專利名稱：利用瞬逝光的物質(zhì)信息獲取方法和物質(zhì)信息測量裝置、以及堿基序列確定方法和裝置的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種利用瞬逝光(evanescent light)的物質(zhì) 信息的獲取技術(shù)。更詳細地說，涉及一種將瞬逝光作為熒光激 發(fā)光來利用、從而測量或確定固定在界面的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、 相互作用、堿基序列等的技術(shù)。
背景技術(shù)：
測量物質(zhì)的位置變化(位移)的方法根據(jù)其對象物的大小 而多種多樣。微米級以上的物質(zhì)能夠用光學顯微鏡等測量其長 度、位移。然而，光學顯微鏡的水平分辨率的極限是數(shù)百納米， 不能捕捉納米級物質(zhì)受到物理、化學作用時大小等的變化。電子顯微鏡等由于在真空中測量、需要蒸鍍等問題而不能 測量任意狀態(tài)下的動態(tài)變化，例如不能觀察溶液中的蛋白質(zhì)、 DNA伴隨結(jié)構(gòu)變化的位移。只有原子力顯微鏡(AFM: Atomic Force Microscope)可以觀察上述位移，但是存在測量準備和操 作難、測量準確度依賴于各個探針等問題。另外，在想要捕捉 時間尺度短的動態(tài)變化的情況下，得到 一個圖像需要數(shù)十分鐘 單位的測量時間的AFM并不適用。在此，已知在臨界角以上的入射角條件(全反射條件)下， 光從折射率較大的介質(zhì)向折射率較小的介質(zhì)入射時，在入射光 的相反側(cè)界面的近場中產(chǎn)生瞬逝光。該瞬逝光的強度隨著離界 面的距離的增加而按指數(shù)函數(shù)急速衰減。在曰本特開2003-29463l號公報、日本特開平10-221339號 公報中公開了利用該瞬逝光解析物質(zhì)的行為、狀態(tài)的技術(shù)。更詳細地說，在日本特開2003-294631號公報中，公開了如下的技 術(shù)事先在細胞中的待測物質(zhì)中進行熒光標記， 一邊進行瞬逝 照明 一邊隨時間在多個時間點檢測從上述待測物質(zhì)發(fā)出的熒光 信號，根據(jù)該熒光信號的變化來解析待測物質(zhì)的每個分子的行 為、狀態(tài)。在日本特開平10-221339號公報中公開了向進行熒光 標記的染色體照射瞬逝光等來觀察染色體的結(jié)構(gòu)、染色體上的 基因排列及其狀態(tài)的技術(shù)。目前逐漸開始開發(fā)根據(jù)晶振原理、表面等離子共振原理、 激發(fā)熒光檢測原理等檢測原理檢測或測量與物質(zhì)間的相互作 用、物質(zhì)的狀態(tài)(例如結(jié)構(gòu)、堿基序列等)、動態(tài)(例如結(jié)構(gòu)變 化、反應進行情況等)有關(guān)的信息。然而，這些技術(shù)都還處于 其檢測精確度有改進余地的階段，不能說是實現(xiàn)了能夠在納米 級水平下，準確地獲取物質(zhì)的上述信息的技術(shù)。因此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種利用了瞬逝光照明 技術(shù)獲取與物質(zhì)的位置、位移有關(guān)的信息，特別是與納米級水 平的位置、位移有關(guān)的信息的新技術(shù)，而且提供利用這些信息 正確地檢測或測量物質(zhì)的相互作用、狀態(tài)、動態(tài)等的新技術(shù)。發(fā)明內(nèi)容在臨界角以上的入射角條件(全反射條件)下，光從折射 率較大的介質(zhì)向折射率較小的介質(zhì)入射時，在入射光前進側(cè)的 相反側(cè)的界面的近場中產(chǎn)生瞬逝光(瞬逝波)。本發(fā)明利用該瞬 逝光的強度隨著離界面的距離的增加而按指數(shù)函數(shù)衰減的性 質(zhì)。本發(fā)明提供如下的物質(zhì)信息獲取方法首先使待測物質(zhì)存 在于可產(chǎn)生瞬逝光的界面區(qū)域，根據(jù)由上述瞬逝光激發(fā)而產(chǎn)生 的、來自上述待測物質(zhì)的熒光強度，獲取上述待測物質(zhì)的位置信息。即，本發(fā)明的主要特征在于(1)事先使待測物質(zhì)存在于 作為瞬逝光的照射范圍的界面(入射光側(cè)的相反側(cè)的界面)附逝光激發(fā)人為標記在待測物質(zhì)上的熒光色素所具有的熒光、該 待測物質(zhì)本身所具有的熒光，根據(jù)該激發(fā)熒光的強度獲取待觀'J 物質(zhì)的位置信息。