)為HEp-2細胞或不同靈長類肝臟組織冰凍切片，含有完整的抗原譜。許多組織經(jīng)IIF著染可提示自身抗體的存在，但是不能對自身抗體的種類進行具體客觀的評價，因此其特異性的證實需要其它技術(shù)如免疫印跡法、ELISA等進行二級確認試驗。并且對IIF著染的鑒定有一定的主觀性，因而對結(jié)果的解釋可能在不同工作日之間、不同觀察者之間、新老組織切片之間而有所不同，對實驗室技術(shù)人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗要求較高，同時對實驗室的專用設(shè)備熒光顯微鏡也有較高要求，各實驗室在這些要求上很難達到統(tǒng)一，并且它使得各實驗室之間的結(jié)果一致性較差。
免疫印跡法(WB)是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫生化技術(shù)，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性的優(yōu)點。但是在SDS-PAGE的過程中，許多抗原決定簇的構(gòu)象可能遭到破壞，不能與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)或者發(fā)生非特異結(jié)合，造成結(jié)果判斷錯誤。最近歐蒙(德國)醫(yī)學實驗診斷股份公司的一項研究發(fā)現(xiàn)僅可用天然的SSA檢測抗SSA抗體。另外患者的樣品中往往含有多種抗可提取性核抗原的抗體，能同時與ENA試劑反應(yīng)出現(xiàn)多條沉淀線，肉眼觀察結(jié)果不客觀。
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有成熟度高，靈敏度高、特異性較好，操作方法簡便快速、無放射性污染且檢測結(jié)果排除了人為的主觀判斷，以及應(yīng)用范圍廣等很多優(yōu)點，但一次試驗只能檢測單一指標，通量低，檢測成本較高，在自身免疫疾病的診斷應(yīng)用推廣方面存在著極大的局限性。
此外，免疫診斷蛋白芯片盡管能同時檢測多項指標，但由于它是把抗原包被在用于制備蛋白質(zhì)芯片的基底-玻片或膜上，并且玻片在點樣前要經(jīng)過醛基化或多聚賴氨酸等預(yù)處理，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，以及后續(xù)實驗的操作繁瑣，重復(fù)性差，市場推廣性不強。
為了克服上述檢測系統(tǒng)性自身免疫疾病的現(xiàn)有方法中的缺點，節(jié)省時間和人力和物力，本發(fā)明人開發(fā)了一種工藝簡單，定位準確，反應(yīng)快速，價格低廉，能進行多項蛋白檢測的ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，及其制備方法。
利用ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測系統(tǒng)性自身免疫性疾病，成功克服了現(xiàn)有檢測試劑盒操作繁瑣、檢測指標單一、檢測成本高等缺陷，具有廉價、簡單、快速、準確、多重檢測等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人所開發(fā)的ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒將現(xiàn)代微陣列技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相融合，在例如96孔酶標板的基底上利用全自動點樣儀有序固定多種蛋白質(zhì)，實現(xiàn)了對樣品中目的蛋白質(zhì)的檢測，可用于生物學、醫(yī)學及其相關(guān)領(lǐng)域中目的蛋白質(zhì)的鑒定和疾病標志性蛋白質(zhì)的鑒別。具體的，所述試劑盒基于芯片技術(shù)的核心原理，集成酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的高成熟度而成的新一代檢測技術(shù)體系。在保持了ELISA方法學的成熟、方便，敏感性和特異性都較為良好的基礎(chǔ)上，又具有芯片技術(shù)的高通量、低成本、高平行、微型化等特點因此，本發(fā)明的一方面涉及一種ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于包括1)同時固定有多種蛋白質(zhì)的基底，以及任選的，2)用于通過ELISA方法檢測待測樣品中是否存在能夠與固定在酶標板基底上的蛋白質(zhì)發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的物質(zhì)之反應(yīng)劑和檢測劑。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，所述用于固定蛋白質(zhì)的基底可以為選自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯材料的用于ELISA實驗的酶標板。事實上，所述基底可以為適用于ELISA反應(yīng)的任一材料，只要所選材料對于所要固定的蛋白質(zhì)是惰性的，不影響待固定的蛋白質(zhì)用于檢測樣品中相關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)。
