專利名稱：3－甲基喹噁啉－2－羧酸殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于3-甲基喹噁啉-2-羧酸(簡稱MQCA，下同)殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法及試劑盒，適用于測定動物性食品中喹乙醇?xì)埩魳?biāo)示物MQCA的殘留量。
背景技術(shù)：
喹乙醇又名喹酰胺醇、喹奧多斯、倍育諾，屬于喹噁啉-1，4-二氧化物類藥物，為人工合成的廣譜抗菌藥，曾作為促生長劑廣泛應(yīng)用于畜、禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中。毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，喹乙醇具有致癌和致突變性。喹乙醇在動物體內(nèi)很快被代謝，MQCA最后離開機(jī)體，被視為喹乙醇的殘留標(biāo)示物。所以分析喹乙醇?xì)埩敉ǔ７治銎錃埩魳?biāo)示物MQCA。MQCA的最大殘留限量在豬肝臟為50μg/kg，肌肉為4μg/kg，在無公害食品、畜禽水產(chǎn)品中喹乙醇規(guī)定為不得檢出。目前檢測MQCA殘留的方法有高效液相色譜法(HPLC)和液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。
HPLC和LC-MS/MS法雖然靈敏，但所需儀器價(jià)格昂貴，對操作人員的要求較高，難于推廣，不適合高通量的樣品篩選。免疫化學(xué)分析法特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)(ELISA)具有快速、靈敏度高、操作簡單、專一性好等優(yōu)點(diǎn)，適合高通量的樣品篩選。目前國內(nèi)外均未見MQCA殘留酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)的專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第1個目的是提供一種3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法。
本發(fā)明的第2個目的是提供一種3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
本發(fā)明的方法和試劑盒專用于動物可食性組織中MQCA殘留的酶聯(lián)免疫檢測，與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的方法和試劑盒具有靈敏度高，檢測快速，使用方便和檢測成本較低等突出優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，包括免疫原、包被原和抗體的制備以及樣品的前處理，其步驟如下(1)將3-甲基喹噁啉-2-羧酸與卵清蛋白相偶聯(lián)得到包被原；(2)將3-甲基喹噁啉-2-羧酸與牛血清白蛋白相偶聯(lián)得到免疫原；(3)用步驟(2)的免疫原免疫兔得到特異性兔多克隆抗體；(4)用步驟(1)的包被原包被固相載體；(5)將所述的樣品先經(jīng)酸解提取后再過MAX柱凈化，最后加入衍生試劑和催化劑進(jìn)行處理，得到待測產(chǎn)物；(6)將步驟(5)的待測產(chǎn)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測。
其中，所述的固相載體是酶標(biāo)板。例如可以采用48或96孔酶標(biāo)板作固相載體。
所述的衍生試劑是苯胺。
所述的催化劑為腈基磷酸二乙酯。
一種基于上述方法的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑，其特征在于，在酶標(biāo)板的每孔內(nèi)，包被有所述的包被原；所述的試劑包括抗3-甲基喹噁啉-2-羧酸特異性兔多克隆抗體，辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體，濃縮洗滌液，濃縮樣品稀釋液，3-甲基喹噁啉-2-羧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，底物顯色A液，底物顯色B液，終止液，衍生試劑和催化劑。
其中所述的底物顯色A液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺。
所述底物顯色B液為過氧化氫或過氧化脲。
所述終止液為硫酸溶液或鹽酸溶液。
所述的濃縮洗滌液為含有0.05～0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)。