該位置信息能夠在納米級水平獲取，成為用 于調(diào)查物質(zhì)間的相互作用、物質(zhì)的狀態(tài)、變化的有用信息。此外，在本發(fā)明中"待測物質(zhì)"是指作為物質(zhì)信息獲取對象 的物質(zhì)，以在一定時間內(nèi)或暫時地存在于產(chǎn)生瞬逝光的界面區(qū) 域的狀態(tài)、例如固定或保持在該界面的狀態(tài)來使用。"位置信息" 包括人為地標記在待測物質(zhì)上的熒光色素、待測物質(zhì)的焚光產(chǎn) 生部位所在的位置(以下稱為"熒光產(chǎn)生位置")和界面之間的 距離信息、與該距離信息的變化有關(guān)的信息兩者。發(fā)生變化的情況(例如通過人為的操作而改變的情況)下，獲 取這種條件變化前后的待測物質(zhì)的熒光強度信息，由此可獲知 該待測物質(zhì)的位移信息、更詳細地說是待測物質(zhì)的熒光產(chǎn)生位 置離界面的距離的變化程度。在這種位移由于物質(zhì)的 一 級結(jié)構(gòu)、 二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)或形態(tài)變化而產(chǎn)生的情 況下，該位移信息成為與物理或化學條件變化對物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、 形態(tài)產(chǎn)生的影響有關(guān)的信息。另外，在本發(fā)明中，通過實時地監(jiān)視激發(fā)熒光的強度，可 追蹤該待測物質(zhì)的位置信息隨時間的變化。由此，可獲取例如物質(zhì)所涉及的相互作用的進行有關(guān)的信息等。并且，在本發(fā)明中，也可以通過根據(jù)預先獲取的標準數(shù)對所測得的與上述熒光強度有關(guān)的數(shù)據(jù)進行校正，確定物質(zhì)的 位置信息，由此提高測量數(shù)據(jù)的可靠性。標準數(shù)據(jù)是指，例如 事先按分子長度的差異準備所需數(shù)量的正確確定了分子長度的 熒光標記物質(zhì)，根據(jù)這些熒光標記物質(zhì)離界面的距離的差異而 發(fā)生變化的熒光強度數(shù)據(jù)。該熒光強度數(shù)據(jù)正確地反映與離界 面的距離相應的焚光強度。接著，本發(fā)明提供物質(zhì)信息測量裝置，該物質(zhì)信息測量裝置至少具備光源；界面，來自該光源的出射光在該界面可產(chǎn) 生瞬逝光；熒光檢測部，其檢測由上述瞬逝光激發(fā)而產(chǎn)生的、其根據(jù)上述熒光強度信息和與離界面的距離相關(guān)的上述瞬逝光 的衰減率信息，自動解析待測物質(zhì)在上述反應場中的位置或/ 以及位移。并且在該裝置中，也可以設置反應場條件控制部， 該反應場條件控制部可改變來自光源的出射光與前進側(cè)相反一 側(cè)的界面所面向的反應場的物理或化學條件。本裝置的反應場條件控制部是能夠人為地控制反應場的物 理或化學條件的單元，例如可舉例能夠自由地操作溫度、pH、 壓力、物質(zhì)濃度、鹽濃度、溶劑種類等的條件的單元、對上述 反應場施加電場的單元、能夠選擇性地自由操作這些單元的單 元等。接著，本發(fā)明，提供一種確定堿基序列的方法，該方法通過 進行如下的步驟來確定單鏈核酸或雙《連核酸的堿基序列事先 將與核酸鏈的堿基或堿基對結(jié)合時發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)保持 在可產(chǎn)生瞬逝光的界面區(qū)域的步驟；使上述核酸鏈與上述蛋白 質(zhì)結(jié)合的步驟；按時間序列連續(xù)測量由上述瞬逝光激發(fā)而產(chǎn)生 的、來自上述蛋白質(zhì)的熒光強度的步驟；以及將該測量得到的 焚光強度數(shù)據(jù)和與堿基或堿基對的種類相關(guān)的上述蛋白質(zhì)的熒光強度數(shù)據(jù)庫進行自動對照的步驟。在本方法中可采用的蛋白 質(zhì)可以從具有通過與核酸鏈結(jié)合而發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的性質(zhì)的物質(zhì) 中選擇，例如可采用以多個堿基或堿基對為識別單位發(fā)生結(jié)構(gòu) 變化的蛋白質(zhì)。此外，檢測來自蛋白質(zhì)的熒光強度，能夠根據(jù) 目的適當?shù)夭捎檬孪葘υ摰鞍踪|(zhì)標記(標簽)熒光物質(zhì)并檢測 來自該熒光物質(zhì)的熒光強度的方法、或檢測來自構(gòu)成該蛋白質(zhì) 本身的氨基酸的熒光強度的方法等。