專利名稱：大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及環(huán)境檢測領(lǐng)域中的一種大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體及其制備方法與其在檢測大腸桿菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大腸桿菌是環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測和食品安全中一種重要的指示微生物。目前，世界各國及國際組織都將大腸菌群數(shù)作為重要的環(huán)境衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，并對其在水中的濃度提出了嚴(yán)格的限制。世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(第二版)中規(guī)定，所有飲用水中的大腸桿菌或耐熱大腸菌在任意100mL水樣中不得檢出；現(xiàn)行美國飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)國家一級飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定總大腸桿菌(包括糞型及艾氏大腸菌)為0mg/L；中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》中規(guī)定總大腸菌群及糞大腸菌群在任意100mL水樣中不得檢出。
目前，國際上公認(rèn)的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)檢測方法以多管發(fā)酵法和濾膜法為主。我國在水和食品衛(wèi)生檢驗標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的大腸菌群數(shù)的檢測方法也是多管發(fā)酵法和濾膜法。但是這兩種檢測方法都存在檢測周期長，操作繁瑣的缺點，因而難以實現(xiàn)對污染源的快速診斷。近年來，世界各國針對水環(huán)境和食品中大腸桿菌的快速檢測進行了大量的研究工作，其中基于免疫技術(shù)原理的ELISA檢測方法呈現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。
免疫檢測技術(shù)是利用抗原和抗體間的特異性反應(yīng)，通過檢測標(biāo)記在反應(yīng)物上的示蹤物，對抗原或抗體進行定性或定量測定的快速檢測技術(shù)。根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)的不同，目前用于檢測環(huán)境污染物的免疫檢測方法主要有酶免疫分析技術(shù)、熒光免疫測定技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫磁珠技術(shù)等。其中，酶免疫分析技術(shù)(Enzyme immunoassay，EIA)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用較為廣泛，該類技術(shù)中的酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)又是最常用的測定方法。該方法具有操作簡單，特異性強，迅速靈敏的優(yōu)點，在大腸桿菌的快速檢測中具有優(yōu)勢。
Vandekerchove等運用多克隆抗體ELISA方法檢測了致病性大腸桿菌(EPEC)，在單個檢測水平上(individual level)，該法試驗得到的敏感度及特異性分別為80.0％和98.4％，而在多個檢測水平上(rabbit flock level)的敏感度及特異性則降低為79.2％和85.2％(VANDEKERCHOVE DGF，KERR PG，CALLEBAUT AP，et.al.Development of a capture ELISA for the detection of antibodies toenteropathogenic Escherichia coli(EPEC)in rabbit flocks usingintimin-specific monoclonal antibodies[J].Veterinary Microbiology，2002.12，88(4)351-366.)。Padhye采用單克隆抗體ELISA法檢測了大腸桿菌O157H7(PADHYE N V，DOYLE M P.Production and characterization of a monoclonalantibody specific for enterohemorrhagic Escherichia coli of serotypes O157H7and O2611[J].J Clin Microbiol，1991，2999-103)。Park等采用多克隆抗體ELISA試劑盒檢測了糞便中的大腸桿菌O157，與傳統(tǒng)的麥康凱培養(yǎng)基法相比，該試劑盒的靈敏度及特異性分別為91.2％和99.5％，而傳統(tǒng)檢測方法的靈敏度及特異性僅為82.4％和100％(PARK C H，VANDEL N M，HIXON D L.Rapid immunoassay fordetection of Escherichia coli O157 directly from stool specimens[J].J ClinMicrobiol，1996，34988-90)。