所述濃縮樣品稀釋溶液為pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明所提供的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒采用間接競爭ELISA法，定性或定量檢測動物可食性組織如肝、肌肉中MQCA殘留。其采用高特異性的MQCA多克隆抗體，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，檢測范圍較寬，假陽性率低，檢測結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，組織最低檢測限為0.6μg/kg，適用于食品動物的可食性組織如肌肉、肝臟中MQCA殘留檢測；可以在較短時間內(nèi)檢測大量樣品，排除大量陰性樣品。由于樣品處理既簡單、省時、省力，檢測又無需昂貴的儀器設(shè)備，所以比較適合在基層檢驗(yàn)檢疫單位推廣使用。


圖1是本發(fā)明的抗原合成路線。
圖2是本發(fā)明免疫原紫外圖譜。
圖3是本發(fā)明MQCA抗體與MQCA標(biāo)準(zhǔn)品的間接競爭反應(yīng)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1、抗原的制備本發(fā)明的抗原制備包括免疫原和包被原的制備，其具體合成路線如圖1所示。
1.1免疫原的制備取3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)0.0376g，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)0.0116g，N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)0.0434g加入到1.5mL 1，4-二氧六環(huán)中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜；離心除去沉淀，上清再與5mL牛血清白蛋白(BSA)0.34g溶液4℃攪拌反應(yīng)過夜；離心，上清液用PBS0.1mol/L，pH7.4的磷酸緩沖液，透析3天后，凍干，置4℃保存?zhèn)溆?。所得免疫原的紫外圖譜如圖2所示。
1.2包被原的制備取3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)0.0376g，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)0.0116g，N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)0.0434g加入到1.5mL 1，4-二氧六環(huán)中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜；離心除去沉淀，上清再與5mL卵清蛋白(OVA)(0.18g)溶液4℃攪拌反應(yīng)過夜；離心，上清液用0.1mol/L，pH7.4的磷酸緩沖液透析3天后，凍干，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2、抗體的制備2.1免疫動物采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以MQCA與BSA偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為0.5～1mg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，在新西蘭大白兔頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，免疫期間要監(jiān)測血清抗體效價(jià)及特異性，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，頸動脈放血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的MQCA多克隆抗體。
2.2抗體純化采用辛酸-硫酸銨鹽析法純化抗體。取兔血清5mL，加入0.06mol/L乙酸緩沖液(pH 5.0)15mL，用0.1mol/LHCL調(diào)pH至4.5；室溫下加入辛酸165μL，攪拌30min；10000r/min 4℃離心30min，棄沉淀。用0.1mol/LNaOH調(diào)上清液pH至7.4；緩慢滴加等體積飽和硫酸銨溶液，攪拌20min，10000r/min4℃離心30min，棄上清液。將沉淀用少量0.01mol/L pH 7.2 PBS溶解；對0.01mol/L PBS(pH 7.2)透析過夜。將純化的抗體分裝小瓶，置-20℃冰箱保存。
2.3抗體效價(jià)采用間接ELISA方法對免疫后不同時期的抗體的效價(jià)進(jìn)行監(jiān)測，以O(shè)D值達(dá)到1.0左右時判定為陽性。結(jié)果抗體的效價(jià)為1∶1.6×105。
2.4抗體特異性抗體的特異性用交叉反應(yīng)率來表示，將一系列與MQCA結(jié)構(gòu)相似或與BSA交聯(lián)相關(guān)的化合物，通過間接競爭ELISA步驟，計(jì)算交叉反應(yīng)率(表1)。
表1本發(fā)明抗體的特異性

由表1中可以看出，該抗體對QCA、喹乙醇和喹烯酮也有一定的交叉反應(yīng)，但對卡巴氧、氨基苯甲酸、γ-氨基丁酸無交叉反應(yīng)。