另外，本發(fā)明提供堿基序列確定裝置，該裝置至少具備如 下部分界面，其保持熒光標記的、與核酸鏈的堿基或堿基對結(jié)合時結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的蛋白質(zhì)，并用于產(chǎn)生瞬逝光；熒光檢測 部，其能夠根據(jù)上述瞬逝光的熒光激發(fā)，連續(xù)測量來自上述蛋 白質(zhì)的熒光強度；數(shù)據(jù)庫保持部，其事先保持與堿基或堿基對 的種類相關(guān)的上述蛋白質(zhì)的熒光強度數(shù)據(jù)庫；以及數(shù)據(jù)處理部， 其通過將上述測量得到的熒光強度數(shù)據(jù)和上述焚光強度數(shù)據(jù)庫 進行自動對照，確定核酸鏈的堿基序列。即，這些與堿基序列確定有關(guān)的方法、裝置的特征在于， 當保持(例如固定)在界面區(qū)域的蛋白質(zhì)沿著單鏈核酸鏈或雙 鏈核酸鏈移動時，通過將熒光強度數(shù)據(jù)和預先獲取的與堿基或 堿基對的種類相關(guān)的上述蛋白質(zhì)的熒光強度數(shù)據(jù)庫進行自動對 照，確定核酸鏈的堿基序列，其中，所述熒光強度數(shù)據(jù)是通過 連續(xù)追蹤根據(jù)堿基或堿基對的種類發(fā)生結(jié)構(gòu)變化時熒光強度的 變化(熒光物質(zhì)的位置變化)而得到的數(shù)據(jù)。在本發(fā)明中，通過瞬逝光照明，可獲取固定在界面的物質(zhì) 的位置信息、位移信息，特別是納米級水平的位置信息、位移 信息。更詳細地說，能夠非接觸地、高精確度地將作為對象的 待測物質(zhì)的納米級水平的位置信息、位移信息進行數(shù)值化。由 此，可檢測或測量物質(zhì)間的相互作用的有無、進行狀況、物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、堿基序列等的狀態(tài)、動態(tài)。


圖l是用于說明本發(fā)明所涉及的物質(zhì)信息獲取方法、物質(zhì)信 息測量裝置中所使用的瞬逝光照射的基本原理的圖。圖2是用于說明該原理的其它圖。圖3是表示作為本發(fā)明的應用例的、檢測核酸鏈向伸展狀態(tài) 的變化的檢測方法的概念的一例的圖。圖4是表示作為本發(fā)明的應用例的、檢測雜交的方法的概念 的 一 例的圖。圖5是示意性地表示本發(fā)明所涉及的堿基序列確定方法或裝置的 一 個實施方式例的概念的圖。圖6是表示實施例1所涉及的實驗結(jié)果的附圖代用圖表。 圖7是表示實施例2所涉及的實驗結(jié)果的附圖代用圖表。 圖8是示意性地表示實施例2所涉及的s s D N A的結(jié)構(gòu)變化的情形的圖。
具體實施方式
下面參照

用于實施本發(fā)明的最佳方式。此外，附 圖中示出的各實施方式表示本發(fā)明的代表性的實施方式的一個 例子，并不是由此限定性地解釋本發(fā)明的范圍。首先，圖l、圖2是用于說明在本發(fā)明所涉及的方法、裝置 中所使用的瞬逝光照射的基本原理的圖。在圖l中示出了物質(zhì)信息測量裝置，該物質(zhì)信息測量裝置具 備光源Q;界面S,來自該光源Q的出射光P在該界面可產(chǎn)生瞬 逝光PE;熒光檢測部D,對由上述瞬逝光PE激發(fā)而產(chǎn)生的、從 存在于上述界面S的近場A中的待測物質(zhì)(圖l中未圖示)發(fā)出的熒光f的強度進行檢測；以及解析部C,其根據(jù)該熒光強度信 息和與離界面S的距離相關(guān)的上述瞬逝光PE的衰減率信息，自 動解析反應場R中的待測物質(zhì)的位置或/以及位移。此外，關(guān)于來自待測物質(zhì)的熒光強度的檢測，能夠根據(jù)目 的適當?shù)夭捎檬孪葘υ摯郎y物質(zhì)標記(標簽)焚光物質(zhì)來檢測 來自該熒光物質(zhì)的熒光強度的方法、或采用檢測來自構(gòu)成該待 測物質(zhì)本身的熒光發(fā)光性的物質(zhì)的熒光強度的方法等。根據(jù)需要，熒光檢測部D具備透鏡L1，其對熒光f進行聚 光并變換為平行光；光檢測器(光電檢測器)PD;透鏡L2，其 向該光檢測器PD聚光熒光f;濾鏡H,其用于攔截混雜在焚光f 中而前進的光P;以及未圖示的反射鏡(例如分色鏡)，其用于 改變光前進方向；等。