Ramadan等利用ELISA檢測方法在2小時內(nèi)檢測到了大腸桿菌O157(10-108CFU/mL)(ABUKNESHA R A，DARWISH F.Coupling of enzymaticand immunoassay steps to detect E.colia new，highly sensitive tandemtechnique for the analysis of low levels of bacteria[J].Talanta，2005.1，65(2)343-348)。我國姚斐等利用間接酶聯(lián)免疫吸附方法檢測了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的大腸桿菌O157H7，最小檢測濃度為105CFU/mL(YAO Fei(姚斐)，SHA Sha(沙莎)，CHEN Gang(陳剛)，et al.Indirect enzyme linked immunosorbent assay fordiagnosis of viable but nonculturable Escherichia coli O157H7[J].Journalof Ocean University of Qingdao(青島海洋大學(xué)學(xué)報)，2001，31(2)211-214.)。孫克江等應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測了大腸桿菌O157H7，與常規(guī)的培養(yǎng)等方法相比，檢出率及敏感性均得到大幅提高(SUN Kejiang(孫克江)，GUO Hong(郭宏)，ZHANGDongfa(張東發(fā))，et al.Enzyme linked immunosorbent assay for detectingO157H7[J].Disease Surveillance(疾病監(jiān)測)，2001，16(9)353-355)。雖然ELISA檢測方法操作簡單，靈敏度高，但是若用該法檢測所有血清型的大腸桿菌則需要廣譜抗體(Broad spectrum antibody)，此外，上述試劑盒要想實現(xiàn)商品化仍需對其可靠性做進一步檢驗，而且目前檢測標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，因此，商品化受到極大限制。
美國食品與藥物管理局已認(rèn)可使用商品化的出血性大腸肝菌O157H7的免疫檢測試劑盒。我國僅中國獸藥監(jiān)察所分別針對大腸埃希氏菌K88、K99和987P抗原開發(fā)出了ELISA檢測試劑盒，用于控制幼畜大腸桿菌病(China Institute of Veterinary DrugControl(沒有具體作者).Research and application of enzyme linkedimmunosorbent assay for detecting E.coli kit.Bulletin of Agricultural Scienceand Technology(農(nóng)業(yè)科技通訊)，1997，8無卷期頁碼)。由以上諸多文章中可見，目前國內(nèi)外的研究和應(yīng)用多針對致病性的大腸桿菌O157H7，還未有針對總大腸桿菌開發(fā)的ELISA檢測試劑盒，而環(huán)境檢測標(biāo)準(zhǔn)中所要求檢測的均為總大腸桿菌。同時，各研究結(jié)果顯示，針對于大腸桿菌所開發(fā)的各技術(shù)的檢測限均難以滿足環(huán)境檢測的要求。因此，迫切需要一種環(huán)境檢測領(lǐng)域中用于檢測總大腸桿菌的ELISA試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便易行的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計方案一種大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟1)分離出大腸桿菌，具體方法為先將樣品接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上在36-38℃下培養(yǎng)12-36小時，再將在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基長出的菌落涂布于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上在36-38℃下培養(yǎng)24-48小時，接著挑取在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上長出的紫紅色帶金屬光澤的單菌落，再次接種于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上在36-38℃下培養(yǎng)24-48小時，然后挑取紫紅色帶金屬光澤的單菌落，接種于添加了質(zhì)量百分濃度為1.4-1.8％溴甲酚紫的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中在36-38℃下培養(yǎng)12-36小時，待乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中的紫色褪去，將菌液接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基斜面上，對長出的菌落進行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)，將鑒定為大腸桿菌的菌落再接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上在36-38℃下培養(yǎng)12-36小時，菌落呈黑紫色的為大腸桿菌；2)將分離的大腸桿菌培養(yǎng)后滅活，再破碎菌體，使抗原位點充分暴露，得到大腸桿菌破碎全菌體抗原；3)將大腸桿菌破碎全菌體抗原免疫動物；4)從經(jīng)免疫的動物中分離、純化抗血清，得到大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體。