在本發(fā)明的又一方面，涉及一種用于檢測選自包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、混合性結(jié)締組織病(MCTD)、干燥綜合癥(SS)、系統(tǒng)性硬皮病(PSS)、多發(fā)性肌炎或皮肌炎(PM/DM)、和類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的系統(tǒng)性自身免疫疾病的ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中包括1)同時固定有針對選自如下特征性抗體的之抗原的酶標板基底抗Smith抗體、抗RNP抗體(抗核糖核蛋白抗體)、抗SSA抗體(抗干燥綜合征抗原A抗體)、抗SSB抗體(抗干燥綜合征抗原B抗體)、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體和抗Rib-P抗體(抗核糖體P蛋白抗體)，以及任選的，2)用于通過ELISA方法檢測待測樣品中是否存在能夠與固定在酶標板基底上的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)之反應(yīng)劑和發(fā)光液。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述固定在基底，例如用于ELISA反應(yīng)的酶標板上的針對所述特征性抗體之抗原的種類為至少2n種，n為大于等于1的整數(shù)，例如n＝1，2，3，4，5或6。相應(yīng)的，固定于基底上的抗原種類可以為2種，3種，4種，5種，6種，7種，8種，9種，10種，11種，12種，13種，14種，15種，16種，32種或64等等。
采用本發(fā)明所述ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與傳統(tǒng)的ELISA試劑盒相比，具有如下優(yōu)勢后者在一次檢測中所測得指標數(shù)有限，樣本數(shù)量僅為一個；而前者在每個反應(yīng)孔中可以一次性完成多個指標的檢測，做到了多樣本多指標并行檢測，并且操作簡單，大大提高工作效率，節(jié)約成本。
不僅如此，采用本發(fā)明所述ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與現(xiàn)有的蛋白芯片相比，其優(yōu)勢在于后者把蛋白固定在玻璃片或者膜上，使得實驗操作要求高，過程繁瑣，人為因素產(chǎn)生的操作誤差大，而前者的實驗操作步驟與傳統(tǒng)的ELISA幾乎相同，因此更適合用于臨床檢測。
因此，本發(fā)明所述ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒是在傳統(tǒng)的ELISA的基礎(chǔ)上，成功地融和了ELISA技術(shù)和微陣列技術(shù)二者的優(yōu)點，形成的一種操作簡單，檢測快速、準確，具有多重分析能力的實驗技術(shù)。
具體的，本發(fā)明采用以下步驟制備所述ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，以及利用所述試劑盒，針對7種不同自身免疫疾病的特征性抗體加以檢測。
ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫方法是在傳統(tǒng)的96孔酶標板上固定特異性的抗原分子。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述試劑盒在基底，例如用于ELISA反應(yīng)的酶標板上固定有由如下抗原分子組成的用于同時檢測7種不同自身免疫疾病的抗原Sm、RNP、SSA、SSB、Scl-70、Jo-1和rRNP特異性抗原，和陽性對照人IgG。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗原的固定采用如下方法，1)將0.1-10ng特異性抗原的磷酸鹽緩沖液點樣于傳統(tǒng)的96孔可拆卸酶標板條孔內(nèi)，4℃包被16-24個小時；2)用含0.05-0.5％Tween20，1-5％BSA，5-10％的脫脂奶粉，5-10％的蔗糖之0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液或者Tris緩沖液，37℃封閉0.5-3小時；以及3)用含有0.05-0.5％Tween20，0.1-1％NaCl的0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液洗滌，晾干后，于2-8℃保存?zhèn)溆谩?br>

圖1為本發(fā)明所述ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測反應(yīng)的實驗原理。