解析部C是計算機，作為數(shù)據(jù)庫預先保存熒光強度和與離 界面S的距離相關(guān)的上述瞬逝光PE的衰減率信息，并且保存計 算程序，該計算程序?qū)⒃摂?shù)據(jù)庫和實際測量的熒光強度進行對 照，通過自動運算，以離界面S的距離的形式算出作為熒光f的 產(chǎn)生源的熒光物質(zhì)所存在的位置。在此，說明瞬逝光照射原理，當光P從光源Q以臨界角以上 的入射角條件(全反射條件)下從折射率較大的介質(zhì)M1向折射 率較小的介質(zhì)M 2入射時，在該入射光P的相反側(cè)界面S的近場A 中產(chǎn)生瞬逝光(瞬逝波)PE。該瞬逝光PE的強度(電場的平方) 具有隨著離界面S的距離Z的增加而按指數(shù)函數(shù)急速衰減的性 質(zhì)(參照圖2),可使用下面的式組來具體說明該性質(zhì)。此外， 下面的式組中所示符號的意思將在文章結(jié)尾部分匯總記載。首先，可用下面的[式l]"來表示電場分布(大津元一著近 接場光O基礎p.26-29 )。[式l]<formula>formula see original document page 11</formula>已知，通過將瞬逝光PE用于照明源，例如能夠只抽取固液 界面附近的熒光信息，該方法實際應用在TIRF (Total internal reflection fluorescence:全內(nèi)反射熒光)顯樣i鏡等。在此，焚光 強度是瞬逝光PE的線性函數(shù)，在考慮其時間平均的情況下，不 依賴于位置(x),因此能夠從上述的電場分布的[式l]改寫成下 面的[式2]。 [式2]<formula>formula see original document page 11</formula>并且，通過如下面的[式3]那樣定義d,進一步導出接下來 的[式4]。 [式3]<formula>formula see original document page 11</formula>[式4]上述式3、 4的d依賴于各介質(zhì)、入射角和波長，它們越小， 瞬逝光PE的強度在越短的距離內(nèi)衰減。在此，在將瞬逝光PE用 作熒光激發(fā)光的情況下，在相同的瞬逝光場中，若在熒光物質(zhì)的位置(z)從Z!的狀態(tài)變化為Z2的狀態(tài)的現(xiàn)象的前后，能得到熒光強度(=kl ( z))的變化，則能夠根據(jù)上述的式4，如下面 的式5那樣算出并解析熒光物質(zhì)的位置變化(位移)。 [式5〗接著，根據(jù)圖3、圖4具體說明利用如下方法的測量系統(tǒng)的 實施方式例將瞬逝光PE用作熒光激發(fā)光，根據(jù)上述的式5等 測量存在于界面S的近場A中的熒光物質(zhì)的位置信息。首先，在圖3所示的實施方式例中，對可形成瞬逝光PE的 界面S固定作為核酸鏈的待測物質(zhì)T的 一 端，在該待觀'J物質(zhì)T的 另一端部標記有熒光物質(zhì)(熒光色素)F。在初始狀態(tài)(I)下， 該待測物質(zhì)T(T1)隨機地互相纏繞成線圈狀，熒光物質(zhì)F存在 于接近界面S的位置上。將根據(jù)此時的瞬逝光P E得到的熒光強 度設為Il。接著，改變反應場R的物理條件或化學條件。例如，當對 反應場R施加電場時，作為核酸鏈的待測物質(zhì)T能夠在 一 端被固 定的狀態(tài)下伸展，因此從界面S到熒光物質(zhì)F的距離變長(參照 圖3中的符號T2 )。根據(jù)此時的瞬逝光PE得到的熒光強度I2成為 比上述熒光強度I1衰減的值(再次參照圖2)。在此，將初始狀態(tài)(I)下得到的熒光強度I1和改變反應場 R的物理條件或化學條件之后的熒光強度I2代入到上述式5時， 能夠?qū)Υ郎y物質(zhì)T上標記的熒光物質(zhì)F離界面S的距離變化、即 位移量(Az、參照圖2)進行數(shù)值化。在這種測量系統(tǒng)中，例 如可獲知外部條件的變化對核酸鏈的高級結(jié)構(gòu)等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、 形態(tài)等產(chǎn)生的影響。此外，已知核酸分子在液相中受到電場作用時伸展或移動。 該原理認為由構(gòu)成骨架的磷酸離子(負電荷)和其周圍的水電 離而成的氫原子(正電荷)形成電子云，由這些負電荷和正電 荷產(chǎn)生的極化向量(偶極子)通過高頻高電壓的施加而整體上 朝向一個方向，其結(jié)果伸展，此外，在被施加不均勻電場的情況下，向電力線集中的部位移動(Seiichi Suzuki, Takeshi Yamanashi， Shin-ichi Tazawa， Osamu Kurosawa and Masao Washizu: "Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy"， IEEE Transaction on Industrial Applications, Vol.34, No.l， P75-83 ( 1998 ))。