自然環(huán)境，特別是生活污水中存在多種大腸桿菌，因而在上述制備方法的步驟1)中，首先需要分離出存在于待測樣品中的多種大腸桿菌，以使制備的多克隆抗體具有廣譜性。
步驟2)中用于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基的選擇是多種多樣的，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等，優(yōu)選為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件可為在36-38℃下培養(yǎng)15-18小時；對大腸桿菌進行滅活的方法可為先用質(zhì)量百分濃度為0.85-0.9％的生理鹽水制成濃度為108-1010cfu/mL的菌懸液，再加入體積百分濃度為0.3-0.5％的福爾馬林液(甲醛溶液)，最后在55-80℃下水浴0.5-1.5小時；破碎菌體的方法也是多種多樣的，優(yōu)選為用功率為150-300W的超聲波細(xì)胞破碎儀對大腸桿菌進行破壁處理，工作時間為2-4min，工作方式為4-6s，間歇4-6s。
步驟3)中免疫方法的選擇是多種多樣的，如背部皮下多點注射法、腹腔注射法等，免疫劑量可為0.3-2.0mL/只(濃度為108-1010cfu/mL)，此外，用于制備大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的免疫動物可為兔、雞、鼠、羊或馬等常用的免疫動物。
步驟4)中為獲得較好的檢測效果，還應(yīng)每隔7-10天測定免疫動物抗血清的抗體效價，當(dāng)抗體效價達(dá)到最大值時，可從經(jīng)免疫的動物中分離、純化抗血清；所述對抗血清進行純化的方法可為飽和硫酸銨鹽析沉淀法和親和層析等方法。
用上述方法制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體是本發(fā)明需要保護的。
本發(fā)明的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體可用于大腸桿菌的免疫檢測中。
所述大腸桿菌的免疫學(xué)檢測方法可采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)或熒光免疫測定技術(shù)等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，對于固相反應(yīng)而言，可以將本發(fā)明的多克隆抗體固定于固相載體，也可以將待測樣品固定于固相載體上。反應(yīng)通常在室溫下進行，檢測過程中需要洗滌不與本發(fā)明多克隆抗體結(jié)合的樣品的步驟。
對于液相反應(yīng)而言，通?？梢韵蛱幵谔囟ň彌_體系中的待測樣品中直接加入本發(fā)明的多克隆抗體，然后在適于抗原抗體發(fā)生相互作用的溫度下(如室溫)進行反應(yīng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何根據(jù)多克隆抗體的來源選擇相應(yīng)的第二抗體。所述第二抗體可以是放射性同位素標(biāo)記的，包括但不限于使用選自32P、125I、S、2H等；也可以是非放射性同位素標(biāo)記的，包括但不限于使用選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、鏈霉親和素等標(biāo)記。本發(fā)明所述檢測方法中使用的檢測試劑取決于檢測過程使用的第二抗體的標(biāo)記物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何選擇合適的檢測試劑。
所述大腸桿菌的ELISA檢測法，可包括如下步驟1)用待測樣品包被酶聯(lián)板，洗板；2)封閉經(jīng)包被的酶聯(lián)板，洗板；3)加大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體，洗板；4)加酶標(biāo)二抗，洗板；5)加底物顯色；6)終止反應(yīng)；7)測定OD450值。
上述檢測方法中的反應(yīng)條件及試劑均可按照常規(guī)方法進行選擇。
步驟4)中的二抗可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶標(biāo)記的抗兔抗抗體。
本發(fā)明還提供了一種檢測大腸桿菌的ELISA試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測大腸桿菌的ELISA試劑盒，可包括上述大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體。