圖2為本發(fā)明所述酶標板的點樣示意圖。
圖3為本發(fā)明所述酶標板的檢測結(jié)果。
下面，結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例1用于系統(tǒng)性自身免疫疾病檢測的ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中固定多種蛋白質(zhì)抗原的酶標板的制備為了檢測樣品中是否含有選自包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，混合性結(jié)締組織病(MCTD)、干燥綜合癥(SS)、系統(tǒng)性硬皮病(PSS)、多發(fā)性肌炎或皮肌炎(PM/DM)和類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的系統(tǒng)性自身免疫疾病的特征性抗體，制備固定有針對選自如下特征性抗體之抗原的酶標板抗Smith抗體、抗RNP抗體(抗核糖核蛋白抗體)、抗SSA抗體(抗干燥綜合征抗原A抗體)、抗SSB抗體(抗干燥綜合征抗原B抗體)、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體和抗Rib-P抗體(抗核糖體P蛋白抗體)。
1.抗原的制備所述針對特征性抗體抗Smith抗體，抗RNP抗體(抗核糖核蛋白抗體)，抗SSA抗體(抗干燥綜合征抗原A抗體)，抗SSB抗體(抗干燥綜合征抗原B抗體)，抗Scl-70抗體，抗Jo-1抗體和抗Rib-P抗體(抗核糖P蛋白抗體)的抗原均商購自Immunovision.Inc，(產(chǎn)品名稱和產(chǎn)品號分別為SCL-3000，3785；JO1-3000，3540；SSA-3000，4237；SSB-3000，3307；SMA-3000，4109；SRC-3000，4018；和PAG-3000，3776)。
采用購自Greiner公司的8孔板條[產(chǎn)品號04300143]，使用如下包被緩沖液(磷酸二氫鈉0.2965g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉4g，純化水加至1000ml)。發(fā)光液購買自Pierce公司[產(chǎn)品號37075]2.點樣將4-100nl的含有0.1-10ng的上述相關(guān)疾病特異性抗原的0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液用全自動點樣儀點樣于Greiner公司的8孔板條的孔內(nèi)，4℃包被16-24個小時。具體的，Array-ELISA點陣示意圖如圖2所示，其中用于點樣的陣列形式不局限于所表示的形式，可以任意組合。
3.封閉用50-200μl的含0.05-0.5％Tween20，1-5％BSA，5-10％的脫脂奶粉，5-10％的蔗糖的0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液或者Tris緩沖液(磷酸氫二鈉5.8g，磷酸二氫鈉0.593g，氯化鈉8.0g，Casein 2.5g，硫柳汞鈉0.5g，蔗糖(HCV\TP)50.0g，蔗糖(HIV\HBV)100.0g，山羊血清100ml，明膠10ml)，37℃封閉0.5-3小時，用含有經(jīng)20倍稀釋的濃縮洗液(氯化鉀4.0g，磷酸二氫鉀4.0g，磷酸氫二鈉58.0g，氯化鈉160.0g，硫柳汞鈉0.1g，Tween-20 50ml，加純化水至1000ml)洗滌。晾干后，于2-8℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2采用自身免疫疾病檢測的ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的測定1.加樣將用樣品稀釋液(磷酸氫二鈉2.9g，磷酸二氫鈉0.2965g，氯化鈉10g，Casein2.5g，氨基吡啉5g，小牛血清100ml，甘油75ml，Tween-20 5ml，曲拉通-1005ml，ProClin300 0.15ml，純化水加至1000ml)按照1∶50稀釋好的待測樣本50ul加入如上述實施例1所制備的酶標板的各個反應(yīng)孔中，放入孵育振蕩器，3檔37℃反應(yīng)60分鐘。
2.洗板樣本反應(yīng)結(jié)束后，把反應(yīng)板從振蕩器中拿出來，放入洗板機的相應(yīng)位置，調(diào)節(jié)“條數(shù)”按鍵至相應(yīng)條數(shù)，調(diào)節(jié)“次數(shù)”按鍵至5次，洗板機洗板時無浸泡，無振蕩，無間歇。洗板結(jié)束后，用吸水紙把板拍干。
3.加入酶標二抗向每孔加入1/20000 RP(商購自pierce公司)標記的兔抗人IgG的抗體(商購自北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司)50ul，放入孵育振蕩器，3檔37℃反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后洗板。