接著，圖4是用于說明對存在于界面S的近場A中的熒光物 質(zhì)的位置信息進行測量的其它實施方式例的圖，即是應用了本 發(fā)明的 一 個例子，是表示檢測雜交的情況下的概念的圖。首先，在該實施方式例中，事先將具有可形成自身環(huán)化結(jié) 構(gòu)的堿基序列結(jié)構(gòu)的、末端標記有熒光物質(zhì)(熒光色素)F的 探針核酸鏈X的另一端固定在界面S上。由于圖3的(I)所示的 狀態(tài)的探針核酸鏈X1處于形成自身環(huán)化結(jié)構(gòu)的狀態(tài)，因此焚光 物質(zhì)F存在于接近界面S的位置。將根據(jù)此時的瞬逝光P E得到的 熒光強度設為Il。接著，當對界面S的反應場R導入具備與探針核酸鏈X互補 的堿基序列部位的核酸鏈Y時，核酸鏈X(X1)的自身環(huán)化結(jié) 構(gòu)解開，并與核酸鏈Y形成雙鏈。此時，核酸鏈X(X2)的熒 光物質(zhì)F與界面S之間的距離變長(參照圖4的(II))。將根據(jù)此 時的瞬逝光PE得到的熒光強度設為I2 (I2<I1 )。在此，當將初始狀態(tài)(I)下得到的熒光強度I1和上述焚光 強度I2代入到上述式5時，能夠?qū)擞浽谔结樅怂徭淴上的焚光 物質(zhì)F離界面S的距離變化、即位移量(Az)具體地進行數(shù)值化。 在這種測量系統(tǒng)中，例如可檢測探針核酸鏈X的雜交的有無、 雜交的進行狀況。從圖3、圖4所示的實施方式例可知，根據(jù)本發(fā)明，可得到 與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化、物質(zhì)間的相互作用有關(guān)的信息，另外通過實時地監(jiān)視測量焚光強度，可獲知物質(zhì)的隨時間的動態(tài)變化、 相互作用的進行狀況等。接著，圖5是示意性地表示本發(fā)明所涉及的堿基序列確定方 法的一個實施方式例的概念的圖。在本實施方式中，首先將熒光物質(zhì)F標記在與核酸鏈的石咸 基或堿基對結(jié)合時結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的蛋白質(zhì)E上，并保持(例如 固定)在界面S區(qū)域中。此外，能夠根據(jù)目的等來適當?shù)卮_定 固定等的保持方法。蛋白質(zhì)E具有在與圖5中用符號N表示的核酸鏈結(jié)合時該蛋 白質(zhì)E (或核酸鏈N)如滑動般移動的功能，可適當釆用與核酸 鏈N結(jié)合時根據(jù)其結(jié)合的堿基(或堿基對)的種類而伴隨特有 的結(jié)構(gòu)變化的性質(zhì)的物質(zhì)。例如可采用DNA解螺旋酶、聚合酶。圖5的(I)示出蛋白質(zhì)E(E1)結(jié)合在被導入到界面S上的 反應場R中的核酸鏈N上的某時刻的情形。此時，標記在蛋白質(zhì) El上的熒光物質(zhì)F存在于離界面S距離zl的位置上，通過瞬逝光 PE(在圖5中未圖示。參照圖l)產(chǎn)生強度I1的熒光。此外，在圖5中將核酸鏈N表示為單鏈，但是也可以是雙鏈。 另外，在本實施方式中，例示了在蛋白質(zhì)E上標記熒光物質(zhì)F的 方法，但是也可以根據(jù)目的，適當?shù)夭捎脵z測來自構(gòu)成該蛋白 質(zhì)E的熒光發(fā)光性的氨基酸(例如色氨酸等)的熒光的強度的 方法。圖5的(II)示出核酸鏈N相對于蛋白質(zhì)E滑動以 一 個堿基份 或多個堿基單位的狀態(tài)。此時蛋白質(zhì)E所結(jié)合的堿基種類或堿 基的組合(核酸鏈N為雙鏈時是堿基對的種類、堿基對的組合) 不同時，蛋白質(zhì)E的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(參照圖5的(II)的符號E2)。 此時，標記在蛋白質(zhì)E上的熒光物質(zhì)F存在于離界面S距離z2(例 如z2〈zl)的位置，通過瞬逝光PE (在圖5中未圖示。參照圖l)產(chǎn)生比強度I1更衰減的強度I2 (即12>11 )的熒光。在進行這種熒光強度測量之前，預先測量與堿基或堿基對的種類、組合相關(guān)(在界面S上的)的蛋白質(zhì)E的熒光強度，將 其進行數(shù)據(jù)庫化并保持在計算機(相當于圖1的解析部C)的存儲部中。然后，在上述計算機的數(shù)據(jù)處理部中，根據(jù)預先保持的計算機程序自動地將上述數(shù)據(jù)庫和所測量的熒光強度Il、 12 進行對照，由此自動確定該核酸《連N的石威基序列。可實施這種堿基序列確定方法的裝置例如具備如圖1所示 的裝置結(jié)構(gòu)。首先，該裝置具備界面S，該界面S事先保持與核 酸鏈N的堿基或堿基對結(jié)合時發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的、標記有焚光物 質(zhì)F的蛋白質(zhì)E，并且可產(chǎn)生瞬逝光。