所述試劑盒還可包括所述大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的酶標(biāo)二抗。
所述酶標(biāo)二抗可為羊抗兔IgG等。
所述用于標(biāo)記二抗的酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶等標(biāo)記酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸法交聯(lián)在抗體上。
試劑盒中還可包括由顯色液A和顯色液B組成的顯色液，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲溶液，所述顯色液B液為鄰苯二胺或3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液。
為方便使用，所述試劑盒還可包括檢測用的洗滌液，如PBST等常規(guī)的洗滌試劑；封閉液，如1％BSA等；包被液，如0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)等。
本發(fā)明提供了一種大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體及其制備方法。在本發(fā)明的制備方法中，大腸桿菌分離自自自然環(huán)境，特別是生活污水，因而是環(huán)境中大腸桿菌的代表性菌群類型，基于此得到的多克隆抗體可特異性識別環(huán)境中的總大腸桿菌，具有廣譜性；)此外，該制備方法還具有簡單，成本低廉的優(yōu)點。實驗證明，用本發(fā)明方法制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體具有特異性高，純度及效價高(大于1∶1×105，原因在于脂多糖(LPS)位于細(xì)胞壁的最外層，由脂多糖單體組成，脂多糖單體的成分之一特異性多糖，其多糖鏈上具有大腸桿菌的菌體抗原成分，因此當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞壁破碎時，O抗原得以充分暴露；由于鞭毛是從細(xì)胞漿外層的基礎(chǔ)顆粒生長出來，穿過胞漿膜和細(xì)胞壁向菌體外伸出的細(xì)長波狀彎曲的絲狀物，因此當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞壁破碎時，H抗原得以充分暴露；同時，由于菌毛始于胞漿膜或接近胞漿膜的胞漿中，穿過細(xì)胞壁向菌體外延伸，因此當(dāng)大腸桿菌破碎后，大量菌毛抗原得以充分暴露，因此，在免疫過程中破碎全菌體抗原中包含了各種充分暴露的抗原位點，使得免疫效果佳)，可長期保存的優(yōu)點，將其用于環(huán)境及食品檢測領(lǐng)域中大腸桿菌的免疫檢測中，將具有精確性、靈敏度高等優(yōu)勢，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明。


圖1為大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖2為大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的效價測定結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所有培養(yǎng)基均用蒸餾水配制，分裝包裝好后滅菌備用，滅菌條件為在115℃下滅菌20-30min。
實施例1、大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的制備及其效價測定一、制備大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體現(xiàn)用本發(fā)明的方法制備大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體，包括以下步驟1、從生活污水中分離出大腸桿菌1)采集水樣分別從北京市的4個生活污水處理廠(清河污水處理廠、肖家河污水處理廠、北小河污水處理廠的進水口處和清華大學(xué)校內(nèi)生活污水水樣)采集水樣，共取水樣16點，每廠4點。采樣用塑料樣品瓶，取水時盡量減少與空氣接觸時間，用手握住樣品瓶底部，將瓶迅速浸入水面下，然后將瓶口轉(zhuǎn)向水流方向，待水樣充滿至瓶體積2/3時，在水中塞上瓶蓋，取出水面。將取回的水樣保存于4℃冰箱中，保存時間不應(yīng)超過6個小時。
2)大腸桿菌的分離和鑒定采用選擇性培養(yǎng)方法從步驟1)采集的水樣中分離出大腸桿菌，具體方法包括以下步驟A.將水樣劃線接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(牛肉膏2.5g，蛋白胨5.0g，NaCl2.5g，瓊脂10g，水500mL，pH7.2)上37℃培養(yǎng)24小時(復(fù)壯)；B.將在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基長出的菌落涂布于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母浸膏5g，牛肉膏5g，乳糖10g，瓊脂20g，磷酸氫二鉀3.5g，無水亞硫酸鈉5g，5％堿性品紅乙醇溶液20mL，水1000mL，pH至7.2-7.4)上在37℃下培養(yǎng)24-48小時進行分離；C.