專利名稱：Dna結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及利用納米粒子分離DNA結(jié)合蛋白的系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
DNA與蛋白質(zhì)的相互作用包含了大量的生命活動信息，是后基因組時代研究的一個重要內(nèi)容。特別是，DNA與蛋白質(zhì)的識別的研究關(guān)系到生物大分子的構(gòu)象特異性識別以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中蛋白因子的作用機制等方面問題的解決。傳統(tǒng)的研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法存在一些困難凝膠滯后實驗(EMSA)只能驗證已知蛋白與DNA的相互作用，并且實驗中要用到同位素標(biāo)記，對實驗者健康有影響；染色質(zhì)免疫共沉淀法(CHIP)要預(yù)先猜測與DNA作用的蛋白因子，并且要用到該蛋白因子的單抗，成本高，此外，抗體的加入又有可能影響DNA與蛋白的結(jié)合。
目前，納米科學(xué)正在突飛猛進地發(fā)展，將納米科學(xué)與生物學(xué)結(jié)合，用于解決生命研究中的重大問題，這是一個納米科學(xué)發(fā)展的必然趨勢。為了更方便直接地研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，建立一種基于磁性納米粒子(MNP)的微量蛋白因子的分離系統(tǒng)，以篩選與某一特定DNA序列識別的蛋白質(zhì)正在成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，以克服現(xiàn)有的凝膠滯后實驗只能驗證已知蛋白與DNA的相互作用，并且實驗中要用到同位素標(biāo)記，對實驗者健康有影響；染色質(zhì)免疫共沉淀法需要預(yù)先猜測與DNA作用的蛋白因子，并且要用到該蛋白因子的單抗，成本高，此外，抗體的加入又有可能影響DNA與蛋白的結(jié)合的缺陷。
技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，由如下組分構(gòu)成(1)表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子；(2)標(biāo)記有生物素的雙鏈DNA；(3)與雙鏈DNA結(jié)合的核蛋白；(4)外加磁場。
上述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的優(yōu)選方案之一為，所說的磁性納米粒子是二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子，且表面通過氨基或羧基與鏈霉親和素共價連接。
上述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的優(yōu)選方案之二為，所說的磁性納米粒子平均粒徑為50～100nm。
上述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的優(yōu)選方案之三為，所說的DNA結(jié)合蛋白的分子量范圍為6.2kD至4.1kD。
上述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的優(yōu)選方案之四為，所說的生物素標(biāo)記的雙鏈DNA的片段長度范圍為100bp～800bp。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種利用磁性納米粒子分離DNA結(jié)合蛋白的方法，包括如下步驟a)二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子表面進行氨基或羧基修飾；b)在經(jīng)過修飾的磁性納米粒子表面共價連接鏈霉親和素；c)利用表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子結(jié)合生物素修飾的雙鏈DNA；d)利用磁性納米粒子的超順磁性分離并洗脫DNA結(jié)合蛋白。
上述的利用磁性納米粒子分離DNA結(jié)合蛋白的方法的優(yōu)選方案之一為，所說的磁性納米粒子平均粒徑范圍為50～100nm50～100nm。
上述的利用磁性納米粒子分離DNA結(jié)合蛋白的方法的優(yōu)選方案之二為，所說的DNA結(jié)合蛋白的分子量范圍為6.2kD至4.1kD。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供上述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)在研究蛋白質(zhì)分離及DNA與蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用。
上述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)在研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用的優(yōu)選方案為，所說的蛋白質(zhì)為DNA轉(zhuǎn)錄因子。
有益效果(1)磁性納米粒子與長鏈dsDNA的鍵合系高效專一，分離過程中蛋白與DNA在最適的結(jié)合體系中保持相互特異結(jié)合；