提供堿基序列確定裝置，該堿基序列確定裝置還具備熒光 檢測部D，該萸光檢測部D利用上述瞬逝光PE來激發(fā)標記在上 述蛋白質(zhì)E上的焚光物質(zhì)F,并能夠根據(jù)產(chǎn)生的熒光激發(fā)光f來連 續(xù)地進行測量，還至少具備數(shù)據(jù)庫保持部，其事先保持與堿 基或堿基對的種類相關(guān)的上述蛋白質(zhì)E的熒光強度數(shù)據(jù)庫(基 礎數(shù)據(jù)庫)；以及數(shù)據(jù)處理部，其通過將由上述測量得到的熒光 強度數(shù)據(jù)和上述熒光強度數(shù)據(jù)庫進行自動對照，確定核酸鏈的 堿基序列。此外，數(shù)據(jù)庫保持部和數(shù)據(jù)處理部設置在圖l所示的 解析部C。
即，在這些與堿基序列確定有關(guān)的方法、裝置中，在單鏈 核酸鏈或雙鏈核酸鏈相對于保持(例如固定)在界面S區(qū)域中 的蛋白質(zhì)E移動時，通過將熒光強度數(shù)據(jù)和預先獲取的與堿基 或堿基對的種類相關(guān)的上述蛋白質(zhì)的熒光強度數(shù)據(jù)庫進行自動 對照，能夠連續(xù)地自動確定核酸鏈的堿基序列，其中，所述熒 光強度數(shù)據(jù)是通過連續(xù)追蹤該蛋白質(zhì)E根據(jù)堿基或堿基對的種 類而發(fā)生結(jié)構(gòu)變化時的熒光強度的變化(熒光物質(zhì)的位置(離界面的距離)變化)而得到的數(shù)據(jù)。 [實施例1]
根據(jù)上述說明的測量原理、方法，進行對短鏈DNA施加電
場時該D N A的平均長度變化測量實驗。
更具體地:沈，準備在垂直方向具有相對電^1的小室(口徑 200pm、高度(深度)51im的反應場)，在該小室的底面產(chǎn)生瞬 逝光。利用化學結(jié)合將DNA的一端固定在該小室底面，另一端 用熒光色素(Cy3)標記。然后，在施加電場前后測量根據(jù)該 熒光色素的位置而會發(fā)生變化的熒光強度。測量是在顯微鏡下 進行。
在此，認為在僅全反射入射下的測量中，產(chǎn)生如下的問題 無法將由瞬逝光的強度變化引起的熒光強度變化與由施加電場 導致的溫度變化引起的熒光強度變化進行區(qū)分。
因此，在本實施例中，進一步改變實驗測量系統(tǒng)，通過還 同時進行垂直全入射光下的測量來區(qū)分由溫度變化引起的熒光 強度的變化。即，由于在垂直入射光引起的激發(fā)中，激發(fā)光強 度不隨離基板的高度而發(fā)生變化，因此反應場中的熒光色素 (Cy3分子)不論位置均發(fā)出相同的熒光強度。該熒光強度僅 為溫度的函數(shù)。在圖6中示出根據(jù)這種測量系統(tǒng)測量依賴于瞬逝 光激發(fā)光的高度(離界面的距離)的熒光強度變化的結(jié)果。
該圖6示出了對lmer、 30mer、 90mer三種Cy3修飾的合成寡 聚DNA施加6.5Vpp/pm的電場時，瞬逝光激發(fā)(與圖6中的TIRF 對應)和垂直入射激發(fā)(與圖6中的TRANS對應)的熒光強度 的變化。
在lmer的情況下，瞬逝光激發(fā)(TIRF )和垂直入射激發(fā) (TRANS )，熒光強度的變化只有噪聲水平左右的差異(參照 圖6中的最下方的曲線)，但是在30mer、 90mer的情況下，得到噪聲水平以上的顯著的差異(參照圖6)。此外，溫度上升引起的強度變化分別是2.5 ~ 3.0%左右，根據(jù)另外進行的熒光強度溫 度特性的結(jié)果計算時，對應于不足rc的溫度上升。根據(jù)該基線，在30mer、 90mer的情況下，在瞬逝光激發(fā) (TIRF)時熒光強度進一步分別降低1.7%左右。在根據(jù)該結(jié)果 算出DNA的伸展后的長度時，可知30mer、 90mer的DNA兩者的 平均長度都變化了 3nm左右。