挑取在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上長出的紫紅色帶金屬光澤單菌落，再劃線接種于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上在37℃下培養(yǎng)36小時進行分離；D.挑取步驟C分離出的紫紅色帶金屬光澤單菌落，接種于添加了溴甲酚紫的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(蛋白胨5g，牛肉膏1.5g，乳糖2.5g，氯化鈉2.5g，0.5mL 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，水500mL，pH7.2)中在37℃下培養(yǎng)約24小時；E.待步驟D中乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中的紫色褪去，挑取培養(yǎng)基中的菌液，將其接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基斜面上；F.對在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基斜面上長出的菌落進行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，將鑒定為大腸桿菌的菌落再涂布接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(半乳糖5g，胰蛋白胨2.5g，NaCl 2.5g，K2HPO41g，伊紅Y 0.2g，美藍(lán)0.05g，瓊脂7.5g，水500mL，pH7.2)上，在37℃下培養(yǎng)約24h觀察顏色形態(tài)，菌落呈黑紫色，有光澤或無光澤的為大腸桿菌，低溫保存、備用(一般可以儲存約6個月)。
用上述方法獲得的大腸桿菌包括了水環(huán)境中代表性的大腸桿菌，能夠用以表征水環(huán)境中的總大腸桿菌。
2、大腸桿菌破碎全菌體抗原的制備將步驟2)分離的大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏2.5g，蛋白胨5.0g，NaCl 2.5g，水500mL，pH 7.2)上，在37℃孵育箱中培養(yǎng)17h，然后用質(zhì)量百分濃度為0.9％的生理鹽水制成濃度為1010cfu/mL的所分離的大腸桿菌的菌懸液(用Mc Farland比濁管測定菌數(shù))，再加入體積百分濃度為0.4％的福爾馬林液，最后在60℃下水浴1h，得到大腸桿菌全菌體抗原，再將1mL大腸桿菌全菌體抗原用200W超聲波細(xì)胞破碎儀破碎3min，5s工作，5s間歇，使大腸桿菌細(xì)胞壁破碎，抗原位點充分暴露，得到大腸桿菌破碎全菌體抗原。
3、免疫動物將步驟2獲得的大腸桿菌破碎全菌體抗原對2只成年雌性新西蘭大白兔采用背部6點皮下注射法(靠近淋巴結(jié)的腋下、背部、腹股溝各兩側(cè))進行免疫，免疫前1周取家兔耳緣靜脈血，分離血清作為陰性對照(Neg)，免疫劑量為1.0mL/次，每次免疫時加注1.0mL福氏佐劑(購自sigma公司)作為免疫佐劑，分別于初次免疫后第7、14、21和28天再加強免疫一次(免疫方案見表1)。
表1 免疫方案

4、大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的獲得1)效價測定免疫過程中，定期(初期免疫后每隔7天，待免疫五次后每天檢測)從免疫兔子的耳緣靜脈采血，采血量為1mL/只，分離血清，用間接ELISA法檢測血清中的抗體效價(抗體的效價(titer)(又稱滴度)是評價抗體性能的一個重要指標(biāo)，是常用于表達(dá)抗血清中特異性抗體相對含量的一個半定量指標(biāo)。效價是指在一定條件下，抗血清經(jīng)過一系列稀釋與定量的抗原反應(yīng)，當(dāng)陽性抗血清吸光值大于2.1倍陰性血清的對照吸光值時抗血清的稀釋倍數(shù)。)以考察免疫效果，具體步驟如下a.包被用0.05M pH9.6碳酸氫鈉緩沖溶液(Na2CO30.159g，NaHCO30.294g，ddH2O 100mL)將大腸桿菌破碎全菌體抗原包被96孔板，每孔包被量為100μL，37℃溫育2h；b.封閉用PBST洗滌液(內(nèi)含0.05％Tween-20的0.01M pH7.4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)，配方為NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween-20 0.5mL，用水定容至1L)清洗酶標(biāo)板3次，每次3min，再每孔添加質(zhì)量百分濃度為1％的牛血清白蛋白(BSA)封閉液100μL，37℃溫育2h；c.加抗體以PBST洗滌液清洗酶標(biāo)板3次，每次3min，再加入上述分離自免疫兔子的抗血清100μL，37℃溫育1h；d.加酶標(biāo)抗抗體以PBST洗滌液清洗酶標(biāo)板3次，每次3min，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體(購自Sigma)100μL，37℃溫育1h；e.加底物顯色以PBST洗滌液清洗酶標(biāo)板3次，每次3min，再加3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB)溶液(Na2HPO4142mg，檸檬酸105mg，TMB 2mg，30％H2O27.5μl，蒸餾水5mL)100μL，反應(yīng)5min；f.終止反應(yīng)及OD450值測定加H2SO4終止液(H2SO428mL，ddH2O 500mL)終止反應(yīng)后，取出放入酶標(biāo)儀中，讀取450nm下的吸光度。