2.5抗體的穩(wěn)定性按照間接ELISA方法，在不同時間測定抗體的效價(jià)，以研究抗體的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2，可以看出該抗體在-20℃至少可以保存3個月其效價(jià)不變。
表2本發(fā)明抗體的穩(wěn)定性

實(shí)施例3、樣品前處理方法的建立提取準(zhǔn)確稱取豬肌肉組織5g置于具塞離心管中，加5％偏磷酸20％甲醇溶液8mL，旋渦混合2min，在25℃下6000r/min離心15min，取出上清液，然后再向組織樣品中加5％偏磷酸20％甲醇溶液8mL重復(fù)提取一次，合并2次上清液。于上清液中加乙酸乙酯8mL，旋渦混合1min，4000r/min離心10min，取有機(jī)相層，再加乙酸乙酯8mL重復(fù)提取，合并2次有機(jī)相。有機(jī)相中，加磷酸鹽緩沖液6mL，旋渦混和1min，放置10min，使下層清晰，收集水相。另用磷酸鹽緩沖液6mL提取乙酸乙酯相一次。使水相清晰，合并2次水提取液。
準(zhǔn)確稱取豬肝臟樣品2g置于具塞離心管中，加5％偏磷酸20％甲醇溶液6mL，旋渦混合2min，在25℃下6000r/min離心15min，取出上清液，然后再向組織樣品中加5％偏磷酸20％甲醇溶液8mL重復(fù)提取一次，合并2次上清液。于上清液中加乙酸乙酯8mL，旋渦混合1min，4000r/min離心10min，取有機(jī)相層，再加乙酸乙酯6mL重復(fù)提取，合并2次有機(jī)相。其余步驟同肌肉樣品處理方法。
凈化MAX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化。加樣品提取液至MAX柱中，控制流速小于3mL/min，先后用0.05mol/L氫氧化鈉溶液3mL、甲醇3mL淋洗，抽干，2％甲酸甲醇溶液3mL洗脫，洗脫液置45～50℃水浴氮?dú)獯蹈桑燃淄槎ㄈ葜?mL，充分混合。
衍生加入催化劑腈基磷酸二乙酯工作液10μL(配制方法參見6.1)，加入衍生試劑苯胺工作液20μL(配制方法參見6.1)，塞緊，旋渦混勻，于37℃水浴避光反應(yīng)5h，然后將各離心管于40℃氮?dú)獯蹈?，用樣品稀釋液定容?mL，旋渦混勻后待測。
實(shí)施例4、酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)方法的建立4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線將MQCA用三氯甲烷稀釋成640ng/mL，另取三氯甲烷1mL作為本底，按照實(shí)施例3確定的衍生條件進(jìn)行衍生，反應(yīng)完畢后用PBS定容至1mL；然后用本底將衍生好的MQCA-PAN結(jié)合物稀釋配成64ng/mL、16ng/mL、4ng/mL、1ng/mL、0.25ng/mL、0ng/mL系列濃度，按間接競爭ELISA方法測定。以MQCA-PAN結(jié)合物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3所示)，曲線在0.25～64ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.99以上。
4.2靈敏度采用IC50評價(jià)方法的靈敏度。分別測定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50(見表3)。結(jié)果表明IC50的變動范圍在1.06μg/L～4.8μg/L之間，均值為2.82ng/mL。測定20份空白組織(豬肌肉、肝臟)樣品，將其平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為組織最低檢測限。結(jié)果(見表4)顯示豬肝臟和肌肉組織最低檢測限分別為0.64μg/kg和0.60μg/kg。
表3本發(fā)明方法的靈敏度

表4空白組織測定結(jié)果及最低檢測限(n＝20，LOD＝X+3SD)

4.3準(zhǔn)確度將1mg/mL MQCA液添加到豬肌肉或豬肝臟組織中，使其終濃度為0μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、20μg/kg，每個濃度5個重復(fù)，重復(fù)7天，按照實(shí)施例3所述方法提取、凈化、衍生，采用間接競爭ELISA測定樣品中MQCA濃度，并計(jì)算回收率和變異系數(shù)(表5)。結(jié)果顯示，豬肉、豬肝組織中添加1μg/kg、5μg/kg、20μg/kg的MQCA時，回收率均在60％～120％之間，批間變異系數(shù)均＜20％。
表5本發(fā)明方法的準(zhǔn)確度