(2)采用磁性分離手段，分離的條件溫和，對生物樣品不產(chǎn)生損傷，并且操作簡單、迅速；(3)利用此納米分離系統(tǒng)可以分離得到DNA結(jié)合蛋白，彌補目前DNA結(jié)合蛋白質(zhì)分離方法中的不足，提供了安全、可靠、低成本的技術(shù)平臺；(4)值得關(guān)注的是，本發(fā)明方法可以用于尋找未知的DNA結(jié)合蛋白，而不是僅限于驗證某一蛋白與DNA的識別，這為分離與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)提供了良好的分離平臺，并為研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用開辟了新的思路；(5)本發(fā)明的方法可以用于篩選并獲得轉(zhuǎn)錄因子，能夠為研究基因調(diào)節(jié)機制提供更直接的分子水平的證據(jù)。


圖1磁性納米粒子捕捉hCMV MIEP結(jié)合的蛋白因子。Lane 1Hela核抽提物；Lane MTakara低分子量蛋白Marker；Lane 2標(biāo)記有hCMVMIEP的MNP由50mM NaCl洗脫液；Lane 3標(biāo)記有Biotin-primer的MNP由50mM NaCl洗脫液；Lane4標(biāo)記有hCMV MIEP的MNP由200mM NaCl洗脫液；Lane 5標(biāo)記有Biotin-primer的MNP由200mMNaCl洗脫液。該圖說明hCMV MIEP片段至少可以結(jié)合分子量為6.2kD、5.4kD、3.8kD和4.1kD的蛋白。
圖2茚三酮顯色產(chǎn)物可見光吸收譜.a.MNP-NH2；b.無水乙醇洗滌MNP-NH2的上清液；c.MNP；d.CH3CH2OH。本圖說明AEAPS能夠通過化學(xué)鍵有效地連接在磁性納米粒子的二氧化硅表面。
圖3MNP-NH2-Strepavidin與OB-hCMV MIEP的特異性結(jié)合效率。Lane 10.12mg MNP-NH2-Strepavidin與10pmol OB-hCMV MIEP混合后游離的DNA；Lane2～70.12mg MNP-NH2-Strepavidin與20pmol、18pmol、16pmol、14pmol、12pmol、10pmol OB-hCMV MIEP混合后游離的DNA；Lane MDL2000 Marker。該圖說明修飾有Biotin的dsDNA能夠有效地與磁性納米粒子鍵合，鍵合效率為12ng磁性納米粒子結(jié)合1pmol DNA。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學(xué)試劑和有機溶劑購自上?；瘜W(xué)試劑廠，引物和探針均由上海生工公司合成。表面包覆有SiO2的磁性納米粒子由上海師范大學(xué)納米生物技術(shù)實驗室制備。
具體實施過程中，如下步驟是一種可行和優(yōu)選的方法(1)用N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS)修飾二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子表面將甲醇、丙三醇及ddH2O按100∶60∶1的比例混合，將表面包覆有SiO2的磁性納米粒子10～30mg加入上述溶液中，超聲25min以上分散均勻，向混合液中滴加1～2mL AEAPS，超聲5～20min混勻，50～80℃水浴攪拌反應(yīng)10～20hr。加外磁場利用順磁性分離出磁性納米粒子，甲醇清洗，真空干燥過夜，收集磁性納米粒子。
(2)磁性納米粒子表面修飾鏈霉親和素取3～5mg修飾過氨基的磁性納米粒子加入到500μL pH7.0左右的緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)中，超聲分散均勻，加入50～100ug的Strepavidin，溶液室溫振蕩24hr以上。加入戊二醛(25％水溶液)室溫反應(yīng)2～4hr。用pH5～8左右的緩沖液清洗，將粒子重分散于pH5～8左右的緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子對生物素修飾的雙鏈DNA的捕捉將20μL上述經(jīng)過鏈霉親和素修飾的磁性納米粒子(約含0.05～0.4mg粒子)用10倍體積的緩沖液平衡，與10pmol～20pmol 5’-biotin標(biāo)記的雙鏈DNA片段(100bp～800bp)混合，室溫振蕩30min以上。
實施例1表面修飾氨基的磁性納米粒子的制備將甲醇、丙三醇及ddH2O按100∶60∶1的比例混合，將表面包覆有SiO2的磁性納米粒子20mg加入上述溶液中，超聲20～50min分散均勻，向混合液中滴加1～5mL AEAPS，超聲5～10min混勻，50～80℃水浴攪拌反應(yīng)5hr以上。加外磁場利用順磁性分離出磁性納米粒子，甲醇清洗，40～90℃真空干燥過夜，收集磁性納米粒子。
實施例2磁性納米粒子表面修飾Strepavidin取3mg修飾過氨基的MNP加入到500μL pH7.0左右的磷酸鹽緩沖液(如0.1mol/L，pH7.0)中，超聲分散均勻，加入75ug的Strepavidin，溶液室溫振蕩24hr。加入0.5mL戊二醛(25％水溶液)室溫反應(yīng)2～4hr。用磷酸鹽緩沖液清洗，將粒子重分散于磷酸鹽緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例3表面修飾有Strepavidin的磁性納米粒子對Biotin修飾的雙鏈DNA的捕捉將20μL上述經(jīng)過Strepavidin修飾的磁性納米粒子(約含0.15mg粒子)用10倍體積的緩沖液平衡，與10pmol 5’-biotin標(biāo)記的hCMV MIEP片段(588bp)混合，室溫振蕩30min。用10倍體積的緩沖液清洗粒子。