2)分離抗血清當(dāng)免疫兔子抗體的效價達(dá)到最高時，用頸動脈放血的方法大量采血(注意大量采血前，先將家兔禁食24h以防血脂過高)，取血后在室溫下放置約2h使其凝固，然后用高速離心機11000rpm離心10min，取上清分裝，于-20℃冷凍保藏(或于4℃冷藏)。
3)抗血清的純化A.用飽和硫酸銨鹽析沉淀法進行純化首先用飽和硫酸銨鹽析沉淀法對步驟2)分離的抗血清進行初步純化，具體方法包括以下步驟(1)取抗血清樣品20mL，加入等量PBS(NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，用水定容至1L，pH5.0)，于冰上用玻璃棒輕輕攪拌，緩慢、逐滴加入4℃預(yù)冷的SAS(飽和硫酸銨溶液)40mL，于4℃冰箱中靜置12-24h(注加入等體積的SAS后終濃度變?yōu)樵瓭舛鹊?0％)；(2)4℃、12000rpm離心10min，棄上清，將沉淀物用12mL PBS溶解，緩慢、逐滴加入4℃預(yù)冷的8mL SAS，4℃靜置1h；(3)重復(fù)步驟(2)離心，用13.4mL PBS溶解沉淀，滴加6.6mL SAS，4℃靜置1h；
(4)重復(fù)步驟(2)離心，將沉淀用PBS溶解，裝入透析袋；(5)于4℃冰箱中，用25倍體積的PBS進行透析，期間每3h換液一次，共換液3次，直至用BaCl2檢測透析液無白色沉淀為止。
B.用親和層析法進行純化對步驟A中用飽和硫酸銨鹽析沉淀法進行初步純化的抗血清用購自AmershamBiosciences公司的蛋白A親和層析柱(HiTrap rProtein A FF)做進一步純化，具體方法包括以下步驟(1)準(zhǔn)備收集管，向待收集部分加入120μl 1M Tris·HCl(pH9.0)/mL；(2)用起始緩沖液(HiTrap rProtein A FF層析柱的綁定產(chǎn)品)填充注射器，以至少5倍柱體積的蒸餾水洗滌酒精防腐劑；(3)以5倍柱體積的洗脫緩沖液(HiTrap rProtein A FF層析柱的綁定產(chǎn)品)洗柱使柱再生；(4)用5-10倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液(HiTrap rProtein A FF層析柱的綁定產(chǎn)品)平衡柱子；(5)樣品過柱，用注射器將樣品注入柱子上端接口；(6)用5-10倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱(注意避免過度洗滌)；(7)用2-5倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫，得到大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體。
二、大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的檢測1、蛋白質(zhì)含量測定使用分光光度計在280nm下測定步驟一中用本發(fā)明方法制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果破碎全菌體抗體2.4mg/mL，表明獲得了蛋白質(zhì)含量較高的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體。
2、SDS-PAGE電泳檢測再對步驟一制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體進行SDS-PAGE電泳檢測，具體檢測步驟為先后用洗潔精、自來水、蒸餾水、無水乙醇清洗玻板，再用吸水紙擦干；配膠配置10mL 15％的Tris·甘氨酸SDS-PAGE分離膠溶液和4mL 5％的Tris·甘氨酸SDS-PAGE濃縮膠溶液，樣品處理液(1g SDS，5mL甘油，0.5mg BPB，2.5mL巰基乙醇，10mL pH6.8的Tris·HCl緩沖液，加水至50mL)；分離膠溶液充分混勻后，平穩(wěn)地將其從一側(cè)加入4.5mL，然后在液面上注入一層水，以隔絕空氣，促使聚合并消除凝膠彎月面的形成，使凝膠表面平坦；于37℃孵箱中放置40min后將水倒掉，用濾紙吸干，注入濃縮膠液至玻板頂端，然后立即小心插入梳子，37℃孵箱中放置30min；拔梳子時先往電泳內(nèi)槽灌滿電泳緩沖液，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形，同時去掉凝膠密封框，30min后即可上樣；樣品處理時，用2×樣品處理液與樣品1∶1混合，將其同標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker一起在100℃下煮10min，冷卻至室溫，離心(去除樣品中一些不溶性的物質(zhì))；上樣時，上樣量為10μg/孔；將濃縮膠和分離膠分別在80V和160V下進行電泳；當(dāng)溴酚藍(lán)前沿到達(dá)玻璃板底部時停止電泳；取膠時，撬去玻板，將濃縮膠輕輕刮去，避免把分離膠刮破，將分離膠卸下，左上切角，用純水沖洗；染色與脫色時，將分離膠經(jīng)微波加熱1-2min后倒掉染色液，再用微波加熱脫色3min×2(平皿里放大量海綿)，搖床振蕩冷卻；凝膠脫色干凈后，脫色液經(jīng)活性炭回收，凝膠泡清水后即可進行掃描，結(jié)果如圖1所示(泳道psQ為大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體，泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量)，可以看出所得大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的重鏈及輕鏈清晰，雜蛋白含量少，表明用本發(fā)明方法制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體具有較高的純度。