即，根據(jù)本實驗，在排除了施加電場導致的反應溶液的溫度變化所引起的熒光強度的變化的基礎上，能夠根據(jù)由瞬逝光 的強度變化引起的熒光強度變化來檢測DNA的高級結(jié)構(gòu)變化 (電場導致的伸展)。 [實施例2]在實施例2中，根據(jù)上述說明的測量原理、方法，進行關(guān)于 生物體高分子在鹽濃度環(huán)境變化中的平均長度變化測量的實 驗。在玻璃底培養(yǎng)皿的玻璃上固定90mer的ssDNA的一端，用熒 光色素(Cy3)標記另一端。其中灌滿純水或鹽水。滿足全反 射條件地向玻璃界面入射激發(fā)激光，從而產(chǎn)生瞬逝光。按時間序列測量純水環(huán)境的(1)、過15秒之后對處于純水 環(huán)境的系統(tǒng)滴加10mM的NaCl使最終濃度為2mM的(11)、再 過15秒之后對處于2mM NaCl環(huán)境的系統(tǒng)滴加2mM的NaCl的 (III)的相應于熒光色素的位置而發(fā)生變化的熒光強度。在圖 7中示出結(jié)果。如圖7所示，可知純水中的標記ssDNA的焚光的強度在滴加 鹽之后增大。即，可知隨著鹽的滴加，熒光標記接近玻璃界面。 認為該現(xiàn)象是由于如圖8所示，在純水中，由于構(gòu)成DNA鏈 的離子彼此間的靜電排斥，鏈為伸展的狀態(tài)(參照圖8的(I)),通過鹽的滴加，充滿于在玻璃上的溶液的離子強度增加，由此，
構(gòu)成DNA鏈的離子被屏蔽，鏈內(nèi)的斥力降低，從而結(jié)構(gòu)收縮(參 照圖8的(II))。
當根據(jù)上述的式5計算焚光強度變化時，標記ssDNA的焚光 在滴加鹽前后的位移大約是2nm。因而可知，才艮據(jù)本發(fā)明所涉 及的方法可測量納米等級的非常微小的位移。另外可知，利用 本發(fā)明所涉及的方法，可追蹤鹽濃度等引起的分子結(jié)構(gòu)的變化、 例如核酸的高級結(jié)構(gòu)的變化。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
本發(fā)明可用于檢測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)(例如生物體物質(zhì)的一級結(jié) 構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)等)的變化、形態(tài)變化、 雜交/抗原抗體反應/蛋白質(zhì)間相互作用/高分子-高分子間/高分 子-低分子/低分子-低分子間的反應等相互作用的產(chǎn)生及其進 行情況、蛋白質(zhì)的單元結(jié)構(gòu)的變化、物質(zhì)的擴散狀態(tài)等的檢測 技術(shù)、監(jiān)視這些變化的監(jiān)視技術(shù)來利用。
式組中表示的符號的意思如下。
I熒光強度
P光(入射光)
PE瞬逝光(瞬逝照明光)
S界面
T待測物質(zhì)
Z離界面(S)的熒光物質(zhì)的位置(距離)信息 △ z位移信息
E ( x， z) ( x， z)處的電場強度 To電場纟展幅 co角頻率
k2介質(zhì)2中的波n折射率比ei入射角Io熒光強度的基準強度(標準化強度)nl介質(zhì)M1中的折射率n2介質(zhì)M2中的折射率d熒光強度(瞬逝光強度的厚度基準)zl l的狀態(tài)下的位置(離界面的距離)z2 2的狀態(tài)下的位置(離界面的距離)11 l的狀態(tài)中的熒光強度12 2的狀態(tài)中的熒光強度
權(quán)利要求
1. 一種物質(zhì)信息獲取方法，使待測物質(zhì)存在于可產(chǎn)生瞬逝光的界面區(qū)域中，根據(jù)由上述瞬逝光激發(fā)而產(chǎn)生的來自上述待測物質(zhì)的熒光強度獲取上述待測物質(zhì)的位置信息。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)信息獲取方法，其特征在于，上述待測物質(zhì)被固定在上述界面上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)信息獲取方法，其特征在于，變化前后的熒光強度信息，得到該待測物質(zhì)的位移信息。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的物質(zhì)信息獲取方法，其特征在于， 上述位移信息是由物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或形態(tài)變化所帶來的信息。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)信息獲取方法，其特征在于， 實時地監(jiān)視上述激發(fā)熒光的強度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)信息獲取方法，其特征在于， 上述位置信息是納米級的位置信息。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)信息獲取方法，其特征在于， 根據(jù)預先獲取的標準數(shù)據(jù)，對測量的與上述熒光強度有關(guān)的數(shù) 據(jù)進行校正，由此確定上述位置信息。