實(shí)施例5、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備5.1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的組成試劑盒主要由盒體、酶標(biāo)板、MQCA標(biāo)準(zhǔn)品液(1mg/mL)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體、MQCA抗體液、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、苯胺衍生試劑、腈基磷酸二乙酯(DEPC)催化劑和泡沫托架所組成5.2所用試劑的配制(1)包被稀釋液Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至pH9.6；(2)封閉液卵清蛋白0.1g溶于100mLpH7.4 PBS；(3)濃縮洗滌液NaCl80g，KH2PO42g，Na2HPO412H2O29g，KCl2g，吐溫(Tween)-205mL，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至pH7.4；(4)濃縮樣品稀釋液NaCl80g，KH2PO42g，Na2HPO412H2O29g，KCl2g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至pH 7.4；(5)底物顯色A液再本實(shí)施例中，采用的是四甲基聯(lián)苯胺溶液，即取四甲基聯(lián)苯胺200mg，無水乙醇(在另外的實(shí)施例中，可將所述的四甲基聯(lián)苯胺改為鄰苯二胺，無水乙醇可改為二甲亞砜)100mL，加雙蒸水至1000mL；(6)底物顯色B液取Na2HPO414.60g，檸檬酸9.33g，0.75％過氧化氫尿素6.4mL，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至pH 5.0～5.4；(7)底物顯色混合液(在本實(shí)施例中是四甲基聯(lián)苯胺-過氧化氫尿素溶液)將底物顯色A液和底物顯色液B按體積比1∶1混合即為底物顯色液混合液；(8)終止液在本實(shí)施例中采用的是2mol/L的硫酸溶液，即取18mol/L濃硫酸100mL，緩慢滴加到雙蒸水至900mL，即為終止液(在另外的實(shí)施例中可將2mol/L的硫酸溶液改為4mol/L的鹽酸溶液)。
5.3酶標(biāo)板的制備用上述制備的包被緩沖液將MQCA與卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋成1μg/mL，每孔加入100μL，4℃過夜，傾去包被液，洗滌液洗滌3次，拍干，然后每孔加入200μL封閉液，37℃孵育1h，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，用鋁膜真空密封保存、備用。
5.4本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性2～8℃穩(wěn)定性試驗(yàn)將試劑盒置于4℃下保存，于0、1、2、3、4、5、6、7月分別取試劑盒，測定IC50值、0標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值和豬肝臟中添加量為4μg/kg時的回收率。以IC50值大于10μg/L、0標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值小于0.6和回收率不在50％～120％范圍內(nèi)為判定試劑盒失效的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表6。
表6本發(fā)明的試劑盒4℃穩(wěn)定性試驗(yàn)

37℃加速穩(wěn)定性試驗(yàn)將試劑盒置于37℃下保存，于0、1、2、3、4、5d分別取試劑盒，測定IC50值、0標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值和豬肝臟中添加量為4μg/kg時的回收率。以IC50值大于10μg/L、0標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值小于0.6和回收率不在50％～120％范圍內(nèi)為判定試劑盒失效的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表7。
表7本發(fā)明的試劑盒37℃加速穩(wěn)定性試驗(yàn)

表6和表7結(jié)果顯示，試劑盒在4℃保存到第3個月時，所有指標(biāo)均在正常波動范圍內(nèi)。37℃保存到第5d，0標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值下降到0.64，IC50值為11.26μg/L，回收率為102％，說明試劑盒中的部分試劑已開始失效。根據(jù)唐偉國主編，尹行等編，《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷試劑的制備與應(yīng)用》，上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1996年版文獻(xiàn)中的規(guī)定，試劑盒在37℃放置一天，相當(dāng)于2～8℃保存一個半月。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明本試劑盒在4℃條件下的保存期至少為6個月。