3、效價測定用與步驟一中相同的間接ELISA法測定用本發(fā)明方法制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的效價，除步驟c中的抗體變?yōu)榇竽c桿菌破碎全菌體多克隆抗體外，其余步驟均相同。效價測定結(jié)果如圖2所示(Neg為陰性對照，psQ為大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體)，用大腸桿菌破碎全菌體抗原免疫新西蘭白兔產(chǎn)生了較強的免疫反應(yīng)，獲得的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體對包被的大腸桿菌破碎全菌體抗原具有較高的吸收值，表明抗體能夠與抗原具有較強的特異反應(yīng)性，所獲得的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體效價較高，大于1∶1×105。
實施例2、用含有大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的ELISA試劑盒檢測大腸桿菌一、含有大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的ELISA試劑盒的制備將實施例1制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體與作為第二抗體的經(jīng)過辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，顯色A液30％H2O21mL，顯色B液質(zhì)量百分濃度為1％的3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液1mL(將TMB溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(或二甲基甲酰胺(Dimethyl formamide，DMF))得到)，洗滌及稀釋液PBST 50mL，封閉液1％BSA 10mL，包被液0.05M pH9.6碳酸氫鈉50mL，H2SO4終止液10mL共同包裝，得到檢測大腸桿菌的ELISA試劑盒。
二、大腸桿菌的檢測以清華大學(xué)校內(nèi)生活污水為例，用步驟一制備的試劑盒對環(huán)境中的大腸桿菌進行測定，具體方法包括以下步驟(1)包被酶聯(lián)板用0.05M pH9.6碳酸氫鈉緩沖溶液將污水水樣包被在96孔板中，每孔100μl，37℃放置2小時，然后用10mM PBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍；(2)封閉已包被的酶聯(lián)板用1％的BSA封閉包被的酶聯(lián)板，100μl/孔，37℃保溫30分鐘；(3)在酶聯(lián)板上加實施1制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體(經(jīng)200倍稀釋)100μl/孔，37℃保溫1小時，然后用10mM PBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍。
(4)加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，100μl/孔，37℃保溫30分鐘，然后用10mM PBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍；(5)加辣根過氧化物酶底物溶液(9.8mL pH5.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中加入0.2mL TMB溶液，再加入20μl 30％H2O2，搖勻)，50μl/孔，室溫顯色5分鐘；(6)加2N H2SO450μl/孔終止反應(yīng)；(7)測定OD450值。
結(jié)果OD450值為0.6，對照用已知濃度的大腸桿菌菌液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的大腸桿菌量約為104/mL，表明本發(fā)明的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體及含有該抗體的試劑盒可用于大腸桿菌的免疫檢測中。
權(quán)利要求