8. —種物質(zhì)信息測量裝置，至少具備 光源；界面，來自該光源的出射光在該界面可產(chǎn)生瞬逝光； 熒光檢測部，其對由上述瞬逝光激發(fā)而產(chǎn)生的、從存在于上述界面上的待測物質(zhì)發(fā)出的熒光強度進行檢測；以及解析部，其根據(jù)上述熒光強度信息和與離界面的距離相關(guān)的上述瞬逝光的衰減率信息，自動解析待測物質(zhì)在上述反應場中的位置或/以及位移。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的物質(zhì)信息測量裝置，其特征在于， 具備反應場條件控制部，該反應場條件控制部可改變上述出射
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的物質(zhì)信息測量裝置，其特征在 于，上述反應場條件控制部具有針對上述反應場的電場施加單元。
11. 一種確定堿基序列的方法，通過進行如下步驟來確定單鏈核酸或雙鏈核酸的堿基序列事先將在與核酸鏈的堿基或堿基對結(jié)合時發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的使上述核酸鏈與上述蛋白質(zhì)結(jié)合的步驟；按時間序列連續(xù)測量由上述瞬逝光激發(fā)而產(chǎn)生的、來自上 述蛋白質(zhì)的熒光強度的步驟；以及將由該測量得到的熒光強度數(shù)據(jù)和與堿基或堿基對的種類 相關(guān)的上述蛋白質(zhì)的熒光強度數(shù)據(jù)庫進行自動對照的步驟。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，上述蛋白 質(zhì)將多個堿基或堿基對作為識別單位來發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。
13. —種堿基序列確定裝置，至少具備界面，其將與核酸鏈的堿基或堿基對結(jié)合時發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)利用熒光物質(zhì)標記之后保持，并且產(chǎn)生瞬逝光；焚光檢測部，其能夠根據(jù)上述瞬逝光的熒光激發(fā)，連續(xù)測量來自上述蛋白質(zhì)的熒光強度；數(shù)據(jù)庫保持部，其事先保持與堿基或堿基對的種類相關(guān)的上述蛋白質(zhì)的熒光強度數(shù)據(jù)庫；以及數(shù)據(jù)處理部，其通過將由上述測量得到的熒光強度數(shù)據(jù)和上述熒光強度數(shù)據(jù)庫進行自動對照，確定核酸鏈的堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明提供利用瞬逝光照明技術(shù)的物質(zhì)的位置信息、位移信息。利用瞬逝光(PE)的強度隨著離界面(S)的距離(Z)的增加而按指數(shù)函數(shù)急速衰減的性質(zhì)，事先將待測物質(zhì)(T)固定在可產(chǎn)生瞬逝光(PE)的界面(S)，根據(jù)由上述瞬逝光(PE)激發(fā)而產(chǎn)生的、來自上述待測物質(zhì)T的熒光強度(I)，獲取上述待測物質(zhì)(T)的位置信息(Z)、位移信息(Δz)。使用該位置信息(Z)、位移信息(Δz)，捕捉物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或其變化、堿基序列、物質(zhì)間的相互作用的有無或進行狀況等。
文檔編號G01N21/64GK101218497SQ20068002476
公開日2008年7月9日 申請日期2006年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月7日
發(fā)明者岸井典之, 勝本洋一 申請人:索尼株式會社