實(shí)施例6、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的測定程序6.1工作液配制(1)樣品稀釋液配制將試劑盒中提供的濃縮樣品稀釋液(pH7.4的磷酸鹽緩沖液)用三蒸水10倍稀釋后使用，置4℃冰箱保存；(2)洗滌液配制將試劑盒中提供的濃縮洗滌液(0.05～0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)用三蒸水10倍稀釋后使用，置4℃冰箱保存；(3)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體工作液配制根據(jù)每次所需用量(根據(jù)檢測樣品的多少決定用量)，將試劑盒中提供的HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體液用樣品稀釋液5000倍稀釋后使用；(4)MQCA抗體工作液配制根據(jù)每次所需用量(根據(jù)檢測樣品的多少決定用量)，將MQCA抗體液用樣品稀釋液25000倍稀釋后使用；(5)催化劑工作液配制取100uL乙腈于1.5mL具塞塑料離心管中，棄去10μL，加入催化劑腈基磷酸二乙酯原液10μL，旋渦混勻；(6)衍生試劑工作液配制取0.5mL乙腈于1.5mL具塞塑料離心管中，棄去30μL，加入衍生試劑苯胺30μL，旋渦混勻(衍生試劑對光敏感，操作注意避光)；(7)底物顯色A液配制向底物顯色A液瓶中加入10mL無水乙醇，混勻即為底物顯色A液濃縮液，根據(jù)每次所測樣品的數(shù)量決定其用量，用三蒸水10倍稀釋后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用；(8)底物顯色B液配制將底物顯色B液濃縮液用三蒸水10倍稀釋，得到底物顯色B液稀釋液，再按每10ml底物顯色B液稀釋液加入過氧化氫脲64uL的比例加入過氧化氫脲徹底混勻后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用；(9)底物混合液配制根據(jù)每次所需用量，將配制的底物顯色A液和底物顯色B液按體積比1∶1混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
6.2測定步驟(1)將48或96孔酶標(biāo)板置于室溫下回溫備用；(2)將衍生好的標(biāo)準(zhǔn)品液(640ng/mL)用樣品稀釋液(0ng/mL)稀釋成64ng/mL、16ng/mL、4ng/mL、1ng/mL、0.25ng/mL、0ng/mL，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，各取40μL加入到微孔中；將樣品液取40μL加入到微孔中。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行試驗(yàn)，記下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置；(3)在每一微孔中加入MQCA抗體工作液60μL，充分混合后于培養(yǎng)箱37℃孵育1h，覆蓋上薄膜或置濕盒中防止蒸發(fā)；(4)倒出孔中的液體，洗滌3次并拍干；(5)在每一微孔中加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體工作液100μL，充分混合后于培養(yǎng)箱37℃孵育1h，覆蓋上薄膜或置濕盒中防止蒸發(fā)；(6)倒出孔中的液體，洗滌4次并拍干；(7)在每一微孔中加入底物混合液100μL，充分混合后于培養(yǎng)箱37℃孵育15到20min；(8)在每一微孔中加入反應(yīng)終止液50μL終止反應(yīng)；(9)加入終止液后60min內(nèi)在450nm處測量吸光度值。
6.3結(jié)果判斷所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品吸光值的平均值除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光值再乘以100，即為抑制率。以抑制率為縱坐標(biāo)，MQCA濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線在0.25μg/L～64μg/L范圍內(nèi)趨近直線，每一個樣品的濃度(μg/kg)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。
實(shí)施例7、本發(fā)明試劑盒的考核與應(yīng)用
7.1本發(fā)明試劑盒的考核將本發(fā)明試劑盒用HPLC方法進(jìn)行考核，結(jié)果(見表8)顯示ELISA具有良好的靈敏度和特異性，與HPLC方法相關(guān)性良好。
表8 HPLC法與本發(fā)明方法的比較