1.一種大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟1)分離出大腸桿菌，具體方法為先將樣品接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上在36-38℃下培養(yǎng)12-36小時，再將在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基長出的菌落涂布于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上在36-38℃下培養(yǎng)24-48小時，接著挑取在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上長出的紫紅色帶金屬光澤的單菌落，再次接種于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上在36-38℃下培養(yǎng)24-48小時，然后挑取紫紅色帶金屬光澤的單菌落，接種于添加了質(zhì)量百分濃度為1.4-1.8％溴甲酚紫的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中在36-38℃下培養(yǎng)12-36小時，待乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中的紫色褪去，將菌液接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，對長出的菌落進行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)，將鑒定為大腸桿菌的菌落再接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上在36-38℃下培養(yǎng)12-36小時，菌落呈黑紫色的為大腸桿菌；2)將分離的大腸桿菌培養(yǎng)后滅活，再破碎菌體，得到大腸桿菌破碎全菌體抗原；3)將大腸桿菌破碎全菌體抗原免疫動物；4)從經(jīng)免疫的動物中分離、純化抗血清，得到大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中的大腸桿菌分離自生活污水；步驟2)中用于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為在36-38℃下培養(yǎng)15-18h；用功率為150-300W的超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體，工作時間為2-4min，工作方式為4-6s，間歇4-6s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中對大腸桿菌進行滅活的方法為先用質(zhì)量百分濃度為0.85-0.9％的生理鹽水制成濃度為108-1010cfu/mL的菌懸液，再加入體積百分濃度為0.3-0.5％的福爾馬林液，最后在55-80℃下水浴0.5-1.5h，
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3)中采用皮下多點注射法或腹腔注射法將大腸桿菌破碎全菌體抗原免疫動物，免疫劑量為0.3-2.0mL/只；免疫動物為兔、雞、鼠、羊或馬。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述對抗血清進行純化的方法為飽和硫酸銨鹽析沉淀法和/或親和層析法。
6.用權(quán)利要求1-5任一項所述的方法制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體。
7.一種檢測大腸桿菌的ELISA試劑盒，包括權(quán)利要求6所述的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括所述大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體的酶標(biāo)二抗，由顯色液A和顯色液B組成的顯色液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)二抗為經(jīng)過辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG；所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲溶液；所述顯色液B液為鄰苯二胺或3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8或9所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括PBST，1％BSA和0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，其目的是提供一種大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體及其制備方法與其在檢測大腸桿菌中的應(yīng)用。該制備方法包括以下步驟1)分離大腸桿菌；2)培養(yǎng)后滅活，再破碎菌體，得到大腸桿菌破碎全菌體抗原；3)將大腸桿菌破碎全菌體抗原免疫動物；4)從經(jīng)免疫的動物中分離、純化抗血清，得到大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體。用本發(fā)明方法制備的大腸桿菌破碎全菌體多克隆抗體具有特異性高，純度及效價高(大于1∶1×10
文檔編號G01N33/535GK1935844SQ200610113828
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月18日
發(fā)明者何苗, 王娜, 施漢昌, 蔡強 申請人:清華大學(xué)