4.檢測每孔加入配制好的(A∶B＝1∶1)發(fā)光液(商購自pierce公司)30ul，室溫下30秒成像。拍攝時采用低溫CCD，在穩(wěn)定的低溫下放入相配套的掃描儀中，用焦距(mm)25；光圈1.4-16的Fujinon HF 25HA-1B鏡頭拍攝圖片，讀取數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖3所示實施例3ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)的比較采用上述實施例1-3所述的方法，對獲自北京市協(xié)和醫(yī)院的樣品進行檢測。與目前常用的檢測方法加以比較，結(jié)果如下。

權(quán)利要求
1.一種ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于包括1)同時固定有多種蛋白質(zhì)基底，以及任選的，2)用于通過ELISA方法檢測待測樣品中是否存在能夠與固定在酶標板基底上的蛋白質(zhì)發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的物質(zhì)之反應(yīng)劑和檢測劑。
2.權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述固定蛋白質(zhì)的基底為選自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯的ELISA酶標板。
3.權(quán)利要求1的試劑盒，其用于檢測選自包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，混合性結(jié)締組織病(MCTD)、干燥綜合癥(SS)、系統(tǒng)性硬皮病(PSS)、多發(fā)性肌炎或皮肌炎(PM/DM)和類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的系統(tǒng)性自身免疫疾病之特征性抗體的多種蛋白質(zhì)，其中所述多種蛋白質(zhì)為針對選自如下的抗體之抗原抗Smith抗體，抗RNP抗體(抗核糖核蛋白抗體)，抗SSA抗體(抗干燥綜合征抗原A抗體)，抗SSB抗體(抗干燥綜合征抗原B抗體)，抗Scl-70抗體，抗Jo-1抗體和抗Rib-P抗體(抗核糖體P蛋白抗體)。
4.權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述固定在基底上的針對所述特征性抗體之抗原的種類為至少2n種，n為大于等于1的整數(shù)。
5.一種在權(quán)利要求1所述ENA抗體譜微陣列-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中的基底上固定用于檢測特異性抗體的抗原的方法，包括將所述特異性抗原點樣于基底上，4℃包被16-24個小時；用含0.05-0.5％Tween20，1-5％BSA，5-10％的脫脂奶粉，5-10％的蔗糖之0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液或者Tris緩沖液，37℃封閉0.5-3小時；用含有0.05-0.5％Tween20，0.1-1％NaCl的0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液洗滌，晾干后，于2-8℃保存?zhèn)溆谩?br> 6.權(quán)利要求5的方法，其中所述固定蛋白質(zhì)的基底為選自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯的ELISA酶標板。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗可提取性核抗原(ENA)抗體譜微陣列(Array)－酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒，特別是用于檢測選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，混合性結(jié)締組織病(MCTD)、干燥綜合癥(SS)、系統(tǒng)性硬皮病(PSS)、多發(fā)性肌炎或皮肌炎(PM/DM)和類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的系統(tǒng)性自身免疫疾病之特征性抗體的ENA抗體譜微陣列－酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
文檔編號G01N33/544GK101063680SQ20061007801
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月29日
發(fā)明者汪建, 楊玲, 牟峰, 張偉, 陳久龍, 郝志波, 姜范波, 何靜云, 陳唯軍, 沈東艷, 許東光, 顧志鵬, 沈遠, 蘇慧玲, 李黎, 萬戈江, 方健秋, 文潔 申請人:北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司, 北京華大基因研究中心, 汪建, 楊玲, 牟峰