實施例4分離與雙鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)Hela細胞核抽提物與25pmol hCMV MIEP片段在緩沖液B(8mMHEPES(pH 7.9)，100mM KCl，6mM MgCl2，0.08mM EDTA，0.2mM DTT，8％甘油，0.04mg/mL鮭魚精DNA)中30℃水浴反應(yīng)1hr。加入用緩沖液B平衡好的磁性納米粒子約0.3mg捕捉hCMV MIEP片段與其結(jié)合蛋白的復(fù)合物，室溫振蕩反應(yīng)30min。磁性分離納米粒子，用5倍體積的緩沖液B清洗粒子，而后依次加入含50～200mM NaCl的洗脫液，室溫洗脫5min，收集洗脫液。即得到與hCMV MIEP片段結(jié)合的蛋白。
實施例5分離系統(tǒng)在研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用在獲得與hCMV MIEP片段結(jié)合的蛋白后，選擇可與NFκB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合的單克隆抗體與聚丙稀酰胺凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)漬條帶進行免疫印跡分析，獲得特異性陽性結(jié)果，表明hCMV MIEP片段結(jié)合的蛋白中含有特異性轉(zhuǎn)錄因子，并進行進一步的分離、測序、同源性比較等。
權(quán)利要求
1.一種DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，由如下組分構(gòu)成(1)表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子；(2)標(biāo)記有生物素的雙鏈DNA；(3)與雙鏈DNA結(jié)合的核蛋白；(4)外加磁場。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，其特征在于，所說的磁性納米粒子是二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子，且表面通過氨基或羧基與鏈親和素共價連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，其特征在于，所說的磁性納米粒子平均粒徑為50～100nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，其特征在于，所說的DNA結(jié)合蛋白的分子量范圍為6.2kD至4.1kD。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，其特征在于，所說的生物素標(biāo)記的雙鏈DNA的片段長度范圍為100bp～800bp。
6.一種利用磁性納米粒子分離DNA結(jié)合蛋白的方法，包括如下步驟(1)二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子表面進行氨基或羧基修飾；(2)在經(jīng)過修飾的磁性納米粒子表面共價連接鏈霉親和素；(3)利用表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子結(jié)合生物素修飾的雙鏈DNA；(4)利用磁性納米粒子的超順磁性分離并洗脫DNA結(jié)合蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用磁性納米粒子分離DNA結(jié)合蛋白的方法，其特征在于，所說的磁性納米粒子粒徑范圍為50～100nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用磁性納米粒子分離DNA結(jié)合蛋白的方法，其特征在于，所說的DNA結(jié)合蛋白的分子量范圍為6.2kD至4.1kD。
9.權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)在研究蛋白質(zhì)分離及DNA與蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，所說的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)錄因子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種DNA結(jié)合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，由如下組分構(gòu)成表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子；標(biāo)記有生物素的雙鏈DNA；與雙鏈DNA結(jié)合的核蛋白；和外加磁場。磁性納米粒子與長鏈dsDNA的鍵合系高效專一，分離過程中蛋白與DNA在最適的識別體系中保持相互特異結(jié)合。采用磁性分離洗脫手段條件溫和，對樣品不產(chǎn)生損傷，并且操作簡單迅速。利用此納米分離系統(tǒng)可以分離得到DNA結(jié)合蛋白，為研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用提供了可靠的技術(shù)平臺。
文檔編號G01N33/68GK101045743SQ20061014830
公開日2007年10月3日 申請日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者沈鶴柏, 王皓月, 周海清, 費儉, 陳偉 申請人:上海師范大學(xué)