7.2本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用取21頭45日齡，體重15.0±2.0kg品種為“長大”的二元雜交去勢健康仔豬，隨機(jī)分為2組，一組為不添加藥物的空白對照組，另一組為加藥試驗(yàn)組。試驗(yàn)組飼喂含50mg/kg的喹乙醇7天，停藥0天、4天、10天、14天分別屠宰3頭，空白對照組分別在停藥0天、4天、10天各屠宰3頭，按照試劑盒測定程序測定豬肝臟、肌肉中MQCA的含量。測定結(jié)果如表9所示停藥0天，ELISA方法測定肝臟、肌肉中MQCA含量分別為83.7ng/g和7.7ng/g，而HPLC方法檢測結(jié)果分別為82.3ng/g和7.0ng/g，停藥14天，用ELISA方法和HPLC方法檢測肝臟中MQCA含量分別為4.77ng/g和4.6ng/g，肌肉中均未檢出。兩種方法測定結(jié)果都能反映MQCA在肝臟和肌肉中的殘留量隨時間的延長逐漸降低，陰性對照組測定結(jié)果均為陰性(＜1μg/kg)，加藥組均為陽性(＞1μg/kg)，說明本發(fā)明的試劑盒具有實(shí)際檢出能力，可以篩選出陽性樣品(＞1μg/kg)。
表9豬肝臟和肌肉組織中MQCA含量的測定

注“-”表示不予計(jì)算
權(quán)利要求
1.一種3-甲基喹啉-2-羧酸殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，包括免疫原、包被原和抗體的制備以及樣品的前處理，其步驟如下(1)將3-甲基喹啉-2-羧酸與卵清蛋白相偶聯(lián)得到包被原；(2)將3-甲基喹啉-2-羧酸與牛血清白蛋白相偶聯(lián)得到免疫原；(3)用步驟(2)的免疫原免疫兔得到特異性兔多克隆抗體；(4)用步驟(1)的包被原包被固相載體；(5)將所述的樣品先經(jīng)酸解提取后再過MAX柱凈化，最后加入衍生試劑和催化劑進(jìn)行處理，得到待測產(chǎn)物；(6)將步驟(5)的待測產(chǎn)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固相載體是酶標(biāo)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的衍生試劑是苯胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的催化劑為腈基磷酸二乙酯。
5.適用于權(quán)利要求1、2、3或4所述方法的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑，其特征在于，在酶標(biāo)板的每孔內(nèi)，包被有所述的包被原；所述的試劑包括抗3-甲基喹啉-2-羧酸特異性兔多克隆抗體，辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體，濃縮洗滌液，濃縮樣品稀釋液，3-甲基喹啉-2-羧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，底物顯色A液，底物顯色B液，終止液，衍生試劑和催化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的底物顯色A液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述底物顯色B液為過氧化氫或過氧化脲。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述終止液為硫酸溶液或鹽酸溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的濃縮洗滌液為含有0.05～0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述濃縮樣品稀釋溶液為pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。公開了一種用于3－甲基喹∴啉－2－羧酸殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法及試劑盒。本發(fā)明的方法主要包括免疫原、包被原和特異抗體的制備、樣品前處理和ELISA方法的建立。與之相配套的試劑盒由3－甲基喹∴啉－2－羧酸(MQCA)特異性抗體、包被有MQCA與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板以及MQCA標(biāo)準(zhǔn)品等組成。樣品經(jīng)偏磷酸水解處理，釋放MQCA，MAX柱凈化，苯胺衍生處理及間接競爭ELISA方法測定。本發(fā)明的方法及試劑盒具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能同時快速檢測大批樣品，組織最低檢測限為0.6μg/kg。
文檔編號G01N33/547GK1963507SQ20061016483
公開日2007年5月16日 申請日期2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日
發(fā)明者袁宗輝, 楊波, 趙春保, 高愛中, 彭大鵬, 王玉蓮, 謝長清, 陶燕飛, 陳冬梅, 黃玲利, 戴夢紅, 劉振利 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)